JPWO2020149391A1 - 未分化細胞の分化抵抗性評価法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、分化細胞に未分化細胞が残存するか否かは、分化過程だけで無く、未分化iPS細胞の段階ですでに規定されていると考えられる。実際に、iPS細胞のクローンによって分化抵抗性があることが報告されており、分化抵抗性クローンに特徴的なメチル化や発現遺伝子も解析されている。
一方、本発明者らの研究から、分化能が高いiPS細胞クローンであっても継代を重ねることなどによって、分化能に変化が生じ、未分化iPS細胞が混入しやすくなる場合が有ることが明らかとなってきた。したがって、分化能が良好なクローンであっても、未分化iPS細胞混入リスクを日常的に評価することが重要である。
しかしながら、これまでに未分化iPS細胞の段階で分化細胞に未分化iPS細胞が混入する可能性を予測する手法は存在しなかった。
本発明は、未分化細胞の段階で、細胞が分化したときに未分化なままの細胞が残存/混入する可能性を予測する手法を提供することを目的とする。
その結果、ZNF354C, C12orf56, ZNF578, MIR886は未分化iPS細胞が残存しないiPS細胞において発現が有り、DPP6は未分化iPS細胞が残存するiPS細胞において発現することを見出した。さらに、メチル化解析に用いなかった別のiPS細胞クローンにおいても、これらクローンの分化細胞における未分化iPS細胞残存の有無と、今回同定した遺伝子の発現に相関が有ることが明らかとなった。
(1)下記の(i)及び/又は(ii)を測定することを含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
(2)ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する(1)記載の方法。
(3)DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する(1)記載の方法。
(4)ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い(メチル化状態が高いと発現(=プロモーター活性)が低いため)場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い(メチル化状態が高いと発現が低いため)場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する(1)記載の方法。
(5)DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する(1)記載の方法。
(6)未分化細胞が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する(1)〜(3)又は(6)のいずれかに記載の方法。
(8)遺伝子の発現レベルを測定する方法が、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析又はそれらの組み合わせである(7)記載の方法。
(9)遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定する方法が、メチル化 DNA を濃縮した後に、濃縮されたDNAを検出する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列を解読(シークエンス)する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列をハイブリダイゼーションにより検出する方法、メチル化特異的PCR(MSP)法、メチル化感受性の制限酵素による切断の有無で検出する方法、メチル化シトシンをグルコシル化し、グルコシル化シトシン感受性の酵素で検出する方法又はそれらの組み合わせである(1)、(4)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(10)未分化細胞集団における、下記の(i)及び/又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
(11)ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する(10)記載の方法。
(12)DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する(10)記載の方法。
(13)ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する(10)記載の方法。
(14)DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する(10)記載の方法。
(15)未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)株、胚性幹細胞(ES細胞)株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)株又は胚性生殖細胞(EG細胞)株である(10)〜(14)のいずれかに記載の方法。
(16)未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するために、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をマーカーとして使用する方法。
(17)下記の(i)及び/又は(ii)を測定可能な試薬を含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価するためのキット。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
(18)遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である(17)記載のキット。
(19)遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである(17)記載のキット。
(20)遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定可能な試薬が、バイサルファイト(亜硫酸水素塩)、メチル化解析用マイクロアレイ試薬、Sanger法によるシークエンス試薬、次世代シークエンサー用シークエンス試薬、5-mC抗体、5-hmC抗体、メチルアデノシン抗体、5’-methyl-2’-deoxycytidine抗体、HRP標識DNA抗体、5-hmC グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシル-5hmC感受性制限酵素エンドヌクレアーゼ、MBD1 (Methyl-CpG Binding Domain Protein1)、MBD2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein2)、特異的PCRプライマー、特異的プローブ又はDNA精製キットである(17)記載のキット。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019‐005892の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、1種類であってもよいし、2種類以上の組み合わせでもよい。
未分化細胞の分化抵抗性は、細胞株によって異なることが知られているが、継代回数、継代方法や継代時の細胞密度などの培養条件によって、変化する可能性がある。あるいは培養用基質や培地によっても変化する可能性がある。
分化抵抗性は、分化誘導後に一定の細胞数の分化細胞を再播種し、未分化培養条件下で培養し、増殖したコロニーを未分化マーカー(SOX2など)による免疫染色で、未分化iPS細胞であることを確認し、1コロニーを1個の未分化iPS細胞であるとして算出することで評価できる。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、1種類であってもよいし、2種類以上の組み合わせでもよい。
マーカーとして使用する遺伝子は、1種類であってもよいし、2種類以上の組み合わせでもよい。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、1種類であってもよいし、2種類以上の組み合わせでもよい。
未分化細胞の継代回数は、少なくとも1回以上であればよく、未分化細胞の分化抵抗性が高い場合の継代数は、40〜100が好ましく、未分化細胞の分化抵抗性が低い場合の継代数は8〜30が好ましい。iPS細胞は無限に増殖すると考えられているので継代数は何回でも無限でも可能である。
。
〔実施例1〕iPS細胞時点で未分化残存の評価が可能なマーカーの同定
目的
再生医療応用に資するiPS(ES)細胞由来分化細胞における未分化細胞の混入の検出および排除は、すべてのiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保における重要な課題である。これまでに網膜色素上皮細胞(RPE)におけるLIN28Aの発現検証による迅速な未分化細胞の混入評価が報告されているが、我々は複数の細胞加工製品においてLIN28Aでの評価が不適であることを見出している。また、製造の最終段階における品質評価では、その時点で規格外となった場合に、時間および経済的に多大な損失が生じるという問題があり、製造の遅れは時に患者の予後をも左右することも考えられる。
iPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保のため、最終製品の迅速・超高感度な評価手法の開発が必要である。さらに時間的、経済的観点から製造のより早い段階すなわち、未分化iPS細胞の段階で未分化細胞が最終製品に残存する可能性を予測することが望まれる。
そこで本発明では未分化iPS細胞の段階で最終製品に残存する可能性を予測することが可能な評価手法を開発した。
これまでにiPS細胞から分化誘導した三胚葉いずれの分化細胞においても利用可能な、汎用性の高い未分化マーカーを同定している(「未分化細胞検出法」(特願2018-115025))。この研究の中で継代回数が長いiPS細胞において未分化残存が起こりやすいクローンを同定している。さらに、この未分化残存の起こりやすさはジェネティックな変異(遺伝子変異)ではなく、エピジェティックな修飾であることを強く示唆するデータを得た。そこで、未分化残存が起こりやすいiPS細胞クローンと未分化残存が起こりにくいiPS細胞クローンのDNAメチル化状態に違いがある遺伝子を抽出し、さらに定量PCRにより発現と未分化残存に相関がある遺伝子(MIR886(VTRNA2-1)、DPP6、ZNF578、C12orf56、ZNF354C)を抽出した。
[分化抵抗性評価のための未分化残存試験]
ヒトiPS細胞から肝細胞を分化誘導し、iPS細胞肝芽の作製に最適なタイミングで胚体内胚葉(DE)の2-6日後(HEとする)にPLoS One. 2014 Oct 27;9(10):e110496に記載の方法を一部改変し、ディッシュコーティング剤としてLaminin511E8(iMatrix,ニッピ)、培養培地としてStemFitを用いて1週間培養し、出現したコロニーをSOX2, TRA1-60などの未分化iPS細胞マーカーで免疫染色することにより、出現したコロニーが未分化iPS細胞コロニーであることを確認する。未分化コロニー1つは分化細胞に含まれる未分化iPS細胞1細胞より形成されたコロニーとして、分化細胞に含まれる未分化iPS細胞の細胞数を評価する。
ヒトiPS細胞から肝細胞の分化誘導はNature. 499(7459):481-4.(2013); Cell Rep. 21(10):2661-2670.(2017)、に記載の通りに行った。
[メチル化解析]
メチル化解析は各分化段階の細胞のDNA について、バイサルファイト処理実施後、イルミナ社Infinium MethylationEPIC BeadChip Kit を用いて、DNA メチル化解析を行った。
[発現定量評価]
定量PCRはNature. 499(7459):481-4.(2013); Cell Rep. 21(10):2661-2670.(2017)、に記載の通りに行った。
各マーカー遺伝子の発現量と、再培養法にて評価した肝内胚葉細胞(HE)での残存未分化iPS細胞数の相関を図1に示す。未分化残存しやすい株では、再培養法で未分化iPS細胞の残存が見られ、未分化残存し難い株では、未分化iPS細胞の残存が検出されない。各マーカー遺伝子は未分化残存した時(未分化残存し難い株)と未分化残存しなかった時(未分化残存しやすい株)の間で明確な発現の違いが有る。すなわち、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886では、未分化残存が無い場合に、未分化残存が有る場合に比べ、遺伝子発現が高く、一方DPP6では、未分化残存が無い場合に、未分化残存が有る場合に比べ、遺伝子発現が低い。
・iPS細胞はクローンの特性によるもの以外に、培養状態(継代回数など)によって、分化細胞に未分化iPS細胞が残存する場合が有る。
・継代回数の増加によって生じる未分化iPS細胞が残存しやすいiPS細胞はエピジェネティックな変化によって生じる。
・メチル化変異によって遺伝子発現が変化し、未分化iPS細胞の残存しやすさと相関する遺伝子を同定した。この遺伝子は、iPS細胞の段階で分化細胞における未分化iPS細胞の残存のしやすさを類推するマーカーとなる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (20)
- 下記の(i)及び/又は(ii)を測定することを含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態 - ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する請求項1記載の方法。
- DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する請求項1記載の方法。
- ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する請求項1記載の方法。
- DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する請求項1記載の方法。
- 未分化細胞が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する請求項1〜3又は6のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルを測定する方法が、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析又はそれらの組み合わせである請求項7記載の方法。
- 遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定する方法が、メチル化 DNA を濃縮した後に、濃縮されたDNAを検出する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列を解読(シークエンス)する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列をハイブリダイゼーションにより検出する方法、メチル化特異的PCR(MSP)法、メチル化感受性の制限酵素による切断の有無で検出する方法、メチル化シトシンをグルコシル化し、グルコシル化シトシン感受性の酵素で検出する方法又はそれらの組み合わせである請求項1、4〜6のいずれかに記載の方法。
- 未分化細胞集団における、下記の(i)及び/又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態 - ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する請求項10記載の方法。
- DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6の発現レベル及び/又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する請求項10記載の方法。
- ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する請求項10記載の方法。
- DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する請求項10記載の方法。
- 未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)株、胚性幹細胞(ES細胞)株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)株又は胚性生殖細胞(EG細胞)株である請求項10〜14のいずれかに記載の方法。
- 未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するために、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をマーカーとして使用する方法。
- 下記の(i)及び/又は(ii)を測定可能な試薬を含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価するためのキット。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態 - 遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である請求項17記載のキット。
- 遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである請求項17記載のキット。
- 遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定可能な試薬が、バイサルファイト(亜硫酸水素塩)、メチル化解析用マイクロアレイ試薬、Sanger法によるシークエンス試薬、次世代シークエンサー用シークエンス試薬、5-mC抗体、5-hmC抗体、メチルアデノシン抗体、5’-methyl-2’-deoxycytidine抗体、HRP標識DNA抗体、5-hmC グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシル-5hmC感受性制限酵素エンドヌクレアーゼ、MBD1 (Methyl-CpG Binding Domain Protein1)、MBD2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein2)、特異的PCRプライマー、特異的プローブ又はDNA精製キットである請求項17記載のキット。
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