JPWO2020145041A1 - 喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法 - Google Patents

喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法に関する。本発明の方法は、（１）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２のうちの少なくとも特定の１１個の遺伝子を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、確率ＰＳＭＫを算出し；（２）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子のうちの少なくとも特定の４個の遺伝子を含む４以上の遺伝子の発現に関するに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された係数を用いて、確率ＰＣＯＰＤを算出し；（３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記たばこ製品のエアロゾルまたはエアロゾルの喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクをとして算出する、ことを含む。

Description

本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法、及び、加熱式たばこに関する。
慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，以下、本明細書において、「ＣＯＰＤ」と呼称する場合がある）は大気中の汚染物質や粉じん、微生物などの有害物質を長期間吸入曝露されることで生じる炎症性呼吸器疾患である。たばこ煙はＣＯＰＤの主たるリスク要因の一つとして考えられていることから、たばこ煙のＣＯＰＤ発症リスクを評価する手法の確立は急務である。この点、喫煙曝露試験に関する動物モデルも報告されているが、ヒトへの影響について評価を外挿することについては種差の問題が懸念される。
このような背景から、たばこ業界においてヒト由来細胞を用いたインビトロ試験によるヒトへの疾病リスク予測の重要性が高まっている。特に気道上皮組織は吸入される有害物質に対して最初の防御機構として働く組織であることから、気道上皮細胞を用いたたばこ煙の生物影響評価は積極的に行われている。近年は従来の単層培養細胞を用いた単回曝露試験に加え、より生体に近い組織構造を有する三次元培養モデルを用いた頻回曝露試験といった、ヒトへの外挿性の高い試験系を用いた評価も積極的に行われてきている。
近年、電子たばこや加熱式たばこなどの従来とは異なるたばこ製品が開発・上市されている。これらの製品は燃焼を伴わずにエアロゾルを発生させる点が特徴的であり、従来の燃焼性たばこではみられるような燃焼および高温の燃焼ガスが刻みたばこ内の成分を化学反応させることに伴い生成される化学物質の発生が抑制され得ると考えられている。実際にこれらのたばこ製品を用いた成分分析の結果から、生物活性を持ついくつかの化学成分が燃焼性たばこと比較して量的に少ないことが報告されている。
喫煙物品の煙やエアロゾルに含まれる化学物質へ反応する複雑な生体応答を網羅的に解析する手法として、各種オミクス技術の活用が注目されている。特にｑＰＣＲアレイやマイクロアレイを用いた遺伝子発現量測定は、技術の大きな進歩によりデータ品質が他のオミクス技術と比較して非常に高く、公共データベースへの登録数も豊富である。そのため、アレイデータ情報を利用したメタ解析も盛んに行われている。燃焼性たばこ煙の曝露に比べ、生物活性を持つ化学物質含有量の低い電子たばこや加熱式たばこなどの煙は、気道上皮細胞中の遺伝子発現変動が抑えられていることは報告されている。しかしながら、これら生物活性を持つ化学物質が引き起こす遺伝子発現量の変動から具体的な疾病リスクを予測する手法に関しては、未だ具体的な評価手法が定まっていないのが現状である。
ＷＯ２０１３／１９００９２は、ＣＯＰＤのリスクに用いる一群の遺伝子を記載している。Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００７，１７５（６）：５７７−５８６は、ＣＯＰＤ患者特徴的な遺伝子を報告している。しかしながら、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価するのに有効な方法は未だに提供されていない。
ＷＯ２０１３／１９００９２ ＷＯ２０１６／０７５７４８ ＷＯ２０１６／０７５７４９
Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００７，１７５（６）：５７７−５８６ ＩＳＯ ３３０８
本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法、及び、加熱式たばこを提供することを目的とする。
本発明者らは、マイクロアレイデータを用いたインビトロ評価系からのたばこ製品のＣＯＰＤリスクポテンシャル評価手法を新規に構築し、三次元培養細胞モデルを用いた加熱式たばこのエアロゾル曝露による生体影響を評価したところ、本加熱式たばこのＣＯＰＤポテンシャルリスクが低いことを見出し、本発明を想到した。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法であって、
（１）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＳＭＫ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子に対する係数を、ａｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｘは１１−１５のいずれかの整数を示す。］
を算出し；
（２）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＣＯＰＤ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数を、ｂｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｙは４−１０のいずれかの整数を示す。］
を算出し；
（３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のＰＲＦ
Figure 2020145041
 として算出する、
ことを含む、前記インビトロ評価方法。
［態様２］
工程（１）において、１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づくロジスティック回帰分析により、確率ＰＳＭＫを算出する、態様１に記載のインビトロ評価方法。
［態様３］
工程（２）において、４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された係数を用いて、確率ＰＣＯＰＤを算出する、態様１または２に記載のインビトロ評価方法。
［態様４］
気道上皮細胞が、哺乳類の気道上皮細胞である、態様１−３のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様５］
気道上皮細胞がヒト気道上皮細胞、マウス気道上皮細胞、またはラット気道上皮細胞である、態様１−４のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様６］
気道上皮細胞が三次元培養細胞である、態様１−５のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様７］
気道上皮細胞が気液界面培養下である、態様１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様８］
加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞において、ＰＲＦが０．８以下の範囲である場合に、当該加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクは低いまたはない、と判断する、態様１−７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
２種類の加熱式たばこについてＰＲＦを比較し、ＰＲＦがより低い加熱式たばこの方を、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクがより低い、と判断する、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
（１）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータ、並びに、
（２）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータ
の、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法への利用。
［態様１１］
加熱式たばこであって、
再構成たばこからなるエアロゾル源を、直接または間接に電気的に加熱する、という構造的特徴を有し、
当該加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液を用いて態様１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法を行った場合に、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞における、ＰＲＦが０．８以下の範囲である、前記加熱式たばこ。
［態様１２］
再構成たばこが、平均粒径０．２ｍｍ以下の再構成たばこ顆粒であって、そして、
多孔性物質または繊維からなる担体の全て又はその一部が電気ヒーターで加熱されて生ずるプロピレングリコールとグリセリンの混合蒸気により再構成たばこ顆粒が加熱される、
態様１１に記載の加熱式たばこ。
［態様１３］
再構成たばこが、平均短辺長1ｍｍ以上、平均長辺長５ｍｍ以下の再構成たばこシートであって、巻紙にくるまれ、たばこロッドを構成し、そして、
前記たばこロッドが、巻紙の外周と接するから電気ヒーターにより加熱される、
態様１１記載の加熱式たばこ。
［態様１４］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．４μｇ／本以下のアセトルデヒドを含む、加熱式たばこ。
［態様１５］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．２μｇ／本以下のアクロレインを含む、加熱式たばこ。
［態様１６］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが６８．４μｇ／本以下のホルムアルデヒドを含む、加熱式たばこ。
本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法により、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、統計的に定量評価し、比較することが可能になった。喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価する方法は従来知られていなかったものであり、本発明によりはじめて可能になったことで、比較可能になることは科学的にも産業的にも意義が大きい。本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法により、リスク低減製品（喫煙または吸引を含む製品の使用に伴う健康リスクを低減させる可能性のある製品）の研究・開発が可能になった。
図１は、加熱式たばこにおける被加熱による温度変化の一例を示す。 図２は、加熱式たばこにおける被加熱による温度変化の一例を示す。 図３は、マイクロアレイデータの分析の結果を示す。（Ａ）は、ＣＯＰＤ発症への関与が示唆されている生体応答に関連する陽性対照試薬曝露による遺伝子発現特性の階層的クラスタリングを示す。（ｂ）は、燃焼性たばこの全煙バブリング曝露による発現変動遺伝子のベン図である。 公共データベースを用いたＣＯＰＤポテンシャルリスク値の計算結果を示す。 曝露２４時間後の加熱式たばこ（ＮＧＰ１、ＮＧＰ２）及び試験用標準巻たばこ（３Ｒ４Ｆ、１Ｒ６Ｆ）の全煙バブリング曝露を用いたＣＯＰＤポテンシャルリスク値の計算結果を平均値±標準偏差で示す。
１．喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法
本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法に関する。上記評価方法は、
（１）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータ、具体的には、マイクロアレイデータ又はｑＰＣＲ法による遺伝子発現データ、に基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＳＭＫを算出し；
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子に対する係数を示す。また、ａｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｘは１１−１５のいずれかの整数を示す。］
（２）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータ、具体的には、マイクロアレイデータ又はｑＰＣＲ法による遺伝子発現データに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＣＯＰＤを算出し；
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数を示す。また、ｂｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｙは４−１０のいずれかの整数を示す。］
（３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記たばこ製品の煙またはエアロゾルの喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のポテンシャルリスク値（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒ：ＰＲＦ）
Figure 2020145041
 として算出する、
ことを含む。
「慢性閉塞肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）は大気中の汚染物質や粉じん、微生物などの有害物質を長期間吸入曝露されることで生じる炎症性呼吸器疾患である。ＣＯＰＤは、喫煙と関係が深いと考えられている。本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクをインビトロでの統計的な定量評価方法に関する。
「たばこ製品」の種類は特に限定されない。紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品も、エアロゾル源が燃焼ではなく加熱により発生する「加熱式たばこ」も含む。加熱式たばこは、たばこロッド部を含む香味吸引器であり、たばこを燃焼させることなく、電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して発生させた蒸気と粒子状物質が混合した気体が、香味吸引器を通して引き込まれた空気中に混入される。さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過されて、たばこ・葉タバコ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。加熱式たばこにおいては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（全煙）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式たばこの端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。
加熱式たばこは、エアロゾルの発生方式別に３つの態様として、直接加熱式香味吸引器と間接加熱式（空気加熱）香味吸引器と間接加熱式（ベイパー加熱）香味吸引器が有る。直接加熱式香味吸引器とは、以下の特徴を備えるたばこロッドを含む香味吸引器である。たばこ葉や再構成たばこ又は再構成たばこシートを含むたばこロッド部が、主に電気加熱により直接加熱され、葉たばこ由来のニコチンやフレーバーを含んだエアロゾルを発生させる。間接加熱式（空気加熱）香味吸引器とは以下の特徴を備えるたばこロッドを含む香味吸引器である。たばこ葉や再構成たばこ又は再構成たばこシートを含むたばこロッド部が、電気加熱などの熱源を使用して加熱された空気により、間接的に加熱されることで葉たばこ由来のニコチンやフレーバーを含んだエアロゾルを発生させる。これらは、吸引中、たばこ葉や再構成たばこ又は再構成たばこシートから揮発性化合物が放出され、香味吸引器を通して引き込まれた空気中に混入される。放出された化合物が冷めるにつれて凝結してエアロゾルを形成し、これが消費者によって吸い込まれる。間接加熱式（ベイパー加熱）香味吸引器とは、以下の特徴を備えるたばこロッドを含む香味吸引器である。電気加熱によりエアロゾル源（液体）を加熱してエアロゾルを発生させ、そのエアロゾルが、葉たばこ由来のニコチンやフレーバーを含んだエアロゾルを発生させる。
たばこ製品のエアロゾル」とは、例えば、紙巻きタバコの煙、あるいは、香味吸引器から発生するエアロゾルすなわちガス状の物質、揮発性の物質と、粒子状物質の混合気であるエアロゾルが含む全ての成分を意味する。
「たばこ製品のエアロゾル中の粒子状物質」とは、例えば、紙巻きタバコの煙、あるいは、香味吸引器から発生するエアロゾル中のガス状、揮発性の物質を除く全ての物質を意味し、総粒子状物質（ＴＰＭ、ｔｏｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍａｔｔｅｒ）と呼称される場合もある。総粒子状物質は、たばこ業界では紙巻たばこの煙あるいは香味吸引器から発生するエアロゾルをガラスフィルターに通し、ガラスフィルターに捕集される物質を称する。一態様において、加熱式たばこのエアロゾル中の粒子状物質には、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール等を含む。
「エアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露」とは、総粒子状物質を適宜の溶媒ないし適宜の細胞の液体培地に溶かした試料溶液へ細胞を暴露する場合の他、たばこ製品のエアロゾルすなわちガス状の物質、揮発性の物質と、粒子状物質の混合気を通過させてガス状の物質、揮発性の物質と粒子状物質を溶解させた適宜の溶媒ないし適宜の液体培地を得る全煙バブリング法により得られた試料溶液へ細胞を曝露する場合も含む。
試料溶液の「溶液」は、たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を溶解できる溶液であれば特に限定されない。一態様において、溶液として、両親媒性溶媒を用いる。両親媒性溶媒は、非限定的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等を含む。
喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法は、たばこ製品から発生したエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞を利用する。試料溶液の中のたばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質の濃度、気道上皮細胞への曝露時間は、たばこ製品の種類等に応じて適宜調調整可能である。本明細書において、たばこ製品を嗜む行為は、「喫煙」を以って、「吸引」を含むたばこ製品の喫煙または吸引という使用行為の総称として使用する場合がある。
「気道上皮細胞」は、呼気・吸気の運搬経路である気管−気管支−細気管支（「気道」と総称される場合がある）の上皮組織由来の細胞である。非限定的に、気道上皮細胞は、哺乳類の気道上皮細胞であってもよい。非限定的に、気道上皮細胞は、ヒト気道上皮細胞、マウス気道上皮細胞、モルモット気道上皮細胞またはラット気道上皮細胞であってもよい。
一態様において、気道上皮細胞は三次元培養細胞である。三次元培養細胞は、二次元培養細胞と比較して生体の環境により近い環境でのインビトロ評価を可能にする。例えば、Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ社から販売されているＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）は、立体細胞培養プレートに再構成されたヒト気道上皮インビトロ３Ｄ再構成モデルであり、前記インビトロ評価方法に利用可能である。
一態様において、気道上皮細胞は気液界面培養下である。気道上皮細胞が気液界面培養下であることにより気道上皮細胞を繊毛細胞へ分化誘導が可能であり、また粒子状物質が気道上皮細胞に直接的に接するという実際の曝露形態を再現できる利点が得られる。
喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法は、
（１）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータ、具体的には、マイクロアレイデータ又はｑＰＣＲ法による遺伝子発現データに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、喫煙者と判断される確率として、以下の確率ＰＳＭＫ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子に対する係数を示す。また、ａｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｘは１１−１５のいずれかの整数を示す。］
を算出することを含む。
以下の１５個の遺伝子は、本発明において、喫煙との関連性が見出された遺伝子である。
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
これらのうち、以下の１１個の遺伝子は、変数減少法により喫煙との関連性が特に高いことが見出された遺伝子である。
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
公共データベースのマイクロアレイデータは、非限定的に、例えば、ＥＭＢＬ−ＥＢＩに登録されたマイクロアレイデータ：Ｅ−ＭＴＡＢ−１６９０，Ｅ−ＧＥＯＤ−２０２５７，Ｅ−ＧＥＯＤ−８５４５を利用することができる。
公共データを用いたロジスティック回帰分析は、例えば、公共データベースに登録されたマイクロアレイデータに付与された属性情報から、目的変数として健常人（ＨＬＴ）および喫煙者（ＳＭＫ）の区分を利用し、説明変数としてＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２の１１遺伝子を含む遺伝子のＧＣ−ＲＭＡによる正規化遺伝子発現データａｉを外挿して、非限定的に、例えば、統計分析フリーソフト「Ｒ」によるロジスティック回帰分析を行い、得られた回帰式から切片ＣＮＳ｜ＳＭＫおよび係数βｉを得ることができる。
一態様において、「少なくとも以下の１１個の遺伝子：ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２を含む１１以上の遺伝子」は、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の遺伝子である。好ましくは、１１個の遺伝子である。
前記インビトロ評価方法は、また、（２）たばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータ、具体的には、マイクロアレイデータ又はｑＰＣＲ法による遺伝子発現データに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、喫煙者のうちＣＯＰＤ患者と判断される確率として、以下の確率ＰＣＯＰＤ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数を示す。また、ｂｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｙは４−１０のいずれかの整数を示す。］
を算出する、ことを含む。
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧの４個の遺伝子は、変数減少法によりＣＯＰＤとの関連性が高いことが見出された遺伝子である。ＤＵＳＰ６は、喫煙との関連性が特に高い１１個の遺伝子には含まれないが、喫煙との関連性が見出された１５個の遺伝子のうちには含まれる。
公共データベースのマイクロアレイデータは、非限定的に、例えば、ＥＭＢＬ−ＥＢＩに登録されたマイクロアレイデータ：Ｅ−ＭＴＡＢ−１６９０，Ｅ−ＧＥＯＤ−２０２５７，Ｅ−ＧＥＯＤ−８５４５を利用することができる。
公共データを用いたロジスティック回帰式は、例えば、公共データベースに登録されたマイクロアレイデータに付与された属性情報から、目的変数として喫煙者（ＳＭＫ）およびＣＯＰＤ患者（ＣＯＰＤ）の区分を利用し、説明変数としてＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧの４遺伝子を含む遺伝子のＧＣ−ＲＭＡによる正規化遺伝子発現データｂｉを外挿して、非限定的に、例えば、統計分析フリーソフト「Ｒ」によるロジスティック回帰分析を行い、得られた回帰式から切片ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤおよび係数γｉを得ることができる。
一態様において、「ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧを含む４以上の遺伝子」は、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個である。好ましくは４個である。
そして、前記インビトロ評価方法は、（１）、（２）の結果に基づき、（３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のポテンシャルリスク値（ＰＲＦ）
Figure 2020145041
 として算出する、ことを含む。
一態様において、工程（１）において、１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
のすべての遺伝子の発現に関するマイクロアレイデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、確率ＰＳＭＫを算出する。
一態様において、工程（２）において、４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
のすべての遺伝子の発現に関するマイクロアレイデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、確率ＰＣＯＰＤを算出する。
本明細書の実施例において、ＮＧＰ（ＮＥＸＴ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＤＵＣＴ）（ＮＧＰ１、ＮＧＰ２）で、最大濃度２０００パフ／Ｌの濃度で２４時間曝露した場合、ＰＲＦは、非喫煙者で０．０７、喫煙者で０．４６、ＣＯＰＤ患者で０．８３であり、非喫煙の健常者と比較してＰＲＦの増加が認められた。なお、実施例で使用したＮＧＰ１、ＮＧＰ２は各々、本明細書の「加熱式たばこの実施態様」の項目で後述する、「第３の態様」にかかる加熱式たばこ、「第２の態様」に係る加熱式たばこ、に相当する。ＮＧＰ２の詳細については、特願２０１８−２１３４９８（未公開）にも記載されている。
前記インビトロ評価方法の一態様において、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞において、ＰＲＦが０．８以下の範囲（実施例のＣＯＰＤ患者のＰＲＦより低い）である場合に、当該加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクは低いまたはない、と判断する。非限定的に、最小濃度２００パフ／Ｌで２４時間曝露の条件下で同様の実験を行った場合も、同様にＰＲＦを算出をすることができる。
一態様において、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞において、ＰＲＦが０．４以下の範囲（実施例の喫煙者のＰＲＦより低い）である場合に、当該加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクは低いまたはない、と判断する。
前記インビトロ評価方法の一態様において、２種類の加熱式たばこについてＰＲＦを比較し、ＰＲＦがより低い加熱式たばこの方を、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクがより低い、と判断する。
本発明はまた、（１）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するマイクロアレイデータ、並びに、
（２）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するマイクロアレイデータ
の、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法への利用、に関する。
２．加熱式たばこ
本発明は、加熱式たばこに関する。前記加熱式たばこは、再構成たばこからなるエアロゾル源を、直接または間接に電気的に加熱する、という構造的特徴を有する。
当該加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液を用いて本発明のインビトロ評価方法を行った場合に、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞における、ＰＲＦが０．８以下の範囲、あるいは、ＰＲＦが０．４以下の範囲である。ＰＲＦは、発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法によって、初めて明らかにされたものである。このような低いＰＲＦを有する加熱式たばこは、本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法によって初めて想到された。
「加熱式たばこ」の態様は、「１．喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法」の項目に記載した通りである。前記加熱式たばこは、再構成たばこからなるエアロゾル源を、直接または間接に電気的に加熱する、という構造的特徴を有する。
一態様において、当該加熱式たばこの再構成たばこは、平均粒径０．２ｍｍ以上、１．２ｍｍ以下の再構成たばこ顆粒である。一態様において、多孔性物質または繊維からなる担体の全て又はその一部が電気ヒーターで加熱されて生ずるプロピレングリコールとグリセリンの混合蒸気により再構成たばこ顆粒が加熱される。一態様において、当該加熱式たばこの再構成たばこは、平均粒径０．２ｍｍ以上、平均粒径１．２ｍｍ以下である再構成たばこ顆粒であって、そして、多孔性物質または繊維からなる担体の全て又はその一部が電気ヒーターで加熱されて生ずるプロピレングリコールとグリセリンの混合蒸気により再構成たばこ顆粒が加熱される。
一態様において、再構成たばこが、平均短辺長1ｍｍ以上、平均長辺長５ｍｍ以下の再構成たばこシートである。一態様において、再構成たばこシートは、巻紙にくるまれ、たばこロッドを構成し、そして、前記たばこロッドが、巻紙の外周と接するから電気ヒーターにより加熱される。一態様において、再構成たばこが、平均短辺長1ｍｍ以上、平均長辺長５ｍｍ以下の再構成たばこシートであって、巻紙にくるまれ、たばこロッドを構成し、そして、前記たばこロッドが、巻紙の外周と接するから電気ヒーターにより加熱される。
加熱式たばこの実施態様
以下、非限定的に、加熱式たばこの実施態様を説明する。
加熱式たばこは、電気ヒーターを備える吸引器具へ挿入された状態でエアロゾルとガスの混合気を発生させ、消費者の口腔・気道・鼻腔を経由した吸引に供される物品である。形状は棒状であり全長は２０ｍｍ以上１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以上８５ｍｍ以下であってよい。
第１の態様として、形状は棒状であり、全長は２０ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、４０ｍｍ以上、５０ｍｍ以上、６０ｍｍ以上、７０ｍｍ以上、８０ｍｍ以上、８３ｍｍ、５０ｍｍ以下、６０ｍｍ以下、７０ｍｍ以下、８０ｍｍ以下、９０ｍｍ以下、１００ｍｍ以下であってよい。
第２の態様として、形状は棒状であり、全長は２０ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、４０ｍｍ以上、５０ｍｍ以上、６０ｍｍ以上、７０ｍｍ以上、８０ｍｍ以上、５５ｍｍ、５０ｍｍ以下、６０ｍｍ以下、７０ｍｍ以下、８０ｍｍ以下、９０ｍｍ以下、１００ｍｍ以下であってよい。外周長さは１５ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２２ｍｍであってよい。
第３の態様として、再構成たばこ顆粒を含むポリプロピレン製のプラスチックカプセルであって、プラスチックカプセルの形状は略円筒であり、全長は１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、４０ｍｍ以上、５０ｍｍ以上、６０ｍｍ以上、７０ｍｍ以上、４０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、６０ｍｍ以下、７０ｍｍ以下、８０ｍｍ以下、９０ｍｍ以下であってよい。
第１、第２の態様ともに、加熱式たばこは、たばこロッド部・空洞部・紙管・フィルター部からなり、フィルター部は繊維セクション又は空洞セクション又は中空紙管セクションからなる。
第１の態様に係る加熱式たばこについて説明する。
たばこロッド部：たばこロッド部は、棒状であり、その長さは加熱式たばこの長軸方向に３０ｍｍ以上５０ｍｍ以下、４２ｍｍが好ましい。たばこロッド部は、再構成たばこシートの小片が巻紙で包まれてなる。
再構成たばこ：再構成たばこシートを裁刻した小片は、短辺１ｍｍ以上、長辺１５ｍｍ以下であってよい。好ましくは長辺は１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下であってよい。再構成たばこシートは、香味成分としてニコチンを０．８０％以上０．９０％以下で含んでよい。再構成たばこシートは、香味成分としてメンソールを含んでよい。その場合、メンソールはたばこロッド部１本あたり０．３ｍｇ以上５．３ｍｇ以下で含んでよい。再構成たばこシートは、保湿剤としてアルコールを含んでよくプロピレングリコールを０．０４％以上で０．５８％以下、グリセリンを１２．４％以上１４．３％以下で含んでよい。再構成たばこシートは、保湿剤として糖類・単糖・二糖を含んでよく、単糖・二糖を合計３．７％以下含んでよく、フルクトースを２．１％以上２．７％以下、グルコースを１．３％以上１．８％以下、スクロースを０．２％以上０．４％以下で含んでよい。再構成たばこシートは、ｐＨ調整剤として有機酸を含んでよく、クエン酸を４．１ｍｇ／ｇ以上４．６ｍｇ／ｇ以下、リンゴ酸を３０．９ｍｇ／ｇ以上３４．４ｍｇ／ｇ以下、３０．９ｍｇ／ｇ以上３４．４ｍｇ／ｇ以下、コハク酸を０．２ｍｇ／ｇ以上０．３ｍｇ／ｇ以下で、ギ酸を０．１ｍｇ／ｇ以上０．２ｍｇ／ｇ以下で含んでよい。
巻紙：巻紙は、通気度６４．０（Ｃｏｒｒｅｓｔａ Ｕｎｉｔ）以上６７．０（Ｃｏｒｒｅｓｔａ Ｕｎｉｔ）以下であってよく、坪量２６．２（ｇ／ｍ２）以上２６．４（ｇ／ｍ２）以下であってよく、炭酸カルシウム含有量は２５．２％以上２５．５％以下であってよく、助燃剤は０．７％であってよい。
フィルター部：フィルター部は、棒状であり、その長さは加熱式たばこの長軸方向に５ｍｍ以上１８ｍｍ以下が好ましい。フィルター部はアセテート繊維フィルターと中空紙管からなる。アセテート繊維フィルターの長さは長軸方向に５ｍｍ以上１８ｍｍ以下であって良く、望ましくは８ｍｍである。アセテート繊維フィルターを構成するアセテート繊維は、任意の断面形状であってよく、丸断面形状、Ｙ字型断面形状、Ｘ字型断面形状であってよい。中空紙管の長さは長軸方向に５ｍｍ以上１８ｍｍ以下であって良く、望ましくは８ｍｍである。
空洞部：空洞部は、空洞部のフィルター部側の端部からフィルター部へ５ｍｍ以上１６ｍｍ以下延伸しかつたばこロッド部側の端部からたばこロッド部へ５ｍｍ以下延伸するチップペーパー内面と、フィルター部の端面、たばこロッドを構成する再構成たばこシート刻みの端面で画分される。空洞部は、棒状であり、その長さは加熱式たばこの長軸方向に２０ｍｍ以上３０ｍｍ以下であってよく、望ましくは２５ｍｍである。
チップペーパー：チップペーパーは、空洞部を構成し、円周方向に整列した開孔が２以上の複数個所設けられてよい。開孔の列は１列であってよく、２以上の複数列設けられてよい。チップペーパーは、テープ状の紙片を螺旋状に成型し定長に切断された紙管で内貼りされてよい。
第２の態様に係る加熱式たばこについて説明する。
たばこロッド部：たばこロッド部は、棒状であり、その長さは加熱式たばこの長軸方向に１５ｍｍ以上２５ｍｍ以下、２２ｍｍが好ましい。たばこロッド部は、再構成たばこシートの小片が巻紙で包まれてなる。再構成たばこシートを裁刻した小片は、短辺１ｍｍ以上、長辺１５ｍｍ以下であってよく、好ましくは長辺は１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下であってよい。
再構成たばこ：再構成たばこシートの小片は、たばこロッド部に２００ｍｇ以上３００ｍｇ、２２０ｍｇ以上２８０ｍｇ以下、２４０ｍｇ以上２６０ｍｇ以下、２５０ｍｇ以上２６０ｍｇ、２５５ｍｇ又は２６０ｍｇ含まれてよい。
巻紙：巻紙は、通気度６４．０（Ｃｏｒｒｅｓｔａ Ｕｎｉｔ）以上６７．０（Ｃｏｒｒｅｓｔａ Ｕｎｉｔ）以下であってよく、坪量２６．２（ｇ／ｍ２）以上２６．４（ｇ／ｍ２）以下であってよく、炭酸カルシウム含有量は２５．２％以上２５．５％以下であってよく、助燃剤は０．７％であってよい。
フィルター部：フィルター部は、棒状であり、その長さは加熱式たばこの長軸方向に５ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ以上４０ｍｍ以下、３５ｍｍが好ましい。フィルター部はアセテート繊維フィルターと中空紙管と中空アセテート管からなる。
アセテート繊維フィルターの長さは長軸方向に５ｍｍ以上３５ｍｍ以下であって良く、望ましくは７ｍｍである。アセテート繊維フィルターを構成するアセテート繊維は、任意の断面形状であってよく、丸断面形状、Ｙ字型断面形状、Ｘ字型断面形状であってよい。
中空紙管の長さは長軸方向に５ｍｍ以上３５ｍｍ以下であって良く、望ましくは２０ｍｍである。中空紙管は、外気取入孔として、円周方向に整列した開孔が、２以上の複数個所、望ましくは１５箇所設けられてよい。外気取入孔の開孔の列は１列であってよく、２以上の複数列設けられてもよい。
中空アセテート管は、アセテート繊維からなる壁厚１．２ｍｍのアセテート管であり、中空アセテート管の長さは長軸方向に５ｍｍ以上３５ｍｍ以下であって良く、望ましくは８ｍｍである。
第３の態様に係る加熱式たばこは、例えばＷＯ２０１６／０７５７４８、ＷＯ２０１６／０７５７４９に記載されている非燃焼型香味吸引器を含む。非燃焼型香味吸引器は、電源ユニットと、エアロゾル源と霧化部を含む第１カートリッジと、第２カートリッジとを有する。第２カートリッジは、霧化部によって霧化されたエアロゾルを通すことによってエアロゾルに香味を付与する。ここで、香味源を加熱せずにエアロゾルに香味を付与することができることに留意すべきである。また、香味源から実質的にエアロゾルが発生しないことに留意すべきである。霧化部は燃焼を伴わずにエアロゾル源を霧化する。第２カートリッジは前記エアロゾルに香味を付与する香味源を収容する。香味源は、非燃焼型香味吸引器が発生するエアロゾルに香味を付与する再構成たばこからなる顆粒によって構成される。再構成たばこ顆粒のサイズは、０．２ｍｍ以上１．２ｍｍ以下であることが好ましい。さらには、再構成たばこ顆粒のサイズは、０．２ｍｍ以上０．７ｍｍ以下であることが好ましい。香味源を構成する再構成たばこ顆粒のサイズが小さいほど、比表面積が増大するため、香味源を構成する顆粒から香喫味成分が揮散し易い。
被加熱の実施態様
以下、非限定的に、加熱式たばこにおける被加熱の実施態様を説明する。
第１の態様に係る加熱式たばこは、２本で１組の発熱線を備え樹脂で被覆された１枚のフィルム状ヒーターにより加熱されエアロゾルとガスの混合気を発生させる。加熱式たばこは、ヒーターによる外周からの加熱と、吸引動作に伴いたばこロッド部の反吸口端から再構成たばこシート小片の集合体内へ導入される外気により冷却される。従って、加熱式たばこがエアロゾルとガスの混合気を発生させる際の再構成たばこシート小片の集合体の温度分布は一様ではなく、次の３か所：反吸口側端から１ｍｍの位置（Ｔｏｐ）・中央位置（Ｍｉｄｄｌｅ）・吸口側端から１ｍｍの位置（Ｅｎｄ）に挿入した熱電対は、互いに異なる温度変化を示し、同じ位置であっても外周部（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）と中心部（Ｃｅｎｔｅｒ）では異なる温度変化の態様を示す。さらに、Ｅｎｄ以外の位置では、吸引動作に伴いたばこロッド部内へ導入される外気により冷却され、短時間の温度下降がある。
Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−Ｔｏｐにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね５相に分かれる。第１相は、加熱開始から４０秒までである。温度は、４０秒以内に７５℃へ上昇する。第２相は、４０秒以降から１３５秒までである。温度は、７５℃から１５０℃まで上昇し、それを維持する。第３相は、１３５秒以降から１５０秒までである。温度は、１５０℃から２００℃まで上昇する。第４相は、１５０秒以降から２２０秒までである。温度は、２００℃から２３０℃まで上昇する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２３０℃から室温へ下降する。
Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−Ｍｉｄｄｌｅにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね５相に分かれる。第１相は、加熱開始から２５秒までである。温度は、１５０℃へ上昇する。第２相は、２５秒以降から１３５秒までである。温度は、１５０℃から２００℃まで上昇する。第３相は、１３５秒以降から１５０秒までである。温度は、２００℃から２３０℃まで上昇する。第４相は、１５０秒以降から２２０秒までである。温度は、２３０℃から２４０℃まで上昇する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２４０℃から室温へ下降する。
Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−Ｅｎｄにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね４相に分かれる。第１相は、加熱開始から２５秒までである。温度は、２５秒以内に２００℃へ上昇する。第２相は、２５秒以降から１５０秒までである。温度は、２００℃から２４０℃まで上昇し、それを維持する。第３相は、１５０秒以降から２２０秒までである。温度は、２４０℃から２００℃まで下降する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２００℃から室温へ下降する。
Ｃｅｎｔｅｒ−Ｔｏｐにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね５相に分かれる。第１相は、加熱開始から４０秒までである。温度は、５０℃へ上昇する。第２相は、４０秒以降から１３５秒までである。温度は、５０℃から１２５℃まで上昇する。第３相は、１３５秒以降から１５０秒までである。温度は、１５０℃から１８０℃まで上昇する。第４相は、１５０秒以降から２２０秒までである。温度は、２００℃から２１０℃まで上昇する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２１０℃から室温へ下降する。
Ｃｅｎｔｅｒ−Ｍｉｄｄｌｅにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね５相に分かれる。第１相は、加熱開始から２５秒までである。温度は、１００℃へ上昇する。第２相は、２５秒以降から１３５秒までである。温度は、１００℃から１８０℃まで上昇する。第３相は、１３５秒以降から１５０秒までである。温度は、１８０℃から２００℃まで上昇する。第４相は、１５０秒以降から２２０秒までである。温度は、２００℃から２４０℃まで上昇する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２４０℃から室温へ下降する。
Ｃｅｎｔｅｒ−Ｅｎｄにおいて、加熱式たばこの温度変化は、概ね４相に分かれる。１相は、加熱開始から２５秒までである。温度は、１００℃へ上昇する。第２相は、２５秒以降から４５秒までである。温度は、１００℃から１５０℃まで上昇する。第３相は、４５秒以降から１３５秒までである。温度は、１５０℃から２３０℃まで上昇する。第４相は、１３５秒以降から２２０秒までである。温度は、２３０℃から２００℃まで下降する。終相は、２２０秒以降である。温度は、２００℃から室温へ下降する。
上記の温度変化は、各相の遷移に伴い連続的である。
第２の態様に係る加熱式たばこの被加熱も第１の加熱式たばこの被加熱と同様に行うことができる。
一例として、第１および第２の態様の加熱式たばこに、上記の温度変化をもたらすヒーターは、図１、図２にしめすような温度変化の態様を示してよい。
第１箇所におけるヒーターの温度変化は、概ね４相に分かれてよい。第１相は、加熱開始から２５秒までである。ヒーターの温度は、吸引開始から２５秒以内に２００℃へ上昇する。第２相は、２５秒から１５０秒までである。ヒーターの温度は、３０秒から４５秒までで２３０℃へ上昇し、以降１５０秒まで約２３０℃を維持する。第３相は、１５０秒以降から２２０秒までである。ヒーターの温度は、１５０秒以降は２２０℃へ下降し２２０秒まで２２０℃を維持する。終相は、２２０秒以降である。ヒーターの温度は、２２０℃から常温へ下降する。
第２箇所におけるヒーターの温度変化は、概ね４相に分かれてよい。第１相は、吸引開始から７５秒までである。ヒーターの温度は、吸引開始から７５秒以内に１００℃まで上昇する。第２相は、７５秒から１３５秒までである。ヒーターの温度は、７５秒から８０秒までで１４０℃へ上昇し、以降１３５秒までで１５０℃へ上昇する。第３相は、１３５秒から２２０秒までである。ヒーターの温度は、１３５秒から１５０秒までで２３０℃へ上昇し、１５０秒から２２０秒まで２３０℃を維持する。終相は、２２０秒以降である。ヒーターの温度は、２３０℃から常温へ下降する。第１・第２箇所における温度変化は、各相の遷移に伴い連続的である。
第３の態様に係る加熱式たばこの被加熱は、例えば、以下のように行う。霧化部は電熱線、電磁誘導型加熱機構または超音波発振子を含み、使用者による吸引動作の際に電源ユニットから電流が供給されて発熱または動作し、第１カートリッジが含むエアロゾル源を霧化させる。霧化部によって霧化されたエアロゾルを通すことによってエアロゾルに香味を付与する。霧化されたエアロゾルが第２カートリッジを通過する際の、第２カートリッジ内の雰囲気の温度は、常温以上、２６℃以上、４０℃以下、好ましくは３０℃以下である。ここで、香味源は加熱されずにエアロゾルに香味を付与することができることに留意すべきである。
加熱式たばこのエアロゾルとガスの混合気成分
以下、被限定的に、加熱式たばこのエアロゾルとガスの混合気成分の実施態様を説明する。
カナダ保健省が定める喫煙条件（ＣＩＲ条件）、ただし加熱式たばこのフィルター部に設けられた開孔部は塞がない条件で、６回又は８回の喫煙動作により発生させたエアロゾルとガスの混合気において、たばこロッド１本あたりのカルボニル化合物の量は以下の態様であって良い。
第１の態様において、ホルムアルデヒドは、１００．００（μｇ／本）以下が好ましい。望ましくは７０．００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは。５０．００（μｇ／本）以上、７０．００（μｇ／本）以下が好ましい。最も望ましくは５７．６０（μｇ／本）以上、６８．４０（μｇ／本）以下であってよい。
第２の態様として、ホルムアルデヒドは、４０．００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは３７．００（μｇ／本）以下である。
第１の態様において、アセトアルデヒドは、３．０００（μｇ／本）以下が好ましい。望ましくは２．０００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは。０．７５０（μｇ／本）以上、２．０００（μｇ／本）以下が好ましい。最も望ましくは０．８００（μｇ／本）以上、１．４００（μｇ／本）以下であってよい。
第２の態様として、アセトアルデヒドは、１．０００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは０．９４０（μｇ／本）以下が好ましい。
第１の態様において、アクロレインは、３．０００（μｇ／本）以下が好ましい。望ましくは２．０００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは、０．７５０（μｇ／本）以上、１．５００（μｇ／本）以下が好ましい。最も望ましくは０．８００（μｇ／本）以上、１．２００（μｇ／本）以下であってよい。
第２の態様として、アクロレインは、０．３００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは０．２６５（μｇ／本）以下が好ましい。
第３の態様において、ホルムアルデヒド、アクロレイン、アセトアルデヒドは、検出限界以下であり、現在の分析技術において０．０００（μｇ／本）である。
カナダ保健省が定める喫煙条件（ＣＩＲ条件）、ただし加熱式たばこのフィルター部に設けられた開孔部は塞がない条件で、８回の喫煙動作により発生させたエアロゾルとガスの混合気において、たばこロッド１本あたりのＴＳＮＡｓの量は、カナダ保健省が定める喫煙条件（ＣＩＲ条件）で喫煙した３Ｒ４Ｆ紙巻たばこの１０％以下であって良い。ホルムアルデヒドは、０％以上、０．８０％以上、１．３０％以下であってよい。アセトアルデヒドは、０％以上、３．３０％以上、３．８０％以下であってよい。アクロレインは、０％以上、０．４０％以上、０．７０％以下であってよい。
一態様において、加熱式たばこは、発生するエアロゾルが１．４μｇ／本以下のアセトアルデヒドを含む。
一態様において、加熱式たばこは、発生するエアロゾルが１．２μｇ／本以下のアクロレインを含む。
一態様において。加熱式たばこは、発生するエアロゾルが６８．４μｇ／本以下のホルムアルデヒドを含む。
カナダ保健省が定める喫煙条件（ＣＩＲ条件）、ただし加熱式たばこのフィルター部に設けられた開孔部は塞がない条件で、６回又は８回の喫煙動作により発生させたエアロゾルとガスの混合気において、たばこロッド１本あたりのニコチン、グリセリン、プロピレングリコールの量は、以下の態様であって良い。
第１の態様において、ニコチンは０．２４０ｍｇ／本以上０．５１０ｍｇ／本以下、グリセリンは０．７００ｍｇ／本以上２．９００ｍｇ／本以下、プロピレングリコールは０．０２０ｍｇ／本以上０．２７０ｍｇ／本以下であってよい。
第２の態様において、ニコチンは０．４００ｍｇ／本以上０．５００ｍｇ／本以下、グリセリンは２．０００ｍｇ／本以上２．５００ｍｇ／本以下、プロピレングリコールは０．４００ｍｇ／本以上０．５００ｍｇ／本以下であってよい。
ＣＲＭ法（ＣＯＲＲＥＳＴＡ ＲＥＣＯＭＭＥＮＤＥＤ ＭＥＴＨＯＤ Ｎｏ. ８１）条件に準拠し、第３の態様において、５０回の吸煙動作で発生させたエアロゾルとガスの混合気において、ニコチンは１．０００ｍｇ／本以上１．５００ｍｇ／本以下、グリセリンは２０．００ｍｇ／本以上３０．００ｍｇ／本以下、プロピレングリコールは４０．００ｍｇ／本以上６０．００ｍｇ／本以下であってよい。
本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法であり、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患を、従来知られていなかった喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価する方法を提供するものである。本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価する方法の利用により、上記のような、リスク低減製品（喫煙または吸引に伴う健康リスクを低減させる可能性のある加熱式たばこ）を提供するものである。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１ 細胞培養
ヒト気道上皮細胞ＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）はＥｐｉｔｈｅｌｉｘ社より購入した。試験には３７℃、５％ ＣＯ２環境下で１０日間培養したものを使用し、培養時は２−３日ごとに培地交換を行った。
実施例２ マイクロアレイ試験
ＣＯＰＤの発症は、活性酸素由来の酸化ストレス、長期的な酸化ストレスに伴う炎症応答、ＤＮＡ損傷に起因する、と仮定し、これら生体応答を誘起する物質を陽性対照試薬とした曝露実験を行った。
具体的には、先ず、単回曝露試験として、ＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）に対し、任意の濃度でＮａＣｌＯ、ｔＢＨＱ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、シスプラチン、ブレオマイシンの各物質を陽性対照試薬として添加した。ＮａＣｌＯ及びｔＢＨＱは酸化ストレス、ＴＮＦα及びＩＬ−１βは炎症応答、シスプラチン及びブレオマイシンはＤＮＡ損傷の各応答を誘起する。各物質の添加の４時間後にｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ抽出にはキアゲン社のＲＮｅａｓｙを使用した。ｍＲＮＡ抽出後、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いてマイクロアレイデータを取得した（データ１：陽性対照試薬曝露データ）。
同様に、参照シガレットとして試験用標準紙巻たばこ３Ｒ４Ｆを使用し、ＩＳＯ（国際標準化機構）方式（ＩＳＯ：３３０８）に準拠した方法で発生させた主流煙を培地中に通して回収した（全煙バブリング溶液）。３Ｒ４Ｆを０．５本／Ｌ、１．０本／Ｌ、２．０本／Ｌの濃度で調整した全煙バブリング溶液を作製し、上記同様の手法により細胞に添加、ｍＲＮＡ抽出、マイクロアレイデータの取得を行った（データ２：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット曝露データ）。
次に、頻回曝露試験として、３Ｒ４Ｆおよび第３の態様に係る加熱式たばこの主流煙からそれぞれＩＳＯ方式、ＣＲＭ法（ＣＯＲＲＥＳＴＡ ＲＥＣＯＭＭＥＮＤＥＤ ＭＥＴＨＯＤ Ｎｏ. ８１）で発生させた主流煙を回収し、取得した全煙バブリング溶液を希釈することで複数濃度の試験液を調整した（３Ｒ４Ｆ：２５−２００パフ／Ｌ、１Ｒ６Ｆ：５０−２００パフ／Ｌ、ＮＧＰ１：２５０−２０００パフ／Ｌ、ＮＧＰ２：２００−２０００パフ／Ｌ）。
加熱式たばこについては、３Ｒ４Ｆ及び１Ｒ６Ｆの対照試料よりも１０倍多い回数を捕集することで細胞に曝露されるニコチン量が３Ｒ４Ｆ及び１Ｒ６Ｆと同程度かそれ以上になるように調整した。即ち、細胞に曝露される総粒子状物質が、３Ｒ４Ｆ及び１Ｒ６Ｆの対照試料と比較して１０倍多い換算となる試料を調製した。
これらの試験液をＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）に添加し、２４時間曝露を行った。曝露後、ｍＲＮＡの抽出を行い、マイクロアレイデータの取得を行った（データ３：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット＆ＮＧＰ１曝露データ、データ４：１Ｒ６Ｆリファレンスシガレット＆ＮＧＰ２曝露データ）。
実施例３ マイクロアレイデータ解析
実施例２で得られたデータ１：陽性対照試薬曝露データ、データ２：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレットデータ、データ３：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット＆ＮＧＰ１曝露データ、データ４：１Ｒ６Ｆリファレンスシガレット＆ＮＧＰ２曝露データ、および公共データベースのマイクロアレイデータ（Ｅ−ＭＴＡＢ−１６９０，Ｅ−ＧＥＯＤ−２０２５７，Ｅ−ＧＥＯＤ−８５４５）のＣＥＬファイルに関し、試験ごとにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ｖｅｒ． １４．９（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）による正規化を行った。正規化のアルゴリズムとしてはＧＣ−Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ（ＧＣ−ＲＭＡ）を用い、全サンプルの平均値を用いたベースライン補正を行った。正規化後のデータに対し、統計分析フリーソフト「Ｒ」を使用して遺伝子名のアノテーションを行った。
実施例４ データ分析
本実施例では、実施例３で得られたマイクロアレイデータの分析を行った。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇのアルゴリズムを用い、ユークリッド距離を用いたウォード法によりクラスター解析を行った。ロジスティック回帰分析に関しては統計分析フリーソフト「Ｒ」を使用し、ライブラリーとしてＭＡＳＳ，ｃａｒｅｔ，ｄａｔａ．ｔａｂｌｅを用い、ロジスティック回帰分析を行った。
データ１：陽性対照試薬曝露データに関しては、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇを用いてクラスター解析を行い、共通した変動特徴を有する遺伝子群を抽出した。
データ２：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット曝露データに関しては、各たばこ煙濃度曝露時に共通して変動する遺伝子群を抽出した。
データ１：陽性対照試薬曝露データとデータ２：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット曝露データで抽出された遺伝子群を比較したところ、共通する遺伝子１５個（ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２）が抽出された（図３）。これら遺伝子の機能、および閉塞性肺疾患との関連性について既報が存在するかどうかを調査した結果を表１に示す。
Figure 2020145041
上記１５個の遺伝子の遺伝子群を用いて、マイクロアレイデータベースに存在する健常人とＣＯＰＤ患者（それぞれＮＳ群、ＣＯＰＤ群と称す）の肺のマイクロアレイデータ（Ｅ−ＭＴＡＢ−１６９０，Ｅ−ＧＥＯＤ−２０２５７，Ｅ−ＭＴＡＢ−８５４５）を用いたロジスティック回帰による判別分析を行った。結果を表２に示す。
Figure 2020145041
ロジスティック回帰モデルからの交差検証結果（５重の交差検証を独立に１００回繰り返した。統計分析フリーソフト「Ｒ」を用いた統計解析の結果から、本発明のモデルによるＮＳ群をＮＳ群と判別する精度が０．８２６、ＣＯＰＤ群をＣＯＰＤ群と判別する精度が０．８７１、総合的な精度が０．８５３１と、いずれにおいても非常に高い精度であった。このことは、ヒト気道上皮細胞のインビトロの３ＤモデルにおいてＣＯＰＤリスク評価が可能な遺伝子が抽出できたことを意味する。
実施例５ ロジスティック回帰分析によるリスク評価
本実施例では、実施例４で見出された１５個の遺伝子（ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２）の遺伝子群を用いて、実際の健常人、喫煙者、およびＣＯＰＤ患者の公共マイクロアレイデータを使用したロジスティック回帰分析による判別を行った。
変数減少法（寄与度の高い遺伝子をＡＩＣ（赤池情報量基準）ないしＢＩＣ（ベイズ情報基準）を基に算出する方法）によりＡＩＣないしＢＩＣが最も少なくなる遺伝子群についてそれぞれ探索した。その結果、健常人と喫煙者の判別に関しては１１遺伝子（ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２）、喫煙者とＣＯＰＤ患者の判別に関しては４遺伝子（ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ）が判別における寄与の高い遺伝子として抽出された。変数減少後の遺伝子を用いたロジスティック回帰式の切片および係数の値（Ｅｓｔｉｍａｔｅ）、またそれらの統計値（Ｓｔｄ．Ｅｒｒｏｒ、Ｚ ｖａｌｕｅ、Ｐｒ（＞｜Ｚ｜））について、結果を以下の表３に示す。
Figure 2020145041
各ロジスティック回帰式で算出される確率からポテンシャルリスク値（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒ，ＰＲＦ）を算出した。発症確率およびポテンシャルリスク値は下記のように算出した。
（ｉ）１１個の遺伝子（ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２）の発現に関するマイクロアレイデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率を算出した。
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子対する係数を、ａｉはマイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値を示す。切片、係数の値は表３に示す。］
（ｉｉ）４個の遺伝子（ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ）の発現に関するマイクロアレイデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された係数を用いて、以下の確率を算出した。
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数、ｂｉはマイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値を示す。切片、係数の値は表３に示す。］
（ｉｉｉ）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記紙巻束たばこの煙の吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のＰＲＦ
Figure 2020145041
 として算出した。
上記計算式を用いて健常人（ＮＳ）、健常な喫煙者（ＳＭＫ）、ＣＯＰＤ患者（ＣＯＰＤ）のＰＲＦを算出した。結果を、図４に示す。図４に示される通り、ＰＲＦは、非喫煙者で０．０６、喫煙者で０．４６、ＣＯＰＤ患者で０．８３であり、非喫煙の健常者と比較して、ＰＲＦの増加が認められた。
実施例６ 種々の濃度、種々の曝露期間の香味吸引器に対するリスク評価
実施例５に記載の回帰式を用いて、各種たばこ製品の種々の濃度、種々の曝露期間について、頻回曝露試験のＰＲＦを算出した。結果を図５に示す。ＮＧＰ曝露群のＰＲＦの平均値はいずれの濃度、曝露期間においても上記で設定した範囲に収まることが明らかとなった。
喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法によりリスク評価を行ったところ、既存の紙巻きたばこと比べてＮＧＰのＰＲＦが非常に低いことが明らかとなった。
本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患を従来知られていなかった喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価するために利用できる。本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法により、リスク低減製品（喫煙または吸引に伴う健康リスクを低減させる可能性のある製品）の研究・開発に利用できる。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法であって、
（１）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＳＭＫ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子に対する係数を、ａｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｘは１１−１５のいずれかの整数を示す。］
を算出し；
（２）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＣＯＰＤ
Figure 2020145041
 ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数を、ｂｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｙは４−１０のいずれかの整数を示す。］
を算出し；
（３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のＰＲＦ
Figure 2020145041
 として算出する、
ことを含む、前記インビトロ評価方法。
［態様２］
工程（１）において、１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づくロジスティック回帰分析により、確率ＰＳＭＫを算出する、態様１に記載のインビトロ評価方法。
［態様３］
工程（２）において、４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された係数を用いて、確率ＰＣＯＰＤを算出する、態様１または２に記載のインビトロ評価方法。
［態様４］
気道上皮細胞が、哺乳類の気道上皮細胞である、態様１−３のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様５］
気道上皮細胞がヒト気道上皮細胞、マウス気道上皮細胞、またはラット気道上皮細胞である、態様１−４のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様６］
気道上皮細胞が三次元培養細胞である、態様１−５のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様７］
気道上皮細胞が気液界面培養下である、態様１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
［態様８］
加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞において、ＰＲＦが０．８以下の範囲である場合に、当該加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクは低いまたはない、と判断する、態様１−７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
２種類の加熱式たばこについてＰＲＦを比較し、ＰＲＦがより低い加熱式たばこの方を、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクがより低い、と判断する、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
（１）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータ、並びに、
（２）以下の１５個の遺伝子：
ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータ
の、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法への利用。
［態様１１］
加熱式たばこであって、
再構成たばこからなるエアロゾル源を、直接または間接に電気的に加熱する、という構造的特徴を有し、
当該加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液を用いて態様１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法を行った場合に、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞における、ＰＲＦが０．８以下の範囲である、前記加熱式たばこ。
［態様１２］
再構成たばこが、平均粒径０．２ｍｍ以下の再構成たばこ顆粒であって、そして、
多孔性物質または繊維からなる担体の全て又はその一部が電気ヒーターで加熱されて生ずるプロピレングリコールとグリセリンの混合蒸気により再構成たばこ顆粒が加熱される、
態様１１に記載の加熱式たばこ。
［態様１３］
再構成たばこが、平均短辺長1ｍｍ以上、平均長辺長５ｍｍ以下の再構成たばこシートであって、巻紙にくるまれ、たばこロッドを構成し、そして、
前記たばこロッドが、巻紙の外周と接するから電気ヒーターにより加熱される、
態様１１記載の加熱式たばこ。
［態様１４］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．４μｇ／本以下のアセトルデヒドを含む、加熱式たばこ。
［態様１５］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．２μｇ／本以下のアクロレインを含む、加熱式たばこ。
［態様１６］
態様１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが６８．４μｇ／本以下のホルムアルデヒドを含む、加熱式たばこ。
「たばこ製品」の種類は特に限定されない。紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品も、エアロゾルが燃焼ではなく加熱により発生する「加熱式たばこ」も含む。加熱式たばこは、たばこロッド部を含む香味吸引器であり、たばこを燃焼させることなく、電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して発生させた蒸気と粒子状物質が混合した気体が、香味吸引器を通して引き込まれた空気中に混入される。さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過されて、たばこ・葉タバコ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。加熱式たばこにおいては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（全煙）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式たばこの端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。
喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法は、たばこ製品から発生したエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞を利用する。試料溶液の中のたばこ製品のエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質の濃度、気道上皮細胞への曝露時間は、たばこ製品の種類等に応じて適宜調整可能である。本明細書において、たばこ製品を嗜む行為は、「喫煙」を以って、「吸引」を含むたばこ製品の喫煙または吸引という使用行為の総称として使用する場合がある。
加熱式たばこのエアロゾルとガスの混合気成分
以下、非限定的に、加熱式たばこのエアロゾルとガスの混合気成分の実施態様を説明する。
第１の態様において、ホルムアルデヒドは、１００．００（μｇ／本）以下が好ましい。望ましくは７０．００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは、５０．００（μｇ／本）以上、７０．００（μｇ／本）以下が好ましい。最も望ましくは５７．６０（μｇ／本）以上、６８．４０（μｇ／本）以下であってよい。
第１の態様において、アセトアルデヒドは、３．０００（μｇ／本）以下が好ましい。望ましくは２．０００（μｇ／本）以下が好ましい。さらに望ましくは、０．７５０（μｇ／本）以上、２．０００（μｇ／本）以下が好ましい。最も望ましくは０．８００（μｇ／本）以上、１．４００（μｇ／本）以下であってよい。
一態様において、加熱式たばこは、発生するエアロゾルが６８．４μｇ／本以下のホルムアルデヒドを含む。
本発明は、喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法であり、従来知られていなかった喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価する方法を提供するものである。本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価する方法の利用により、上記のような、リスク低減製品（喫煙または吸引に伴う健康リスクを低減させる可能性のある加熱式たばこ）を提供するものである。
参照シガレットとして試験用標準紙巻たばこ３Ｒ４Ｆを使用し、ＩＳＯ（国際標準化機構）方式（ＩＳＯ：３３０８）に準拠した方法で発生させた主流煙を培地中に通して回収した（全煙バブリング溶液）。３Ｒ４Ｆを０．５本／Ｌ、１．０本／Ｌ、２．０本／Ｌの濃度で調整した全煙バブリング溶液を作製し、上記同様の手法により細胞に添加、ｍＲＮＡ抽出、マイクロアレイデータの取得を行った（データ２：３Ｒ４Ｆリファレンスシガレット曝露データ）。
Figure 2020145041
本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法は、従来知られていなかった喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを統計的に定量評価するために利用できる。本発明の喫煙または吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法により、リスク低減製品（喫煙または吸引に伴う健康リスクを低減させる可能性のある製品）の研究・開発に利用できる。

Claims (16)

  1. 吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法であって、
    （１）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
    のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
    を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＳＭＫ
    Figure 2020145041
     ［上記式において、ＣＮＳ｜ＳＭＫは切片を、βｉは各々の遺伝子に対する係数を、ａｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｘは１１−１５のいずれかの整数を示す。］
    を算出し；
    （２）加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液に曝露した気道上皮細胞における以下の１５個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１ Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
    のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
    ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
    を含む４以上の遺伝子の発現に関するに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された切片および係数を用いて、以下の確率ＰＣＯＰＤ
    Figure 2020145041
     ［上記式において、ＣＳＭＫ｜ＣＯＰＤは切片を、γｉは各々の遺伝子対する係数を、ｂｉは遺伝子発現データであり、マイクロアレイデータのＧＣ−ＲＭＡによる正規化後の値またはｑＰＣＲ法による遺伝子発現の定量値を示す。ｙは４−１０のいずれかの整数を示す。］
    を算出し；
    （３）確率ＰＳＭＫおよび確率ＰＣＯＰＤから、前記加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクを、以下のＰＲＦ
    Figure 2020145041
     として算出する、
    ことを含む、前記インビトロ評価方法。
  2. 工程（１）において、１１個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
    のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づくロジスティック回帰分析により、確率ＰＳＭＫを算出する、請求項１に記載のインビトロ評価方法。
  3. 工程（２）において、４個の遺伝子：
    ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
    のすべての遺伝子の発現に関するデータに基づき、あらかじめ公共データを用いたロジスティック回帰分析により算出された係数を用いて、確率ＰＣＯＰＤを算出する、請求項１または２に記載のインビトロ評価方法。
  4. 気道上皮細胞が、哺乳類の気道上皮細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
  5. 気道上皮細胞がヒト気道上皮細胞、マウス気道上皮細胞、またはラット気道上皮細胞である、請求項１−４のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
  6. 気道上皮細胞が三次元培養細胞である、請求項１−５のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
  7. 気道上皮細胞が気液界面培養下である、請求項１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法。
  8. 加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞において、ＰＲＦが０．８以下の範囲である場合に、当該加熱式たばこの吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクは低いまたはない、と判断する、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ２種類の加熱式たばこについてＰＲＦを比較し、ＰＲＦがより低い加熱式たばこの方を、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクがより低い、と判断する、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
  10. （１）以下の１５個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
    のうちの少なくとも以下の１１個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＡＤＭ，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＨＩＬＰＤＡ，ＥＧＬＮ３，ＣＸＣＲ４，ＡＲＥＧ，ＦＢＸＯ３２
    を含む１１以上の遺伝子の発現に関するデータ、並びに、
    （２）以下の１５個の遺伝子：
    ＴＸＮＩＰ，ＥＦＮＡ１，ＣＹＰ１Ｂ１，ＡＤＭ，ＡＲＥＧ，ＤＵＳＰ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＩＧＦＢＰ３，ＷＮＴ５Ａ，ＣＸＣＲ４，ＰＨＬＤＡ１，ＨＩＬＰＤＡ，ＺＢＥＤ２，ＥＧＬＮ３，ＦＢＸＯ３２
    のうちの少なくとも以下の４個の遺伝子：
    ＥＦＮＡ１，ＴＸＮＩＰ，ＤＵＳＰ６，ＡＲＥＧ
    を含む４以上の遺伝子の発現に関するデータ
    の、吸引による慢性閉塞性肺疾患のリスクのインビトロ評価方法への利用。
  11. 加熱式たばこであって、
    再構成たばこからなるエアロゾル源を、直接または間接に電気的に加熱する、という構造的特徴を有し、
    当該加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む試料溶液を用いて請求項１−６のいずれか１項に記載のインビトロ評価方法を行った場合に、加熱式たばこのエアロゾルあるいはエアロゾル中の粒子状物質を含む溶液を、最大濃度２０００パフ／Ｌで２４時間曝露した気道上皮細胞における、ＰＲＦが０．８以下の範囲である、前記加熱式たばこ。
  12. 再構成たばこが、平均粒径０．２ｍｍ以下の再構成たばこ顆粒であって、そして、
    多孔性物質または繊維からなる担体の全て又はその一部が電気ヒーターで加熱されて生ずるプロピレングリコールとグリセリンの混合蒸気により再構成たばこ顆粒が加熱される、
    請求項１１に記載の加熱式たばこ。
  13. 再構成たばこが、平均短辺長1ｍｍ以上、平均長辺長５ｍｍ以下の再構成たばこシートであって、巻紙にくるまれ、たばこロッドを構成し、そして、
    前記たばこロッドが、巻紙の外周と接するから電気ヒーターにより加熱される、
    請求項１１記載の加熱式たばこ。
  14. 請求項１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．４μｇ／本以下のアセトルデヒドを含む、加熱式たばこ。
  15. 請求項１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが１．２μｇ／本以下のアクロレインを含む、加熱式たばこ。
  16. 請求項１１−１３いずれか１項に記載の加熱式たばこであって、発生するエアロゾルが６８．４μｇ／本以下のホルムアルデヒドを含む、加熱式たばこ。

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