JP2017184623A - 未分化細胞間における分化傾向の評価方法、分化傾向の評価マーカーとしてのＳＡＬＬ３ ｍＲＮＡ、及び、未分化細胞の分化能力の制御方法 - Google Patents

未分化細胞間における分化傾向の評価方法、分化傾向の評価マーカーとしてのＳＡＬＬ３ ｍＲＮＡ、及び、未分化細胞の分化能力の制御方法 Download PDF

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Abstract

【課題】簡易且つ低労力にて未分化細胞間における分化傾向を評価する方法を提供する。
【解決手段】複数の未分化細胞間における分化傾向の評価方法であって、各々の未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を検出する工程と、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する工程と、を有する。
【選択図】図２

Description

本発明は、未分化細胞間における分化傾向の評価方法、分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNA、及び、未分化細胞の分化能力の制御方法に関する。
人工多能性幹細胞（iPS細胞）や胚性幹細胞（ES細胞）といった多能性幹細胞は、分化多能性と自己複製能を持つため、再生医療への応用を目的とした、細胞・組織加工製品の原材料として重要な役割を果たすことが強く期待されている。
多能性幹細胞を利用した細胞・組織加工製品の臨床応用に当たり懸念されるのは、製品に混在する可能性のある造腫瘍性細胞による移植部位での腫瘍形成である。未分化の多能性幹細胞は、動物に移植することにより奇形腫（テラトーマ）を形成するという造腫瘍性を元来有する。そのため、製品中の未分化細胞は腫瘍形成を誘発する可能性があり、製造工程における未分化細胞の残存に対する方策が強く望まれている。また未分化な多能性幹細胞を分化させることにより製品が製造されるため、目的とは異なった分化細胞等の製品への混在の可能性もある。これらの目的外細胞の製品への混在をより低減するには、多能性幹細胞から目的とした細胞への分化効率を上昇させる必要があり、分化方法の改良が世界中の研究機関で精力的に行われている。
しかしながら、近年、個々のヒトES細胞株は、全ての系譜に均等に分化する能力をもっているわけではなく、特定の胚葉への分化指向性に大きな偏りがあることが報告されている(非特許文献１)。即ち、ヒト多能性幹細胞の肝臓細胞、心筋細胞や神経細胞等への分化効率は、細胞株に大きく依存することが明らかとなってきた。従って、目的細胞への分化効率が高い最適な株を選別することが、細胞・組織加工製品の品質・安全性を担保するためには非常に重要である。
製品に最適な多能性幹細胞株を選別する際に、全ての細胞株を分化させ、目的細胞に特異的に発現している遺伝子・タンパク質の量、細胞機能、細胞形態等で判別することは、時間的にも労力的にも負担が大きい。未分化状態における各々の多能性幹細胞株の特性から各々の株の分化指向性が予測できれば、より少ない時間と労力で最適な株を選別することが可能になることが想定される。
これまでの研究から同定されたヒトES/iPS細胞分化予測マーカーは、外胚葉へ分化しやすいヒトES/iPS細胞においてmiR-371-3の発現が高くなっていることが報告されているのみで(非特許文献２)、中胚葉又は内胚葉への分化予測も可能なマーカーはいまだ存在していない。
Osafune,K.ら、Nat Biotechnol、2008年、26巻3 号 Hyesoo, Kら、Cell Stem Cell、2011年、8巻
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、簡易且つ低労力にて未分化細胞間における分化傾向を評価する方法を提供することを目的とする。
本発明にかかる複数の未分化細胞間における分化傾向の評価方法は、各々の未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を検出する工程と、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する工程と、を有することを特徴とする。
本発明にかかる複数の未分化細胞間における分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNAは、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する、ことを特徴とする。
本発明にかかる未分化細胞の分化能力の制御方法は、未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を制御することを特徴とする。
本発明によれば、簡易且つ低労力にて、未分化細胞間における分化傾向を評価することができる。また、本発明によれば、簡易且つ低労力にて、未分化細胞の分化能力を制御することができる。これにより、細胞・組織加工製品の原料となる複数の未分化細胞株の中から、目的細胞に分化しやすい細胞株を容易に選択することができる。
分化傾向予測マーカー遺伝子の同定を目的とした本実施例の実験スキームの概略を示す図である。 各胚葉への第一主成分得点順位を示す図である。 ヒトiPS細胞10株におけるSALL3の発現量を示す図である。 SALL3発現抑制株のEB(embryoidbody 胚様体)分化誘導を示す図であり、そのうち（Ａ）はSALL3発現抑制株とcontrol shRNAを導入した株とのSALL3の発現量比較図であり、（Ｂ）はRIPA bufferによりタンパク質を抽出して、ウエスタンブロットでのSALL3の発現量をタンパクレベルで確認する図であり、（Ｃ）はSALL3発現抑制株とContorol shRNA株とをEBに分化誘導後、RNAを抽出し、各分化マーカー遺伝子の発現量をqRT-PCRにより定量した図である。灰色の棒グラフはControl shRNA株、黒色の棒グラフはSALL3 shRNA株を示す。 ヒトiPS細胞の三胚葉分化におけるSALL3の役割の模式図である。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
本実施形態にかかる複数の未分化細胞間における分化傾向の評価方法は、各々の未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を検出する工程と、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する工程と、を有する。
分化傾向を評価する対象となる複数の未分化の細胞は、多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、例えば、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞である。
SALLはジンクフィンガー蛋白質をコードしている遺伝子であり、SALLファミリーメンバーは、SALL1、SALL2、SALL3、及びSALL4からなる群より選択される。本実施形態にかかる分化傾向の評価方法では、各々の未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量が検出される。ここでSALL3遺伝子（配列番号１）は、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_171999に示される遺伝子を指す。
SALL3 mRNAの発現量の検出は、特に限定されるものではないが、例えばPCR法による検出である。
そして、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する。
外胚葉（Ectoderm）は、発生初期の嚢胚期における胚の外表面の細胞層であり、将来、表皮や中枢神経系・感覚器官等に発達する。内胚葉(Endoderm)は、発生初期の嚢胚期の最も内側の細胞層であり、将来、消化管の主要部分やその付属腺、呼吸器等に発達する。中胚葉(Mesoderm)は、発生初期に外胚葉と内胚葉との間に構成される細胞群であり、骨格・筋肉・循環器・生殖器等に発達する。
本実施形態にかかる複数の未分化細胞間における分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNAは、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する。
本実施形態にかかる未分化細胞の分化能力の制御方法は、未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量の制御を行う。
未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を抑制させることにより、未分化細胞が中胚葉系又は内胚葉系に分化する分化能力を有する。また、未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を上昇させることにより、未分化細胞が外胚葉系に分化する分化能力を有する。発現量を制御する方法としては、SALL3 mRNAの発現を制御するベクターもしくはオリゴヌクレオチドをトランスフェクションする方法、SALL3 mRNAをゲノム編集する方法やSALL3 mRNAの産物をトランスフェクションする方法等が挙げられる。
本実施例では、10株のヒト正常細胞由来iPS細胞株（201B7、253G1、409B2、ATCC-DYR0100、ATCC-HYR0103、mc-iPS、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A及びTic）を用いた。201B7、253G1、409B2、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A及びHiPS-RIKEN-12Aは理研バイオリソースセンターより入手した。ATCC-DYR0100及びATCC-HYR0103はATCCより入手した。mc-iPSはSystem Biosciencesより入手した。Ticは医薬基盤研究所より入手した。
フィーダー細胞を用いたヒトiPS細胞培養は、マイトマイシンC処理したSNL細胞（マウス線維芽細胞STO株にネオマイシン耐性遺伝子及びLIFを発現させた細胞）上において、4 ng/ml ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、和光純薬）を添加したヒトES細胞培地（リプロセル）中で培養することにより行った。フィーダーレスによるiPS細胞培養は、マトリゲル（BDバイオサイエンス）でコートを行ったディッシュ上において、mTeSR1培地（STEMCELL Technologies）で培養することにより行った。未分化な細胞コロニーは、CTK溶液（リプロセル）及びSTEMPRO EZPassage（インビトロジェン）を用い、100 μm セルストレイナー（BDバイオサイエンス）を通過させた細胞塊（クランプ）として、5〜6日ごとに継代した。全ての細胞株は、5%CO2-95%Air、37℃の条件で培養し、培地交換は継代２日目以降毎日行った。
分化傾向予測マーカー遺伝子の同定を目的とした本研究の実験スキームの概略を図１に示す。iPS細胞株10種類それぞれを、60 mm細胞培養ディッシュ (BD Bioscience)にフィーダーレス条件下で6〜7日間培養したのち、RNeasy Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。各RNAの品質評価はAgilent RNA 6000 Nano Assay (Agilent Technologies)を用いて、28Sと18SのrRNA比率を算出することにより純度を確認した。抽出したRNAサンプルは-80℃で冷凍保存した。RNAサンプルのビオチンラベル化cRNA合成は、GeneChip 3’ IVT Express kit (Affymetrix)を用いて、製品プロトコールに従い行った。
まず、total RNAからT7プロモーター配列を含む2本鎖cDNA合成を行い、in vitro逆転写反応によりcDNAを鋳型としたビオチンラベルされたaRNAを合成した。次いでハンマーヘッド反応を利用したカルシウムランダム分解により、〜100-120 ntのaRNA断片を作製した。GeneChip Hybridization Oven (Affymetrix)を用いて、Genechip アレイ Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix)に作製したビオチンラベル化aRNAをハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、GeneChip Wash and Stain Kit (Affymetrix)とGeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix)を用いて洗浄とフィコエリスリン染色を行った。その後、GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix)を用いてGenechipアレイの蛍光画像をスキャンし、イメージ画像を取得した。得られた蛍光強度のデータはExpression Console Ver.1.1 (Affymetrix)を用いて解析した。シグナルのノーマライズはMAS5アルゴリズム、及びMSKファイル(Affymetrix)を用いて行った。
Probe Setのシグナル値は以下のフィルターを掛け、残ったProbe Setに関して解析を行った。
［フィルター（１）］Expression Consoleで解析された各Probe SetのシグナルはAbsolute Analysis (発現の有無を判定する解析)の結果、「発現があるもの:P(Present)」、「発現があるかわからないもの:M(Marginal)」あるいは「発現がないもの:A(Absent)」として判定がなされる。細胞株各群の6例の半数以上(つまり4例以上)でPと判断されたProbe Setについては、当該細胞株においてそのProbe Setがコードする遺伝子が発現していると判断した。逆に各群の6例のうちP判定されたものが3例以下の場合は当該細胞株においてそのProbe Setをコードする遺伝子の発現はないと判断した。
細胞株のうち、少なくとも1株以上において発現が見られるProbe Setは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で発現が見られないProbe Setは棄却した。
［フィルター（２）］分散分析(ANOVA)で細胞株間の遺伝子発現の平均値の比較を行い、有意水準5％の条件で帰無仮説が棄却できたもの、即ち10細胞株の中で発現量が有意に異なる細胞株が少なくとも１つは存在する結果が出たProbe Setは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で有意な差が現れなかったProbe Setは棄却した。
［フィルター（３）］細胞株間の遺伝子発現の平均値の差が5倍以上のあるもの、即ち10細胞株の最低の平均値と最高の平均値の差が5倍以上出るProbe Setは次のフィルターをかけ、差が5倍より小さいものは棄却した。
iPS細胞からの胚葉体の調製は，Bockらの方法に従った(Bock, Cら、Cell、2100年、144巻、p439-452)。フィーダー細胞上で培養したiPS細胞を CTK溶液で剥離し、20%KSR（Knockout Serum Replacement，インビトロジェン）を含む分化培地［KO-DMEM（インビトロジェン），0.1 mM非必須アミノ酸，0.2 mM l-グルタミン酸，0.1% 2-メルカプトエタノール，100 U/ml ペニシリン，100 μg/ml ストレプトマイシン］で懸濁した。ゼラチンコートディッシュ（イワキ）上で37℃で1時間培養し、フィーダー細胞を付着させた後に、ヒトiPS細胞を超低接着プレート（Ultra-Low Attachment，コーニング）上で37℃、16日間培養し、胚葉体を形成させた。培地交換は2〜3日ごとに行った。EBのtotal RNA抽出にはRNeasy micro kit (QIAGEN)を用いて、製品のプロトコールに従い抽出した。EBより抽出したtotal RNAから、High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems)を用いてプロトコールに従いcDNAを合成した。1 mg total RNAから合成したcDNAを、TaqMan 2×Universal PCR MasterMix No Amp Erase UNG (Applied Biosystems)と混和し、Bockらの報告(Bock, Cら、Cell、2100年、144巻、p439-452)を参考にして選択した97種類の遺伝子 (外胚葉：45遺伝子，中胚葉：56遺伝子，内胚葉：27遺伝子)をターゲットとするTaqManプローブとプライマーの入ったTaqMan Array Micro Fluidic Cards (Applied Biosystems)にアプライした後、7900HT Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems)にてduplicateで測定した。
各遺伝子の発現量を補正するために18S rRNAの発現量の測定を行った。マーカー遺伝子のRNA発現量はサンプルの平均値と標準偏差により標準化した後、統計ソフトウェアSYSTAT(SYSTAT Software)により主成分分析し、各胚葉分化それぞれについて第一主成分を得た。得られた第一主成分と標準化したマーカー遺伝子の発現量から第一主成分得点を算出し、得点の高い順に順位付けをした（First PCA rank, 図２）。
マイクロアレイ解析によるmRNAの発現量シグナルと、各細胞株における外胚葉、中胚葉、内胚葉それぞれのマーカー遺伝子のFirst PCA rankを用いて、スピアマンの順位相関係数を算出した。順位相関係数が正の場合は1に近いほど相関が高いことを表しており、分化しやすい細胞株に高発現していることを示している。また、順位相関係数が負の場合は-1に近いほど相関が高いことを表しており、分化しにくい細胞株に高発現していることを示している。算出した順位相関係数について、有意水準5%の条件 (相関係数が0.648より大きい、もしくは-0.648より小さい)で有意差を検討した。外胚葉分化傾向と正に相関するprobe setの数は135、負に相関するprobe setの数は92、中胚葉では正に相関するprobe setの数は35、負に相関するprobe setの数は7、内胚葉では正に相関するprobe setの数は9、負に相関するprobe setの数は29であった。
得られたFirst PCA rankの結果から、外胚葉のrankと中・内胚葉のrankが有意に逆相関を示すことが分かった。各胚葉間のスピアマンの順位相関係数は、外胚葉-内胚葉：0.661 (p<0.05)、中胚葉?内胚葉：0.794 (p<0.01)、外胚葉?内胚葉：-0.467 (p<0.2)であった。即ち、外胚葉に分化しやすい株は中・内胚葉に分化しにくく、中・内胚葉に分化しやすい株は外胚葉に分化しにくいということが示された。このことから、発明者らは各胚葉への分化指向性と発現量に相関のある遺伝子の中で、外胚葉への分化と中・内胚葉への分化で逆の相関を示す遺伝子は、機能的に分化指向性に関与する可能性が高いと予想した。
そこで、同定した各胚葉のFirst PCA rankと発現量に相関のある遺伝子の中から、三胚葉分化指向性で全て相関を示し、且つ、外胚葉と中・内胚葉とで逆の相関を示している遺伝子を抽出した所、SALL3遺伝子のみが選別された。ヒトiPS細胞10株におけるSALL3の発現量を図３に示す。未分化状態におけるヒトiPS細胞10株のマイクロアレイの結果からSALL3のSignal値を元に、Signalの最も低いR-2Aを基準に相対的な発現量比を示した。外・中・内胚葉へのFirst PCA rankとSALL3発現量とのスピアマン順位相関係数は、外胚葉：0.6970、中胚葉：-0.6606、内胚葉：-0.6606であった。このことから、SALL3の発現量をヒトiPS株間で比較することにより、発現が高い株は外胚葉系に分化しやすい株、発現が低い株は中・内胚葉に分化しやすい株と予測することが可能となる。
次に、SALL3遺伝子の発現を制御することにより、分化効率の制御が可能かどうかを検討する目的で、253G1株中のSALL3遺伝子の発現をLentivirus shRNA(Sigma-Aldrich)（配列番号２）を用いてノックダウンした。コントロールとしてはNon-Target shRNA control(Sigma-Aldrich)（配列番号３）を用いた。shRNAにより、253G1株のSALL3の遺伝子発現、またSALL3タンパク質発現が抑制されたことをqRT-PCRとウエスタンブロットにより確認した(図４(Ａ)(Ｂ))。
得られたSALL3発現抑制株を用いて、上述の方法によりEB分化を行い、分化マーカーをqRT-PCRにより測定した。その結果、外胚葉マーカーであるPAX6、NCAM1、NES、TUBB3はSALL3発現抑制株の方が発現が低く、逆に中胚葉マーカーのGATA4、T、KRD、内胚葉マーカーのFOXA2、AFPはSALL3発現抑制株の方が発現が高かった。即ち、SALL3発現抑制により、外胚葉への分化が抑制され、また中胚葉、内胚葉への分化が促進されることが明らかとなった(図４(Ｃ))。
以上の結果から、SALL3は外胚葉分化を促進し、中・内胚葉分化を阻害する機能を有することが示唆された(図５)。
目的の器官に分化させやすい多能性幹細胞を選択するので、再生医療分野に利用できる。
配列番号２、３：shRNA

Claims (9)

  1. 複数の未分化細胞間における分化傾向の評価方法であって、
    各々の未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を検出する工程と、
    SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する工程と、
    を有することを特徴とする分化傾向の評価方法。
  2. 前記SALL3 mRNAの発現量の検出は、PCR法による検出であることを特徴とする請求項１項に記載の分化傾向の評価方法。
  3. 前記未分化細胞は、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞であることを特徴とする請求項１又は２項に記載の分化傾向の評価方法。
  4. 複数の未分化細胞間における分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNAであって、
    SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も高い細胞が最も外胚葉系に分化する傾向があると評価し、SALL3 mRNAの発現量が相対的に最も低い細胞が最も中胚葉系又は内胚葉系に分化する傾向があると評価する、ことを特徴とする分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNA。
  5. 前記未分化細胞は、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞であることを特徴とする請求項４項に記載の分化傾向の評価マーカーとしてのSALL3 mRNA。
  6. 未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を制御することを特徴とする未分化細胞の分化能力の制御方法。
  7. 前記未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を抑制させることにより、前記未分化細胞が中胚葉系又は内胚葉系に分化する分化能力を有することを特徴とする請求項６に記載の未分化細胞の分化能力の制御方法。
  8. 前記未分化細胞のSALL3 mRNAの発現量を上昇させることにより、前記未分化細胞が外胚葉系に分化する分化能力を有することを特徴とする請求項６に記載の未分化細胞の分化能力の制御方法。
  9. 前記未分化細胞は、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞であることを特徴とする請求項６乃至８の何れか１項に記載の未分化細胞の分化能力の制御方法。
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