KR101381319B1

KR101381319B1 - 간세포 분화 탐지용 ｄｎａ 메틸화 마커 및 이를 이용한 탐지 방법

Info

Publication number: KR101381319B1
Application number: KR1020110031848A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 김미랑; 강태욱; 김선영; 이한철
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2014-04-04
Also published as: KR20120114084A

Abstract

본 발명은 간세포 분화 탐지용 DNA 메틸화 마커 및 이를 이용한 탐지 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 간세포 분화 탐지용 DNA 메틸화 마커가 집적된 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 사용하여 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계를 판별하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진하는 물질을 스크리닝 할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마커를 탈메틸화 시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

Description

간세포 분화 탐지용 ＤＮＡ 메틸화 마커 및 이를 이용한 탐지 방법{DNA methylation markers for detecting hepatogenesis and a method for detecting using the same}

본 발명은 간세포 분화 탐지용 DNA 메틸화 마커 및 이를 이용한 탐지 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 간세포 분화 탐지용 DNA 메틸화 마커가 집적된 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법에 관한 것이다.

인간 배아 줄기 세포(embrynic stem cells, ES)로부터 간세포(hepatocytes)로 분화시키는 것은 재생 의약 및 시험관 내 의약 시험을 위해 간세포의 다른 원료로 생각된다. 간은 놀라운 재생 가능성을 갖지만, 재생은 만성 간 질환에서는 결국 실패한다. 간 질환의 마지막 단계를 위해서는 간 이식이 유일한 효과적 치료법이다(Kung JW et al ., Curr Opin Biotechnol 2009;20:568-574). 현재 줄기-세포 기술은 배아 줄기 세포(ES)-유래된 간세포를 사용하는 것이 간 질환을 치료하는 대체적인 전략이 될 수 있다는 것을 보여준다(Ogawa S. et al ., Surg Today 2009;39:1019-1025). 게다가, 간은 인체에서 해독을 하는 주요 기관이다. 따라서, 배아 줄기 세포(ES)-유래된 간세포는 또한 독성학 연구 및 의약 대사 실험에도 유용할 수 있다(Rogiers V. et al ., Methods Mol Biol 1998;107:279-294).

최근, 몇몇 그룹들이 간세포로의 배아 줄기 세포(ES)의 분화를 보고하였다(Cai J. et al ., Hepatology 2007;45:1229-1239; Touboul T. et al ., Hepatology 2010;51:1754-1765; Schwartz RE. et al ., Stem Cells Dev 2005;14:643-655; Hay DC. et al ., Stem Cells 2008;26:894-902). Cai et al .은 시험관 내 간세포로의 분화는 3 단계로 이루어진다는 것을 보고하였다; 첫 번째로 배아 줄기 세포(ES)는 내배엽 전구체(endoderm progenitor, EP)로 분화되고, 그 후에 초기 간 세포(early hepatic cells)로 분화되며, 최종적으로 성숙한 간세포(mature hepatocytes, MH)로 분화된다(Cai J. et al ., Hepatology 2007;45:1229-1239). 간 질환에서 배아 줄기 세포(ES)의 임상적 적용을 위해서는, 분화의 명확하고 효과적인 프로토콜이 요구되지만, 분화의 각 단계를 구별하는데 사용되는 마커가 한정되어 있다(Kung JW. et al ., Curr Opin Biotechnol 2009;20:568-574).

시험관 내 간생성의 발생학적 계통을 이해하는 것은 발생생물학뿐만 아니라 간 질환의 치료에도 중요하다. DNA 메틸화 및 히스톤 변형을 포함하는, 후성적 조절은 배아 줄기 세포(ES) 분화에 주요한 역할을 한다(Reik W. et al ., Nature 2007;447:425-432). DNA 메틸화의 게놈-범위 리프로그래밍(reprogramming)이 초기 생식 세포 발생에서 일어난다. 부모로부터 온 게놈은 수정 후 능동적인 DNA 탈메틸화를 거치고, 복제-의존적인 수동적인 탈메틸화가 착상 전 배아에서 일어난다. 착상에 의하여, DNA 메틸전이효소(methyltransferases)가 활성화되고, DNA 메틸화 수준은 빠르게 증가된다(Seki Y.et al ., Dev Biol 2005;278:440-458). 배아 줄기 세포(ES)는 배반포(blastocyst) 단계에서 배아의 내배엽(inner cell mass)으로 부터 유개되고, 그것은 DNA 메틸화를 포함하는 후성적 활성이 높은 수준으로 나타나는 특징이 있다(Keller G.et al . Genes Dev 2005;19:1129-1155).

전형적으로, DNA 메틸화 연구는 근위 프로모터 영역(proximal promoter regions)에 초점이 맞추어져 왔다. 많은 단일-유전자(single-gene) 연구들은 프로모터 메틸화가 하류의 유전자의 불활성된 전사와 연관된다는 것을 보여주었다. 그러나, 프로모터들의 한정된 숫자들만이 계통-특이적인 DNA 메틸화를 보인다(Mohn F. et al ., Mol Cell 2008;30:755-766). 최근, 게놈-범위의 DNA 메틸화 연구들은 프로모터-원위 영역(promoter-distal regions)에서의 DNA 메틸화가 발생 과정 동안에 광범위하게 바뀐다는 것으로 알려져 있다(Meissner A. et al ., Nature 2008;454:766-770; Schmidl C. et al ., Genome Res 2009;19:1165-1174).

이에 본 발명자들은 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)의 3 분화단계에서 게놈-범위의 DNA 메틸화 및 유전자 발현을 분석하기 위한 마이크로어레이를 사용하여, 16개의 배아 줄기 세포(ES)-특이적, 11개의 내배엽 전구체(EP)-특이적, 및 40개의 성숙한 간세포(MH)-특이적 DNA 메틸화 마커들을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 시험관 내 간세포로 분화하는 동안 DNA 메틸화의 전체-게놈 모습을 제공하기 위하여 메틸화된 DNA 결합 도메인 서열분석(methylated DNA binding domain sequencing, MBD-seq)을 사용하였다.

본 발명의 목적은 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 인간 줄기 세포로부터 간세포로의 분화를 촉진하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

POU5F1(POU class 5 homeobox 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002701), DPPA2(developmental pluripotency associated 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_138815), DPEP3(dipeptidase 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022357), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_016582), USP44(ubiquitin specific peptidase 44, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032147), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003106), MT1F(metallothionein 1F, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005949), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004378), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), VGF(VGF nerve growth factor inducible, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), SFRP2(secreted frizzled related protein 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_016354), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005378), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003577), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005769), PRDM14(PR domain containing 14, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_024504), MT1G(metallothionein 1G, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005950), CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005454), GATA4(GATA binding protein 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_077531), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031944), LEFTY1(left-right determination factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_020997), VWF(von Willebrand factor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000552), NODAL(nodal homolog (mouse), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018055), DLX5(distal-less homeobox 5, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_007933), FOXC1(forkhead box C1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001453), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022055), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022454), LEFTY2(left-right determination factor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003240), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001085), AGT(angiotensinogen, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000029), AFP(alpha-fetoprotein, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001134), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004617), APOA4(apolipoprotein A-IV, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000482), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003122), KNG1(kininogen 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000893), CFH(complement factor H, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000186), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000689), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_013279), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007256), RIN2(Ras and Rab interactor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018993), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_014467), FGG(fibrinogen gamma chain, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000509), VTN(vitronectin, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000638), KLB(klotho beta, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_175737), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_011520), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032607), DEFB1(defensin, beta 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005218), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022094), ANGPTL6(angiopoietin-like 6, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031917), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_006063), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001078), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005211), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003937), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003167), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005855), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005651), AQP10(aquaporin 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_080429), CTSE(cathepsin E, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001910), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003064), APOC2(apolipoprotein C-II, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000483), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005410), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001343), TFF1(trefoil factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003225), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002242), FMO1(flavin containing monooxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002021), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002153), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000302) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_025130).

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법을 제공한다;

⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;

⑵ 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현량 을 측정하는 단계:

POU5F1(POU class 5 homeobox 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002701), DPPA2(developmental pluripotency associated 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_138815), DPEP3(dipeptidase 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022357), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_016582), USP44(ubiquitin specific peptidase 44, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032147), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003106), MT1F(metallothionein 1F, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005949), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004378), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), VGF(VGF nerve growth factor inducible, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), SFRP2(secreted frizzled related protein 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_016354), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005378), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003577), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005769), PRDM14(PR domain containing 14, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_024504), MT1G(metallothionein 1G, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005950), CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005454), GATA4(GATA binding protein 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_077531), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031944), LEFTY1(left-right determination factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_020997), VWF(von Willebrand factor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000552), NODAL(nodal homolog (mouse), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018055), DLX5(distal-less homeobox 5, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_007933), FOXC1(forkhead box C1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001453), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022055), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022454), LEFTY2(left-right determination factor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003240), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001085), AGT(angiotensinogen, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000029), AFP(alpha-fetoprotein, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001134), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004617), APOA4(apolipoprotein A-IV, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000482), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003122), KNG1(kininogen 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000893), CFH(complement factor H, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000186), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000689), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_013279), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007256), RIN2(Ras and Rab interactor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018993), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_014467), FGG(fibrinogen gamma chain, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000509), VTN(vitronectin, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000638), KLB(klotho beta, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_175737), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_011520), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032607), DEFB1(defensin, beta 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005218), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022094), ANGPTL6(angiopoietin-like 6, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031917), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_006063), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001078), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005211), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003937), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003167), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005855), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005651), AQP10(aquaporin 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_080429), CTSE(cathepsin E, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001910), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003064), APOC2(apolipoprotein C-II, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000483), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005410), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001343), TFF1(trefoil factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003225), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002242), FMO1(flavin containing monooxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002021), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002153), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000302) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_025130).; 및

⑶ 하기 ⒜의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 배아 줄기 세포-특이적으로 유전자의 발현량이 증가하면 미분화 단계인 것으로 판별하고, 하기 ⒝의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 내배엽 전구체-특이적으로 유전자의 발현량이 증가하면 분화 중인 단계인 것으로 판별하며, 또는 하기 ⒞의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 성숙한 간세포-특이적으로 유전자의 발현량이 증가하면 간세포로 분화한 단계인 것으로 판별하는 단계:

⒜ POU5F1(POU class 5 homeobox 1), DPPA2(developmental pluripotency associated 2), DPEP3(dipeptidase 3), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3), USP44(ubiquitin specific peptidase 44), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), MT1F(metallothionein 1F), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1), VGF(VGF nerve growth factor inducible), SFRP2(secreted frizzled related protein 2), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4), PRDM14(PR domain containing 14) 및 MT1G(metallothionein 1G),

⒝ CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)), GATA4(GATA binding protein 4), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)), LEFTY1(left-right determination factor 1), VWF(von Willebrand factor), NODAL(nodal homolog (mouse)), DLX5(distal-less homeobox 5), FOXC1(forkhead box C1), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17) 및 LEFTY2(left-right determination factor 2),

⒞ SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3), AGT(angiotensinogen), AFP(alpha-fetoprotein), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4), APOA4(apolipoprotein A-IV), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), KNG1(kininogen 1), CFH(complement factor H), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1), RIN2(Ras and Rab interactor 2), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2), FGG(fibrinogen gamma chain), VTN(vitronectin), KLB(klotho beta), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3), DEFB1(defensin, beta 1), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), ANGPTL6(angiopoietin-like 6), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase)), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase), AQP10(aquaporin 10), CTSE(cathepsin E), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), APOC2(apolipoprotein C-II), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila)), TFF1(trefoil factor 1), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13), FMO1(flavin containing monooxygenase 1), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1).

⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;

⑵ 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 DNA 탈메틸화를 측정하는 단계:

⑶ 하기 ⒜의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 배아 줄기 세포-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 미분화 단계인 것으로 판별하고, 하기 ⒝의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 내배엽 전구체-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 분화 중인 단계인 것으로 판별하며, 또는 하기 ⒞의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 성숙한 간세포-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 간세포로 분화한 단계인 것으로 판별하는 단계:

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화를 촉진하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다;

⑴ 제 1항의 마이크로어레이 칩에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;

⑵ 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현량 또는 DNA 탈메틸화를 측정하는 단계; 및

⑶ 단계 ⑵의 내배엽 전구체-특이적 유전자 또는 성숙한 간세포-특이적 유전자의 발현량을 증가시키거나, 또는 내배엽 전구체-특이적 유전자 또는 성숙한 간세포-특이적 유전자를 DNA 탈메틸화시키는 피검 화합물 또는 조성물을 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화를 촉진하는 후보 물질로 판정하는 단계.

본 발명의 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 사용하여 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계를 판별하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진하는 물질을 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마커를 탈메틸화 시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

도 1은 시험관 내(in vitro) 간생성하는 동안에 전사체(transcriptome) 및 메틸화체(methylome)의 프로파일링을 나타내는 그림이다.
(A) 인간 배아줄기세포(ES)는 내배엽 전구체(EP)로, 더 나아가 성숙한 간세포(MH)으로 분화되었다. 각 단계의 세포 형태와 면역형광 염색을 보여준다. POU5F1는 배아 줄기 세포(ES)에서 염색되고, SOX17는 내배엽 전구체(EP)에서 염색되며, 그리고 AFP는 성숙한 간세포(MH)에서 염색된다.
(B) 전체-게놈 발현 비드칩(Whole-Genome Expression BeadChip)에 의한 전사체(transcriptome) 분석 및 인피니엄 인간메틸화27 비드칩(Infinium HumanMethylation27 BeadChip) 및 MBD 서열분석 모두에 의한 메틸화체(methylome) 분석이다.
도 2는 클러스터 1(A)의 67 유전자들, 클러스터 2(B)의 83 유전자들, 및 클러스터 1(C)의 375 유전자들에 대한 유전자 온톨로지 분석을 나타내는 그림이다. DAVID 기능적 주석달기 클러스터링 도구가 유전자 온톨로지 분석에 사용되었다.
도 3은 배아 줄기 세포(ES)-, 내배엽 전구체(EP)-, 및 성숙한 간세포(MH)-특이적 발현을 갖는 유전자들의 클러스터를 나타내는 그림이다.
(A) 3 분화 상태에서의 배아 줄기 세포(ES) 마커(POU5F1, SOX2, 및 NANOG), 내배엽 전구체(EP) 마커(SOX17, FOXA2, 및 GATA4), 및 성숙한 간세포(MH) 마커(ALB, AFP, 및 SERPINA1)의 qRTPCR 분석이다.
(B) 클러스터 1 (배아 줄기 세포(ES)-특이적 발현 유전자들), 클러스터 2 (내배엽 전구체(EP)-특이적 발현 유전자들), 및 클러스터 3 (성숙한 간세포(MH)-특이적 발현 유전자들). 각 분화 단계에서 잘 알려진 마커들과 공동-발현된 유전자들은 클러스터하고 MultiExperiment Viewer로 보여진다.
도 4는 배아 줄기 세포(ES)-특이적 발현 및 탈메틸화를 갖는 유전자들을 나타내는 그림이다.
(A) 마이크로어레이 데이타로부터 16개의 배아 줄기 세포(ES)-특이적 마커들의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 수준이다.
(B) qRT-PCR로 배아 줄기 세포(ES)-특이적 마커들에 대한 발현 마이크로어레이의 확인이다.
(C) 파이로서열분석(pyrosequencing)으로 배아 줄기 세포(ES)-특이적 마커들에 대한 발현 마이크로어레이 메틸화의 확인이다. 10-kb 창(window)에서의 CpG 위치들을 제공한다. 메틸화 비드칩 어레이에서 표적 CpG 위치는 검정 삼각형으로 표시된 것처럼 10-kb 창의 가운데에 위치한다.
도 5는 내배엽 전구체(EP)-특이적 발현 및 탈메틸화를 갖는 유전자들을 나타내는 그림이다.
(A) 마이크로어레이 데이타로부터 11개의 내배엽 전구체(EP)-특이적 마커들의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 수준이다.
(B) qRT-PCR로 마이크로어레이 발현의 확인이다.
(C) 파이로서열분석(pyrosequencing)으로 마이크로어레이 메틸화의 확인이다.
도 6은 성숙한 간세포(MH)--특이적 발현 및 탈메틸화를 갖는 유전자들을 나타내는 그림이다.
(A) 마이크로어레이 데이타로부터 40개의 성숙한 간세포(MH)-특이적 마커들의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 수준이다.
(B) qRT-PCR로 마이크로어레이 발현의 확인이다.
(C) 파이로서열분석(pyrosequencing)으로 마이크로어레이 메틸화의 확인이다.
도 7은 시험관 내 간세포로 분화하는 동안 게놈-규모의 DNA 메틸화 변화를 나타내는 그림이다.
(A) 배아 줄기 세포(ES) 대 내배엽 전구체(EP) 및 내배엽 전구체(EP) 대 성숙한 간세포(MH)에서 인간 게놈의 모든 200-bp 단편(총 15,399,219 단편)에 대한 DNA 메틸화 값을 비교하는 스캐터 플롯(Scatter plots)을 나타낸 그림이다. 과메틸화(빨강)은 메틸화가 2-배 증가한 것으로 정의되고, 저메틸화(녹색)은 메틸화가 2-배 감소한 것으로 정의된다.
(B) 총 10,200,091 단편에 대한, 모든 CpG 단편을 포함하는 200-bp 단편은 CpG 밀도에 따라 분류되었다. 낮은-CpG, 중간-CpG, 및 높은-CpG 단편들이 정의되었다.
(C) 인용(Ref), 과메틸화된(Hyper), 및 저메틸화된(Hypo) 단편들에 대한 단편 분류 분포를 보여주는 히스토그램이다.
(D) 인용(Ref), 과메틸화된(Hyper), 및 저메틸화된(Hypo) 단편들의 게놈 상 모습의 분포이다. 프로모터는 RefSeq 데이타베이스에서 주석을 단 전사 시작점의 2 kb 상류로 정의된다. 또한 다른 게놈의 모습도 RefSeq 데이타베이스로 정의된다. SINE, 짧은 산재된 핵 인자(short interspersed nuclear element); LINE, 긴 산재된 핵 인자(long interspersed nuclear element); LTR, 긴 말단 반복(long terminal repeat).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

상기 마이크로어레이 칩에 집적된 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 인간 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ES)-특이적 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다;

POU5F1(POU class 5 homeobox 1), DPPA2(developmental pluripotency associated 2), DPEP3(dipeptidase 3), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3), USP44(ubiquitin specific peptidase 44), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), MT1F(metallothionein 1F), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1), VGF(VGF nerve growth factor inducible), SFRP2(secreted frizzled related protein 2), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4), PRDM14(PR domain containing 14) 및 MT1G(metallothionein 1G).

상기 마이크로어레이 칩에 집적된 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 내배엽 전구체(endoderm progenitor; EP)-특이적 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다;

CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)), GATA4(GATA binding protein 4), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)), LEFTY1(left-right determination factor 1), VWF(von Willebrand factor), NODAL(nodal homolog (mouse)), DLX5(distal-less homeobox 5), FOXC1(forkhead box C1), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17) 및 LEFTY2(left-right determination factor 2).

상기 마이크로어레이 칩에 집적된 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 성숙한 간세포(mature hepatocytes; MH)-특이적 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다;

SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3), AGT(angiotensinogen), AFP(alpha-fetoprotein), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4), APOA4(apolipoprotein A-IV), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), KNG1(kininogen 1), CFH(complement factor H), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1), RIN2(Ras and Rab interactor 2), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2), FGG(fibrinogen gamma chain), VTN(vitronectin), KLB(klotho beta), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3), DEFB1(defensin, beta 1), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), ANGPTL6(angiopoietin-like 6), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase)), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase), AQP10(aquaporin 10), CTSE(cathepsin E), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), APOC2(apolipoprotein C-II), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila)), TFF1(trefoil factor 1), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13), FMO1(flavin containing monooxygenase 1), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1).

상기 마이크로어레이 칩은 유전자의 발현 검출용 또는 DNA 탈메틸화 검출용인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배아 줄기 세포(배아 줄기 세포(ES))는 >90%의 효율로 내배엽 전구체(내배엽 전구체(EP))로 분화시키고, 그 후에 내배엽 전구체는 >80%의 효율로 간세포로 분화시켰다(도 1A).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)의 발현 분석은 4회 반복 실험하였다. 표시된 시점에 세포주에서 분리된 RNA를 사용하고, 46,000개 이상의 인간 전사체에 대한 발현 프로파일을 제공하는 인간-6 전체-게놈 발현 비드칩을 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 질을 확인한 총 RNA 300 ng을 사용하여 선형 증폭 키트(linear amplification kit; Ambion, Austin, TX)로 비오틴-표지된 cRNA를 만들었다. 칩 혼성화, 세척, Cy3-스트렙타비딘 염색, 및 스캐닝은 제조자가 제공한 시약 및 프로토콜에 따라 비드어레이 리더(BeadArray Reader; Illumina) 플랫폼에서 수행하였다. 발현을 결정하기 위해 검출 점수를 사용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, qRT-PCR를 통하여 POU5F1, SOX2, 및 NANOG는 배아 줄기 세포-특이적으로 발현하였고, SOX17, FOXA2, 및 GATA4는 내배엽 전구체(EP)-특이적으로 발현하였으며, ALB, AFP, 및 SERPINA1는 성숙한 간세포(MH)-특이적으로 발현하였음을 확인하였다. 이런 마커들은 분화하는 동안에 극적인 발현 변화를 보인다(도 3A).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH) 단계 동안 특이적으로 발현되는 추가적인 유전자들을 찾기 위하여, 각 단계에서 잘 알려진 마커들과 공동-발현되는 유전자들을 클러스터하였다(도 3B). 클러스터 1은 POU5F1, SOX2, 및 NANOG과 배아 줄기 세포(ES)-특이적 발현을 보이는 67개의 유전자들을 포함한다(표 2). 클러스터 2는 SOX17, FOXA2, 및 GATA4과 내배엽 전구체(EP)-특이적 발현을 보이는 83개의 유전자들을 포함한다(표 3). 클러스터 3은 ALB, AFP, 및 SERPINA1과 성숙한 간세포(MH)-특이적 발현을 보이는 375개의 유전자들을 포함한다(표 4).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배아 줄기 세포(배아 줄기 세포(ES)), 내배엽 전구체(내배엽 전구체(EP)), 및 성숙한 간세포(성숙한 간세포(MH))의 메틸화 분석은 3회 반복 실험하였다. 각 시료에서 게놈 DNA(1 ㎍)은 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research, Orange, CA)를 사용하여 중아황산염(bisulfite)으로 변형시키고, 변형된 DNA 200 ng 을 증폭에 사용하였다. 증폭된 DNA는 인피니엄 인간메틸화27 비드칩(Infinium HumanMethylation27 BeadChip, Illumina)로 혼성화하고, 잘 알려진 14,495 이상의 유전자에서 선별된 27,578 CpG 위치의 메틸화 상태를 분석하였다. 어레이는 비드어레이 리더(BeadArray Reader)를 사용하여 이미지화하고, 일루미나(Illumina) 사의 안내에 따라 이미지 프로세싱 및 인텐시티 데이타(intensity data)의 추출을 수행하였다. 각 메틸화 신호는 β 값으로 계산하고, 이는 0(완전히 메틸화되지 않은 시토신)에서 1(완전히 메틸화된 시토신)의 범위로 DNA 메틸화의 정량적인 값으로 계산되었다(Bibikova M. et al., Genome Res 2006;16:1075-1083).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클러스터 1에서 67개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 핵산 대사, 발생, 및 mRNA 전사와 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2A). 67 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 16개의 배아 줄기 세포(ES) 특이적 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 6). <도 4A>는 분화 과정 동안 16개의 배아 줄기 세포(ES)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 상세히 살펴보면, 미분화 상태의 유지 및 배아 줄기 세포(ES)의 증식에 기능을 하는(Du J. et al., J Biochem 2010;147;265-271), DPPA2 (developmental pluripotency associated 2); 디펩티다제(dipeptidases)의 족에 속하는 막-결합 단백질인(Habib GM. et al., Faseb J 2003;17:1313-1315), dipeptidases; 양성자 올리고펩티드 공동수송체(a proton oligopeptide cotransporter)(Daniel H. et al., Pflugers Arch 2004;447:610-618)인, SLC15A3 (solute carrier family 15 member 3); 세포 주기를 조절하는 데 핵심적 역할을 하는 탈유비키틴화(deubiquitinating) 효소인(Stegmeier F. et al., Nature 2007;446:876-881), USP44 (ubiquitin specific peptidase 44); 및 자기재생(selfrenewal) 및 만능(pluripotent) 분화에 관련된(Li SS. et al., Stem Cells Dev 2006;15:532-555), LECT1 (leukocyte cell derived chemotaxin 1)을 확인하였다. 각각, qRT-PCR 분석(도 4B) 및 파이로서열분석(도 4C)을 사용하여 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)에서 이 유전자들의 mRNA 발현과 DNA 메틸화 수준을 입증하였고; 이 유전자들의 mRNA 발현과 DNA 메틸화는 마이크로어레이 데이타에 부합된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클러스터 2에서 83개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 신호 전달, 발생, 배 발생(embryogenesis), 세포 커뮤니케이션, 및 절편 분화(segment specification)와 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2B). 83 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 11개의 내배엽 전구체(EP)특이적 메틸화 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 7). 도 5A는 분화 과정 동안 11개의 내배엽 전구체(EP)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 이 11개의 마커들 중에서, 배아 줄기 세포(ES)의 분화와 관계되는 마디 신호전달 저해제(nodal signaling inhibitor)인(Katoh M. et al., Int J Mol Med 2006;17:795-799), CER1 (cerberus 1); 형태 발생(morphogenesis) 및 내배엽 분화에 중대한 역할을 하는(Hart AH. et al., Development 2002;129:3597-3608), MIXL1 (Mix1 homeobox-like 1); 초기 배 발생에서 좌-우 축 결정에 필요한(Meno C. et al., Cell 1998;94:287-297), LEFTY1 및 LEFTY2 (left-right determination factors 1 및 2); 및 내피하의(subendothelial) 콜라겐 및 혈소판의 결합 부위를 갖는 연쇄되고, 복합기능적인 단백질인(Kim J. et al., Nature 2010;466:992-995), VWF (von Willebrand factor)을 확인하였다. qRT-PCR 분석에 의한 이 유전자들의 mRNA 발현(도 5B) 및 파이로서열분석에 의한 DNA 메틸화 수준(도 5C)를 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클러스터 3에서 375개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 면역 및 방어, 수송, 단백질 분해(proteolysis), 세포 커뮤니케이션, 지방산 대사, 및 세포 부착(cell adhesion)과 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2C). 375 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 40개의 성숙한 간세포(MH)특이적 메틸화 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 8). 도 6A는 분화 과정 동안 40개의 성숙한 간세포(MH)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 상세히 살펴보면, 세린 프로테아제 저해제 유전자 패밀리(serine protease inhibitor gene family) 중의 하나인, SERPINA3 (serpin peptidase inhibitor A3); 지방 대사에 많은 역할을 하는(Tubb MR. et al., J Biol Chem 2007;282:28385-28394), APOA4 (apolipoprotein A4); 혈액 응집(blood coagulation)에 중요한 역할을 하는(Muller-Esterl W. Kininogens, kinins and kinships. Thromb Haemost 1989;61:2-6), KNG1 (kininogen 1); 세포 부착(cell adhesion) 및 퍼짐(spreading)을 촉진하는(Ragno P. et al., Cancer Res 1998;58:1315-1319), VTN (vitronectin); 및 간에서 스테로이드와 담즙 산(bile acids)의 황산화(sulfation)를 촉매하는(Chatterjee B. et al., Methods Enzymol 2005;400:165-191), SULT2A1 (sulfotransferase 2A1)을 확인하였다. qRT-PCR 분석에 의한 이 유전자들의 mRNA 발현(도 6B) 및 파이로서열분석에 의한 DNA 메틸화 수준(도 6C)를 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배아 줄기 세포(ES)로부터 내배엽 전구체(EP)로의 분화하는 동안, 과메틸화(11.3%)는 저메틸화 (3.4 %)보다 좀더 빈번하였고, 반면에 내배엽 전구체(EP)로부터 성숙한 간세포(MH)로 분화하는 동안, 저메틸화 (10.4 %)가 과메틸화 (4.1 %)보다 좀더 빈번하였다(도 7A). CpG 함량에 기초하여 과- 또는 저메틸화된 절편들의 특징을 조사하였다. 첫째로, UCSC hg18 어셈블리로부터 각 절편의 DNA 서열을 확보하고 모든 CpG 절편을 포함하였다. 그 다음에 전체 인간 게놈의 절편들(총 10,200,091 절편들)을 3개의 카테고리고 균등하게 나누었다: 높은-CpG 절편들(CpG 관찰/예측 비> 0.313), 낮은-CpG 절편들(CpG 관찰/예측 비< 0.180), 및 중간-CpG 절편들(도 7B). 예측된 것처럼, 높은-CpG 절편들이 분화하는 동안 가장 빈번한 메틸화 변화를 보였다(도 7C).

또한 본 발명은 본 발명에 따른 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 포함하는 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법을 제공한다;

⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;

상기 방법에 있어서 단계 ⑴의 시료는 게놈 DNA, mRNA 또는 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서 단계 ⑵의 유전자의 발현량은 마이크로어레이 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)으로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서 단계 ⑶의 배아 줄기 세포-특이적으로 유전자의 발현량이 증가한다는 것은 내배엽 전구체 및 성숙한 간세포의 상기 유전자의 발현량보다 증가하는 것을 의미하고, 상기 내배엽 전구체-특이적으로 유전자의 발현량이 증가한다는 것은 배아 줄기 세포 및 성숙한 간세포의 상기 유전자의 발현량보다 증가하는 것을 의미하며, 상기 성숙한 간세포-특이적으로 유전자의 발현량이 증가한다는 것은 배아 줄기 세포 및 내배엽 전구체의 상기 유전자의 발현량보다 증가하는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포의 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법을 제공한다;

⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;

상기 방법에 있어서 단계 ⑵의 DNA 탈메틸화는 마이크로어레이 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서 단계 ⑶의 배아 줄기 세포-특이적으로 DNA 탈메틸화한다는 것은 유전자의 CpG 메틸레이션 수준이 내배엽 전구체 및 성숙한 간세포의 상기 유전자의 CpG 메틸레이션 수준보다 감소하는 것을 의미하고, 상기 내배엽 전구체-특이적으로 DNA 탈메틸화한다는 것은 유전자의 CpG 메틸레이션 수준이 배아 줄기 세포 및 성숙한 간세포의 상기 유전자의 CpG 메틸레이션 수준 보다 감소하는 것을 의미하며, 상기 성숙한 간세포-특이적으로 DNA 탈메틸화한다는 것은 유전자의 CpG 메틸레이션 수준이 배아 줄기 세포 및 내배엽 전구체의 상기 유전자의 CpG 메틸레이션 수준 보다 감소하는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩을 사용하여 인간 줄기 세포로부터 간세포로의 분화를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다;

⑴ 본 발명에 따른 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;

상기 방법에 있어서 단계 ⑶의 내배엽 전구체 또는 성숙한 간세포-특이적 유전자의 발현량을 증가시킨다는 것은 배아 줄기 세포의 상기 유전자의 발현량보다 증가하는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서 단계 ⑶의 성숙한 간세포-특이적 유전자를 DNA 탈메틸화시킨다는 것은 유전자의 CpG 메틸레이션 수준이 배아 줄기 세포에 있어서 상기 유전자의 CpG 메틸레이션 수준보다 감소하는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서 단계 ⑶의 상기 인간 줄기 세포로부터 간세포로의 분화를 촉진하는 후보 물질은 배아 줄기 세포를 내배엽 전구체로 분화시키는 것을 촉진시키거나, 내배엽 전구체를 성숙한 간세포로 분화시키는 것을 촉진시키거나, 또는 배아 줄기 세포를 성숙한 간세포로 분화시키는 것을 촉진시키는 후보 물질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 스크리닝 방법으로 스크리닝된 후보 물질을 이용하여 배아 줄기 세포 또는 내배엽 전구체로부터 간세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

배아 줄기 세포의 간세포( hepatocytes )로의 분화

인간 배아 줄기 세포 (CHA-hES4) 는 한국, 성남, 포천 차 대학교, 의과대학에서 제공받았다. Cai et al.(Cai J, Zhao Y, Liu Y, Ye F, Song Z, Qin H, et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology 2007;45:1229-1239)의 3-단계 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 간세포로 분화시켰다(도 1A).

간단히 설명하면, 배아 줄기 세포는 3일 동안 새로운 배지를 첨가하지 않는 시스템(feeder-free system)에서 조절된 배지에 완전히 자라게 배양하였다. 그 후, 배아 줄기 세포는 0.5 ㎎/㎖ 알부민 분획 V(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 50 ng/㎖ 액티빈 A(activin A)(Peprotech, Rocky Hill, NJ)을 포함하는 RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT)에서 1일 동안 배양하고 추가로 1 % 인슐린-트랜스페린-셀레늄(insulin-transferrin-selenium, ITS; Sigma-Aldrich)를 보충한 상기와 동일한 RPMI 배지에서 4일 동안 배양하였다. 액티빈 A로 처리한 후, 배아 줄기 세포를 수확하였다. 추가적인 분화를 위해, 배아 줄기 세포를 30 ng/㎖ FGF4(Peprotech) 및 20 ng/㎖ BMP2(Peprotech)을 포함하는 간세포 배양 배지(HCM; Lonza,Baltimore, MD)에서 5일 동안 배양하고 추가로 20 ng/㎖ 간세포 성장 인자(Peprotech)를 보충한 HCM에서 5일 동안 배양하였다. 10 ng/㎖ 온코스타틴 M(oncostatin M; R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 0.1 μM 덱사메타손(dexamethasone; Sigma-Aldrich)을 보충한 HCM에서 5일 동안 배양하여 배아 줄기 세포-유래 간세포의 성숙을 유도하였다. 성숙한 간세포를 수확하였다. 배지는 매일 갈아주었다.

배아 줄기 세포(배아 줄기 세포(ES))는 >90 %의 효율로 내배엽 전구체(내배엽 전구체(EP))로 분화시키고, 그 후에 내배엽 전구체는 >80 %의 효율로 간세포로 분화시켰다(도 1A).

배아 줄기 세포에서 간세포로 분화하는 동안 유전자 발현의 프로파일링

3 분화 단계(배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH))의 유전자 발현은 일루미나 비드칩(Illumina BeadChip) 분석으로 프로파일하였다.

<2-1> 인간-6 전체-게놈 발현 비드칩( Human -6 Whole - Genome Expression BeadChip )으로 발현 분석

배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)의 발현 분석은 4회 반복 실험하였다. 표시된 시점에 세포주에서 분리된 RNA를 사용하고, 46,000개 이상의 인간 전사체에 대한 발현 프로파일을 제공하는 인간-6 전체-게놈 발현 비드칩을 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 질을 확인한 총 RNA 300 ng을 사용하여 선형 증폭 키트(linear amplification kit; Ambion, Austin, TX)로 비오틴-표지된 cRNA를 만들었다. 칩 혼성화, 세척, Cy3-스트렙타비딘 염색, 및 스캐닝은 제조자가 제공한 시약 및 프로토콜에 따라 비드어레이 리더(BeadArray Reader; Illumina) 플랫폼에서 수행하였다. 발현을 결정하기 위해 검출 점수를 사용하였다.

<2-2> 정량적 역 전사( Quantitative Reverse TranscriptionPCR , qRT - PCR ).

각 분화 단계의 잘 알려진 마커들의 qRT-PCR을 수행하였다. 배아 줄기 세포(ES)의 마커는 POU5F1, SOX2, 및 NANOG이다. 내배엽 전구체(EP)의 마커는 SOX17, FOXA2, 및 GATA4이다. 성숙한 간세포(MH)의 마커는 ALB, AFP, 및 SERPINA1이다.

qRT-PCR는 (Kim M. et al ., Cancer Res 2008;68:7147-7155)에서 설명한 바와 같이 수행하였다. PCR 프라이머 서열은 <표 1>에 기재하였다. 총 RNA는 RNeasy 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조하였고; DNase-처리된 RNA (5 ㎍)은 Superscript II 역 전사효소(reverse transcriptase) (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 역-전사시켰다. 실시간 PCR은 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA)에서 수행하였다. β-액틴을 암호화하는 유전자를 대조군으로 증폭시켰다. 표적 mRNA의 상대적 정량은 comparative threshold cycle (CT) 방법(Johnson MR., et al., Anal Biochem 2000;278:175-184)으로 분석하였다.

qRT-PCR를 위한 프라이머 서열

번호	유전자	정방향 프라이머(5'-3')	역방향 프라이머(5'-3')
1	POU5F1	GAAGGATGTGGTCCGAGTGT (서열번호: 1)	GTGAAGTGAGGGCTCCCATA (서열번호: 2)
2	SOX2	AACCCCAAGATGCACAACTC (서열번호: 3)	CGGGGCCGGTATTTATAATC (서열번호: 4)
3	NANOG	CAAAGGCAAACAACCCACTT (서열번호: 5)	TCTGGAACCAGGTCTTCACC (서열번호: 6)
4	SOX17	CAGAATCCAGACCTGCACAA (서열번호: 7)	GCGGCCGGTACTTGTAGTT (서열번호: 8)
5	FOXA2	CTACGCCAACATGAACTCCA (서열번호: 9)	CGGTAGAAGGGGAAGAGGTC (서열번호: 10)
6	GATA4	TCCAAACCAGAAAACGGAAG (서열번호: 11)	CTGTGCCCGTAGTGAGATGA (서열번호: 12)
7	ALB	CCAGAGATTTCCCAAAGCTG (서열번호: 13)	TGGGATTTTTCCAACAGAGG (서열번호: 14)
8	AFP	GTAGCGCTGCAAACAATGAA (서열번호: 15)	CCCTCTTCAGCAAAGCAGAC (서열번호: 16)
9	SERPINA1	AGGGCCTGAAGCTAGTGGAT (서열번호: 17)	TCCTCGGTGTCCTTGACTTC (서열번호: 18)
10	DPPA2	CCAAGAGAGCAAGGCTTCAG (서열번호: 19)	GTCTGCCGAGAGAAGTCTGC (서열번호: 20)
11	DPEP3	CCTGGACAGGCTTAGAGACG (서열번호: 21)	AGTGAGTGACCACCCTCCAC (서열번호: 22)
12	SLC15A3	CCACATCCCAAACATTTTCC (서열번호: 23)	GATCAAGCGGTCCTTCAGAG (서열번호: 24)
13	USP44	GATTTGGCTCAGGGCACTAC (서열번호: 25)	AGCGTCTTCATTGGGATGTT (서열번호: 26)
14	LECT1	AGGCGCTGGAAGACTGAATA (서열번호: 27)	GATCTTCTGGCAGTGGGTGT (서열번호: 28)
15	CER1	TCTGGCACCACTTCATGTTC (서열번호: 29)	AATGAACAGACCCGCATTTC (서열번호: 30)
16	MIXL1	AAGCGCACGTCTTTCAGC (서열번호: 31)	TGGAAGGATTTCCCACTCTG (서열번호: 32)
17	LEFTY1	CGCCAGGAGATGTACATTGA (서열번호: 33)	CTTGATGCTGACGATCATGG (서열번호: 34)
18	VWF	TGCTGACACCAGAAAAGTGC (서열번호: 35)	AGTCCCCAATGGACTCACAG (서열번호: 36)
19	LEFTY2	CAGGGACTATGGAGCTCAGG (서열번호: 37)	CACACACTCGTAAGCCAGGA (서열번호: 38)
20	SERPINA3	GGTGAGCTCTACCTGCCAAA (서열번호: 39)	CACAGCCTTATGGACCACCT (서열번호: 40)
21	APOA4	TGAACTCACCCAGCAACTCA (서열번호: 41)	CCTTCCCAATCTCCTCCTTC (서열번호: 42)
22	KNG1	GTGGTGGCTGGATTGAACTT (서열번호: 43)	CGCAAATCTTGGTAGGTGGT (서열번호: 44)
23	VTN	GGGAGCGGGTCTACTTCTTC (서열번호: 45)	GCTAATGAACTGGGGCTGTC (서열번호: 46)
24	SULT2A1	TGGTTTGACCACATTCATGG (서열번호: 47)	TCATGCTCTGAAAGGAGCTG (서열번호: 48)

qRT-PCR를 통하여 POU5F1, SOX2, 및 NANOG는 배아 줄기 세포-특이적으로 발현하였고, SOX17, FOXA2, 및 GATA4는 내배엽 전구체(EP)-특이적으로 발현하였으며, ALB, AFP, 및 SERPINA1는 성숙한 간세포(MH)-특이적으로 발현하였음을 확인하였다. 이런 마커들은 분화하는 동안에 극적인 발현 변화를 보인다(도 3A).

<2-3> 배아 줄기 세포( ES )-, 내배엽 전구체( EP )-, 및 성숙한 간세포( MH )-특이적으로 발현된 유전자들의 클러스터링.

모든 유전자들이 시험관 내(in vitro)에서 간세포로의 분화 과정 동안 세 단계의 잘 알려진 마커와 유사한 유전자 발현 변화를 보이는 지 유전자들의 세 클러스터를 확인하는 실험을 하였다. 유전자 발현 마이크로어레이 데이타는 TIGR MultiExperiment Viewer로 보내고(Saeed AI. et al ., Biotechniques 2003;34:374-378), K-방법 클러스터링(K-means clustering)을 수행하였다. 데이타의 필터링과 편집(compilations)은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행하였다.

배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH) 단계 동안 특이적으로 발현되는 추가적인 유전자들을 찾기 위하여, 각 단계에서 잘 알려진 마커들과 공동-발현되는 유전자들을 클러스터하였다(도 3B). 클러스터 1은 POU5F1, SOX2, 및 NANOG과 배아 줄기 세포(ES)-특이적 발현을 보이는 67개의 유전자들을 포함한다(표 2). 클러스터 2는 SOX17, FOXA2, 및 GATA4과 내배엽 전구체(EP)-특이적 발현을 보이는 83개의 유전자들을 포함한다(표 3). 클러스터 3은 ALB, AFP, 및 SERPINA1과 성숙한 간세포(MH)-특이적 발현을 보이는 375개의 유전자들을 포함한다(표 4).

시험관 내 간세포 발생 동안 클러스터 1에서 유전자들의 mRNA 발현 수준

유전자	ES	EP	MH
AASS	1551	172	106.4
APOBEC3H	446.8	71.1	65.2
CAMKV	2776.8	161.7	69.7
CDCA7L	1769.3	126.1	76.2
CHST4	1015.1	103.7	69.8
CKMT1A	879.1	97.2	82.7
CRABP1	3575.4	356.1	60.5
CXXC6	1002.6	170.4	96.8
CYP2S1	2213.4	277.2	165.6
DCLK1	2045	179.4	113.9
DNMT3B	4362.2	1098.9	110.4
DPEP3	791.8	84.7	79.7
DPPA2	1009	138.5	66.8
DPPA4	11517.3	2035.4	671.6
DPPA5	706.4	57.3	53.5
FLJ25404	3656.4	445.4	77.6
GPM6B	872.3	131.6	76.5
HEY2	2486	188.6	152.2
HLA-DOA	470.1	75.8	63.4
HS.148659	2122.1	73.9	63.4
HS.270778	503.6	83.5	60.2
HS.540043	2113.4	196.1	69.4
HS.561216	2054.3	297.1	61
HS.574590	4512.1	395.7	66
HS.575696	4443.5	329.7	68
IRX2	1056.3	148.7	79.8
LECT1	3634.9	84.5	75.5
LOC440132	2133.9	78.4	75.1
LOC642559	17043.9	1445.9	100.7
LOC643272	11129.8	1492.7	84.7
LOC645682	6932.2	229.1	63.6
LOC649970	1910.3	170.3	100.4
MIAT	2649.3	87.4	67.5
MT1F	1762.5	195.1	135
MT1G	5806.6	98.5	75.8
MT1H	2045.1	73.9	65.9
MYCN	3231	557.3	148
NANOG	767.4	126.9	59.9
PHC1	2244.4	362.4	221
PHF17	2199	301.3	193.6
POU5F1	3957.2	160.6	68.2
POU5F1P1	8281.5	541.5	67.9
PPFIA4	1201.9	173.4	127.8
PRDM14	1277.9	82.1	64.2
PRIM1	1447.2	214.2	95.6
PTPRZ1	964.2	78.3	68.6
RHBDL3	591.4	74.1	72.5
SALL2	7238.1	687.6	651.2
SCG5	1030.9	161.1	122.5
SEPHS1	7154.7	1134.4	410.2
SFRP2	881.5	80.1	77
SILV	1088.9	157.1	154.5
SLC15A3	605.3	88.3	87.5
SOX2	2967	96.4	99.9
SOX3	992.6	66	63.3
SPP1	4132	101.3	101.3
SYT4	1518	196.7	191.9
TCEAL2	1881.7	306.6	213.1
TERF1	1536.1	189.8	178.3
TMEM145	1305.5	113.7	86.8
TMEM158	7695.2	862.2	715.4
UPK1A	965	80	76
USP44	837.2	63.6	61.7
UTF1	446.7	64.5	55.6
VASH2	4140.7	454.8	115.8
VGF	2282.5	185.3	102
WDR54	4731.5	790.4	343.4

시험관 내 간세포 발생 동안 클러스터 2에서 유전자들의 mRNA 발현 수준

유전자	ES	EP	MH
ABCD1	76.8	657.2	250.5
ACE2	63.5	515.5	142.5
ACOX3	256.3	3535.7	403.7
AMOT	147.7	1598.2	405
ANGPT2	73.9	1686.7	122.1
ARL4D	78.5	704.3	133.5
BHLHB5	59.1	2838.8	57.3
BMP2	133.7	5705.7	1804.4
C21ORF129	65.7	1230.7	359.9
C6ORF60	308.3	4297.5	249.1
C8ORF13	96.1	796.4	67.7
C8ORF31	75	695.1	91.7
C9ORF19	754.1	8513.5	784.8
CCDC81	80	5484.5	85.2
CCKBR	94.6	4545.2	123.1
CER1	69.8	9835.5	66.4
CFLAR	140.3	2142	708.5
COL9A2	113.3	4835.6	123.5
CRIP1	132.2	2949.4	86.8
CST1	73.7	22497.9	419
CXCR4	111.5	2623.4	146.6
CXCR7	163.9	4267.9	470.8
DACT2	147.9	2622.2	208.3
DLX5	64.2	1047.8	74.9
ELOVL2	70.6	569.4	225.3
EOMES	66.9	13642.3	62.5
FGF17	71.8	15514.6	71.1
FGF8	64.9	1108.7	63.2
FHOD1	575.9	4630.7	465.5
FOXA2	62.9	4049.5	1190.3
FOXC1	92.3	945.7	116.9
FOXQ1	62.2	9562.8	204.8
FREM1	83	4230.9	610.2
FST	563.1	8779.5	1425.4
FZD5	273.8	3871.6	1222.9
GADD45A	451	1780.1	817.5
GATA4	62.1	564.9	183.4
GRP	68.2	762.4	63.4
GSC	75.5	2748.5	74.9
HS.241559	63.5	854.8	129.6
HS.475733	72.5	705.6	114.7
HS.502887	63.1	641.2	65.7
HS.543452	70.8	1202.5	71.1
HS.572444	75.6	3600.4	164.8
IER3	750.9	7241.8	1106.3
IGFBP5	212.2	9968.3	2568.7
IGFBP6	257.1	3144.7	287.6
KCNF1	113.1	1001.4	195.1
KCNK12	1117.2	14422.1	1039.1
LEFTY1	304.1	15090.9	59.1
LEFTY2	339.5	24852.6	93.7
LHX1	80.7	1876.8	83.7
LOC642299	194	1935	192.1
LOC646100	81	1003.1	77.3
LOC653158	75.6	846	130.2
LOC728473	60.4	4253.6	1197.3
LOC730273	161.8	1381.7	211.9
MBD4	1216	2850.1	1046.5
MIXL1	79	1987.9	67.4
MXRA5	162.2	3141.4	844.4
MYL4	61.4	1010	283.4
MYL7	84.1	5496.2	299.2
NBL1	307.7	5485.1	1990.2
NFKBIA	1418.8	12133.7	2762.6
NODAL	242	4890.6	109.4
NTN1	96.5	790.1	255.7
OXTR	122.7	2002.4	204.6
PLCE1	64.2	736.4	283.9
PLXNA2	75.9	697.7	157.2
RAGE	109.3	1273.2	162
RHOBTB3	203.6	14780.7	3684.5
ROR2	271.3	4193.7	388.7
SLC5A9	60.7	1142.3	83.8
SLCO2A1	114.4	3037	235.6
SOX17	61.4	3116.6	77.4
STMN2	243	5888	1793.1
TDRD7	133.2	2861.7	903.7
TMEM63A	159.1	1473.7	564.4
TMOD1	100.6	1520.8	67.5
TNNC1	232.9	4102.2	161.1
VWF	84.7	1797	73.1
WNT3	102.5	1324.5	178.6
ZBTB40	162.4	1619.1	319.4

시험관 내 간세포 발생 동안 클러스터 3에서 유전자들의 mRNA 발현 수준

유전자	ES	EP	MH
A1CF	65.2	66.5	723.3
A2M	50	51.3	2383.4
ABCA1	1176.4	3080.9	8525.6
ACAA1	385.2	633.8	4583.6
ACTA1	815.2	2295.3	4813.7
ACTA2	234	239.7	8626.3
AFM	58.4	61.9	484.2
AFP	192.8	64	24254.1
AGT	58.7	59.5	3038.9
AHSG	97.9	86	6849.9
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VCAM1	65.8	65.8	1462.6
VIL1	94.6	312.7	820.4
VSIG2	78	69.9	1016.9
VTN	61.7	225.5	24930
ZBTB16	62.4	64.4	406.3
ZBTB20	85.1	78.2	496.4
ZFHX3	128.6	426.6	834.9
ZG16	63.4	60.8	759.1
ZNF702	105.3	409.9	849.8

배아 줄기 세포에서 간세포로 분화하는 동안 DNA 메틸화의 프로파일링

각 단계에서 DNA 메틸화 마커 후보를 찾기 위하여, 폭넓게 사용되는 중아황산염(bisulfite)-기초 비드 어레이인, 인피니엄 어레이에서 27,578 CpG 위치들의 메틸화 상태를 분석하였다(Bibikova M. et al., Genome Res 2006;16:1075-1083).

<3-1> 인피니엄 인간메틸화27 비드칩( Infinium HumanMethylation27 BeadChip )으로 메틸화 분석

배아 줄기 세포(배아 줄기 세포(ES)), 내배엽 전구체(내배엽 전구체(EP)), 및 성숙한 간세포(성숙한 간세포(MH))의 메틸화 분석은 3회 반복 실험하였다. 각 시료에서 게놈 DNA(1 ㎍)은 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research, Orange, CA)를 사용하여 중아황산염(bisulfite)으로 변형시키고, 변형된 DNA 200 ng 을 증폭에 사용하였다. 증폭된 DNA는 인피니엄 인간메틸화27 비드칩(Infinium HumanMethylation27 BeadChip, Illumina)를 혼성화하고, 잘 알려진 14,495 이상의 유전자에서 선별된 27,578 CpG 위치의 메틸화 상태를 분석하였다. 어레이는 비드어레이 리더(BeadArray Reader)를 사용하여 이미지화하고, 일루미나(Illumina) 사의 안내에 따라 이미지 프로세싱 및 인텐시티 데이타(intensity data)의 추출을 수행하였다. 각 메틸화 신호는 β 값으로 계산하고, 이는 0(완전히 메틸화되지 않은 시토신)에서 1(완전히 메틸화된 시토신)의 범위로 DNA 메틸화의 정량적인 값으로 계산되었다(Bibikova M. et al., Genome Res 2006;16:1075-1083).

<3-2> 파이로시퀀싱 분석( Pyrosequencing Analysis ).

파이로시퀀싱은 Kim M. et al., Cancer Res 2008;68:7147-7155에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 프라이머들은 PSQ 분석 디자인(Biotage AB, Kungsgatan, Sweden; 표 1)으로 고안하였다.

중아황산염(bisulfite)-변형된 DNA (EZ DNA methylation kit; Zymo Research)를 프라이머 세트와 f-Taq 중합효소(Solgent, Daejeon, Korea)를 포함하여 총량 25-μL로 증폭시켰다. 파이로시퀀싱 반응은 PSQ HS 96A 시스템 (Biotage AB)으로 수행하였다.

파이로시퀀싱을 위한 프라이머

번호	유전자	정방향 프라이머(5'-3')	역방향 프라이머(5'-3')	시퀀싱 프라이머(5'-3')
1	POU5F1	GGAAGGTATAAGGGAGTA (서열번호: 49)	Biotin-CACACCTCCATATTCTTC (서열번호: 50)	TGTTGATGTATTGAGGGAT (서열번호: 51)
2	DPPA2	Biotin-TTTAAAGTATTAGGGGTTATAT (서열번호: 52)	CTAAATACAACCCTCTAAAAT (서열번호: 53)	AATACAACCAAAAAAACACT (서열번호: 54)
3	DPEP3	GTTTAGGAGTTGGGTATAAGT (서열번호: 55)	Biotin-CCAAAAATCTTCCTAATC (서열번호: 56)	TTTAGGAGTTGGGTATAAGT (서열번호: 57)
4	SLC15A3	Biotin-AATGGTTGAGTGTGATTAAA (서열번호: 58)	CCAAAATTCCACTTTTAC (서열번호: 59)	TCTTCCAATCAAACTCC (서열번호: 60)
5	USP44	GTATAGAAAGGGAGTAAGTGT (서열번호: 61)	Biotin-CCCCAACAATACATTATTA (서열번호: 62)	AGGGAGTAAGTGTATAGTTT (서열번호: 63)
6	LECT1	AATGGTTTTTAGTTAGTTGT (서열번호: 64)	Biotin-CCAAAAAAATACTCAAATAC (서열번호: 65)	AGTTAGTTGTTATAGTAGAG (서열번호: 66)
7	GATA4	GGTTAAGGAAAAGAGAGAA (서열번호: 67)	Biotin-CCAAAAACTCCTAACCTTATA (서열번호: 68)	TATATTTAGTAGTGTAAAAA (서열번호: 69)
8	CER1	TTTGTTTGGTTATTGATTAT (서열번호: 70)	Biotin-AAACCCAAACTTCTTTTATA (서열번호: 71)	TTGATTATTTGTTTTTTTAT (서열번호: 72)
9	MIXL1	AGTTTTGATGAGGATAGA (서열번호: 73)	Biotin-CCACAAAACTCTCTTCTC (서열번호: 74)	TATAGGTTAGGTAAGGTGTT (서열번호: 75)
10	LEFTY1	TGGGGTATAATTATGTTTTG (서열번호: 76)	Biotin-CCCCTAACAACCAAATAT (서열번호: 77)	TGAGTTATTGTAAATAGAAG (서열번호: 78)
11	VWF	TAGTAGTGGGGATTTTATAG (서열번호: 79)	Biotin-TACCTTCCCCTACAAATA (서열번호: 80)	ATGGTTTAGGGTGGG (서열번호: 81)
12	LEFTY2	Biotin-GTGATTGTAAAGGTATTTG (서열번호: 82)	AACCTACACTCCTTACAC (서열번호: 83)	CAAAAATCCCTCAAAATTAT (서열번호: 84)
13	AFP	TTTTGTAGTTTGAGGAGAATAT (서열번호: 85)	Biotin-TTTACCAATAATTAACAACAT (서열번호: 86)	TTTGAATATAAAATATAAAT (서열번호: 87)
14	SERPINA3	Biotin-TATTTGAGTAGGTTTAATAAGTT (서열번호: 88)	CAAAACAACCAAATATTCTA (서열번호: 89)	CAACCAAATATTCTATTCTC (서열번호: 90)
15	APOA4	Biotin-TAGGGTTATAAAAGTTTAAGA (서열번호: 91)	TCCTCCTTCCTCAATATA (서열번호: 92)	CCTTCCTCAATATAACTCC (서열번호: 93)
16	KNG1	Biotin-TGGTTTTGTAAAAGTTATAG (서열번호: 94)	CCAAAAATTAAATAACTCT (서열번호: 95)	CATTTACATTTAAAAATCAC (서열번호: 96)
17	VTN	Biotin-AGGTTGAGTAAATAGAGTAGT (서열번호: 97)	AACTCTAATCTCCCTAAAA (서열번호: 98)	CTCTAATCTCCCTAAAATCT (서열번호: 99)
18	SULT2A1	Biotin-TGTTGGGATAAGGTTAAA (서열번호: 100)	TCCCTTATCACAAACTCA (서열번호: 101)	CCTTCAAACCATAAAAAATC (서열번호: 102)

배아 줄기 세포( ES )-, 내배엽 전구체( EP )-, 및 성숙한 간세포( MH )-특이적으로 발현되고 탈메틸화 유전자

<4-1> 배아 줄기 세포(ES)-특이적으로 발현되고 탈메틸화 유전자

클러스터 1에서 67개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 핵산 대사, 발생, 및 mRNA 전사와 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2A). 67 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 16개의 배아 줄기 세포(ES) 특이적 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 6).

ES 마커들의 mRNA 발현과 CpG 메틸화 간의 상관관계

유전 자명	설명	mRNA 발현			CpG 메틸화			R	P	CpG ID	염색체 위치
유전 자명	설명	ES	EP	MH	ES	EP	MH	R	P	CpG ID	염색체 위치
POU5F1	POU class 5 homeobox 1	3957.2	160.6	68.2	0.33549	0.73675	0.87732	-0.96265	5.12E-22	cg13083810	chr6:31247135
DPPA2	developmental pluripotency associated 2	1009	138.5	66.8	0.17464	0.42681	0.6139	-0.81367	5.29E-10	cg11759378	chr3:110518159
DPEP3	dipeptidase 3	791.8	84.7	79.7	0.28714	0.52114	0.68032	-0.75527	4.25E-08	cg21695020	chr16:66572127
SLC15A3	solute carrier family 15, member 3	605.3	88.3	87.5	0.34492	0.56289	0.63529	-0.7225	3.03E-07	cg26980692	chr11:60476523
USP44	ubiquitin specific peptidase 44	837.2	63.6	61.7	0.0209	0.31781	0.57337	-0.70251	8.81E-07	cg04488758	chr12:94469497
SOX2	SRY (sex determining region Y)-box 2	2967	96.4	99.9	0.1025	0.13744	0.19587	-0.51823	0.00086	cg15105987	chr3:182913011
MT1F	metallothionein 1F	1762.5	195.1	135	0.20939	0.23036	0.2484	-0.51188	0.00102	cg00728317	chr16:55249534
CRABP1	cellular retinoic acid binding protein 1	3575.4	356.1	60.5	0.06406	0.0826	0.10866	-0.41881	0.00887	cg20550118	chr15:76420717
LECT1	leukocyte cell derived chemotaxin 1	3634.9	84.5	75.5	0.28122	0.42289	0.51576	-0.41691	0.009216	cg22398616	chr13:52212204
VGF	VGF nerve growth factor inducible	2282.5	185.3	102	0.04553	0.05681	0.07923	-0.41143	0.01028	cg04084157	chr7:100595769
SFRP2	secreted frizzled related protein 2	881.5	80.1	77	0.01837	0.03733	0.03154	-0.36316	0.025025	cg23910835	chr4:154930350
MYCN	v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)	3231	557.3	148	0.0306	0.03166	0.03299	-0.3392	0.037222	cg02204046	chr2:15998211
UTF1	undifferentiated embryonic cell transcription factor 1	446.7	64.5	55.6	0.02721	0.0244	0.02849	-0.33842	0.037687	cg09053680	chr10:134894104
CHST4	carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4	1015.1	103.7	69.8	0.05239	0.06147	0.04931	-0.33092	0.042422	cg00840403	chr16:70117706
PRDM14	PR domain containing 14	1277.9	82.1	64.2	0.0361	0.04373	0.05623	-0.32901	0.043704	cg10457247	chr8:71145633
MT1G	metallothionein 1G	5806.6	98.5	75.8	0.07138	0.14267	0.19887	-0.31793	0.037981	cg09985279	chr16:55259635

<도 4A>는 분화 과정 동안 16개의 배아 줄기 세포(ES)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 상세히 살펴보면, 미분화 상태의 유지 및 배아 줄기 세포(ES)의 증식에 기능을 하는(Du J. et al., J Biochem 2010;147;265-271), DPPA2 (developmental pluripotency associated 2); 디펩티다제(dipeptidases)의 족에 속하는 막-결합 단백질인(Habib GM. et al., Faseb J 2003;17:1313-1315), dipeptidases; 양성자 올리고펩티드 공동수송체(a proton oligopeptide cotransporter)(Daniel H. et al., Pflugers Arch 2004;447:610-618)인, SLC15A3 (solute carrier family 15 member 3); 세포 주기를 조절하는 데 핵심적 역할을 하는 탈유비키틴화(deubiquitinating) 효소인(Stegmeier F. et al., Nature 2007;446:876-881), USP44 (ubiquitin specific peptidase 44); 및 자기재생(selfrenewal) 및 만능(pluripotent) 분화에 관련된(Li SS. et al., Stem Cells Dev 2006;15:532-555), LECT1 (leukocyte cell derived chemotaxin 1)을 확인하였다. 각각, qRT-PCR 분석(도 4B) 및 파이로서열분석(도 4C)을 사용하여 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)에서 이 유전자들의 mRNA 발현과 DNA 메틸화 수준을 입증하였고; 이 유전자들의 mRNA 발현과 DNA 메틸화는 마이크로어레이 데이타에 부합된다.

<4-2> 내배엽 전구체(EP)-특이적으로 발현되고 탈메틸화 유전자

클러스터 2에서 83개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 신호 전달, 발생, 배 발생(embryogenesis), 세포 커뮤니케이션, 및 절편 분화(segment specification)와 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2B). 83 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 11개의 내배엽 전구체(EP)특이적 메틸화 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 7).

EP 마커들의 mRNA 발현과 CpG 메틸화 간의 상관관계

유전 자명	설명	mRNA 발현			CpG 메틸화			R	P	CpG ID	염색체 위치
유전 자명	설명	ES	EP	MH	ES	EP	MH	R	P	CpG ID	염색체 위치
CER1	cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)	69.8	9835.5	66.4	0.33459	0.11752	0.45896	-0.64268	1.36E-05	cg07926025	chr9:14712864
GATA4	GATA binding protein 4	62.1	564.9	183.4	0.4884	0.33369	0.84675	-0.59	9.68E-05	cg26020513	chr8:11605765
MIXL1	Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)	79	1987.9	67.4	0.24566	0.08598	0.26448	-0.58249	0.000125	cg18354264	chr1:224477631
LEFTY1	left-right determination factor 1	304.1	15090.9	59.1	0.66151	0.4789	0.75857	-0.55541	0.000295	cg10774440	chr1:224142776
VWF	von Willebrand factor	84.7	1797	73.1	0.73291	0.4599	0.7266	-0.53763	0.0005	cg27347104	chr12:6103918
NODAL	nodal homolog (mouse)	242	4890.6	109.4	0.08049	0.0825	0.15731	-0.45385	0.00421	cg04377282	chr10:71871423
DLX5	distal-less homeobox 5	64.2	1047.8	74.9	0.10287	0.08641	0.12775	-0.43668	0.006124	cg06537230	chr7:96491119
FOXC1	forkhead box C1	92.3	945.7	116.9	0.01794	0.01898	0.02043	-0.40482	0.011699	cg23867624	chr6:1555196
KCNK12	potassium channel, subfamily K, member 12	1117.2	14422.1	1039.1	0.02025	0.02467	0.02155	-0.39211	0.014901	cg27320127	chr2:47651900
SOX17	SRY (sex determining region Y)-box 17	61.4	3116.6	77.4	0.04024	0.03065	0.03959	-0.36914	0.022565	cg02919422	chr8:55533097
LEFTY2	left-right determination factor 2	339.5	24852.6	93.7	0.84623	0.48096	0.61615	-0.36657	0.023595	cg22462235	chr1:224196104

도 5A는 분화 과정 동안 11개의 내배엽 전구체(EP)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 이 11개의 마커들 중에서, 배아 줄기 세포(ES)의 분화와 관계되는 마디 신호전달 저해제(nodal signaling inhibitor)인(Katoh M. et al., Int J Mol Med 2006;17:795-799), CER1 (cerberus 1); 형태 발생(morphogenesis) 및 내배엽 분화에 중대한 역할을 하는(Hart AH. et al., Development 2002;129:3597-3608), MIXL1 (Mix1 homeobox-like 1); 초기 배 발생에서 좌-우 축 결정에 필요한(Meno C. et al., Cell 1998;94:287-297), LEFTY1 및 LEFTY2 (left-right determination factors 1 및 2); 및 내피하의(subendothelial) 콜라겐 및 혈소판의 결합 부위를 갖는 연쇄되고, 복합기능적인 단백질인(Kim J. et al., Nature 2010;466:992-995), VWF (von Willebrand factor)을 확인하였다. qRT-PCR 분석에 의한 이 유전자들의 mRNA 발현(도 5B) 및 파이로서열분석에 의한 DNA 메틸화 수준(도 5C)를 확인하였다.

<4-3> 성숙한 간세포( MH )-특이적으로 발현되고 탈메틸화 유전자

클러스터 3에서 375개의 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 이들 유전자가 면역 및 방어, 수송, 단백질 분해(proteolysis), 세포 커뮤니케이션, 지방산 대사, 및 세포 부착(cell adhesion)과 관련되어 있다는 것을 나타낸다(도 2C). 375 개의 유전자들 중에, 마이크로어레이 데이타에서 mRNA 발현과 CpG 메틸화간의 중요한 음성적 상관관계를 보여주는 40개의 성숙한 간세포(MH)특이적 메틸화 마커를 확인하였다(컷오프 R < 0.3, P < 0.05; 표 8).

도 6A는 분화 과정 동안 40개의 성숙한 간세포(MH)-특이적 마커의 mRNA 발현 및 CpG 메틸화 패턴을 보여준다. 상세히 살펴보면, 세린 프로테아제 저해제 유전자 패밀리(serine protease inhibitor gene family) 중의 하나인, SERPINA3 (serpin peptidase inhibitor A3); 지방 대사에 많은 역할을 하는(Tubb MR. et al., J Biol Chem 2007;282:28385-28394), APOA4 (apolipoprotein A4); 혈액 응집(blood coagulation)에 중요한 역할을 하는(Muller-Esterl W. Kininogens, kinins and kinships. Thromb Haemost 1989;61:2-6), KNG1 (kininogen 1); 세포 부착(cell adhesion) 및 퍼짐(spreading)을 촉진하는(Ragno P. et al., Cancer Res 1998;58:1315-1319), VTN (vitronectin); 및 간에서 스테로이드와 담즙 산(bile acids)의 황산화(sulfation)를 촉매하는(Chatterjee B. et al., Methods Enzymol 2005;400:165-191), SULT2A1 (sulfotransferase 2A1)을 확인하였다. qRT-PCR 분석에 의한 이 유전자들의 mRNA 발현(도 6B) 및 파이로서열분석에 의한 DNA 메틸화 수준(도 6C)를 확인하였다.

배아 줄기 세포에서 간세포로 분화하는 동안 유전자 사이 부위의 역동적인 DNA 메틸화 변화

또한 시험관 내(in vitro) 간세포 분화 과정 동안 전-게놈 DNA 메틸화 변화를 분석하기 위하여, 메틸화된 이중-가닥 DNA 단편들을 강화하는 MBD2 단백질의 메틸-CpG 결합 도메인을 사용하는 서열분석-기초 기술인, MBD-서열분석을 수행하였다(도 1B) (Harris RA. et al., Nat Biotechnol 2010).

<5-1> MBD -서열 분석

게놈 DNA는 네뷸라이저(nebulizer)(Illumina)로 1분 동안 가스 44 psi로 100-500 bp의 단편으로 만들고 그 후에 MethylMiner methylated DNA enrichment kit(Invitrogen) 를 사용하여 메틸화된 DNA를 농축시켰다. 간단하게 설명하면, 메틸화된 DNA는 1 ㎍ 분절된 게놈 DNA에서 마그네틱 다이나비드(magnetic Dynabeads)에 결합된 인간 MBD2 단백질의 메틸-CpG 결합 도메인에 결합시켜 침강시켰다. 그 후에 메틸화된 단편들을 고염 용출 완충액(Invitrogen)으로 용출시키고 Qiagen miniElute PCR 정제 키트로 정제하였다. 메틸화된 DNA 단편들을 일루미나 게놈 분석기(Illumina Genome Analyzer)로 서열을 분석하기 위해 어탭터에 라이게이션하였다. 라이게이션 산물은 2 % 아가로스 겔에서 전기영동하여 200300 bp 크기의 단편을 얻었고 PCR로 18 사이클로 증폭되었다. 클러스터 생산 및 72 사이클의 단일 해독 서열분석(single-read sequencing)을 하였다. 서열들은 일루미나 게놈 분석기 데이타 분석 파이프라인(Illumina Genome Analyzer data analysis pipeline)을 사용하여 인간 게놈에 위치를 파악하였다. 총 게놈을 200-bp 절편으로 나누고, 해독의 번호를 각 절편에 매겼다. 해독의 수는 총 해독 수에 대해 표준화되었다.

인피니엄 어레이(Infinium arrays)는 14,000개 이상의 유전자에 대한 고도로 재생할 수 있는 CpG 메틸화 데이타를 제공함에도 불구하고, 유전자 당 단지 하나 또는 몇개의 CpG 위치의 메틸화 상태를 보여준다. 배아 줄기 세포(ES), 내배엽 전구체(EP), 및 성숙한 간세포(MH)에서 전-게놈 DNA 메틸화를 프로파일하기 위하여, MBD-서열분석을 수행하였다. 전체 게놈을 200-bp 절편들(총 15,399,219 절편들)로 나누고 각 절편들간에 위치를 파악된 번역의 수를 세었다. 비드칩(BeadChip) 데이타로부터 CpG 메틸화 수준 및 매치된 절편에서 세어진 서열분석 번역의 비교는 좋은 상관관계를 보였다(배아 줄기 세포(ES)에서 R = 0.5223, P < 2.2E16; 내배엽 전구체(EP)에서 R = 0.4993, P < 2.2E16; 성숙한 간세포(MH)에서 R = 0.5331, P < 2.2E16). 과메틸화(hypermethylation) 및 저메틸화(hypomethylation)는 각각, 메틸화에서 2-배 증가 및 감소로 정의하였다. 배아 줄기 세포(ES)로부터 내배엽 전구체(EP)로의 분화하는 동안, 과메틸화(11.3%)는 저메틸화 (3.4 %)보다 좀더 빈번하였고, 반면에 내배엽 전구체(EP)로부터 성숙한 간세포(MH)로 분화하는 동안, 저메틸화 (10.4 %)가 과메틸화 (4.1 %)보다 좀더 빈번하였다(도 7A).

CpG 함량에 기초하여 과- 또는 저메틸화된 절편들의 특징을 조사하였다. 첫째로, UCSC hg18 어셈블리로부터 각 절편의 DNA 서열을 확보하고 모든 CpG 절편을 포함하였다. 그 다음에 전체 인간 게놈의 절편들(총 10,200,091 절편들)을 3개의 카테고리고 균등하게 나누었다: 높은-CpG 절편들(CpG 관찰/예측 비> 0.313), 낮은-CpG 절편들(CpG 관찰/예측 비< 0.180), 및 중간-CpG 절편들(도 7B). 예측된 것처럼, 높은-CpG 절편들이 분화하는 동안 가장 빈번한 메틸화 변화를 보였다(도 7C). 그러나 적어도 부분적으로는 그것들의 낮은 CpG 함량 때문에, 낮은-CpG 절편들이 불충분하게 표시된 것으로 생각된다.

또한 과- 또는 저메틸화된 절편들이 게놈의 모습과 관련되는 지를 조사하였다. 프로모터 영역들은 전사 시작점의 2 kb 상류로 정의하였다. 메틸화 변화가 있는 대부분의 절편들은 유전자 사이의 영역(intergenic regions), 인트론, 및 SINE (short interspersed nuclear elements)이었다(도 7D).

유전자 사이의 영역이 인간 게놈의 약 7.3%임에도 불구하고, 과- 또는 저메틸화된 절편들의 3233%가 유전자 사이의 영역에 있고(반복 서열은 제외), 이는 유전자 사이의 영역에서 메틸화 변화가 배아 줄기 세포(ES)의 분화에 중요하다는 것을 제안한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기의 군으로 기재되는 각 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된, 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 마이크로어레이 칩:
POU5F1(POU class 5 homeobox 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002701), DPPA2(developmental pluripotency associated 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_138815), DPEP3(dipeptidase 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022357), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_016582), USP44(ubiquitin specific peptidase 44, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032147), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003106), MT1F(metallothionein 1F, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005949), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004378), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), VGF(VGF nerve growth factor inducible, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), SFRP2(secreted frizzled related protein 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_016354), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005378), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003577), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005769), PRDM14(PR domain containing 14, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_024504), MT1G(metallothionein 1G, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005950), CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005454), GATA4(GATA binding protein 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_077531), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031944), LEFTY1(left-right determination factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_020997), VWF(von Willebrand factor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000552), NODAL(nodal homolog (mouse), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018055), DLX5(distal-less homeobox 5, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_007933), FOXC1(forkhead box C1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001453), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022055), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022454), LEFTY2(left-right determination factor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003240), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001085), AGT(angiotensinogen, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000029), AFP(alpha-fetoprotein, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001134), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004617), APOA4(apolipoprotein A-IV, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000482), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003122), KNG1(kininogen 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000893), CFH(complement factor H, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000186), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000689), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_013279), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007256), RIN2(Ras and Rab interactor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018993), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_014467), FGG(fibrinogen gamma chain, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000509), VTN(vitronectin, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000638), KLB(klotho beta, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_175737), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_011520), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032607), DEFB1(defensin, beta 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005218), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022094), ANGPTL6(angiopoietin-like 6, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031917), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_006063), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001078), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005211), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003937), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003167), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005855), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005651), AQP10(aquaporin 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_080429), CTSE(cathepsin E, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001910), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003064), APOC2(apolipoprotein C-II, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000483), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005410), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001343), TFF1(trefoil factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003225), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002242), FMO1(flavin containing monooxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002021), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002153), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000302) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_025130).
제 1항에 있어서, 하기의 군으로 기재되는 유전자는 인간 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ES)-특이적 유전자인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 칩;
POU5F1(POU class 5 homeobox 1), DPPA2(developmental pluripotency associated 2), DPEP3(dipeptidase 3), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3), USP44(ubiquitin specific peptidase 44), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), MT1F(metallothionein 1F), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1), VGF(VGF nerve growth factor inducible), SFRP2(secreted frizzled related protein 2), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4), PRDM14(PR domain containing 14) 및 MT1G(metallothionein 1G).
제 1항에 있어서, 하기의 군으로 기재되는 유전자는 내배엽 전구체(endoderm progenitor; EP)-특이적 유전자인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 칩;
CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)), GATA4(GATA binding protein 4), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)), LEFTY1(left-right determination factor 1), VWF(von Willebrand factor), NODAL(nodal homolog (mouse)), DLX5(distal-less homeobox 5), FOXC1(forkhead box C1), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17) 및 LEFTY2(left-right determination factor 2).
제 1항에 있어서, 하기의 군으로 기재되는 유전자는 성숙한 간세포(mature hepatocytes; MH)-특이적 유전자인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 칩;
SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3), AGT(angiotensinogen), AFP(alpha-fetoprotein), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4), APOA4(apolipoprotein A-IV), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), KNG1(kininogen 1), CFH(complement factor H), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1), RIN2(Ras and Rab interactor 2), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2), FGG(fibrinogen gamma chain), VTN(vitronectin), KLB(klotho beta), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3), DEFB1(defensin, beta 1), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), ANGPTL6(angiopoietin-like 6), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase)), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase), AQP10(aquaporin 10), CTSE(cathepsin E), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), APOC2(apolipoprotein C-II), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila)), TFF1(trefoil factor 1), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13), FMO1(flavin containing monooxygenase 1), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1).
제 1항에 있어서, 유전자의 발현 검출용 또는 DNA 탈메틸화 검출용인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 칩.
제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별용 키트.
제 6항에 있어서, 유전자의 발현 검출용 또는 DNA 탈메틸화 검출용인 것을 특징으로 하는 키트.
하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법;
⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;
⑵ 하기의 군으로 기재되는 각 유전자의 발현량을 동시에 측정하는 단계:
POU5F1(POU class 5 homeobox 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002701), DPPA2(developmental pluripotency associated 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_138815), DPEP3(dipeptidase 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022357), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_016582), USP44(ubiquitin specific peptidase 44, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032147), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003106), MT1F(metallothionein 1F, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005949), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004378), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), VGF(VGF nerve growth factor inducible, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), SFRP2(secreted frizzled related protein 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_016354), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005378), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003577), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005769), PRDM14(PR domain containing 14, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_024504), MT1G(metallothionein 1G, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005950), CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005454), GATA4(GATA binding protein 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_077531), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031944), LEFTY1(left-right determination factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_020997), VWF(von Willebrand factor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000552), NODAL(nodal homolog (mouse), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018055), DLX5(distal-less homeobox 5, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_007933), FOXC1(forkhead box C1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001453), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022055), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022454), LEFTY2(left-right determination factor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003240), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001085), AGT(angiotensinogen, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000029), AFP(alpha-fetoprotein, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001134), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004617), APOA4(apolipoprotein A-IV, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000482), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003122), KNG1(kininogen 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000893), CFH(complement factor H, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000186), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000689), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_013279), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007256), RIN2(Ras and Rab interactor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018993), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_014467), FGG(fibrinogen gamma chain, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000509), VTN(vitronectin, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000638), KLB(klotho beta, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_175737), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_011520), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032607), DEFB1(defensin, beta 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005218), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022094), ANGPTL6(angiopoietin-like 6, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031917), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_006063), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001078), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005211), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003937), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003167), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005855), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005651), AQP10(aquaporin 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_080429), CTSE(cathepsin E, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001910), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003064), APOC2(apolipoprotein C-II, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000483), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005410), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001343), TFF1(trefoil factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003225), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002242), FMO1(flavin containing monooxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002021), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002153), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000302) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_025130).; 및
⑶ 하기 ⒜의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 배아 줄기 세포-특이적으로 유전자의 발현량이 정상대조군에 비해 증가하면 미분화 단계인 것으로 판별하고, 하기 ⒝의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 내배엽 전구체-특이적으로 유전자의 발현량이 정상대조군에 비해 증가하면 분화 중인 단계인 것으로 판별하며, 또는 하기 ⒞의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 성숙한 간세포-특이적으로 유전자의 발현량이 정상대조군에 비해 증가하면 간세포로 분화한 단계인 것으로 판별하는 단계:
⒜ POU5F1(POU class 5 homeobox 1), DPPA2(developmental pluripotency associated 2), DPEP3(dipeptidase 3), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3), USP44(ubiquitin specific peptidase 44), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), MT1F(metallothionein 1F), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1), VGF(VGF nerve growth factor inducible), SFRP2(secreted frizzled related protein 2), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4), PRDM14(PR domain containing 14) 및 MT1G(metallothionein 1G),
⒝ CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)), GATA4(GATA binding protein 4), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)), LEFTY1(left-right determination factor 1), VWF(von Willebrand factor), NODAL(nodal homolog (mouse)), DLX5(distal-less homeobox 5), FOXC1(forkhead box C1), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17) 및 LEFTY2(left-right determination factor 2),
⒞ SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3), AGT(angiotensinogen), AFP(alpha-fetoprotein), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4), APOA4(apolipoprotein A-IV), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), KNG1(kininogen 1), CFH(complement factor H), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1), RIN2(Ras and Rab interactor 2), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2), FGG(fibrinogen gamma chain), VTN(vitronectin), KLB(klotho beta), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3), DEFB1(defensin, beta 1), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), ANGPTL6(angiopoietin-like 6), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase)), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase), AQP10(aquaporin 10), CTSE(cathepsin E), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), APOC2(apolipoprotein C-II), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila)), TFF1(trefoil factor 1), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13), FMO1(flavin containing monooxygenase 1), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1).
하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화 단계 판별 방법;
⑴ 인간 배아 줄기 세포로부터 시료를 얻는 단계;
⑵ 하기의 군으로 기재되는 각 유전자의 DNA 탈메틸화를 동시에 측정하는 단계:
POU5F1(POU class 5 homeobox 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002701), DPPA2(developmental pluripotency associated 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_138815), DPEP3(dipeptidase 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022357), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_016582), USP44(ubiquitin specific peptidase 44, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032147), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003106), MT1F(metallothionein 1F, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005949), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004378), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), VGF(VGF nerve growth factor inducible, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007015), SFRP2(secreted frizzled related protein 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_016354), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005378), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003577), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005769), PRDM14(PR domain containing 14, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_024504), MT1G(metallothionein 1G, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005950), CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005454), GATA4(GATA binding protein 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_077531), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031944), LEFTY1(left-right determination factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_020997), VWF(von Willebrand factor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000552), NODAL(nodal homolog (mouse), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018055), DLX5(distal-less homeobox 5, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_007933), FOXC1(forkhead box C1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001453), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022055), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022454), LEFTY2(left-right determination factor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003240), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001085), AGT(angiotensinogen, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000029), AFP(alpha-fetoprotein, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001134), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_004617), APOA4(apolipoprotein A-IV, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000482), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003122), KNG1(kininogen 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000893), CFH(complement factor H, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000186), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000689), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_013279), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_007256), RIN2(Ras and Rab interactor 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_018993), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_014467), FGG(fibrinogen gamma chain, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000509), VTN(vitronectin, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000638), KLB(klotho beta, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_175737), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NT_011520), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_032607), DEFB1(defensin, beta 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005218), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_022094), ANGPTL6(angiopoietin-like 6, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_031917), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_006063), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001078), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005211), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003937), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003167), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005855), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005651), AQP10(aquaporin 10, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_080429), CTSE(cathepsin E, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001910), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003064), APOC2(apolipoprotein C-II, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000483), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_005410), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila), 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_001343), TFF1(trefoil factor 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_003225), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002242), FMO1(flavin containing monooxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002021), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_002153), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_000302) 및 HKDC1(hexokinase domain containing 1, 유전자 등록 번호(Genbank Accession No.) NM_025130).; 및
⑶ 하기 ⒜의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 배아 줄기 세포-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 미분화 단계인 것으로 판별하고, 하기 ⒝의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 내배엽 전구체-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 분화 중인 단계인 것으로 판별하며, 또는 하기 ⒞의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 성숙한 간세포-특이적으로 DNA 탈메틸화되면 간세포로 분화한 단계인 것으로 판별하는 단계:
⒜ POU5F1(POU class 5 homeobox 1), DPPA2(developmental pluripotency associated 2), DPEP3(dipeptidase 3), SLC15A3(solute carrier family 15, member 3), USP44(ubiquitin specific peptidase 44), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), MT1F(metallothionein 1F), CRABP1(cellular retinoic acid binding protein 1), LECT1(leukocyte cell derived chemotaxin 1), VGF(VGF nerve growth factor inducible), SFRP2(secreted frizzled related protein 2), MYCN(-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian)), UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), CHST4(carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4), PRDM14(PR domain containing 14), MT1G(metallothionein 1G),
⒝ CER1(cerberus 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)), GATA4(GATA binding protein 4), MIXL1(Mix1 homeobox-like 1 (Xenopus laevis)), LEFTY1(left-right determination factor 1), VWF(von Willebrand factor), NODAL(nodal homolog (mouse)), DLX5(distal-less homeobox 5), FOXC1(forkhead box C1), KCNK12(potassium channel, subfamily K, member 12), SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17), LEFTY2(left-right determination factor 2),
⒞ SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A , member 3), AGT(angiotensinogen), AFP(alpha-fetoprotein), TM4SF4(transmembrane 4 L six family member 4), APOA4(apolipoprotein A-IV), SPINK1(serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), KNG1(kininogen 1), CFH(complement factor H), ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1), C11orf9(chromosome 11 open reading frame 9), SLCO2B1(solute carrier organic anion transporter family, member 2B1), RIN2(Ras and Rab interactor 2), SRPX2(sushi-repeat-containing protein, X-linked 2), FGG(fibrinogen gamma chain), VTN(vitronectin), KLB(klotho beta), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), CREB3L3(cAMP responsive element binding protein 3-like 3), DEFB1(defensin, beta 1), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), ANGPTL6(angiopoietin-like 6), KBTBD10(kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), CSF1R(colony stimulating factor 1 receptor), KYNU(kynureninase (L-kynurenine hydrolase)), SULT2A1(sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1), RAMP1(receptor (G protein-coupled) activity modifying protein 1), TDO2(tryptophan 2,3-dioxygenase), AQP10(aquaporin 10), CTSE(cathepsin E), SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), APOC2(apolipoprotein C-II), SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1), DAB2(disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein(Drosophila)), TFF1(trefoil factor 1), KCNJ13(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 13), FMO1(flavin containing monooxygenase 1), HSD17B2(hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2), PLOD1(procollagen-lysine 1, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1), HKDC1(hexokinase domain containing 1).
제 8항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 게놈 DNA, mRNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 유전자의 발현량은 마이크로어레이 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 DNA 탈메틸화는 마이크로어레이 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기의 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화를 촉진하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법;
⑴ 제 1항의 마이크로어레이 칩에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
⑵ 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현량 또는 DNA 탈메틸화를 측정하는 단계; 및
⑶ 단계 ⑵의 내배엽 전구체-특이적 유전자 또는 성숙한 간세포-특이적 유전자의 발현량을 증가시키거나, 또는 내배엽 전구체-특이적 유전자 또는 성숙한 간세포-특이적 유전자를 DNA 탈메틸화시키는 피검 화합물 또는 조성물을 인간 배아 줄기 세포로부터 간세포(hepatocytes)로의 분화를 촉진하는 후보 물질로 판정하는 단계.
제 13항에 있어서, 상기 유전자의 발현량은 마이크로어레이 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 DNA 탈메틸화는 마이크로어레이 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.