KR20210102330A - 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법 - Google Patents
흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 흡연 또는 흡입에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, (1) 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자 : TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6 , SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32 중 적어도 특정한 11개의 유전자를 포함하는 11 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 확률 PSMK을 산출하고; (2) 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에서 이하의 15 개의 유전자 중 적어도 특정한 4개의 유전자를 포함하는 4 이상의 유전자의 발현에 관하는 것에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 계수를 이용하여, 확률 PCOPD을 산출하고; (3) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD로부터, 상기 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸의 흡연 또는 흡입에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 산출하는, 것을 포함한다.
Description
본 발명은, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법, 및 가열식 담배에 관한 것이다.
만성 폐색성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하, 본 명세서에서 「COPD」라고 호칭하는 경우가 있다)은 대기 중의 오염 물질이나 분진, 미생물 등의 유해 물질을 장기간 흡입 폭로(曝露)됨으로써 발생하는 염증성 호흡기 질환이다. 담배 연기는 COPD의 주요한 리스크 요인의 하나로서 생각되고 있기 때문에, 담배 연기의 COPD 발병 리스크를 평가하는 수법의 확립은 급선무이다. 이 점에서, 흡연 폭로 시험에 관한 동물 모델도 보고되고 있지만, 사람에 대한 영향에 관하여 평가를 외삽(外揷)하는 것에 관하여는 종차(種差)의 문제가 염려된다.
이러한 배경에서, 담배 업계에 있어서 사람 유래 세포를 이용한 인비트로(in vitro) 시험에 의한 사람에 대한 질병 리스크 예측의 중요성이 높아지고 있다. 특히 기도 상피 조직은 흡입되는 유해 물질에 대하여 최초의 방어 기구(機構)로서 작동하는 조직이기 때문에, 기도 상피 세포(Airway epithelial cell)를 이용한 담배 연기의 생물 영향 평가는 적극적으로 실시되고 있다. 근래에는 기존의 단층 배양 세포를 이용한 단회(單回) 폭로 시험에 더하여, 보다 생체에 가까운 조직 구조를 가지는 삼차원 배양 모델을 이용한 빈회(頻回) 폭로 시험 등, 인간에 대한 외삽성이 높은 시험 시스템을 이용한 평가도 적극적으로 실시되고 있다.
최근, 전자 담배나 가열식 담배 등의 종래와는 상이한 담배 제품이 개발·출시되고 있다. 이들 제품은 연소를 수반하지 않고 에어로졸을 발생시키는 점이 특징적이며, 종래의 가연성 담배에서는 볼 수 있는 연소 및 고온의 연소 가스가 살담배 내의 성분을 화학 반응시키는 것에 동반하여 생성되는 화학 물질의 발생이 억제될 수 있다고 생각되고 있다. 실제로 이들 담배 제품을 이용한 성분 분석의 결과로부터, 생물 활성을 가지는 몇가지 화학 성분이 연소성 담배와 비교하여 양적으로 적은 것으로 보고되고 있다.
흡연 물품의 연기나 에어로졸에 포함되는 화학 물질에 반응하는 복잡한 생체 응답을 망라적으로 해석하는 방법으로서, 각종 오믹스 기술의 활용이 주목받고 있다. 특히 qPCR 어레이나 마이크로 어레이를 이용한 유전자 발현량 측정은, 기술의 큰 진보에 의해 데이터 품질이 다른 오믹스 기술과 비교하여 매우 높고, 공공 데이터베이스에의 등록수도 풍부하다. 그 때문에, 어레이 데이터 정보를 이용한 메타 해석도 활발하게 실시되고 있다. 연소성 담배 연기의 폭로에 비해, 생물 활성을 가지는 화학 물질 함유량이 낮은 전자 담배나 가열식 담배 등의 연기는, 기도 상피 세포에서의 유전자 발현 변동이 억제되고 있음이 보고된 바 있다. 그러나, 이들 생물 활성을 가지는 화학 물질이 일으키는 유전자 발현량의 변동으로부터 구체적인 질병 리스크를 예측하는 방법에 관하여는, 아직 구체적인 평가 방법이 정해져 있지 않은 것이 현실이다.
WO2013/190092은, COPD의 리스크에 이용되는 1군의 유전자를 기재하고 있다. Am. J. Respir Crit Care Med. 2007,175 (6): 577-586은, COPD 환자 특징적인 유전자를 보고하고 있다. 그러나, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 통계적으로 정량 평가하는 데 유효한 방법은 아직 제공되고 있지 않다.
비 특허 문헌 1: Am. J. Respir Crit Care Med. 2007, 175(6): 577-586
비 특허 문헌 2: ISO 3308
본 발명은, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법, 및 가열식 담배를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 마이크로 어레이 데이터를 이용한 인비트로 평가계(評價系, 평가 시스템)에서의 담배 제품의 COPD 리스크 포텐셜(potential) 평가 방법을 새롭게 구축하고, 삼차원 배양 세포 모델을 이용한 가열식 담배의 에어로졸 폭로에 의한 생체 영향을 평가한 결과, 본 가열식 담배의 COPD 포텐셜 리스크가 낮은 것을 발견하여, 본 발명을 생각해냈다.
비한정적으로, 본 발명은 이하의 태양을 포함한다.
[태양 1]
흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법으로서,
(1) 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상(상태) 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11개 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편(切片) 및 계수(係數)를 이용하여, 이하의 확률 PSMK
[상기 식에 있어서, CNS | SMK는 절편을, βi는 각각의 유전자에 대한 계수를, ai는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량값을 나타낸다. x는 11-15 중 어느 하나의 정수를 나타낸다.]
을 산출하고;
(2) 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4이상의 유전자의 발현에 관하는 것에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 이하의 확률 PCOPD
[상기 식에 있어서, CSMK | COPD는 절편을, γi는 각각의 유전자 대한 계수를, bi는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. y는 4-10 중 어느 하나의 정수를 나타낸다.]
을 산출하고;
(3) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD로부터, 상기 가열식 담배의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 이하의 PRF
로서 산출하는,
것을 포함하는, 상기 인비트로 평가 방법.
[태양 2]
공정 (1)에 있어서, 11 개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
의 모든 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하는 로지스틱 회귀 분석에 의해, 확률 PSMK을 산출하는, 태양 1에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 3]
공정 (2)에 있어서, 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
의 모든 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 계수를 이용하여, 확률 PCOPD를 산출하는, 태양 1 또는 2에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 4]
기도 상피 세포가, 포유류의 기도 상피 세포인, 태양 1-3 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 5]
기도 상피 세포가 사람 기도 상피 세포, 마우스(mouse) 기도 상피 세포, 또는 랫(rat) 기도 상피 세포인, 태양 1-4 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 6]
기도 상피 세포가 삼차원 배양 세포인, 태양 1-5 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 7]
기도 상피 세포가 기액(gas liquid) 계면 배양 하에 있는, 태양 1-6 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법.
[태양 8]
가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상(particulate) 물질을 포함하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서, PRF가 0.8 이하의 범위인 경우에, 해당 가열식 담배의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크는 낮거나 또는 없다, 라고 판단하는, 태양 1-7 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[태양 9]
2종류의 가열식 담배에 대해 PRF를 비교하여, PRF가 더 낮은 가열식 담배 쪽을, 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크가 더 낮다, 라고 판단하는, 태양 1-8 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[태양 10]
(1) 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11개 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 및,
(2) 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터
의, 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에의 이용.
[태양 11]
가열식 담배로서,
재구성 담배로 이루어지는 에어로졸 원(源)을, 직접 또는 간접으로 전기적으로 가열하는, 구조적 특징을 가지며,
해당 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액을 이용하여 태양 1-6 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법을 실시한 경우에, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 함유하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서의, PRF가 0.8 이하의 범위인, 상기 가열식 담배.
[태양 12]
재구성 담배가, 평균 입경 0.2mm 이하의 재구성 담배 과립이고, 그리고,
다공성 물질 또는 섬유로 이루어진 담체(擔體)의 전부 또는 그 일부가 전기 히터로 가열되어 발생하는 프로필렌글라이콜과 글라이세린의 혼합 증기에 의해 재구성 담배 과립이 가열되는,
태양 11에 기재된 가열식 담배.
[태양 13]
재구성 담배가, 평균 단변(短邊) 길이 1mm 이상, 평균 장변(長邊) 길이 5mm 이하의 재구성 담배 시트이며, 권지(卷紙)로 싸서, 담배 로드를 구성하고, 그리고,
상기 담배 로드가, 권지의 외주와 접하는 부터 전기 히터에 의해 가열되는,
태양 11에 기재된 가열식 담배.
[태양 14]
태양 11-13 중 어느 한 항에 기재된 가열식 담배로서, 발생하는 에어로졸이 1.4μg/개 이하의 아세트알데하이드를 포함하는, 가열식 담배.
[태양 15]
태양 11-13 중 어느 한 항에 기재된 가열식 담배로서, 발생하는 에어로졸이 1.2μg/개 이하의 아크롤레인을 포함하는, 가열식 담배.
[태양 16]
태양 11-13 중 어느 한 항에 기재된 가열식 담배로서, 발생하는 에어로졸이 68.4μg/개 이하의 폼알데하이드를 포함하는, 가열식 담배.
본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 의해, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를, 통계적으로 정량 평가하고, 비교하는 것이 가능하게 되었다. 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 통계적으로 정량 평가하는 방법은 종래에 알려져 있지 않은 것이며, 본 발명에 의해 처음으로 가능하게 된 것으로서, 비교 가능하게 된 것은 과학적으로도 산업적으로도 의의가 크다. 본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크 인비트로 평가 방법에 의해, 리스크 감소 제품(흡연 또는 흡인을 포함한 제품의 사용에 동반되는 건강 리스크를 저감시킬 가능성이 있는 제품)의 연구·개발이 가능하게 되었다.
[도 1] 도 1은, 가열식 담배에 있어서의 피가열에 의한 온도 변화의 일례를 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 가열식 담배에 있어서의 피가열에 의한 온도 변화의 일례를 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 마이크로 어레이 데이터의 분석 결과를 나타낸다. (A)는, COPD 발병(發症)증상 발현에의 관여가 시사되어 있는 생체 응답에 관련된 양성 대조 시약 폭로에 의한 유전자 발현 특성의 계층적 클러스터링을 나타낸다. (b)는, 연소성 담배의 전연(全煙) 버블링 노출에 의한 발현 변동 유전자의 벤 다이어그램이다.
[도 4] 공공 데이터베이스를 이용한 COPD 포텐셜 리스크 값의 계산 결과를 나타낸다.
[도 5] 폭로 24시간 후의 가열식 담배(NGP1, NGP2) 및 시험용 표준 궐련(3R4F, 1R6F)의 전연 버블링 폭로를 이용한 COPD 포텐셜 리스크 값의 계산 결과를 평균값 ± 표준 편차로 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 가열식 담배에 있어서의 피가열에 의한 온도 변화의 일례를 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 마이크로 어레이 데이터의 분석 결과를 나타낸다. (A)는, COPD 발병(發症)증상 발현에의 관여가 시사되어 있는 생체 응답에 관련된 양성 대조 시약 폭로에 의한 유전자 발현 특성의 계층적 클러스터링을 나타낸다. (b)는, 연소성 담배의 전연(全煙) 버블링 노출에 의한 발현 변동 유전자의 벤 다이어그램이다.
[도 4] 공공 데이터베이스를 이용한 COPD 포텐셜 리스크 값의 계산 결과를 나타낸다.
[도 5] 폭로 24시간 후의 가열식 담배(NGP1, NGP2) 및 시험용 표준 궐련(3R4F, 1R6F)의 전연 버블링 폭로를 이용한 COPD 포텐셜 리스크 값의 계산 결과를 평균값 ± 표준 편차로 나타낸다.
1. 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법
본 발명은, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 관한 것이다. 상기 평가 방법은,
(1) 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15 개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11 개 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 구체적으로는, 마이크로 어레이 데이터 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현 데이터,에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 이하의 확률 PSMK을 산출하고;
[상기 식에 있어서, CNS | SMK는 절편을, βi는 각각의 유전자에 대한 계수를 나타낸다. 또한 ai는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. x는 11-15 중 하나의 정수를 나타낸다.]
(2) 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 구체적으로는, 마이크로 어레이 데이터 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 이하의 확률 PCOPD를 산출하고;
[상기 식에 있어서, CSMK | COPD는 절편을, γi는 각각의 유전자 대한 계수를 나타낸다. 또한, bi는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. y는 4-10 중 하나의 정수를 나타낸다.]
(3) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD에서, 상기 담배 제품의 연기 또는 에어로졸의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를, 이하의 포텐셜 리스크 값(Potential Risk Factor: PRF)
로서 산출하는,
것을 포함한다.
"만성 폐색 폐 질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 대기 중의 오염 물질이나 분진, 미생물 등의 유해 물질을 장기간 흡입 폭로 시킴으로써 발생하는 염증성 호흡기 질환이다. COPD은, 흡연과 관계가 깊다고 여겨지고 있다. 본 발명은 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 인비트로에서의 통계적인 정량 평가 방법에 관한 것이다.
「담배 제품」의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 종이 궐련 등의 가연성 흡연 물품도, 에어로졸 원(소스)이 연소가 아닌 가열에 의해 발생하는 「가열식 담배」도 포함한다. 가열식 담배는, 담배 로드부를 포함하는 향미(香味) 흡인기이며, 담배를 연소시키지 않고, 전기적 열원 또는 화학 반응에 의한 열원으로, 알코올·에탄올·글리세린·프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합 용액을 함침시킨 다공질 또는 섬유질의 물체를 직접적으로 또는 간접적으로 가열하여 발생시킨 증기와 입자 상 물질이 혼합된 기체가, 향미 흡인기를 통해 인입된 공기 중에 혼입된다. 또한 증기와 입자 상 물질과 공기의 혼합 기체가, 상술한 담배에 더하여 잎담배·재구성 담배·재구성 담배 시트·재구성 담배 과립에 통과되어, 담배·잎 담배·재구성 담배류가 포함하는 향끽미(香喫味) 성분, 니코틴이나 각종 천연 향료로 이루어지는 휘발성 화합물을 포함한 기체가 혼입된다. 가열식 담배에 있어서는, 해당 휘발성 화합물을 포함하는 기체를 포함하는 혼합 기체, 즉 에어로졸(全煙)과 가스 상 성분의 혼합 기체가, 소비자에 의해 흡인된다. 통상적으로, 소비자는, 가열식 담배의 끝(입쪽의 끝 또는 필터 끝, 마우스 피스 단)으로 끌어들임으로써, 해당 혼합 기체를 흡인한다.
가열식 담배는, 에어로졸의 발생 방식 별로 3개의 태양으로, 직접 가열식 향미 흡인기와 간접 가열식(공기 가열) 향미 흡인기와 간접 가열식(베이퍼 가열) 향미 흡인기가 있다. 직접 가열식 향미 흡인기란, 이하의 특징을 구비한 담배 로드를 포함하는 향미 흡인기이다. 담배 잎 및 재구성 담배 또는 재구성 담배 시트를 포함하는 담배 로드부가, 주로 전기 가열에 의해 직접 가열되고, 잎담배 유래의 니코틴이나 플레이버(flavor)를 포함한 에어로졸을 발생시킨다. 간접 가열식(공기 가열) 향미 흡인기란 이하의 특징을 구비한 담배 로드를 포함하는 향미 흡인기이다. 담배 잎과 재구성 담배 또는 재구성 담배 시트를 포함하는 담배 로드부가, 전기 가열 등의 열원을 사용하여 가열된 공기에 의해, 간접적으로 가열됨으로써 잎담배 유래의 니코틴과 플레이버(flavor)를 포함한 에어로졸을 발생시킨다. 이들은, 흡인 중, 담배 잎이나 재구성 담배 또는 재구성 담배 시트에서 휘발성 화합물이 방출되어, 향미 흡인기를 통해 인입된 공기 중에 혼입된다. 방출된 화합물이 식음에 따라 응결하여 에어로졸을 형성하고, 이것이 소비자에 의해 빨아들여진다. 간접 가열식(베이퍼 가열) 향미 흡인기란, 이하의 특징을 구비한 담배 로드를 포함하는 향미 흡인기이다. 전기 가열에 의해 에어로졸 원(액체)을 가열하여 에어로졸을 발생시켜, 그 에어로졸이, 잎담배 유래의 니코틴이나 플레이버를 포함한 에어로졸을 발생시킨다.
「담배 제품의 에어로졸」이란, 예를 들면, 종이 궐련의 연기, 또는 향미 흡인기에서 발생하는 에어로졸 즉 가스상의 물질, 휘발성 물질과, 입자 상 물질의 혼합 기체인 에어로졸이 포함하는 모든 성분을 의미한다.
「담배 제품의 에어로졸 중의 입자 상 물질」이라 함은, 예를 들면, 종이 궐련의 연기, 또는 향미 흡인기에서 발생하는 에어로졸 내의 가스 상, 휘발성 물질을 제외한 모든 물질을 의미하며, 총 입자 상 물질(TPM, total particle matter)이라고 호칭되는 경우도 있다. 총 입자 상 물질은, 담배 업계에서는 종이 궐련의 연기 또는 향미 흡인기에서 발생하는 에어로졸을 유리 필터에 통과시켜, 유리 필터에 포집된 물질을 일컫는다. 일 태양에 있어서, 가열식 담배 에어로졸 중의 입자 상 물질에는, 수증기, 니코틴, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 멘톨 등을 포함한다.
「에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로」란, 총 입자 상 물질을 적당한 용매 내지 적당한 세포의 액체 배지(培地)에 녹인 시료용액에 세포를 폭로하는 경우 외에, 담배 제품의 에어로졸 즉 가스 상(status)의 물질, 휘발성의 물질과, 입자 상 물질의 혼합 기체를 통과시켜 가스 상의 물질, 휘발성 물질과 입자 상 물질을 용해시킨 적당한 용매 내지 적당한 액체 배지를 얻는 전연 버블링 법에 의해 얻어진 시료 용액에 세포를 폭로하는 경우도 포함한다.
시료 용액의 「용액」은, 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 용해할 수 있는 용액이면 특별히 한정되지 않는다. 일 태양에 있어서, 용액으로서, 양친매성(兩親媒性) 용매를 사용한다. 양친매성 용매는, 비한정적으로, 디메틸 설폭 사이드(DMSO), 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 등을 포함한다.
흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법은, 담배 제품에서 발생된 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로시킨 기도 상피 세포를 이용한다. 시료 용액 중의 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질의 농도, 기도 상피 세포에의 폭로 시간은, 담배 제품의 종류 등에 따라 적절히 조절 가능하다. 본 명세서에 있어서, 담배 제품을 피는 행위는 「흡연」을 나타내고, 「흡인」를 포함하는 담배 제품의 흡연 또는 흡인이라는 사용 행위의 총칭으로서 사용하는 경우가 있다.
「기도 상피 세포」는, 호기·흡기(呼氣ㆍ吸氣)의 운반 경로인 기관-기관지-세기관지(「기도」로 총칭되는 경우가 있다)의 상피 조직 유래의 세포이다. 비한정적으로, 기도 상피 세포는, 포유류의 기도 상피 세포이어도 된다. 비한정적으로, 기도 상피 세포는 사람 기도 상피 세포, 마우스 기도 상피 세포, 모르모트(guinea pig) 기도 상피 세포 또는 랫 기도 상피 세포이어도 된다.
일 태양에 있어서, 기도 상피 세포는 삼차원 배양 세포이다. 삼차원 배양 세포는, 이차원 배양 세포와 비교하여 생체의 환경에 더 가까운 환경에서의 인비트로 평가를 가능하도록 한다. 예를 들어, Epithelix 사에서 판매되고 있는 MucilAir(등록 상표)는, 입체 세포 배양 플레이트(plate)에 재구성된 사람 기도 상피 인비트로 3D 재구성 모델이고, 상기 인비트로 평가 방법에 이용 가능하다.
일 태양에 있어서, 기도 상피 세포는 기액 계면 배양 하에 있다. 기도 상피 세포가 기액 계면 배양 하에 있는 것에 의해 기도 상피 세포를 섬모 세포로 분화 유도가 가능하며, 또한 입자 상 물질이 기도 상피 세포에 직접적으로 접한다는 실제의 폭로 형태를 재현할 수 있는 이점을 얻을 수 있다.
흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법은,
(1) 담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 구체적으로는, 마이크로 어레이 데이터 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 흡연자로 판단될 확률로서, 이하의 확률 PSMK
[상기 식에서, CNS | SMK는 절편, βi는 각각의 유전자에 대한 계수를 나타낸다. 또한, ai는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. x는 11-15 중 하나의 정수를 나타낸다.]
를 산출하는 것을 포함한다.
이하의 15개의 유전자는, 본 발명에 있어서, 흡연과의 관련성이 발견된 유전자이다.
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
이들 중 이하의 11개의 유전자는, 변수 감소법에 의해 흡연과의 관련성이 특히 높은 것이 발견된 유전자이다.
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
공공 데이터베이스의 마이크로 어레이 데이터는, 비한정적으로, 예를 들어, EMBL-EBI에 등록된 마이크로 어레이 데이터: E-MTAB-1690, E-GEOD-20257, E-GEOD-8545을 이용해도 된다.
공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석은, 예를 들어, 공공 데이터베이스에 등록된 마이크로 어레이 데이터에 부여된 속성 정보로부터, 목적 변수로서 건강인(HLT) 및 흡연자(SMK)의 구분을 이용하여, 설명 변수로서 TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32의 11 유전자를 포함하는 유전자의 GC-RMA에 의한 정규화 유전자 발현 데이터 ai를 외삽하고, 비한정적으로, 예를 들어, 통계 분석 무료 소프트웨어 「R」에 의한 로지스틱 회귀 분석을 실시하여, 얻어진 회귀식으로부터 절편 CNS | SMK 및 계수 βi를 얻을 수 있다.
일 태양에 있어서, 「적어도 이하의 11개 유전자: TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32을 포함하는 11이상의 유전자」는, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 유전자이다. 바람직하게는, 11개의 유전자이다.
상기 인비트로 평가 방법은, 또한, (2)담배 제품의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 구체적으로는, 마이크로 어레이 데이터 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 흡연자 중 COPD 환자로 판단될 확률로서, 이하의 확률 PCOPD
[상기 식에서, CSMK | COPD는 절편을, γi는 각각의 유전자에 대한 계수를 나타낸다. 또한, bi는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. y는 4-10 중 하나의 정수를 나타낸다.]
를 산출하는, 것을 포함한다.
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG의 4개의 유전자는 변수 감소 법에 따라 COPD와의 관련성이 높은 것이 발견된 유전자이다. DUSP6은, 흡연과의 관련성이 특히 높은 11개 유전자에는 포함되지 않지만, 흡연과의 관련성이 발견된 15개의 유전자 중에는 포함된다.
공공 데이터베이스의 마이크로 어레이 데이터는, 비한정적으로, 예를 들어, EMBL-EBI에 등록된 마이크로 어레이 데이터: E-MTAB-1690, E-GEOD-20257, E-GEOD-8545을 이용해도 된다.
공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀식은, 예를 들어, 공공 데이터베이스에 등록된 마이크로 어레이 데이터에 부여된 속성 정보에서, 목적 변수로서 흡연자(SMK) 및 COPD 환자(COPD)의 구분을 이용하여, 설명 변수로서 EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG의 4 유전자를 포함하는 유전자의 GC-RMA에 의한 정규화 유전자 발현 데이터 bi를 외삽하여, 비한정적으로, 예를 들어, 통계 분석 무료 소프트웨어 「R」에 의한 로지스틱 회귀 분석을 수행하여, 얻어진 회귀식으로부터 절편 CSMK | COPD 및 계수 γi를 얻을 수 있다.
일 태양에 있어서, 「EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG을 포함하는 4 이상의 유전자」는, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개이다. 바람직하게는 4개이다.
그리고, 상기 인비트로 평가 방법은, (1), (2)의 결과에 기초하여, (3) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD로부터, 상기 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를, 이하의 포텐셜 리스크 값 (PRF)
으로서 산출하는, 것을 포함한다.
일 태양에 있어서, 공정(1)에서 11개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
의 모든 유전자의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 확률 PSMK을 산출한다.
일 태양에 있어서, 공정(2)에 있어서, 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
의 모든 유전자의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 확률 PCOPD를 산출한다.
본 명세서의 실시예에 있어서, NGP(NEXT GENERATION PRODUCT)(NGP1, NGP2)에서, 최대 농도 2000 퍼프/L의 농도로 24시간 폭로시킨 경우, PRF는, 비흡연자에서 0.07, 흡연자에서 0.46, COPD 환자에서 0.83이며, 비흡연 건강인과 비교하여 PRF의 증가가 인정되었다. 또한, 실시예에서 사용한 NGP1, NGP2는 각각, 본 명세서의 「가열식 담배의 실시 태양」의 항목에서 후술하는, 「제3 태양」에 관련된 가열식 담배, 「제2 태양」에 관련된 가열식 담배, 에 해당한다. NGP2에 대한 자세한 내용은, 일본 특허출원 2018-213498(미공개)에도 기재되어 있다.
상기 인비트로 평가 방법의 일 태양에 있어서, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 함유하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서, PRF가 0.8 이하의 범위(실시예의 COPD 환자의 PRF보다 낮음)인 경우에, 해당 가열식 담배의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크는 낮거나 또는 없다, 로 판단한다. 비한정적으로, 최소 농도 200 퍼프/L로 24시간 폭로의 조건하에서 동일한 실험을 수행한 경우에도, 동일하게 PRF를 산출할 수 있다.
일 태양에 있어서, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 함유하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24 시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서, PRF가 0.4 이하의 범위(실시예의 흡연자의 PRF보다 낮음)인 경우에, 해당 가열식 담배의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크는 낮거나 또는 없다, 로 판단한다.
상기 인비트로 평가 방법의 일 태양에 있어서, 2종류의 가열식 담배에 대하여 PRF를 비교하여, PRF가 더 낮은 가열식 담배 쪽을, 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크가 더 낮다, 고 판단한다.
본 발명은 또한, (1) 이하의 15 개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11 이상의 유전자의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터, 및,
(2) 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4이상의 유전자의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터
의, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에의 이용,에 관한 것이다.
2. 가열식 담배
본 발명은, 가열식 담배에 관한 것이다. 상기 가열식 담배는, 재구성 담배로 이루어진 에어로졸 원(소스)을, 직접 또는 간접으로 전기적으로 가열한다, 는 구조적 특징을 가진다.
해당 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액을 이용하여 본 발명의 인비트로 평가 방법을 실시한 경우, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서의, PRF가 0.8 이하의 범위, 또는, PRF가 0.4 이하의 범위이다. PRF는, 본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 의해, 처음으로 밝혀진 것이다. 이러한 낮은 PRF를 갖는 가열식 담배는, 본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 의해 처음으로 생각해내었다.
「가열식 담배」의 태양은 「1. 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법」의 항목에 기재한 바와 같다. 상기 가열식 담배는, 재구성 담배로 이루어진 에어로졸 원을, 직접 또는 간접으로 전기적으로 가열한다, 라는 구조적 특징을 가진다.
일 태양에 있어서, 해당 가열식 담배의 재구성 담배는, 평균 입경 0.2mm 이상, 1.2mm 이하의 재구성 담배 과립이다. 일 태양에 있어서, 다공성 물질 또는 섬유로 이루어지는 담체의 전부 또는 그 일부가 전기 히터로 가열되어 발생하는 프로필렌글라이콜과 글라이세린의 혼합 증기에 의해 재구성 담배 과립이 가열된다. 일 태양에 있어서, 해당 가열식 담배의 재구성 담배는, 평균 입경 0.2mm 이상, 평균 입경 1.2mm 이하인 재구성 담배 과립으로서, 그리고 다공성 물질 또는 섬유로 이루어진 담체의 전부 또는 그 일부가 전기 히터로 가열되어 발생하는 프로필렌글라이콜과 글라이세린의 혼합 증기에 의해 재구성 담배 과립이 가열된다.
일 태양에 있어서, 재구성 담배가, 평균 단변 길이 1mm 이상, 평균 장변 길이 5mm 이하의 재구성 담배 시트이다. 일 태양에 있어서, 재구성 담배 시트는, 권지(卷紙)에 싸여, 담배 로드를 구성하고, 그리고 상기 담배 로드가, 권지의 외주와 접하는 부터 전기 히터에 의해 가열된다. 일 태양에 있어서, 재구성 담배가, 평균 단변 길이 1mm 이상, 평균 장변 길이 5mm 이하의 재구성 담배 시트로서, 권지에 싸여, 담배 로드를 구성하고, 그리고 상기 담배 로드가, 권지의 외주와 접하기 때문에 전기 히터에 의해 가열된다.
가열식 담배의 실시 태양
이하, 비한정적으로, 가열식 담배의 실시 태양을 설명한다.
가열식 담배는, 전기 히터를 구비한 흡인기구에 삽입된 상태에서 에어로졸과 가스의 혼합기체를 발생시켜, 소비자의 구강·기도·비강을 경유한 흡인에 제공되는 물품이다. 형상은 봉상(棒狀)이며 전체 길이는 20mm 이상 100mm 이하, 50mm 이상 85mm 이하여도 된다.
제1 태양으로서, 형상은 봉상이며, 전체 길이는 20mm 이상, 30mm 이상, 40mm 이상, 50mm 이상, 60mm 이상, 70mm 이상, 80mm 이상, 83mm, 50mm 이하, 60mm 이하, 70mm 이하, 80mm 이하, 90mm 이하, 100mm 이하여도 된다.
제2 태양으로서, 형상은 봉상이며, 전체 길이는 20mm 이상, 30mm 이상, 40mm 이상, 50mm 이상, 60mm 이상, 70mm 이상, 80mm 이상, 55mm, 50mm 이하, 60mm 이하, 70mm 이하, 80mm 이하, 90mm 이하, 100mm 이하여도 된다. 외주 길이는 15mm 이상, 20mm 이상, 25mm 이하, 30mm 이하, 22mm여도 된다.
제3 태양으로서, 재구성 담배 과립을 포함하는 폴리 프로필렌 제의 플라스틱 캡슐이며, 플라스틱 캡슐의 형상은 대략 원통(円筒)이며, 전체 길이는 10mm 이상, 20mm 이상, 30mm 이상, 40mm 이상, 50mm 이상, 60mm 이상, 70mm 이상, 40mm 이하, 50mm 이하, 60mm 이하, 70mm 이하, 80mm 이하, 90mm 이하여도 된다.
제1, 제2 태양 모두, 가열식 담배는, 담배 로드부·공동(空洞)부·지관(紙管)·필터부로 이루어지며, 필터부는 섬유 섹션 또는 공동(空洞) 섹션 또는 중공(中洞) 지관 섹션으로 이루어진다.
제1 태양에 관련된 가열식 담배에 대해 설명한다.
담배 로드부: 담배 로드부는, 봉상이며, 그 길이는 가열식 담배의 장축 방향으로 30mm 이상 50mm 이하, 42mm가 바람직하다. 담배 로드부는, 재구성 담배 시트의 작은 조각(小片)이 권지에 싸여 있다.
재구성 담배: 재구성 담배 시트를 재단하여 새긴(裁刻) 작은 조각은, 단변 1mm 이상, 장변 15mm 이하여도 된다. 바람직하게는 장변 10mm 이하, 더욱 바람직하게는 5mm 이하여도 된다. 재구성 담배 시트는, 향미 성분으로서 니코틴을 0.80% 이상 0.90% 이하로 포함해도 된다. 재구성 담배 시트는, 향미 성분으로서 멘톨을 포함해도 된다. 그 경우, 멘톨은 담배 로드부 하나 당 0.3mg 이상 5.3mg 이하로 포함해도 된다. 재구성 담배 시트는, 보습제로서 알코올을 포함해도 되고 프로필렌글라이콜을 0.04 % 이상 0.58 % 이하, 글라이세린을 12.4 % 이상 14.3 % 이하로 포함해도 된다. 재구성 담배 시트는, 보습제로서 당류·단당·이당을 포함해도 되고, 단당·이당을 합계 3.7 % 이하 포함해도 되고, 프룩토오스(과당)을 2.1 % 이상 2.7 % 이하, 글루코오스(포도당)을 1.3 % 이상 1.8 % 이하, 수크로스를 0.2 % 이상 0.4 % 이하로 포함해도 된다. 재구성 담배 시트는, pH 조정제로서 유기산을 포함해도 되고, 구연산을 4.1mg/g 이상 4.6mg/g 이하, 사과산을 30.9mg/g 이상 34.4mg/g 이하, 30.9mg/g 이상 34.4mg/g 이하, 석신산을 0.2mg/g 이상 0.3mg/g 이하로, 폼산을 0.1mg/g 이상 0.2mg/g 이하로 포함해도 된다.
권지: 권지는, 통기도 64.0(Corresta Unit) 이상 67.0(Corresta Unit) 이하여도 되고, 평량 26.2(g/m2) 이상 26.4(g/m2)이하여도 되고, 탄산 칼슘 함유량은 25.2 % 이상 25.5 % 이하여도 되고, 조연제는 0.7%여도 된다.
필터부: 필터부는, 봉상이며, 그 길이는 가열식 담배의 장축 방향으로 5mm 이상 18mm 이하가 바람직하다. 필터부는 아세테이트 섬유 필터와 중공지관으로 이루어진다. 아세테이트 섬유 필터의 길이는 장축 방향으로 5mm 이상 18mm 이하여도 되고, 바람직하게는 8mm이다. 아세테이트 섬유 필터를 구성하는 아세테이트 섬유는, 임의의 단면 형상여도 되고, 원형 단면 형상, Y 자형 단면 형상, X자형 단면 형상이어도 된다. 중공지관의 길이는 장축 방향으로 5mm 이상 18mm 이하여도 되고, 바람직하게는 8mm이다.
공동부: 공동부는, 공동부의 필터부 측의 단부에서 필터부로 5mm 이상 16mm 이하 연신하고 또한 담배 로드부 측의 단부에서 담배 로드부로 5mm 이하 연신하는 칩 페이퍼 내면과, 필터부의 단면, 담배 로드를 구성하는 재구성 담배 시트 새김의 단면으로 획분(구분)된다. 공동부는, 봉상이며, 그 길이는 가열식 담배의 장축 방향으로 20mm 이상 30mm 이하여도 되고, 바람직하게는 25mm이다.
칩 페이퍼: 칩 페이퍼는, 공동부를 구성하고, 원주 방향으로 정렬된 개공(開孔)이 2 이상의 복수개소 설치되어도 된다. 개공의 열은 1열이여도 되고, 2 이상의 복수 열 설치되어도 된다. 칩 페이퍼는, 테이프 상의 종이 조각을 나선형으로 성형하여 정해진 길이로 절단된 지관에서 안에 붙여도 된다.
제2 태양에 관한 가열식 담배에 대해 설명한다.
담배 로드부: 담배 로드부는, 봉상이며, 그 길이는 가열식 담배의 장축 방향으로 15mm 이상 25mm 이하, 22mm가 바람직하다. 담배 로드부는, 재구성 담배 시트의 작은 조각이 권지로 싸여서 이루어진다. 재구성 담배 시트를 재단하여 새긴 작은 조각은, 단변 1mm 이상, 장변 15mm 이하여도 되고, 바람직하게는 장변은 10mm 이하, 더욱 바람직하게는 5mm 이하여도 된다.
재구성 담배: 재구성 담배 시트의 작은 조각은, 담배 로드부에 200mg 이상 300mg, 220mg 이상 280mg 이하, 240mg 이상 260mg 이하, 250mg 이상 260mg, 255mg 또는 260mg 포함되어도 된다.
권지: 권지는, 통기도 64.0(Corresta Unit) 이상 67.0(Corresta Unit) 이하여도 되고, 평량 26.2(g/m2) 이상 26.4(g/m2) 이하여도 되고, 탄산 칼슘 함유량은 25.2 % 이상 25.5 % 이하여도 되고, 조연제는 0.7%여도 된다.
필터부: 필터부는, 봉상이며, 그 길이는 가열식 담배의 장축 방향으로 5mm, 20mm, 30mm 이상 40mm 이하, 35mm가 바람직하다. 필터부는 아세테이트 섬유 필터와 중공지관과 중공 아세테이트 관으로 이루어진다.
아세테이트 섬유 필터의 길이는 장축 방향으로 5mm 이상 35mm 이하여도 되고, 바람직하게는 7mm이다. 아세테이트 섬유 필터를 구성하는 아세테이트 섬유는, 임의의 단면 형상이어도 되고, 원형 단면 형상, Y자형 단면 형상, X자형 단면 형상이어도 된다.
중공지관의 길이는 장축 방향으로 5mm 이상 35mm 이하이어도 되고, 바람직하게는 20mm이다. 중공지관은, 외부 공기 주입 구멍으로서, 원주 방향으로 정렬된 개공이, 2이상의 복수 개소, 바람직하게는 15개소 설치되어도 된다. 외부 공기 주입 구멍의 개공의 열은 1열이어도 되고, 2 이상의 복수 열 설치되어도 된다.
중공 아세테이트관은, 아세테이트 섬유로 이루어진 벽 두께 1.2mm의 아세테이트 관이며, 중공 아세테이트 관의 길이는 장축 방향으로 5mm 이상 35mm 이하이어도 되고, 바람직하게는 8mm이다.
제3 태양에 관한 가열식 담배는, 예를 들면 WO2016/075748, WO2016/075749에 기재되어 있는 비연소형 향미 흡인기를 포함한다. 비연소형 향미 흡인기는, 전원 유닛과 에어로졸 원과 무화부(霧化部)를 포함하는 제1 카트리지와, 제2 카트리지를 갖는다. 제2 카트리지는 무화부에 의해 무화된 에어로졸을 통과시킴으로써 에어로졸에 향미를 부여한다. 여기서, 향미 원을 가열하지 않고 에어로졸에 향미를 부여할 수 있는 점에 유의해야 한다. 또한, 향미 원에서 실질적으로 에어로졸이 발생하지 않는 점에 유의해야 한다. 무화부는 연소를 수반하지 않고 에어로졸 원을 무화한다. 제2 카트리지는 상기 에어로졸에 향미를 부여하는 향미 원을 수용한다. 향미 원은, 비연소형 향미 흡인기가 발생하는 에어로졸에 향미를 부여하는 재구성 담배로 이루어지는 과립에 의해 이루어진다. 재구성 담배 과립의 크기는, 0.2mm 이상 1.2mm 이하인 것이 바람직하다. 게다가, 재구성 담배 과립의 크기는, 0.2mm 이상 0.7mm 이하인 것이 바람직하다. 향미 원을 구성하는 재구성 담배 과립의 크기가 작을수록, 비표면적이 증대(增大)하기 때문에, 향미 원을 구성하는 과립에서 향끽미(香喫味) 성분이 휘산하기 쉽다.
피가열의 실시 태양
이하, 비한정적으로, 가열식 담배에 있어서의 피가열의 실시 태양을 설명한다.
제1 태양에 관련된 가열식 담배는, 2개로 1세트의 발열선을 구비하고 수지로 피복된 1장의 필름상 히터에 의해 가열되어 에어로졸 및 가스의 혼합 기체를 발생시킨다. 가열식 담배는, 히터에 의한 외주에서의 가열과, 흡인 동작에 동반하여 담배 로드부의 반대 흡구 단에서 재구성 담배 시트 작은 조각의 집합체 내에 도입되는 외기에 의해 냉각된다. 따라서, 가열식 담배가 에어로졸과 가스의 혼합기체를 발생시킬 때의 재구성 담배 시트 작은 조각의 집합체의 온도 분포는 균일하지 않고, 다음의 3개소: 반 흡구측 단로부터 1mm의 위치(Top)·중앙 위치(Middle)·흡구측 단으로부터 1mm의 위치(End)에 삽입된 열전대는, 서로 상이한 온도 변화를 나타내고, 동일한 위치여도 외주부(Peripheral)와 중심부(Center)에서는 상이한 온도 변화의 태양을 보여준다. 또한, End 이외의 위치에서는, 흡인 동작에 더불어 담배 로드 내로 도입되는 외기에 의해 냉각되어, 단시간의 온도 하강이 있다.
Peripheral-Top에 있어서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 5상(相, phase)로 나뉜다. 제1 상은, 가열 개시 후 40초까지이다. 온도는, 40초 이내에 75 ℃로 상승한다. 제2 상은, 40초 이후부터 135초까지이다. 온도는, 75 ℃에서 150 ℃까지 상승하고, 그것을 유지한다. 제3 상은, 135초 이후부터 150초까지이다. 온도는, 150 ℃에서 200℃까지 상승한다. 제4 상은, 150초 이후부터 220초까지이다. 온도는 200 ℃에서 230 ℃까지 상승한다. 종상(終相)은 220초 이후이다. 온도는 230 ℃에서 실온으로 하강한다.
Peripheral-Middle에 있어서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 5상(相)으로 나뉜다. 제1 상은, 가열 개시 후 25초까지이다. 온도는 150 ℃로 상승한다. 제2 상은 25 초 이후부터 135 초까지이다. 온도는 150 ℃에서 200 ℃까지 상승한다. 제3 상은 135 초 이후부터 150 초까지이다. 온도는 200 ℃에서 230 ℃까지 상승한다. 제4 상은 150 초 이후부터 220 초까지이다. 온도는 230 ℃에서 240 ℃까지 상승한다. 종상은 220 초 이후이다. 온도는 240 ℃에서 실온으로 하강한다.
Peripheral-End에 있어서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 4 상으로 나뉜다. 제1 상은, 가열 개시 후 25 초까지이다. 온도는, 25초 이내에 200 ℃로 상승한다. 제2 상은, 25초 이후부터 150 초까지이다. 온도는 200 ℃에서 240 ℃까지 상승하고, 그것을 유지한다. 제3 상은, 150초 이후부터 220 초까지이다. 온도는, 240 ℃에서 200 ℃까지 하강한다. 종상은, 220초 이후이다. 온도는 200 ℃에서 실온으로 하강한다.
Center-Top에서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 5 상(相, phase)으로 나뉜다. 제1 상은, 가열 개시 후 40 초까지이다. 온도는 50 ℃로 상승한다. 제2 상은, 40초 이후부터 135 초까지이다. 온도는, 50 ℃에서 125 ℃까지 상승한다. 제3 상은, 135 초 이후부터 150 초까지이다. 온도는, 150 ℃에서 180 ℃까지 상승한다. 제4 상은, 150 초 이후부터 220 초까지이다. 온도는, 200 ℃에서 210 ℃까지 상승한다. 종상은 220 초 이후이다. 온도는, 210 ℃에서 실온으로 하강한다.
Center-Middle에 있어서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 5 상으로 나뉜다. 제1 상은, 가열 개시 후 25 초까지이다. 온도는, 100 ℃로 상승한다. 제2 상은, 25 초 이후부터 135 초까지이다. 온도는, 100 ℃에서 180 ℃까지 상승한다. 제3 상은, 135 초 이후부터 150 초까지이다. 온도는, 180 ℃에서 200 ℃까지 상승한다. 제4 상은, 150 초 이후부터 220 초까지이다. 온도는, 200 ℃에서 240 ℃까지 상승한다. 종상은 220 초 이후이다. 온도는 240 ℃에서 실온으로 하강한다.
Center-End에 있어서, 가열식 담배의 온도 변화는, 대략 4 상으로 나뉜다. 1 상은, 가열 개시 후 25 초까지이다. 온도는, 100 ℃로 상승한다. 제2 상은, 25 초 이후부터 45 초까지이다. 온도는, 100 ℃에서 150 ℃까지 상승한다. 제3 상은, 45 초 이후부터 135 초까지이다. 온도는, 150 ℃에서 230 ℃까지 상승한다. 제4 상은, 135 초 이후부터 220 초까지이다. 온도는 230 ℃에서 200 ℃까지 하강한다. 종상은, 220 초 이후이다. 온도는 200 ℃에서 실온으로 하강한다.
상기의 온도 변화는, 각 상의 천이(遷移)에 따라 연속적이다.
제2 태양에 관련된 가열 담배의 피가열도 제1의 가열식 담배의 피가열과 동일하게 실시해도 된다.
일 예로서, 제1 및 제2 태양의 가열식 담배에, 상기의 온도 변화를 초래하는 히터는, 도 1, 도 2에 나타낸 것과 같은 온도 변화의 태양을 나타내도 된다.
제1 개소에 있어서의 히터의 온도 변화는, 대략 4 상으로 나뉘어도 된다. 제1 상은, 가열 개시 후 25 초까지이다. 히터의 온도는, 흡인 개시 후 25 초 이내에 200 ℃로 상승한다. 제2 상은, 25 초에서 150 초까지이다. 히터의 온도는, 30 초에서 45 초까지 230 ℃로 상승하고, 이후 150 초까지 약 230 ℃를 유지한다. 제3 상은, 150 초 이후부터 220 초까지이다. 히터의 온도는, 150 초 이후는 220 ℃로 하강하고 220 초까지 220 ℃를 유지한다. 종상은 220 초 이후이다. 히터의 온도는, 220 ℃에서 상온으로 하강한다.
제2 개소에 있어서의 히터의 온도 변화는, 대략 4 상으로 나누어도 된다. 제1 상은, 흡인 개시부터 75 초까지이다. 히터의 온도는, 흡인 개시 후 75 초 이내에 100 ℃까지 상승한다. 제2 상은, 75 초에서 135 초까지이다. 히터의 온도는, 75 초에서 80 초까지 140 ℃로 상승하고, 이후 135 초까지 150 ℃로 상승한다. 제3 상은, 135 초에서 220 초까지이다. 히터의 온도는, 135 초에서 150 초까지 230 ℃로 상승하고, 150 초에서 220 초까지 230 ℃를 유지한다. 종상은 220 초 이후이다. 히터의 온도는, 230 ℃에서 상온으로 하강한다. 제1·제2 개소에 있어서의 온도 변화는, 각 단계의 천이에 따라 연속적이다.
제3 태양에 관련되는 가열식 담배의 피가열은, 예를 들어, 이하와 같이 실시한다. 무화부는 전열선, 전자(電磁) 유도형 가열 기구(機構) 또는 초음파 발진자(radiator)를 포함하고, 사용자에 의한 흡인 동작 시에 전원 유닛에서 전류가 공급되어 발열 또는 동작(動作)하고, 제1 카트리지가 포함하는 에어로졸 원(源)을 무화시킨다. 무화부에 의해 무화된 에어로졸을 통과시킴으로써 에어로졸에 향미를 부여한다. 무화된 에어로졸이 제2 카트리지를 통과할 때의, 제2 카트리지 내의 분위기의 온도는, 상온 이상, 26 ℃이상, 40 ℃이하, 바람직하게는 30 ℃이하이다. 여기서, 향미 원(源)은 가열되지 않고 에어로졸에 향미를 부여할 수 있는 점에 유의해야 한다.
가열식 담배의 에어로졸과 가스의 혼합 기체 성분
이하, 피한정적으로, 가열식 담배의 에어로졸과 가스의 혼합 기체 성분의 실시 태양을 설명한다.
캐나다 보건부가 정하는 흡연 조건(CIR 조건), 다만 가열식 담배의 필터부에 설치된 개공부는 막힘이 없는 조건으로, 6 회 또는 8 회의 흡연 동작에 의해 발생시킨 에어로졸과 가스의 혼합 기체에 있어서, 담배 로드 1 개당의 카보닐 화합물의 양은 이하의 태양이어도 된다.
제1 태양에 있어서, 폼알데하이드는, 100.00 (μg/개) 이하가 바람직하다. 바람직하게는, 70.00 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 50.00 (μg/개) 이상, 70.00 (μg/개) 이하가 바람직하다. 가장 바람직하게는 57.60 (μg/개) 이상, 68.40 (μg/개) 이하여도 된다.
제2 태양에 있어서, 폼알데하이드는, 40.00 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 37.00 (μg/개) 이하이다.
제1 태양에 있어서, 아세트알데하이드는, 3.000 (μg/개) 이하가 바람직하다. 바람직하게는 2.000 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.750 (μg/개) 이상 2.000 (μg/개) 이하여도 된다. 가장 바람직하게는 0.800 (μg/개) 이상 1.400 (μg/개) 이하여도 된다.
제2 태양에 있어서, 아세트알데하이드는 1.000 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.940 (μg/개) 이하가 바람직하다.
제1 태양에 있어서, 아크롤레인은, 3.000 (μg/개) 이하가 바람직하다. 바람직하게는 2.000 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 0.750 (μg/개) 이상, 1.500 (μg/개) 이하가 바람직하다. 가장 바람직하게는 0.800 (μg/개) 이상 1.200 (μg/개) 이하여도 된다.
제2 태양에 있어서, 아크롤레인은 0.300 (μg/개) 이하가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.265 (μg/개) 이하가 바람직하다.
제3 태양에 있어서, 폼알데하이드, 아크롤레인, 아세트알데하이드는, 검출 한계 이하이며, 현재의 분석 기술에서 0.000 (μg/개)이다.
캐나다 보건부가 정하는 흡연 조건(CIR 조건), 다만 가열식 담배의 필터부에 설치된 개공부는 막힘이 없는 조건에서, 8 회의 흡연 동작에 의해 발생시킨 에어로졸 및 가스 혼합 기체에 있어서, 담배 로드 1 개당의 TSNAs의 양은, 캐나다 보건부가 정한 흡연 조건(CIR 조건)에서 흡연한 3R4F 궐련의 10 % 이하여도 된다. 폼알데하이드는, 0 % 이상, 0.80 % 이상, 1.30 % 이하여도 된다. 아세트알데하이드는, 0 % 이상, 3.30 % 이상, 3.80 % 이하여도 된다. 아크롤레인은, 0 % 이상, 0.40 % 이상, 0.70 % 이하여도 된다.
일 태양에 있어서, 가열식 담배는, 발생하는 에어로졸이 1.4μg/개 이하의 아세트알데하이드를 포함한다.
일 태양에 있어서, 가열식 담배는, 발생하는 에어로졸이 1.2μg/개 이하의 아크롤레인을 포함한다.
일 태양에 있어서, 가열식 담배는, 발생하는 에어로졸이 68.4μg/개 이하의 폼알데하이드를 포함한다.
캐나다 보건부가 정한 흡연 조건(CIR 조건), 다만 가열식 담배의 필터부에 설치된 개공부는 막힘이 없는 조건으로, 6 회 또는 8 회 흡연 동작에 의해 발생시킨 에어로졸과 가스의 혼합 기체에 있어서, 담배 로드 1 개 상당의 니코틴, 글리세린, 프로필렌글라이콜의 양은, 이하의 태양이어도 된다.
제1 태양에 있어서, 니코틴은 0.240mg/개 이상 0.510mg/개 이하, 글라이세린은 0.700mg/개 이상 2.900mg/개 이하, 프로필렌글라이콜은 0.020mg/개 이상 0.270mg/개 이하이어도 된다.
제2 태양에서, 니코틴은 0.400mg/개 이상 0.500mg/개 이하, 글라이세린은 2.000mg/개 이상 2.500mg/개 이하, 프로필렌글라이콜은 0.400mg/개 이상 0.500mg/개 이하이어도 된다.
CRM 법(CORRESTA RECOMMENDED METHOD No. 81) 조건에 준거하여, 제3 태양에 있어서, 50회의 흡연 동작으로 발생시킨 에어로졸 및 가스 혼합 기체에 있어서, 니코틴은 1.000mg/개 이상 1.500mg/개 이하, 글라이세린은 20.00mg/개 이상 30.00mg/개 이하, 프로필렌글라이콜은 40.00mg/개 이상 60.00mg/개 이하여도 된다.
본 발명은, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법이며, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환을, 종래 알려지지 않았던 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 통계적으로 정량 평가하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 통계적으로 정량 평가하는 방법의 이용에 의해, 상기와 같은, 리스크 저감 제품(흡연 또는 흡인에 따른 건강 리스크를 저감시킬 가능성이 있는 가열식 담배)을 제공하는 것이다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 그들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1 세포 배양
사람 기도 상피 세포 MucilAir (등록 상표)는 Epithelix 사로부터 구입했다. 시험에는 37 ℃, 5 % CO2 환경 하에서 10 일간 배양한 것을 사용하여, 배양시는 2-3 일마다 배지 교환을 실시하였다.
실시예 2 마이크로 어레이 시험
COPD의 증상 발현은, 활성 산소 유래의 산화 스트레스, 장기적인 산화 스트레스에 수반하는 염증 응답(應答), DNA 손상에 기인한다, 고 가정하고, 이들 생체 응답을 야기하는 물질을 양성 대조 시약으로 한 폭로 실험을 실시하였다.
구체적으로는, 우선, 단회(單回) 폭로 시험으로서, MucilAir(등록 상표)에 대해, 임의의 농도로 NaClO, tBHQ, TNFα, IL-1β, 시스플라틴, 부레오마이신 각 물질을 양성 대조 시약으로서 첨가하였다. NaClO 및 tBHQ는 산화 스트레스, TNFα 및 IL-1β는 염증 응답, 시스플라틴 및 부레오마이신은 DNA 손상의 각 응답을 야기한다. 각 물질의 첨가 4시간 후에 mRNA를 추출하였다. mRNA 추출에는 퀴아젠 사의 RNeasy을 사용했다. mRNA 추출 후, Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix 사)를 이용하여 마이크로 어레이 데이터를 취득하였다(데이터 1 : 양성 대조 시약 폭로 데이터).
동일하게, 참조 시가렛으로서 시험용 표준 궐련 3R4F를 사용하고, ISO(국제 표준화기구) 방식 (ISO:3308)에 준거한 방법으로 발생시킨 주류연(主流煙)을 배지 속을 통과하여 회수하였다(전연(全煙) 버블링 용액). 3R4F을 0.5개/L, 1.0개/L, 2.0 개/L의 농도로 조정한 전연 버블링 용액을 제조하고, 상기와 동일한 수법에 의해 세포에 첨가, mRNA 추출, 마이크로 어레이 데이터의 취득을 수행하였다(데이터2 : 3R4F 참조 시가렛 폭로 데이터).
다음으로, 복수회 폭로 시험으로서, 3R4F 및 제3 태양에 관련된 가열식 담배의 주류연에서 각각 ISO 방식, CRM 법(CORRESTA RECOMMENDED METHOD No. 81)에서 발생시킨 주류연을 회수하여, 취득한 전연 버블링 용액을 희석함으로써 복수 농도의 시험액을 조정하였다(3R4F : 25-200 퍼프/L, 1R6F : 50-200 퍼프/L, NGP1 : 250-2000 퍼프/L, NGP2 : 200-2000 퍼프/L).
가열식 담배에 관해서는, 3R4F 및 1R6F의 대조 시료보다도 10배 많은 횟수를 포집함으로써 세포에 폭로되는 니코틴 량이 3R4F 및 1R6F와 동일 정도나 그 이상이 되도록 조정했다. 즉, 세포에 폭로되는 총 입자 상 물질이, 3R4F 및 1R6F 대조 시료와 비교하여 10배 많은 환산이 되는 시료를 조제하였다.
이들 시험액을 MucilAir (등록 상표)에 첨가하여, 24시간 폭로를 실시했다. 폭로 후, mRNA의 추출을 실시하고, 마이크로 어레이 데이터의 취득을 실시했다(데이터 3: 3R4F 참조(reference) 시가렛 & NGP1 노출 데이터, 데이터 4 : 1R6F 참조 시가렛 & NGP2 폭로 데이터).
실시예 3 마이크로 어레이 데이터 해석
실시예 2에서 얻어진 데이터 1: 양성 대조 시약 폭로 데이터, 데이터 2 : 3R4F 참조 시가렛 데이터, 데이터 3: 3R4F 참조 시가렛 & NGP1 폭로 데이터, 데이터 4: 1R6F 참조 시가렛 & NGP2 폭로 데이터, 및 공공 데이터베이스의 마이크로 어레이 데이터(E-MTAB-1690, E-GEOD-20257, E-GEOD-8545)의 CEL 파일에 관련되고, 시험마다 GeneSpring ver. 14.9(Agilent Technologies 사)에 의한 정규화를 실시했다. 정규화의 알고리즘으로서는 GC-Robust Multiarray Average(GC-RMA)을 이용하여, 전체 샘플의 평균값을 이용한 베이스라인 보정을 실시했다. 정규화 후의 데이터에 대해, 통계 분석 무료 소프트웨어 「R」을 사용하여 유전자명의 주석(annotation)을 실시했다.
실시예 4 데이터 분석
본 실시예에서는, 실시예 3에서 얻어진 마이크로 어레이 데이터의 분석을 실시했다. GeneSpring 알고리즘을 이용하여, 유클리드 거리를 이용한 워드(Ward)법에 의해 클러스터 해석을 실시했다. 로지스틱 회귀 분석에 관해서는 통계 분석 무료 소프트웨어 「R」을 사용하여, 라이브러리로서 MASS, caret, data. table을 이용하여, 로지스틱 회귀 분석을 실시했다.
데이터 1: 양성 대조 시약 폭로 데이터에 관해서는, GeneSpring을 이용하여 클러스터 분석을 실시하고, 공통된 변동 특징을 갖는 유전자 군을 추출했다.
데이터 2: 3R4F 참조 시가렛 폭로 데이터에 관해서는, 각 담배 연기 농도 폭로 시에 공통적으로 변동하는 유전자 군을 추출했다.
데이터 1: 양성 대조 시약 폭로 데이터와 데이터 2: 3R4F 참조 시가렛 폭로 데이터에서 추출된 유전자 군을 비교한 결과, 공통되는 유전자 15개(TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32)가 추출되었다(도 3). 이들 유전자의 기능, 및 폐색성 폐 질환과의 관련성에 관해 이전의 보고가 존재하는지 여부를 조사한 결과를 표 1에 나타낸다.
상기 15개의 유전자의 유전자군을 이용하여, 마이크로 어레이 데이터베이스에 존재하는 건강한 사람(건강인)과 COPD 환자(각각 NS 군, COPD 군이라 칭함)의 폐의 마이크로 어레이 데이터(E-MTAB-1690, E-GEOD-20257, E-MTAB-8545)를 이용한 로지스틱 회귀에 의한 판별 분석을 실시했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
로지스틱 회귀 모델로부터의 교차 검증 결과 (5중의 교차 검증을 독립적으로 100회 반복했다. 통계 분석 무료 소프트웨어 「R」을 이용한 통계 해석의 결과로부터, 본 발명의 모델에 의한 NS군을 NS군으로 판별하는 정밀도가 0.826, COPD군을 COPD군으로 판별하는 정밀도가 0.871, 종합적인 정확도가 0.8531로, 어느 것에나 매우 높은 정밀도였다. 이것은, 사람 기도 상피 세포의 인비트로의 3D 모델에 있어서 COPD 리스크 평가가 가능한 유전자를 추출할 수 있었다는 것을 의미한다.
실시예 5 로지스틱 회귀 분석에 의한 리스크 평가
본 실시예에서는, 실시예 4에서 발견된 15개의 유전자(TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32)의 유전자 군을 사용하여, 실제의 건강인, 흡연자, 및 COPD 환자의 공공 마이크로 어레이 데이터를 사용한 로지스틱 회귀 분석에 의한 판별을 실시했다.
변수 감소법(기여도가 높은 유전자를 AIC(Akaike's Information Criterion, 아카이케 정보량 기준) 내지 BIC(Bayesian Information Criterion, 베이지안 정보 기준)을 토대로 산출하는 방법)에 의해 AIC 내지 BIC가 가장 적게 되는 유전자 군에 관하여 각각 탐색했다. 그 결과, 건강인과 흡연자의 판별에 관해서는 11 유전자(TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, HILPDA, EGLN3, AREG, FBXO32)가, 흡연자와 COPD 환자의 판별에 관해서는 4 유전자(EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG)가 판별에 있어서의 기여가 높은 유전자로서 추출되었다. 변수 감소 후의 유전자를 이용한 로지스틱 회귀식의 절편 및 계수의 값 (Estimate), 또한 그들의 통계값(Std.Error, Z value, Pr(>|Z|))에 관하여, 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.
각 로지스틱 회귀식으로 산출되는 확률에서 포텐셜 리스크 값(Potential Risk Factor, PRF)를 산출했다. 증상 발현 확률 및 포텐셜 리스크 값은 하기와 같이 산출했다.
(i) 11개의 유전자 (TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, HILPDA, EGLN3, AREG, FBXO32)의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 이하의 확률을 산출했다.
[상기 식에 있어서, CNS | SMK는 절편을, βi는 각각의 유전자 대한 계수를, ai는 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값을 나타낸다. 절편, 계수의 값은 표 3에 나타낸다.]
(ii) 4 개의 유전자 (EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG)의 발현에 관한 마이크로 어레이 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 계수를 이용하여, 이하의 확률을 산출했다.
[상기 식에 있어서, CSMK | COPD는 절편을, γi는 각각의 유전자 대한 계수를, bi는 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값을 나타낸다. 절편, 계수의 값은 표 3에 나타낸다.]
(iii) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD로부터, 상기 궐련 담배의 연기의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를, 이하의 PRF
로서 산출하였다.
상기 계산식을 이용하여 건강인(NS), 건강한 흡연자(SMK), COPD 환자(COPD)의 PRF를 산출했다. 결과를, 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, PRF는, 비흡연자에서 0.06, 흡연자에서 0.46, COPD 환자에서 0.83이며, 비흡연 건강인과 비교하여, PRF의 증가가 인정되었다.
실시예 6 다양한 농도, 다양한 폭로 기간의 향미 흡인기에 대한 리스크 평가
실시예 5에 기재된 회귀식을 이용하여, 각종 담배 제품의 다양한 농도, 다양한 폭로 기간에 관하여, 복수회 폭로 시험의 PRF를 산출했다. 결과를 도 5에 나타낸다. NGP 폭로군의 PRF의 평균치는 어느 농도, 폭로 기간에 있어서도 상기에서 설정한 범위에 들어가는 것이 밝혀졌다.
흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 의해 리스크 평가를 실시한 결과, 기존의 궐련에 비해 NGP의 PRF가 매우 낮은 것이 밝혀졌다.
본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법은, 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환을 종래에 알려져 있지 않았던 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를 통계적으로 정량 평가하기 위해 이용할 수 있다. 본 발명의 흡연 또는 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에 의해, 리스크 저감 제품(흡연 또는 흡인에 따른 건강 리스크를 저감시킬 가능성이 있는 제품)의 연구·개발에 이용할 수 있다.
Claims (16)
- 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법으로서,
(1) 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15 개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편(切片) 및 계수(係數)를 이용하여, 이하의 확률 PSMK
[화학식 1]
[상기 식에 있어서, CNS | SMK는 절편을, βi는 각각의 유전자에 대한 계수를, ai는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량값을 나타낸다. x는 11-15 중 어느 하나의 정수를 나타낸다.]
을 산출하고;
(2) 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액에 폭로된 기도 상피 세포에 있어서의 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1 B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4이상의 유전자의 발현에 관련되는 것에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 절편 및 계수를 이용하여, 이하의 확률 PCOPD
[화학식 2]
[상기 식에 있어서, CSMK | COPD는 절편을, γi는 각각의 유전자 대한 계수를, bi는 유전자 발현 데이터이며, 마이크로 어레이 데이터의 GC-RMA에 의한 정규화 후의 값 또는 qPCR법에 의한 유전자 발현의 정량 값을 나타낸다. y는 4-10 중 어느 하나의 정수를 나타낸다.]
을 산출하고;
(3) 확률 PSMK 및 확률 PCOPD에서, 상기 가열식 담배의 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크를, 이하의 PRF
[화학식 3]
로서 산출하는,
것을 포함하는, 상기 인비트로 평가 방법. - 제1항에 있어서,
공정 (1)에 있어서, 11 개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
의 모든 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하는 로지스틱 회귀 분석에 의해, 확률 PSMK을 산출하는, 인비트로 평가 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
공정 (2)에 있어서, 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
의 모든 유전자의 발현에 관한 데이터에 기초하여, 미리 공공 데이터를 이용한 로지스틱 회귀 분석에 의해 산출된 계수를 이용하여, 확률 PCOPD를 산출하는, 인비트로 평가 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 상피 세포가, 포유류의 기도 상피 세포인, 인비트로 평가 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 상피 세포가 사람 기도 상피 세포, 마우스(mouse) 기도 상피 세포, 또는 랫(rat) 기도 상피 세포인, 인비트로 평가 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 상피 세포가 삼차원 배양 세포인, 인비트로 평가 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 상피 세포가 기액 계면 배양 하에 있는, 인비트로 평가 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로시킨 기도 상피 세포에 있어서, PRF가 0.8 이하의 범위인 경우에, 해당 가열식 담배 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크는 낮다 또는 없다, 라고 판단하는, 인비트로 평가 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 2종류의 가열식 담배에 대해 PRF를 비교하여, PRF가 더 낮은 가열식 담배 쪽을, 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크가 더 낮다, 라고 판단하는, 인비트로 평가 방법.
- (1) 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 11개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, ADM, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, HILPDA, EGLN3, CXCR4, AREG, FBXO32
를 포함하는 11개 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터, 및,
(2) 이하의 15개의 유전자:
TXNIP, EFNA1, CYP1B1, ADM, AREG, DUSP6, SLC7A11, IGFBP3, WNT5A, CXCR4, PHLDA1, HILPDA, ZBED2, EGLN3, FBXO32
중 적어도 이하의 4개의 유전자:
EFNA1, TXNIP, DUSP6, AREG
를 포함하는 4 이상의 유전자의 발현에 관한 데이터
의, 흡인에 의한 만성 폐색성 폐 질환의 리스크의 인비트로 평가 방법에의 이용. - 가열식 담배로서,
재구성 담배로 이루어지는 에어로졸 원(源)을, 직접 또는 간접으로 전기적으로 가열하는, 구조적 특징을 가지며,
해당 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 시료 용액을 이용하여 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 인비트로 평가 방법을 실시한 경우에, 가열식 담배의 에어로졸 또는 에어로졸 중의 입자 상 물질을 포함하는 용액을, 최대 농도 2000 퍼프/L로 24시간 폭로한 기도 상피 세포에서, PRF가 0.8 이하의 범위인, 상기 가열식 담배. - 제11항에 있어서, 재구성 담배가, 평균 입경 0.2mm 이하의 재구성 담배 과립이고, 그리고,
다공성 물질 또는 섬유로 이루어진 담체의 전부 또는 그 일부가 전기 히터로 가열되어 발생하는 프로필렌글라이콜과 글라이세린의 혼합 증기에 의해 재구성 담배 과립이 가열되는,
가열식 담배. - 제11항에 있어서, 재구성 담배가, 평균 단변 길이 1mm 이상, 평균 장변 길이 5mm 이하의 재구성 담배 시트이며, 권지(卷紙)로 싸서, 담배 로드를 구성하고, 그리고,
상기 담배 로드가, 권지의 외주와 접하는 부터 전기 히터에 의해 가열되는,
가열식 담배. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 발생하는 에어로졸이 1.4μg/개 이하의 아세트알데하이드를 포함하는, 가열식 담배.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 발생하는 에어로졸이 1.2μg/개 이하의 아크롤레인을 포함하는, 가열식 담배.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 발생하는 에어로졸이 68.4μg/개 이하의 폼알데하이드를 포함하는, 가열식 담배.
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