CN114345428A - 一种分选单细胞的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分选单细胞的微流控芯片，包括：基底层，上表面设有第一金属电极对、第二金属电极对、阻抗识别区域，阻抗识别区域包括第一阻抗检测电极对和第二阻抗检测电极对，第一阻抗检测电极对与第一金属电极对连接，第二阻抗检测电极对与第二金属电极对连接；微通道层，位于基底层上方，微通道层包括微流控管道和分选电极；微流控管道包括主通道，主通道的一端通过若干过滤柱与进样口连通，另一端则与分选口连通，分选口分别与废液通道、收集通道连通，且废液通道与废液出口连通，收集通道与目标出口连通；分选电极包括激励电极以及包围激励电极的地电极，激励电极的一部分和地电极的一部分均临近分选口。

Description

一种分选单细胞的微流控芯片及检测方法

技术领域

本发明涉及细胞检测分析芯片技术领域，具体涉及一种分选单细胞的微流控芯片及检测方法，更具体地涉及一种无标签流式电阻抗谱分析及介电泳分选单细胞的微流控芯片及检测方法。

背景技术

在生命科学和医学领域，细胞分选和表征技术可以快速分离所需的亚群，进行鉴定和监测，以进行临床诊断。最近兴起的个性化医学更是突出了单细胞分析的重要性，例如，在单细胞水平上了解患者实体肿瘤的异质性可以使针对多种细胞亚型的治疗成为可能，从而提高存活率。

目前的单细胞分析方法包括流式细胞术和磁激活细胞分选，但这两种方法均存在不足：(1)样品制备过程复杂繁琐，导致关键细胞的潜在损失；(2)细胞标记的多路复用受到标记光谱重叠的限制；(3)需要大量的细胞。并且，流式细胞仪的操作通常需要专门的技术支持，而且仪器本身的价格较为昂贵。

此外，基于标记的细胞分析和分类方法有着根本的实验问题。首先，对于标记的使用本质上要求了解被测量对象的属性或类型，仅使用已知生物标志物的标记来探寻新的、未定义的细胞群体是不可能的。其次，标记与被测对象结合的生化过程可能会改变细胞的状态，激活特定的信号通路。

为解决上述问题，提出了无标记微流控技术。无标记微流控技术通过介电特性进行细胞表征，不需要对细胞进行外源或内源标记。介电特性(例如膜电容和电导率)反映了膜的形态和功能，进而与细胞之间的生理差异或病理变化相关。细胞膜中离子通道状态的变化，进入内质网和线粒体的细胞内离子流以及形态或核大小的变化都可以很容易地检测为介电特性的变化。

现有的微流控阻抗流式检测芯片通常采用库尔特计数原理的方法来识别细胞的电学特征，如专利201621188264.5。也有基于阻抗频谱法鉴别特定标志物的方法，如专利201080034516.8。这些方法虽然能有效地检测细胞，但是不能将细胞特异性无标记地分选出来。

细胞介电泳分选利用物质介电常数差异来进行分选，具有非标记的优点，但是施加在细胞上的介电泳力的差异极小，同种类型的细胞仅凭介电泳力的差异很难进行特异性分选。因此先进行电学特性的识别，再根据特性差异产生介电泳驱动细胞分选信号。专利201110324803.9提出了类似的方法，但是该专利有三点缺陷：1.关于介电识别部分，该专利虽提出用多对电极来进行多点频率复阻抗测量，但实际上，多对电极还可提供流速测量，提升实时分选的准确性；2.关于阻抗信息分析处理，该专利使用预先存储的细胞复介电常数的基准信息作为分选信号产生的阈值，但是每种甚至每个细胞对象所处的生理状态千差万别，仅凭单一值并不能实现实时特异性的分选；3.阻抗检测电极与溶液接触，电极会与溶液产生电化学反应，造成测量偏差，并对细胞造成一定的损伤。

因此，希望提供一种仅采用电学方法就可以分选不同种类细胞的方法和芯片，能够准确地、实时特异性地分选出不同种类的细胞。

发明内容

为解决上述现有技术中的问题，本发明提供一种分选单细胞的微流控芯片及检测方法，能够提高单细胞实时特异性分选的效率和准确性，并有效减少测量误差及对细胞的损伤。

本发明提供的一种分选单细胞的微流控芯片，包括：

基底层，所述基底层的上表面设有第一金属电极对、第二金属电极对以及阻抗识别区域，所述基底层在所述阻抗识别区域设有第一阻抗检测电极对和第二阻抗检测电极对，所述第一阻抗检测电极对与所述第一金属电极对连接，所述第二阻抗检测电极对与所述第二金属电极对连接；

微通道层，位于所述基底层上方，所述微通道层包括微流控管道和分选电极；所述微流控管道包括一主通道，所述主通道的一端通过若干过滤柱与一进样口连通，另一端则与一分选口连通，所述分选口分别与废液通道、收集通道连通，且所述废液通道与废液出口连通，所述收集通道与目标出口连通；所述分选电极包括激励电极以及包围所述激励电极的地电极，所述激励电极的一部分和所述地电极的一部分均临近所述分选口。

进一步地，所述基底层的上表面与所述微通道层的下表面紧密贴合。

进一步地，所述第一金属电极对包括第一金属电极和第二金属电极，第二金属电极对包括第三金属电极和第四金属电极，所述第一金属电极和所述第三金属电极位于所述主通道的一侧，所述第二金属电极和所述第四金属电极位于所述主通道的另一侧。

进一步地，所述第一阻抗检测电极对和所述第二阻抗检测电极对的中心均在所述主通道的轴线上。

进一步地，所述主通道的一部分、所述分选口、所述废液通道的一部分、所述收集通道的一部分以及所述激励电极和所述地电极临近所述分选口的部分共同形成为分选区域。

进一步地，所述激励电极和所述地电极均由液态金属浇灌微通道构成。

本发明还提供一种分选单细胞的检测方法，包括：

步骤S1，提供上述的微流控芯片，将位于主通道一侧的两个金属电极分别连接至高频交流信号源和低频交流信号源，位于主通道另一侧的两个金属电极均连接至锁相放大器；将所述锁相放大器连接至智能分析模块，将所述智能分析模块连接至高压模块，将所述高压模块分别连接至激励电极和地电极；

步骤S2，从进样口注入样品细胞，样品细胞流经阻抗识别区域时，激发与所述锁相放大器连接的金属电极产生感应电流；

步骤S3，所述锁相放大器对所述感应电流进行放大，并将放大后的感应电流传输至所述智能分析模块；

步骤S4，所述智能分析模块接收放大后的感应电流，对样品细胞的高低频阻抗参数进行分类，生成并输出分选触发信号；

步骤S5，所述高压模块接收所述分选触发信号，并输出分选脉冲，所述分选脉冲传输至分选电极而产生非均匀电场，以使样品细胞中的目标细胞在介电泳力的作用下流向目标出口，非目标细胞流向废液出口。

进一步地，所述步骤S4包括：

步骤S41，对放大后的感应电流进行平滑滤波和事件提取，找出满足高斯拟合的峰形信号数据；

步骤S42，将满足高斯拟合的峰形信号数据作为训练数据输入至神经网络进行实时特征提取，获取样品细胞的高低频阻抗参数以及特征提取的准确率；

步骤S43，当特征提取的准确率达到预设阈值时，采用聚类算法对样品细胞的高低频阻抗参数进行实时运算分类，划分出不同的细胞类别；

步骤S44，根据划分出的细胞类别，生成分选触发信号。

进一步地，所述样品细胞的高低频阻抗参数包括直径、位置、速度以及不透明度。

进一步地，所述神经网络包括：

输入层，设置为接收满足高斯拟合的峰形信号作为输入序列；

长短记忆层，设置为提取所述输入序列的特征；

全连接层，设置为将所述长短记忆层提取的特征进行组合，并输出样品细胞的高低频阻抗参数；

回归层，设置为计算预测响应的半均方误差，以检验神经网络特征提取的准确率。

在本发明的微流控芯片中，检测电极与样品细胞非接触，能够避免电化学反应，有效减少测量误差及对细胞的损伤。并且，分选电极通过灌注液态金属制备，成本低，简便高效。在本发明提供的分选单细胞的检测方法中，采用两对阻抗检测电极检测细胞的高低频阻抗参数，采用智能分析算法对细胞的阻抗特征实时提取并自动分类，极大地提高了单细胞特异性分选的效率和准确性。

附图说明

图1是按照本发明的一种分选单细胞的微流控芯片的结构示意图。

图2是图1的局部放大图。

图3是按照本发明的一种分选单细胞的微流控芯片与外部器件的连接示意图。

图4是特征提取的神经网络的原理图。

图5是阻抗谱检测人白细胞分类结果图。

图6是按照本发明的一种分选单细胞的检测方法实现目标细胞分选的效果图。

具体实施方式

下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。

如图1和图2所示，本发明提供的一种分选单细胞的微流控芯片，包括基底层1以及位于基底层1上方的微通道层2，微通道层2的横截面小于基底层1的横截面且基底层1的上表面与微通道层2的下表面紧密贴合。

基底层1的上表面设有第一金属电极对和第二金属电极对，第一金属电极对包括第一金属电极11和第二金属电极12，第二金属电极对包括第三金属电极13和第四金属电极14，这些金属电极11、12、13和14均位于微通道层2覆盖范围之外的区域。

基底层1的上表面具有阻抗识别区域3，阻抗识别区域3中包括第一阻抗检测电极对31和第二阻抗检测电极对32，第一阻抗检测电极对31与上述第一金属电极对连接，第二阻抗检测电极对32与上述第二金属电极对连接。

微通道层2包括设于其下表面上的微流控管道和分选电极，微流控管道用于使样品细胞流通，分选电极则用于为样品细胞提供介电泳力。其中，微流控管道包括一主通道21，主通道21的一端通过若干过滤柱22与进样口23连通，另一端则与分选口24连通，分选口24分别与废液通道211、收集通道212连通，废液通道211与废液出口25连通，收集通道212与目标出口26连通。并且，上述第一阻抗检测电极对31和第二阻抗检测电极对32的中心均在主通道21的轴线上，上述第一金属电极11和第三金属电极13位于主通道21的一侧，而第二金属电极12和第四金属电极14位于主通道21的另一侧。

分选电极包括激励电极27以及包围激励电极27的地电极28，激励电极27的一部分和地电极28的一部分均临近分选口24。如此，主通道21的一部分、分选口24、废液通道211的一部分、收集通道212的一部分以及激励电极27和地电极28临近分选口24的部分共同形成为分选区域4，以从样品细胞中分选出目标细胞。激励电极27尖端与地电极28尖端的间距小于等于50μm，以提供足够强的电场激发介电泳偏转。在本实施例中，激励电极27尖端与地电极28尖端的间距为20μm。激励电极27尖端与分选口24的距离以及地电极28与分选口24的距离均小于等于30μm。在本实施例中，励电极27尖端与分选口24的距离以及地电极28与分选口24的距离均为15μm。

上述激励电极27和地电极28均由液态金属浇灌微通道构成。具体来说，激励电极27包括激励电极进口271、激励电极通道272以及激励电极出口273，制作激励电极27时，从激励电极进口271通入液态金属，液态金属进入激励电极通道272，并从激励电极出口273排出气体。类似地，地电极28包括地电极进口281、地电极通道282以及地电极出口283，制作地电极28时，从地电极进口281通入液态金属，液态金属进入地电极通道282，并从地电极出口283排出气体。激励电极27和地电极28制作完成后，激励电极进口271或激励电极出口273通过导线连接高压电源，以提供分选脉冲；地电极进口281或地电极出口283也通过导线连接高压电源，以提供分选脉冲。

因而，分选细胞的过程大致为：样品细胞从进样口23进入，经过滤柱22过滤后进入主通道21，在主通道21内流经阻抗识别区域3，然后流向分选区域4。激励电极27和地电极28提供非均匀电场，产生介电泳力，因而样品细胞中的目标细胞在分选口24处选择流向目标出口26，样品细胞中的非目标细胞则在分选口24处选择流向废液出口25。

上述基底层1和微通道层2通过氧等离子对准键合而成，且均采用绝缘透明材料，以便实验进样观察。在本实施例中，基底层1采用厚度为3mm-6mm的玻璃，微通道层2采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

上述金属电极11、12、13和14采用lift-off工艺制成，铬作为黏附层，金作为导电层，厚度为2000A(埃米)。第一阻抗检测电极对31和第二阻抗检测电极对32之间的间距为10μm-100μm，且第一阻抗检测电极对31和第二阻抗检测电极对32的电极表面均覆盖有绝缘二氧化硅，保证电极与样品细胞非接触，有利于延长电极使用寿命，提高检测准确度。

微通道层2采用软光刻工艺制成，其中的微流控管道和分选电极的厚度均为10μm-25μm。相邻两个过滤柱22之间的最小间距为10μm-100μm，以防止较大颗粒进入通道造成堵塞。主通道21的位于阻抗识别区域3部分的厚度为10μm-25μm，这部分的高度和宽度应当满足使单个细胞能够通过阻抗识别区域3的条件。废液通道211的宽度应为收集通道212的宽度的1倍-2.5倍，以确保未施加分选信号的细胞不流向目标出口26。激励电极27和地电极28临近分选口24的部分为曲率较大的形状，以提供足够大的电场梯度。地电极28将激励电极27围住，用于最大程度地减少分选较强的电场对阻抗检测的影响。

基于上述微流控芯片，本发明还提供一种分选单细胞的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1，提供上述微流控芯片，如图3所示，将第一金属电极11连接至高频交流信号源(例如，幅值为5V，频率为100kHz)，第二金属电极12连接至锁相放大器5；将第三金属电极13连接至低频交流信号源(例如，幅值为5V，频率为1MHz)，第四金属电极14连接至锁相放大器5；将锁相放大器5连接至智能分析模块6，并将智能分析模块6连接至高压模块7，将高压模块7分别连接至激励电极27和地电极28。需要说明的是，也可将第一金属电极11连接至低频交流信号源，而将第三金属电极13连接至高频交流信号源；也可将第一金属电极11连接至锁相放大器5，而将第二金属电极12连接至高频或低频交流信号源。换句话说，位于主通道21一侧的两个金属电极分别连接至高频交流信号源和低频交流信号源，位于主通道21另一侧的两个金属电极均连接至锁相放大器5。其中，锁相放大器5用于放大金属电极产生的感应电流。

步骤S2，从进样口23用注射泵注入样品细胞8，样品细胞8经过滤柱22过滤后进入主通道21，在主通道21内流经阻抗识别区域3，激发与锁相放大器5连接的金属电极12、14产生感应电流。其中，样品细胞预先准备好，例如：培养H1975细胞，消化分散成单个细胞后，用PBS磷酸缓冲液和0.05％吐温20配置成的缓冲液重悬，摇匀备用。

步骤S3，锁相放大器5对金属电极12、14产生的感应电流进行放大，并将放大后的感应电流传输至智能分析模块6。

步骤S4，智能分析模块6接收放大后的感应电流，对样品细胞8的高低频阻抗参数进行分类，生成并输出分选触发信号。步骤S4具体包括：

步骤S41，对放大后的感应电流进行平滑滤波和事件提取，找出满足高斯拟合的峰形信号数据。样品细胞中的每个细胞均产生一个脉冲峰，因而需要将满足高斯拟合的峰形提取出来，以供后续处理。

其中，平滑滤波可采用均值滤波，公式为：

式中，s为滤波后的信号，x_i为滤波前的信号，N为信号点数。

事件提取采用高斯拟合算法，采用高斯函数：

式中，y为拟合后的信号，x为拟合前的信号，a、b、c为拟合出来的参数。

步骤S42，将满足高斯拟合的峰形信号数据作为训练数据输入至神经网络进行实时特征提取，获取样品细胞8的高低频阻抗参数以及特征提取的准确率。

如图4所示，实时特征提取的神经网络包括输入层、长短记忆层(LSTM)、全连接层和回归层。其中，输入层接收满足高斯拟合的峰形信号作为输入(一个满足高斯拟合的峰形对应一段序列)，输入序列的长度根据主通道21和两个支路211、212的几何形状以及样品细胞的流速确定，可完全捕获最长事件信号。LSTM层用于提取输入序列的特征，使用双曲正切函数实现激活。全连接层为一层卷积层，用于将LSTM层提取的特征进行组合。全连接层具有四个输出，每个输出对应一个细胞特征。细胞特征包括其直径、位置、速度以及不透明度，这四个特征即为细胞高低频阻抗参数。回归层(也称为输出层)，用于计算预测响应的半均方误差，以检验神经网络特征提取的准确率。

步骤S43，当特征提取的准确率达到预设阈值时，采用聚类算法对样品细胞8的高低频阻抗参数(即每个细胞的直径、位置、速度和不透明度)进行实时运算分类，划分出不同的细胞类别。人白细胞分类结果可参见图5。准确率的预设阈值可根据实验要求进行设定，例如，严格分选可设为95％，分选精度低一点可设为80％。

步骤S44，根据划分出的细胞类别，生成分选触发信号。具体来说，若目标细胞的类别属于划分出的细胞类别之一，则生成PWM波(调制脉宽波)，该PWM波即为分选触发信号。

步骤S5，高压模块7接收分选触发信号，并输出分选脉冲，分选脉冲传输至激励电极27和地电极28而产生非均匀电场，以使样品细胞8中的目标细胞在介电泳力的作用下流向目标出口26(或收集通道212)，非目标细胞流向废液出口25(或废液通道211)，可参见图6。

分选脉冲参数包括分选脉冲的幅值和时长，可根据实验中细胞受力偏转效果确定。在本实施例中，分选脉冲的幅值为100V，分选脉冲的时长为1ms-10ms。

本发明提供的一种分选单细胞的微流控芯片及检测方法，具有以下有益技术效果：

1)采用两对阻抗检测电极检测细胞的高低频阻抗参数和实时运动状态，有效提升下游实时特异性分选的效率。

2)检测电极与样品细胞非接触，避免电化学反应，有效减少测量误差及对细胞的损伤。

3)分选电极通过灌注液态金属制备，成本低，简便高效。

4)采用智能分析算法对细胞的阻抗特征实时提取并自动分类，极大地提高单细胞特异性分选的效率和准确性。

总之，本发明采用阻抗谱识别和介电泳分选的方式实现微流控芯片上流式检测分选，具有非标记、通量高、非接触的特点，检测和分选一体化设计，可以实时特异性地分选出不同种类的目的细胞，可应用在肿瘤细胞、干细胞、胎儿细胞研究等领域。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，包括：

基底层，所述基底层的上表面设有第一金属电极对、第二金属电极对以及阻抗识别区域，所述基底层在所述阻抗识别区域设有第一阻抗检测电极对和第二阻抗检测电极对，所述第一阻抗检测电极对与所述第一金属电极对连接，所述第二阻抗检测电极对与所述第二金属电极对连接；

微通道层，位于所述基底层上方，所述微通道层包括微流控管道和分选电极；所述微流控管道包括一主通道，所述主通道的一端通过若干过滤柱与一进样口连通，另一端则与一分选口连通，所述分选口分别与废液通道、收集通道连通，且所述废液通道与废液出口连通，所述收集通道与目标出口连通；所述分选电极包括激励电极以及包围所述激励电极的地电极，所述激励电极的一部分和所述地电极的一部分均临近所述分选口。

2.根据权利要求1所述的分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，所述基底层的上表面与所述微通道层的下表面紧密贴合。

3.根据权利要求1所述的分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，所述第一金属电极对包括第一金属电极和第二金属电极，第二金属电极对包括第三金属电极和第四金属电极，所述第一金属电极和所述第三金属电极位于所述主通道的一侧，所述第二金属电极和所述第四金属电极位于所述主通道的另一侧。

4.根据权利要求1所述的分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，所述第一阻抗检测电极对和所述第二阻抗检测电极对的中心均在所述主通道的轴线上。

5.根据权利要求1所述的分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，所述主通道的一部分、所述分选口、所述废液通道的一部分、所述收集通道的一部分以及所述激励电极和所述地电极临近所述分选口的部分共同形成为分选区域。

6.根据权利要求1所述的分选单细胞的微流控芯片，其特征在于，所述激励电极和所述地电极均由液态金属浇灌微通道构成。

7.一种分选单细胞的检测方法，其特征在于，包括：

步骤S1，提供如权利要求1-6所述的微流控芯片，将位于主通道一侧的两个金属电极分别连接至高频交流信号源和低频交流信号源，位于主通道另一侧的两个金属电极均连接至锁相放大器；将所述锁相放大器连接至智能分析模块，将所述智能分析模块连接至高压模块，将所述高压模块分别连接至激励电极和地电极；

步骤S2，从进样口注入样品细胞，样品细胞流经阻抗识别区域时，激发与所述锁相放大器连接的金属电极产生感应电流；

步骤S3，所述锁相放大器对所述感应电流进行放大，并将放大后的感应电流传输至所述智能分析模块；

步骤S4，所述智能分析模块接收放大后的感应电流，对样品细胞的高低频阻抗参数进行分类，生成并输出分选触发信号；

步骤S5，所述高压模块接收所述分选触发信号，并输出分选脉冲，所述分选脉冲传输至分选电极而产生非均匀电场，以使样品细胞中的目标细胞在介电泳力的作用下流向目标出口，非目标细胞流向废液出口。

8.根据权利要求7所述的分选单细胞的检测方法，其特征在于，所述步骤S4包括：

步骤S41，对放大后的感应电流进行平滑滤波和事件提取，找出满足高斯拟合的峰形信号数据；

步骤S42，将满足高斯拟合的峰形信号数据作为训练数据输入至神经网络进行实时特征提取，获取样品细胞的高低频阻抗参数以及特征提取的准确率；

步骤S43，当特征提取的准确率达到预设阈值时，采用聚类算法对样品细胞的高低频阻抗参数进行实时运算分类，划分出不同的细胞类别；

步骤S44，根据划分出的细胞类别，生成分选触发信号。

9.根据权利要求7所述的分选单细胞的检测方法，其特征在于，所述样品细胞的高低频阻抗参数包括直径、位置、速度以及不透明度。

10.根据权利要求8所述的分选单细胞的检测方法，其特征在于，所述神经网络包括：

输入层，设置为接收满足高斯拟合的峰形信号作为输入序列；

长短记忆层，设置为提取所述输入序列的特征；

全连接层，设置为将所述长短记忆层提取的特征进行组合，并输出样品细胞的高低频阻抗参数；

回归层，设置为计算预测响应的半均方误差，以检验神经网络特征提取的准确率。

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