JP7041934B2 - 未分化細胞検出法 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Description
1. 未分化iPS細胞で特異的に発現している。
2. 未分化iPS細胞以外の他の細胞系譜での発現が極めて低いこと。
というだけでは不十分で、これに加え
3. 未分化iPS細胞で極めて高く発現していることが、分化細胞中にごく少数存在しても検出可能にするために必要であることを基準とした。
(1)分化細胞集団における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
(2)未分化細胞が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)であり、分化細胞集団が前記未分化細胞から分化した細胞の集団である(1)記載の方法。
(3)分化細胞集団が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞の集団である(1)又は(2)に記載の方法。
(4)内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である(3)記載の方法。
(5)遺伝子の発現レベルをmRNAを含むRNAの量又はタンパク質の量として測定する(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、等温核酸増幅法、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する(1)~(5)のいずれかに記載の方法。
(7)未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することによって、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法。
(8)未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)株、胚性幹細胞(ES細胞)株、人工多能性幹細胞(iPS細胞又はiPSC)株又は胚性生殖細胞(EG細胞)株である(7)記載の方法。
(9)未分化細胞株がiPS細胞株である(8)記載の方法。
(10)分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
(11)分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
(12)LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び/又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキット。
(13)遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である(12)記載のキット。
(14)遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである(12)記載のキット。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019‐207002の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
〔実施例1〕
Materials and Methods
●iPSC
京都大学および東京大学から提供されたものを使用した(TkDA3-4,1231A3,1383D2,1383D6およびFf01)。
●未分化残存
iPSCから分化させた細胞中に残存している未分化細胞を定量するため、我々はTano et al.の方法を応用した。簡潔にまとめると、まず分化させた細胞をトリプシンを用いて剥がし、24-well plateにおいてROCK inhibitor入りStemFit中に1.6x10^5 cells/wellで播種後、毎日StemFitで培地交換しながら37℃で培養した。一週間後、免疫染色を行い、ポジティブなコロニーの数をカウントした。
●コロニーカウント
免疫染色したサンプルを顕微鏡で写真撮影し、撮影した写真について目視でコロニー数を数えた。未分化iPSCコロニー1コロニーを1つの未分化iPS細胞由来として残存未分化iPS細胞数とした。
●Hepatocyte分化
未分化iPS細胞をラミニンコートディッシュにROCK阻害剤(Y-27632)存在下で5~10x10^4 cells/cm2の密度で播種し、RPMI+B27+アクチビンA+Wnt3A存在下で6日間培養し、この細胞を胚体内胚葉細胞(DE)とした。さらにKO-DMEM+KSR+DMSO+2-Mercaptoethanol存在下で4日間培養し肝内胚葉細胞(HE)とした。
●免疫染色
未分化細胞を検出するため、多能性マーカーの一次抗体SOX2, TRA-1-60 (Cell Signaling Technologies)とそれに対応する二次抗体(Thermo Fisher Scientific)を用いて免疫染色を行った。4%パラホルムアルデヒドを15分間処理することで細胞を固定した。PBSで2回洗浄後、0.1% TritonX-100 in PBS (PBST)を加えて10分間処理することで細胞膜を透過させた。その後5% FBS in PBSTを用いてブロッキング処理した。1時間後ブロッキングバッファーを取り除き、適切に希釈した一次抗体溶液を添加して4℃でovernight処理した。その後PBSで3回洗浄し、希釈した二次抗体溶液を添加して遮光下室温で1時間静置した。最後にPBSで3回洗浄し、アパチ封入剤(和光純薬)を添加して観察に用いた。
●顕微鏡(キーエンスなど)
オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X710にて明視野、青色蛍光、緑色蛍光、赤色蛍光を対物レンズ4倍、10倍で1well全体を撮影した。
●qPCR
細胞よりPureLink RNA Mini Kit(Thermo FIsher)を用いてmRNAを含むRNA抽出を行い、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher)を用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、下記のプライマーおよびUniversal Probe Library(Roche)を用いてqPCRを行った。PRDM14については、第1-2エクソンジャンクション間、第2-3エクソンジャンクション間、第4-5エクソンジャンクション間、第6-7エクソンジャンクション間の計4種類の領域において、それぞれプライマーを設計した。これは、多能性幹細胞から目的の分化細胞に分化誘導する過程において、細胞の分化段階によってmRNAを含むRNAの転写開始点が変化すること、スプライシングにより異なるエクソンジャンクション構造が生じうること、RNAの部分分解産物が生じ蓄積しうることなどを考慮し、プライマー設計位置によって未分化細胞の検出感度やその精度が変化しうると考えたためである。
LINC00678
Forward: catctcaccaattttaaatcaggac(配列番号1)
Reverse: ctcccgtcattctgctaacac(配列番号2)
Probe: #17
PRDM14 E1-2
Forward: gctcttggaggtggtgtcg(配列番号3)
Reverse: gccggaaaggttggaagtc(配列番号4)
Probe: #64
PRDM14 E2-3Forward: tgcaccatgcgatttcag(配列番号5)
Reverse: tgcatgaggcatagaccttc(配列番号6)
Probe: #79
PRDM14 E4-5
Forward: gacaattctgtgatgtgggag(配列番号7)
Reverse: tgacactgcacagcaactagg(配列番号8)
Probe: #68
PRDM14 E6-7
Forward: ggcttcggatccacattc(配列番号9)
Reverse: agtggactcgcatgtgtttg(配列番号10)
Probe: #11
●スパイク実験
分化誘導した細胞に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を図に記載の比率で混入し、未分化残存試験、qPCR、qPCR反応後の増幅産物のゲル電気泳動等を実施した。
●統計
Student's t検定によりp値0.05以下を有意差有りとした。相関係数はピアソンの積相関係数に基づき算出した。
・肝臓ではLIN28は未分化iPSCの指標とならない。
LIN28(LIN28A)遺伝子はiPSCから網膜色素上皮細胞(RPE)を分化誘導した際の残存未分化iPSCの指標となることが報告されている(Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012))。マウス発生段階の肝臓でのLIN28Aの発現を見ると、成体(8w)と比べE13.5まで発現が高いことが明らかとなった(図1)。内胚葉細胞であるiPS細胞由来の胚体内胚葉細胞(DE)および肝内胚葉細胞(HE)においても未分化iPS細胞と比べほとんど減少が見られないことが明らかとなった(図2)。
・iPS細胞で特異的に高発現する遺伝子の抽出
iPS細胞由来肝細胞において利用可能な残存未分化iPSCの指標となるマーカー遺伝子の抽出を目的に、マウス発生段階のマイクロアレイ解析およびiPS細胞由来肝細胞の分化誘導過程のシングルセルRNAシークエンス解析、RNAシークエンスデータに基づく刺身プロットの解析を実施し、未分化iPS細胞で特異的かつ高発現しており、分化細胞において発現が低い遺伝子を30遺伝子以上抽出した。抽出した遺伝子についてqPCRによりiPS細胞で発現が高く、分化細胞で発現が低下する遺伝子としてLINC00678及びPRDM14を抽出した(図3)。なお、たとえトランスクリプトーム解析で有望と思われた候補遺伝子であっても、qPCRを実施すると、大半の遺伝子はiPS細胞での発現が低い、分化細胞での発現が高いなどの問題があり、有用なマーカーではなかった。
・各マーカー遺伝子の検出限界の検討(未分化iPSCスパイク試験)
分化誘導したiPS細胞由来肝前駆細胞(HE)に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を記載の比率で混入し、qPCRを実施した(図4)。その結果、未分化iPS細胞の残存/混入を0.025%まで検出可能であった。
・STEMdiffTM Trilineage Differentiation Kitにより作製した分化細胞における未分化残存試験
さらに汎用的にiPS細胞由来の分化誘導細胞における残存未分化細胞のマーカーとなることを示すために、市販の分化誘導キット(Stem Cell Technologies社STEMdiff Trilineage Differentiation Kit)を用いて分化誘導した細胞を用いて検討した(図5)。その結果、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞では残存未分化細胞が観察されたが、マーカー遺伝子発現も残存数に相関して高かった。したがって、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞のいずれの細胞系譜においても残存未分化細胞数とマーカー発現の相関が見られた(図6、7)。
再生医療応用に資するiPS(ES)細胞由来分化細胞における未分化細胞の混入の検出および排除は、すべてのiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保における重要な課題である。これまでに網膜色素上皮細胞(RPE)におけるLIN28Aの発現検証による迅速な未分化細胞の混入評価が報告されているが、肝臓においてはマウス発生過程においてLIN28Aが発現しており、実際にヒトiPS細胞から分化誘導した細胞においてもLIN28Aの発現が観察され、またこの発現が実際に分化細胞中に残存する未分化細胞の有無と相関しないことが明らかとなった。そこで、iPS細胞由来肝細胞における残存未分化細胞のマーカーとして、LINC00678及びPRDM14を抽出した。今回抽出した複数のマーカー遺伝子を用いた残存未分化iPS細胞の検出手法が、様々なiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保のための簡便・迅速なツールとなると期待される。
・Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012)
・Tano et al., PLoS One. 2014 27;9(10):e110496.
本発明のマーカー遺伝子の発現レベルを測定する方法として、等温核酸増幅法の検討を行った。等温核酸増幅法としてLAMP法を用い、LINC00678遺伝子に由来するRNA構造を増幅及び検出するRT-LAMP法を設計した。設計したRT-LAMP法プライマーセット及びプローブの塩基配列は以下の通りであり、プローブは蛍光標識したものを用いた。RT-LAMPの反応組成は、図8に示す。
F3: gacgggagtgtgagatcc(配列番号11)
B3: acatcttctcctgaatcctcag(配列番号12)
FIP: ttggaaatagttctcggttgctctccacatggcgaggcac(配列番号13)
BIP: tggtcaggtggagtaaaacataaggagacacctccatgctgtc(配列番号14)
LoopF: caagaagaaaacaggttcctgg(配列番号15)
LoopB: ggttcaaagcatgaaaaaaattgg(配列番号16)
Probe: ccttcactttgagccaggcaatggtcag(配列番号17)
実施例1の記載の、iPS細胞由来肝前駆細胞(HE)への未分化維持培養しているiPS細胞を段階的に混入した試料を用いて、RT-LAMPを実施した。その結果、RT-LAMPでも検出可能であり、同時に試験したqRT-PCRよりも高い感度を示した(図9)。
本発明のマーカー遺伝子の発現制御に関わるプロモーター領域の制御下にレポータータンパク質遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子、あるいはマウスCD4遺伝子など細胞表面に発現し抗体等を用いて特異的に発現検出可能な遺伝子など)を組み込むことにより、本発明のマーカー遺伝子の発現を直接検出しなくても残存する未分化細胞を検出することが可能となる。
複数のiPS細胞株について目的の細胞および、3胚葉分化誘導キットなどを用いて分化誘導した細胞について本発明のマーカー遺伝子の発現を評価し、マーカー遺伝子の発現が低くなるiPS細胞株を選別することによって安全性が高い未分化細胞株を選別することが可能となる。
分化細胞をモデル動物へ長期移植して生着している細胞を採取し、本発明のマーカー遺伝子の発現をqPCRや等温増幅法(LAMP法など)等により検出あるいは〔実施例3〕に記載の方法によって検出することにより、形成された組織における未分化細胞を検出する。
実施例1と同様の方法で、中胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した横中隔間充織細胞(iPSC-STM/MC)(Cell Rep. 21:2661-2670.(2017))および血管内皮細胞(iPSC-EC) (Cell Rep. 21:2661-2670.(2017))における未分化iPS細胞の残存試験及びqPCRを用いたマーカー遺伝子の発現を検討した。iPSC-STM/MCおよびiPSC-ECどちらにおいてもESRG、LINC00678及びPRDM14が未分化細胞が残存していない分化細胞において減少しており、残存未分化マーカーとして使用できると考えられた(図10,11)。
また、外胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した神経堤細胞(NCC)(Menendez L. et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 108(48):19240-5. 2011)のqPCRによる測定でも、同様の結果が得られた(図12)。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
プライマーのDNA配列を示す。
<配列番号17>
プローブのDNA配列を示す。
Claims (14)
- 分化細胞集団における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
- 未分化細胞が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)であり、分化細胞集団が前記未分化細胞から分化した細胞の集団である請求項1記載の方法。
- 分化細胞集団が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞の集団である請求項1又は2に記載の方法。
- 内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である請求項3記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルをmRNAを含むRNAの量又はタンパク質の量として測定する請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、等温核酸増幅法、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することによって、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法。
- 未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)株、胚性幹細胞(ES細胞)株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)株又は胚性生殖細胞(EG細胞)株である請求項7記載の方法。
- 未分化細胞株がiPS細胞株である請求項8記載の方法。
- 分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
- 分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
- LINC00678及びPRDM14よりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び/又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキット。
- 遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である請求項12記載のキット。
- 遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである請求項12記載のキット。
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