TW202104895A - 抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法 - Google Patents

抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法 Download PDF

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Abstract

本發明係有關抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法。
本發明之方法包含：
(1)以關於11個以上基因之表現之數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出機率PSMK，其中，該11個以上基因係含有曝露於含有煙製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：TXNIP、EFNA1、CYP1 B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中至少特定11個基因；
(2)以關於4個以上基因之表現為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之係數，算出機率PCOPD，其中，該4個以上基因係含有曝露於含有煙製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的前述15個基因中至少特定4個基因；
(3)從機率PSMK及機率PCOPD算出因為前述煙製品之氣溶膠或氣溶膠 之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險。

Description

抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法
本發明係有關抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法及加熱式菸(又稱加熱式香煙)。
慢性閉塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，以下，於本說明書中亦稱為「COPD」)為長期間吸入曝露於大氣中之污染物質或粉塵、微生物等有害物質產生的炎症性呼吸器疾病。由於認為菸的煙是COPD主要風險要因之一，因此建立評估菸的煙之COPD發症風險之手法為當務之急。該點亦報導於有關於抽煙曝露試驗之動物模型，惟，對於人類的影響為外推評估，有物種差異問題之慮。
從該等背景，於菸業界，藉由使用源自人類細胞之體外試驗，預測於人類疾病風險之重要性變高。尤其是由於氣道上皮組織為對於吸入之有害物質作為最初防禦機構作用之組織，因此積極進行使用氣道上皮細胞之菸的煙之生物影響評估。近年來除了以往使用單層培養細胞之單次曝 露試驗之外，亦積極的進行使用具有更接近生體組織構造之三次元培養模型之頻繁曝露試驗，於人類之外推性高之實驗之評估。
近年來，開發電子菸或加熱式菸等與以往不同之菸製品且己上市。該等製品之特徵為未伴隨燃燒而產生氣溶膠(aerosol，又稱霧氣)，認為可抑制如於以往之燃燒性菸看到之燃燒及高溫之燃燒氣體伴隨煙草絲內之成分產生化學反應生成之化學物質之發生。實際上從使用該等菸製品之成分分析結果，具有生物活性之一些化學成分與燃燒性菸比較，有量較少之報告。
作為解析包羅於抽煙物品之煙或氣溶膠中含有之化學物質產生反應之複雜生體反應之手法，各種體學技術之活用廣受注目。尤其是使用qPCR陣列或微陣列之基因表現量測定，由於技術大進步，數據品質與其他體學技術比較，非常高，於公共數據庫之登錄數亦豐富。因此，利用陣列數據資訊之整合分析亦盛行。與燃燒性菸的煙之曝露比較，具有生物活性之化學物質含量低之電子菸或加熱式菸等的煙，有抑制氣道上皮細胞中之基因表現變動之報告。惟，關於從具有該等生物活性之化學物質引起之基因表現量變動預測具體性疾病風險之手法，現狀為具體之評估手法尚未確定。
於WO2013/190092記載COPD之風險中使用之一群基因。於Am.J.Respir Crit Care Med.2007,175(6)：577-586報告COPD病患特徵之基因。惟，未提供用於將抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險進行統計性定量評估之有效方法。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO2013/190092
[專利文獻2]WO2016/075748
[專利文獻3]WO2016/075749
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Am. J. Respir Crit Care Med, 2007, 175(6): 577-586
[非專利文獻2]ISO 3308
本發明以提供抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法及加熱式菸為目的。
本發明人等從使用微陣列數據之體外評估系構築新穎之菸製品COPD風險潛在性評估手法，於藉由使用三次元培養細胞模型之加熱式菸評估氣溶膠曝露對生體影響時，發現本加熱式菸之COPD潛在性風險低，而達成本發明。
本發明非限定性地包含以下之態樣。
[態樣1]
一種前述體外評估方法，為吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法，包含
(1)以關於11個以上基因之表現之數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PSMK，其中，該11個以上基因係含有曝露於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32；
Figure 108146322-A0202-12-0004-1
 [於上述式，CNS|SMK為截距，βi為對於各個基因之係數，αi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。x表示11-15中之任一整數。]
(2)以關於4個以上基因之表現為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PCOPD，其中，該4個以上基因係含有曝露於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32 中之至少下列4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG；
Figure 108146322-A0202-12-0005-2
 [於上述式，CSMK|COPD為截距，γi為對於各個基因之係數，bi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。y表示4-10中之任一整數。]
(3)從機率PSMK及機率PCOPD，將因為前述加熱式菸之吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險作為以下之PRF算出
Figure 108146322-A0202-12-0005-3
[態樣2]
如態樣1所述之體外評估方法，為於步驟(1)藉由以關於11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之所有基因表現之數據為基礎之邏輯回歸分析算出機率PSMK。
[態樣3]
如態樣1或2所述之體外評估方法，為於步驟(2)藉由以關於4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之所有基因表現之數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之係數，算出機率PCOPD。
[態樣4]
如態樣1至3中任一項所述之體外評估方法，其中，氣道上皮細胞為哺乳類之氣道上皮細胞。
[態樣5]
如態樣1至4中任一項所述之體外評估方法，其中，氣道上皮細胞為人類氣道上皮細胞、小鼠氣道上皮細胞或大鼠氣道上皮細胞。
[態樣6]
如態樣1至5中任一項所述之體外評估方法，其中，氣道上皮細胞為三次元培養細胞。
[態樣7]
如態樣1至6中任一項所述之體外評估方法，其中，氣道上皮細胞為氣液界面培養下。
[態樣8]
如態樣1至7中任一項所述之體外評估方法，其中，於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸(puff)/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，於PRF為0.8以下範圍之情況判斷因為該加熱式菸的吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險低或無。
[態樣9]
如態樣1至8中任一項所述之體外評估方法，其中，對於2種加熱式菸比較PRF，將PRF較低之加熱式菸判斷為因為吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險較低。
[態樣10]
一種下列數據之對於吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法的利用，其中，該數據為：
(1)關於含有下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中至少下列11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之11個以上基因之表現的數據，及
(2)關於含有下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中至少下列4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4個以上基因之表現之數據。
[態樣11]
如前述之加熱式菸，為加熱式菸，
具有將由再構成菸所形成之氣溶膠源，直接或間接進行電加熱之構造性特徵，
於使用含有該加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液，進行如態樣1-6中任一項所述之體外評估方法時，於含有加熱式菸之氣溶 膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，PRF為0.8以下之範圍。
[態樣12]
如態樣11所述之加熱式菸，其中，再構成菸為平均粒徑0.2mm以下之再構成菸顆粒，
由多孔性物質或纖維所形成之載體全部或其一部分藉由以電加熱器加熱產生丙二醇與甘油之混合蒸氣，藉此使再構成菸顆粒加熱。
[態樣13]
如態樣11所述之加熱式菸，其中，再構成菸為平均短邊長1mm以上、平均長邊長5mm以下之再構成菸片，裹在捲紙中，構成菸桿，
前述菸桿係於電加熱器與捲紙之外周接觸後藉由電加熱器加熱。
[態樣14]
一種加熱式菸，為如態樣11-13中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有1.4μg/支以下之乙醛。
[態樣15]
一種加熱式菸，為如態樣11-13中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有1.2μg/支以下之丙烯醛。
[態樣16]
一種加熱式菸，為如態樣11-13中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有68.4μg/支以下之甲醛。
藉由本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法可以統計學定量評估，比較抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險。以統計學定量評估抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之方法以往皆不知，可藉由本發明開始成為可比較，於科學上、產業上之意義大。藉由本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法可研究/開發風險降低之製品(可減低使用包含抽煙或吸煙之製品伴隨之健康風險之製品)。
第1圖表示於加熱式菸，藉由被加熱之溫度變化之一例。
第2圖表示於加熱式菸，藉由被加熱之溫度變化之一例。
第3圖表示微陣列數據分析之結果。(A)表示與暗示參予COPD發症之生體反應關連之陽性對照試藥曝露之基因表現特性之階層性集群分析。(B)表示藉由燃燒性菸之全煙冒泡曝露，差異表現基因之文氏圖(Venn diagram)。
第4圖表示使用公共數據庫之COPD潛在性風險值之計算結果。
第5圖係將使用曝露24小時後之加熱式菸(NGP1、NGP2)及試驗用標準捲菸(3R4F、1R6F)全煙冒泡曝露之COPD潛在性風險值之計算結果以平均值±標準偏差表示。
1.抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法
本發明係有關抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法。上述評估方法包含
(1)以關於11個以上基因之表現之數據，具體而言為微陣列數據或藉由qPCR法所得之基因表現數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PSMK，其中，該11個以上基因係包含曝露於含有菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32；
Figure 108146322-A0202-12-0010-4
 [於上述式，CNS|SMK為截距，βi為對於各個基因之係數，αi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。x表示11-15中之任一整數。]
(2)以關於4個以上基因之表現之數據，具體而言為微陣列數據或藉由qPCR法所得之基因表現數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之切片截距及係數，算出以下之確率PCOPD，其 中，該4個以上基因係包含曝露於含有菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG；
Figure 108146322-A0202-12-0011-5
 [於上述式，CSMK|COPD為截距，γi為對於各個基因之係數，bi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。y表示4-10中之任一整數。]
(3)從機率PSMK及機率PCOPD，將因為前述菸製品之煙或氣溶膠的抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險作為以下之潛在性風險值(Potential Risk Factor：PRF)算出
Figure 108146322-A0202-12-0011-6
「慢性閉塞肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)為長期間吸入曝露於大氣中之污染物質或粉塵、微生物等有害物質產生之炎症性呼吸器疾病。COPD認為與抽煙有很深的關係。本發明係有關於體外將抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險以統計學定量之評估方法。
「菸製品」的種類並無特別限制。包含紙捲菸等可燃性抽煙物品、氣溶膠源不燃燒而藉由加熱發生之「加熱式菸」。加熱式菸為含有 菸桿部之香味吸引器，不將菸燃燒，將以電熱源或藉由化學反應之熱源將含浸於酒精/乙醇/甘油/丙二醇或該等之混合溶液之多孔質或纖維質物體直接或間接加熱產生之蒸氣與粒狀物質混合之氣體，通過香味吸引器混入引進之空氣中。再者，蒸氣、粒狀物質與空氣之混合氣體除了上述之菸之外，通過葉菸/再構成菸/再構成菸片/再構成菸顆粒，菸/葉菸/再構成菸類含有之香味吸嚐成分、含有由尼古丁或各種天然香料構成之揮發性化合物之氣體混入。於加熱式菸，包含含有該揮發性化合物之氣體之混合氣體，亦即，氣溶膠(全煙)與氣相成分之混合氣體藉由消費者吸煙。通常，消費者藉由加熱式菸之端(口側之端或過濾器端、煙嘴端)引進，吸煙該混合氣體。
加熱式菸作為氣溶膠發生方式之其他3態樣有直接加熱式香味吸煙器、間接加熱式(空氣加熱)香味吸煙器及間接加熱式(蒸氣加熱)香味吸煙器。直接加熱式香味吸煙器為含有具備以下特徵之菸桿之香味吸煙器。含有菸葉、再構成菸或再構成菸片之菸桿部主要藉由電加熱直接加熱，產生含有源自葉菸之尼古丁或香料之氣溶膠。間接加熱式(空氣加熱)香味吸煙器為含有具備以下特徵之菸桿之香味吸煙器。含有菸葉、再構成菸或再構成菸片之菸桿部藉由經使用電加熱等熱源加熱之空氣間接加熱，產生含有源自葉菸之尼古丁或香料之氣溶膠。該等於吸煙中從菸葉、再構成菸或再構成菸片釋放出揮發性化合物，通過香味吸煙器混入引進之空氣中。釋放出之化合物冷卻接著凝結，形成氣溶膠，被消費者吸入。間接加熱式(蒸氣加熱)香味吸煙器為含有具備以下特徵之菸桿之香味吸煙器。藉由電 加熱將氣溶膠源(液體)加熱，產生氣溶膠，該氣溶膠產生含有源自葉菸之尼古丁或香料之氣溶膠。
「菸製品之氣溶膠」係指例如紙捲菸之煙、含有從香味吸煙器產生之氣溶膠亦即氣體狀物質、揮發性物質及粒狀物質之混合氣之氣溶膠之所有成分。
「菸製品之氣溶膠中之粒狀物質」係指例如紙捲菸之煙或除去從香味吸煙器產生之氣溶膠中之氣體狀、揮發性物質之所有物質，亦有稱為總粒狀物質(TPM、total particle matter)之情況。總粒狀物質為於菸業界，將紙捲菸之煙或從香味吸煙器產生之氣溶膠通過玻璃過濾器，於玻璃過濾器中捕集之物質。於一態樣，加熱式菸之氣溶膠中之粒狀物質包含水蒸氣、尼古丁、丙二醇、甘油、薄荷醇等。
「曝露於含有氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液」除了將細胞暴露於將總粒狀物質溶解於適當之溶劑或適當之細胞液體培養基之試料溶液之情況之外，亦包含將細胞暴露於藉由將菸製品之氣溶膠亦即氣體狀物質、揮發性物質及粒狀物質之混合氣通過，將氣體狀物質、揮發性物質及粒狀物質溶解之適當溶劑或適當液體培養基之全煙冒泡法獲得之試料溶液之情況。
試料溶液之「溶液」只要可將菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質溶解之溶液即可，並無特別限制。於一態樣，使用兩親媒性溶劑作為溶液。兩親媒性溶劑非限定性地包含二甲亞碸(DMSO)、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮等。
抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法係利用曝露於含有從菸製品產生之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞。試料溶液中菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之濃度、曝露於氣道上皮細胞之時間，可對應菸製品的種類等適當調整。於本說明書，關於愛好菸製品之行為，有以「抽煙」作為包含「吸煙」之菸製品之抽煙或吸煙之使用行為之總稱而使用之情況。
「氣道上皮細胞」為源自為呼氣/吸氣搬運路徑之氣管-支氣管-細支氣管(亦有總稱為「氣道」之情況)之上皮組織之細胞。非為限定者，惟氣道上皮細胞亦可為哺乳類之氣道上皮細胞。非為限定者，惟氣道上皮細胞亦可為人類氣道上皮細胞、小鼠氣道上皮細胞、天竺鼠氣道上皮細胞或大鼠氣道上皮細胞。
於一態樣，氣道上皮細胞為三次元培養細胞。三次元培養細胞與二次元培養細胞比較，可於更接近生體環境之環境進行體外評估。例如，Epithelix公司販賣之Mucil Air(註冊商標)為於立體細胞培養盤再構成之人類氣道上皮體外3D再構成模型，可利用於前述體外評估方法。
於一態樣，氣道上皮細胞為於氣液界面培養下。氣道上皮細胞藉由於氣液界面培養下，可將氣道上皮細胞分化誘導為纖毛細胞，又，有粒狀物質於氣道上皮細胞直接接觸，可將實際曝露形態再現之利點。
抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法包含
(1)以關於11個以上基因之表現之數據，具體而言為微陣列數據或藉由qPCR法所得之基因表現數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏 輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PSMK作為判斷為抽煙者之機率，其中，該11個以上基因包含曝露於含有菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32；
Figure 108146322-A0202-12-0015-7
[於上述式，CNS|SMK為截距，βi為對於各個基因之係數，αi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。x表示11-15中之任一整數。]
下列15個基因於本發明發現為與抽煙有關連性之基因。
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32
該等中，下列11個基因為藉由變數減少法而被發現與抽煙之關連性特別高之基因。
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32
公共數據庫之微陣列數據可非限定性地利用例如登錄於EMBL-EBI之微陣列數據：E-MTAB-1690，E-GEOD-20257，E-GEOD-8545。
使用公共數據之邏輯回歸分析，例如為從登錄於公共數據庫之微陣列數據中賦予之屬性資訊，利用健康人(HLT)及抽煙者(SMK)之區分作為目的變數，作為說明變數將含有TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之11種基因之基因之GC-RMA所得之正規化基因表現數據αi外插，且例如非限定性地藉由統計分析免費軟體「R」進行邏輯回歸分析，從獲得之回歸式可獲得截距CNS|SMK及係數βi。
於一態樣，「至少含有11個以上之下列11個基因：TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之基因」為11個、12個、13個、14個或15個基因。較佳為11個基因。
前述體外評估方法，包含(2)以關於4個以上基因之表現之數據，具體而言為微陣列數據或藉由qPCR法所得之基因表現數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PCOPD作為判斷為抽煙者中COPD病患之機率，其中，該4個以上基因包含曝露於含有菸製品之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG；
Figure 108146322-A0202-12-0017-8
[於上述式，CSMK|COPD為截距，γi為對於各個基因之係數，bi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值。y表示4-10中之任一整數。]
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4個基因藉由變數減少法發現為與COPD之關連性高之基因。DUSP6雖未包含於與抽煙關連性特別高之11個基因，惟，包含於發現與抽煙有關連性之15個基因之中。
公共數據庫之微陣列數據例如可非限定性地利用登錄於EMBL-EBI之微陣列數據：E-MTAB-1690，E-GEOD-20257，E-GEOD-8545。
使用公共數據之邏輯回歸式，例如為從登錄於公共數據庫之微陣列數據中賦予之屬性資訊，利用抽煙者(SMK)及COPD病患(COPD)之區分作為目的變數，作為說明變數將含有EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4種基因之基因之GC-RMA所得之正規化基因表現數據bi外插，且例如非限定性地藉由統計分析免費軟體「R」進行邏輯回歸分析，從獲得之回歸式可獲得截距CSMK|COPD及係數γi。
於一態樣，「含有EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4個以上之基因」為4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳為4個。
因此，前述體外評估方法以(1)、(2)之結果為基礎，包含(3)從機率PSMK及機率PCOPD算出前述抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險，作為以下之潛在性風險值(PRF)
Figure 108146322-A0202-12-0018-9
於一態樣，於步驟(1)，以關於11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32所有基因表現之微陣列數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出機率PSMK。
於一態樣，於步驟(2)，以關於4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG所有基因表現之微陣列數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出機率PCOPD。
於本說明書之實施例，以NGP(次世代產品(NEXT GENERATION PRODUCT)(NGP1、NGP2)，以最大濃度2000抽吸/L之濃度曝露24小時時，PRF於非抽煙者為0.07，於抽煙者為0.46，於COPD病患為0.83，與不抽煙之健康者比較，看到PRF增加。又，於實施例使用之NGP1、NGP2各個後述於本說明書之「加熱式菸之實施態樣」項目，相當於與「第3態樣」相關之加熱式菸、與「第2態樣」相關之加熱式菸。對於詳細之NGP2亦記載於日本專利特願2018-213498(未公開)中。
於前述體外評估方法之一態樣，於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，於PRF為0.8以下之範圍(比實施例COPD病患之PRF低)之情況，判斷因為該加熱式菸之抽煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險低或無風險。非為限定性者，惟以最小濃度200抽吸/L曝露24小時之條件下進行相同之實驗時，亦可同樣的算出PRF。
於一態樣，於將加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞，於PRF為0.4以下之範圍(比實施例抽煙者之PRF低)之情況，判斷該加熱式菸對於抽煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險低或無風險。
於前述體外評估方法之一態樣，比較2種加熱式菸之PRF，判斷PRF較低之加熱式菸對於抽煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險較低。
本發明更有關於(1)含有下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列11個基因：
TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之11個以上基因之表現之微陣列數據，及
(2)關於含有下列15個基因：
TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32 中之至少下列4個基因：
EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4個以上基因之表現之微陣列數據對於因為抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法之利用。
2.加熱式菸
本發明係有關加熱式菸。前述加熱式菸之特徵為具有將由再構成菸所形成之氣溶膠源直接或間接進行電加熱之構造。
於使用含有該加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液進行本發明之體外評估方法時，於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，PRF為0.8以下之範圍或PRF為0.4以下之範圍。PRF為根據發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法首次揭示者。具有該等低PRF之加熱式菸藉由本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法首次被想到。
「加熱式菸」之態樣為如「1.抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法」項目所述。前述加熱式菸之特徵為具有將由再構成菸所形成之氣溶膠源直接或間接進行電加熱之構造。
於一態樣，該加熱式菸之再構成菸為平均粒徑0.2mm以上、1.2mm以下之再構成菸顆粒。於一態樣，由多孔性物質或纖維構成之載體全部或其一部分藉由以電加熱器加熱產生丙二醇與甘油之混合蒸氣，藉此使再構成菸顆粒加熱。於一態樣，該加熱式菸之再構成菸為平均粒徑0.2mm以上、平均粒徑1.2mm以下之再構成菸顆粒，因此，藉由由多孔性物質或 纖維構成之載體全部或其一部分藉由以電加熱器加熱產生丙二醇與甘油之混合蒸氣，藉此使再構成菸顆粒加熱。
於一態樣，再構成菸為平均短邊長1mm以上、平均長邊長5mm以下之再構成菸片。於一態樣，再構成菸片裹在捲紙中，構成菸桿，前述菸桿係於電加熱器與捲紙外周接觸後藉由電加熱器加熱。於一態樣，再構成菸為平均短邊長1mm以上、平均長邊長5mm以下之再構成菸片裹在捲紙中，構成菸桿，前述菸桿係於電加熱器與捲紙外周接觸後藉由電加熱器加熱。
[加熱式菸之實施態樣]
以下，非限定性地說明加熱式菸之實施態樣。
加熱式菸為在插入具備電加熱器之吸煙器具之狀態下產生氣溶膠與氣體之混合氣，經由消費者之口腔/氣道/鼻腔而供吸煙之物品。形狀為棒狀，全長可為20mm以上100mm以下，50mm以上85mm以下。
於第1態樣，形狀為棒狀，全長可為20mm以上、30mm以上、40mm以上、50mm以上、60mm以上、70mm以上、80mm以上、83mm、50mm以下、60mm以下、70mm以下、80mm以下、90mm以下、100mm以下。
於第2態樣，形狀為棒狀，全長可為20mm以上、30mm以上、40mm以上、50mm以上、60mm以上、70mm以上、80mm以上、55mm、50mm以下、60mm以下、70mm以下、80mm以下、90mm以下、100mm以下。外周長可為15mm以上、20mm以上、25mm以下、30mm以下、22mm。
於第3態樣，為含有再構成菸顆粒之聚丙烯製之塑膠膠囊，塑膠膠囊之形狀為略圓筒形，全長可為10mm以上、20mm以上、30mm以上、40mm以上、50mm以上、60mm以上、70mm以上、40mm以下、50mm以下、60mm以下、70mm以下、80mm以下、90mm以下。
於第1、第2態樣，加熱式菸由菸桿部/空洞部/紙管/過濾器部構成，過濾器部為由纖維部分、空洞部分或中空紙管部分構成。
對於與第1態樣相關之加熱式菸加以說明。
菸桿部：菸桿部為棒狀，關於其長度，於加熱式菸之長軸方向為30mm以上50mm以下，較佳為42mm。菸桿部由再構成菸片之小片以捲紙包裹構成。
再構成菸：將再構成菸片裁刻之小片可為短邊1mm以上、長邊15mm以下。較佳長邊為10mm以下，更佳為5mm以下。再構成菸片可含有尼古丁0.80%以上0.90%以下作為香味成分。再構成菸片可含有薄荷醇作為香味成分。於該情況，每支菸桿部可含有薄荷醇0.3mg以上5.3mg以下。再構成菸片可含有可含有酒精之丙二醇0.04%以上0.58%以下，甘油12.4%以上14.3%以下作為保濕劑。再構成菸片可含有糖類/單糖/雙糖作為保濕劑，可含有單糖/雙糖合計3.7%以下、果糖2.1%以上2.7%以下、葡萄糖1.3%以上1.8%以下、蔗糖0.2%以上0.4%以下。再構成菸片可含有有機酸作為pH調整劑，可含有檸檬酸4.1mg/g以上4.6mg/g以下、蘋果酸30.9mg/g以上34.4mg/g以下、30.9mg/g以上34.4mg/g以下、琥珀酸0.2mg/g以上0.3mg/g以下、甲酸0.1mg/g以上0.2mg/g以下。
捲紙：捲紙之通氣度可為64.0(Coresta Unit)以上67.0(Coresta Unit)以下，基重可為26.2(g/m2)以上26.4(g/m2)以下，碳酸鈣含量可為25.2%以上25.5%以下，助燃劑可為0.7%。
過濾器部：過濾器部為棒狀，其長度於加熱式菸之長軸方向較佳為5mm以上18mm以下。過濾器部由乙酸酯纖維過濾器及中空紙管構成。乙酸酯纖維過濾器之長度於長軸方向較佳為5mm以上18mm以下，更佳為8mm。構成乙酸酯纖維過濾器之乙酸酯纖維可為任意之截面形狀，亦可為圓截面形狀、Y字型截面形狀、X字型截面形狀。中空紙管之長度於長軸方向可為5mm以上18mm以下，較佳為8mm。
空洞部：空洞部畫分為從空洞部過濾器部側之端部向過濾器部延伸5mm以上16mm以下且從菸桿部側之端部向菸桿部延伸5mm以下之外包紙(tipping paper)內面，以及過濾器部之端面、構成菸桿之再構成菸片煙絲之端面。空洞部為棒狀，其長度於加熱式菸之長軸方向可為20mm以上30mm以下，較佳為25mm。
外包紙：外包紙構成空洞部，可於圓周方向2個以上之複數個位點設置對齊之開孔。開孔之列可設置1列，亦可設置2以上之複數列。外包紙可將膠帶狀之紙片成型為螺旋狀，內貼於切成一定長度之紙管。
對於與第2態樣相關之加熱式菸加以說明。
菸桿部：菸桿部為棒狀，其長度於加熱式菸之長軸方向為15mm以上25mm以下，較佳為22mm。菸桿部由以捲紙將再構成菸片之小片包起來構成。將再構成菸片截刻之小片短邊可為1mm以上、長邊可為15mm以下，較佳長邊可為10mm以下，更佳可為5mm以下。
再構成菸：於菸桿部中，再構成菸片之小片可含有200mg以上300mg、220mg以上280mg以下、240mg以上260mg以下、250mg以上260mg、255mg或260mg。
捲紙：捲紙之通氣度可為64.0(Coresta Unit)以上67.0(Coresta Unit)以下，基重可為26.2(g/m2)以上26.4(g/m2)以下，碳酸鈣含量可為25.2%以上25.5%以下，助燃劑可為0.7%。
過濾器部：過濾器部為棒狀，其長度於加熱式菸之長軸方向較佳為5mm、20mm、30mm以上40mm以下，35mm。過濾器部由乙酸酯纖維過濾器、中空紙管及中空乙酸酯管構成。
乙酸酯纖維過濾器之長度於長軸方向可為5mm以上35mm以下，較佳為7mm。構成乙酸酯纖維過濾器之乙酸酯纖維可為任意截面形狀，可為圓截面形狀、Y字型截面形狀、X字型截面形狀。
中空紙管之長度於長軸方向可為5mm以上35mm以下，較佳為20mm。中空紙管作為外氣取入孔，於圓周方向可於2個以上之複數位點，較佳為15個位點設置對齊之開孔。外氣取入孔開孔之列可設置1列，亦可設置2列以上之複數列。
中空乙酸酯管為由乙酸酯纖維構成之壁厚1.2mm之乙酸酯管，中空乙酸酯管之長度於長軸方向可為5mm以上35mm以下，較佳為8mm。
於與第3態樣相關之加熱式菸，包含例如記載於WO2016/075748、WO2016/075749之非燃燒型香味吸煙器。非燃燒型香味吸煙器具有電源單元、含有氣溶膠源及霧化部之第1匣及第2匣。第2匣為將藉 由霧化部霧化之氣溶膠通過，於氣溶膠賦予香味。此處，需留意香味源不經加熱即可於氣溶膠賦予香味。又，需留意從香味源實質上未產生氣溶膠。霧化部為未伴隨燃燒將氣溶膠源霧化。第2匣為收容於賦予前述氣溶膠香味之香味源。香味源由在非燃燒型香味吸煙器產生之氣溶膠賦予香味之再構成菸構成之顆粒構成。再構成菸顆粒之尺寸較佳為0.2mm以上1.2mm以下。再者，再構成菸顆粒之尺寸較佳為0.2mm以上0.7mm以下。由於構成香味源之再構成菸顆粒之尺寸越小，比表面積增大，香味吸嚐成分越容易從構成香味源之顆粒揮散。
[被加熱之實施態樣]
以下，非限定的對於加熱式菸中被加熱之實施態樣加以說明。
與第1態樣相關之加熱式菸為藉由具備2根1組之發熱線且以樹脂包覆之1張薄膜狀加熱器來進行加熱而產生氣溶膠與氣體之混合氣。加熱式菸藉由加熱器從外周加熱，且藉由伴隨吸煙動作從菸桿部反吸口端導入於再構成菸片小片之集合體內之外氣而冷卻。因此，加熱式菸於產生氣溶膠與氣體之混合氣時，再構成菸片小片之集合體溫度之分布不一樣，於以下3個位點：從反吸口側端起1mm之位置(Top)/中央位置(Middle)/從吸口側端起1mm之位置(End)插入之熱電偶互相顯示不同之溫度變化，且即使於相同位置，於外周部(Peripheral)及中心部(Center)亦顯示不同溫度變化之態樣。再者，於End以外之位置，會藉由伴隨吸煙動作而導入菸桿部內之外氣所冷卻，溫度於短時間內下降。
於Peripheral-Top，加熱式菸之溫度變化大約分為5相。第1相為從開始加熱至40秒。溫度於40秒以內上昇至75℃。第2相為從40秒起至135秒。溫度從75℃上昇至150℃並維持著。第3相為從135秒起至150秒。溫度為從150℃上昇至200℃。第4相為從150秒起至220秒。溫度為從200℃上昇至230℃。終相為220秒以後。溫度從230℃下降至室溫。
於Peripheral-Middle，加熱式菸之溫度變化大約分成5相。第1相為從開始加熱至25秒。溫度為上昇至150℃。第2相為從25秒起至135秒。溫度從150℃上昇至200℃。第3相為從135秒起至150秒。溫度為從200℃上昇至230℃。第4相為從150秒起至220秒。溫度為從230℃上昇至240℃。終相為220秒以後。溫度為從240℃下降至室溫。
於Peripheral-End，加熱式菸之溫度變化大約分成4相。第1相為從開始加熱起至25秒。溫度於25秒以內上昇至200℃。第2相為從25秒起至150秒。溫度為從200℃上昇至240℃並維持著。第3相為從150秒起至220秒。溫度為從240℃下降至200℃。終相為220秒以後。溫度為從200℃下降至室溫。
於Center-Top，加熱式菸之溫度變化大約分為5相。第1相為從開始加熱至40秒。溫度上昇至50℃。第2相為從40秒起至135秒。溫度為從50℃上昇至125℃。第3相為從135秒起至150秒。溫度為從150℃上昇至180℃。第4相為從150秒起至220秒。溫度為從200℃上昇至210℃。終相為220秒以後。溫度為從210℃下降至室溫。
於Center-Middle，加熱式菸之溫度變化大約分為5相。第1相為從開始加熱至25秒。溫度為上昇至100℃。第2相為從25秒起至135秒。溫度為從100℃上昇至180℃。第3相為從135秒起至150秒。溫度為從180℃上昇至200℃。第4相為從150秒起至220秒。溫度為從200℃上昇至240℃。終相為220秒以後。溫度為從240℃下降至室溫。
於Center-End，加熱式菸之溫度變化大約分為4相。第1相為從開始加熱至25秒。溫度為上昇至100℃。第2相為從25秒起至45秒。溫度為從100℃上昇至150℃。第3相為從45秒起至135秒。溫度為從150℃上昇至230℃。第4相為從135秒起至220秒。溫度為從230℃下降至200℃。終相為220秒以後。溫度為從200℃下降至室溫。
上述之溫度變化伴隨各相之遷移為連續性。
與第2態樣相關之加熱式菸之被加熱亦可同樣的進行第1加熱式菸之被加熱。
作為一例，於第1及第2態樣之加熱式菸，帶來上述溫度變化之加熱器可表示如第1圖、第2圖顯示之溫度變化之態樣。
於第1個位點之加熱器之溫度變化大約可分為4相。第1相為從開始加熱至25秒。加熱器之溫度為從開始吸煙起，於25秒以內上昇至200℃。第2相為從25秒至150秒。加熱器之溫度為以30秒至45秒上昇至230℃，之後至150秒維持約230℃。第3相為從150秒起至220秒。加熱器之溫度為150秒以後下降至220℃，維持220℃至220秒為至。終相為220秒以後。加熱器之溫度為從220℃下降至常溫。
於第2個位點之加熱器之溫度變化大約可分為4相。第1相為從開始吸煙至75秒。加熱器之溫度為從開始吸煙起，於75秒以內上昇至100℃。第2相為從75秒至135秒。加熱器之溫度為從75秒至80秒上昇至140℃，之後至135秒上昇至150℃。第3相為從135秒至220秒。加熱器之溫度為從135秒至150秒上昇至230℃，從150秒至220秒維持在230℃。終相為220秒以後。加熱器之溫度為從230℃下降至常溫。於第1/第2個位點之溫度變化，伴隨各相之遷移為連續性。
與第3態樣相關之加熱式菸之被加熱例如以如下所述之方法進行。霧化部包含電熱線、電磁誘導型加熱機構或超音波振動子，藉由使用者吸煙動作時從電源單元供給電流，使發熱或動作，將第1匣含有之氣溶膠源霧化。將藉由霧化部霧化之氣溶膠通過，於氣溶膠賦予香味。於經霧化之氣溶膠通過第2匣時，第2匣內大氣之溫度為常溫以上、26℃以上、40℃以下，較佳為30℃以下。此處，需留意香味源不需經過加熱即可於氣溶膠賦予香味。
[加熱式菸之氣溶膠氣體之混合氣成分]
以下，非限定性地說明加熱式菸之氣溶膠與氣體之混合氣成分之實施態樣。
以加拿大衛生部規定之抽煙條件(CIR條件)，惟於加熱式菸之過濾器部設置之開孔部無阻塞之條件，於藉由6次或8次之抽煙動作產生之氣溶膠與氣體之混合氣中，每支菸桿之羰基化合物之量較佳為以下之態樣。
於第1態樣，甲醛較佳為100.00(μg/支)以下。較佳為70.00(μg/支)以下。更佳為50.00(μg/支)以上、70.00(μg/支)以下。最佳為57.60(μg/支)以上、68.40(μg/支)以下。
於第2態樣，甲醛較佳為40.00(μg/支)以下。更佳為37.00(μg/支)以下。
於第1態樣，乙醛較佳為3.000(μg/支)以下。更佳為2.000(μg/支)以下。再更佳為0.750(μg/支)以上、2.000(μg/支)以下。最佳為0.800(μg/支)以上、1.400(μg/支)以下。
於第2態樣，乙醛較佳為1.000(μg/支)以下。更佳為0.940(μg/支)以下。
於第1態樣，丙烯醛較佳為3.000(μg/支)以下。更佳為2.000(μg/支)以下。再更佳為0.750(μg/支)以上、1.500(μg/支)以下。最佳為0.800(μg/支)以上、1.200(μg/支)以下。
於第2態樣，丙烯醛較佳為0.300(μg/支)以下。更佳為0.265(μg/支)以下。
於第3態樣，甲醛、丙烯醛、乙醛為偵測極限以下，於現在之分析技術為0.000(μg/支)。
以加拿大衛生部規定之抽煙條件(CIR條件)，惟於加熱式菸之過濾器部設置之開孔部無阻塞之條件，藉由8次抽煙動作產生之氣溶膠與氣體之混合氣中，每支菸桿之TSNAs量較佳為於加拿大衛生部規定之抽煙條件(CIR條件)抽煙之3R4F紙捲菸之10%以下。甲醛為0%以上、較 佳0.80%以上、1.30%以下。乙醛為0%以上，較佳為3.30%以上、3.80%以下。丙烯醛為0%以上，較佳為0.40%以上、0.70%以下。
於一態樣，加熱式菸產生之氣溶膠含有乙醛1.4μg/支以下。
於一態樣，加熱式菸產生之氣溶膠含有丙烯醛1.2μg/支以下。
於一態樣，加熱式菸產生之氣溶膠含有甲醛68.4μg/支以下。
以加拿大衛生部規定之抽煙條件(CIR條件)，惟於加熱式菸之過濾器部設置之開孔部無阻塞之條件，藉由6次或8次之抽煙動作產生之氣溶膠與氣體之混合氣中，每支菸桿尼古丁、甘油、丙二醇之量較佳為以下之態樣。
於第1態樣，尼古丁可為0.240mg/支以上0.510mg/支以下，甘油可為0.700mg/支以上2.900mg/支以下，丙二醇可為0.020mg/支以上0.270mg/支以下。
於第2態樣，尼古丁可為0.400mg/支以上0.500mg/支以下，甘油可為2.000mg/支以上2.500mg/支以下，丙二醇可為0.400mg/支以上0.500mg/支以下。
以CRM法(CORESTA RECOMMENDED METHOD NO.81)條件為基準，於第3態樣，於以50次之吸煙動作產生之氣溶膠與氣體之混合氣，尼古丁可為1.000mg/支以上1.500mg/支以下，甘油可為20.00mg/支以上30.00mg/支以下，丙二醇可為40.00mg/支以上60.00mg/支以下。
本發明為抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法，為提供將抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病以往未知之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險進行統計定量評估之方法。藉由利用本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險進行統計定量評估之方法，提供如上所述之風險降低製品(可降低抽煙或吸煙伴隨之健康風險之加熱式菸)。
[實施例]
以下，以實施例為基礎將本發明加以詳細說明，惟，本發明不只限於該等實施例。業者以本說明書之記載為基礎，可容易的於本發明加以修飾/變更，該等包含於本發明之技術範圍。
[實施例1 細胞培養]
人類氣道上皮細胞MucilAir(註冊商標)為從Epithelix公司購入。試驗使用於37℃、5%CO2環境下培養10日者，培養時每2-3日進行培養基交換。
[實施例2 微陣列試驗]
COPD之發症假設以源自活性氧之氧化壓力，伴隨長期氧化壓力之炎症反應、DNA損傷為起因，進行將誘導該等生體反應之物質作為陽性對照試藥之曝露實驗。
具體而言，首先，作為單次曝露試驗，對於MucilAir(註冊商標)以任意濃度添加NaClO、tBHQ、TNFα、IL-1β、順鉑、博來黴素(Bleomycin)各物質作為陽性對照試藥。NaClO及tBHQ為誘導氧化壓力，TNFα及IL-1β為誘導炎症反應，順鉑及博來黴素為誘導DNA損傷之各反 應。於添加各物質4小時後萃取mRNA。萃取mRNA係使用Qiagen公司之RNeasy。mRNA萃取後使用Human Genome U133 Plus 2.0 arrays(Affymetrix公司製造)，取得微陣列數據(數據1：陽性對照試藥曝露數據)。
同樣的，使用試驗用標準紙捲菸3R4F作為參照捲菸，將以ISO(國際標準化機構)方式(ISO：3308)為基準之方法產生之主流煙通過培養基回收(全煙冒泡溶液)。製作將3R4F調整為0.5支/L、1.0支/L、2.0支/L之濃度之全煙冒泡溶液，藉由上述相同之手法，添加於細胞，萃取mRNA，進行微陣列數據之取得(數據2：3R4F參考捲菸曝露數據)。
接著，作為頻繁曝露試驗，將從3R4F及與第3態樣相關之加熱式菸之主流煙各個以ISO方式、CRM法(CORESTA RECOMMEndED METHOD NO.81)產生之主流煙回收，將取得之全煙冒泡溶液稀釋，調整複數濃度之試驗液(3R4F：25-200抽吸/L、1R6F：50-200抽吸/L、NGP1：250-2000抽吸/L、NGP2：200-2000抽吸/L)。
對於加熱式菸，以比3R4F及1R6F之對照試料10倍多之次數捕集，將曝露於細胞之尼古丁量調整為與3R4F及1R6F同程度或同程度以上。亦即，調製曝露於細胞之總粒狀物質與3R4F及1R6F之對照試料比較，成為10倍多之試料。
將該等試驗液添加於MucilAir(註冊商標)，曝露24小時。曝露後進行mRNA之萃取，進行微陣列數據之取得(數據3：3R4F參考捲菸及NGP1曝露數據、數據4：1R6F參考捲菸及NGP2曝露數據)。
[實施例3 微陣列數據解析]
關於於實施例2獲得之數據1：陽性對照試藥曝露數據、數據2：3R4F參考捲菸數據、數據3：3R4F參考捲菸及NGP1曝露數據、數據4：1R6F參考捲菸及NGP2曝露數據及公共數據庫之微陣列數據(E-MTAB-1690，E-GEOD-20257，E-GEOD-8545)之CEL文件，每個試驗藉由GeneSpring Ver.14.9(安捷科技(Agilent Technologies)公司製造)進行正規化。正規化之演算法使用GC-Robust Multiarray Average(GC-RMA)進行使用全部試樣平均值之基線補正。對於正規化後之數據，使用統計分析免費軟體「R」，進行基因名之註解。
[實施例4 數據分析]
於本實施例分析於實施例3獲得之微陣列數據。使用GeneSpring的演算法，藉由使用歐幾德距離(Euclidean distance)之沃德法(Ward's method)進行集群分析(Cluster Analysis)。關於邏輯回歸分析使用統計分析免費軟體「R」，使用MASS，caret，data．table作為函式庫(library)進行邏輯回歸分析。
數據1：關於陽性對照試藥曝露數據，使用GeneSpring進行集群分析，抽出具有共通變動特徵之基因群。
數據2：關於3R4F參考捲菸曝露數據，抽出於各菸的煙濃度曝露時共通變動之基因群。
數據1：於比較於陽性對照試藥曝露數據及數據2：3R4F參考捲菸曝露數據抽出之基因群時，抽出共通之基因15個(TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、 PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32)(第3圖)。表1表示對於該等基因之機能及與閉塞性肺疾病之關連性是否己有報導之調查結果。
[表1]
Figure 108146322-A0202-12-0034-10
使用上述15個基因之基因群，藉由使用存在於微陣列數據庫中之健常人與COPD病患(各個稱為NS群、COPD群)之肺之微陣列數據(E-MTAB-1690，E-GEOD-20257，E-MTAB-8545)之邏輯回歸進行判別分析。結果表示於表2。
[表2]
Figure 108146322-A0202-12-0035-11
從邏輯回歸模型之交叉驗證結果(將5重之交叉驗證獨立的重複操作100次。從使用統計分析免費軟體「R」之統計分析結果，將本發明之模型NS群判別為NS群之精度為0.826，將COPD群判別為COPD群之精度為0.871，總合精度為0.8531，於任一群都為非常高之精度。表示於人類氣道上皮細胞體外之3D模型，COPD風險評估可抽出可能之基因。
[實施例5 藉由邏輯回歸分析之風險評估]
於本實施例，使用於實施例4發現之15個基因(TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32)之基因群，藉 由使用實際健康人、抽煙者及COPD病患之公共微陣列數據之邏輯回歸分析進行判別。
藉由變數減少法(將貢獻度高之基因以AIC(赤池情報量基準)或BIC(貝葉斯情報基準)為基礎算出之方法)，對於AIC或BIC最少之基因群各個進行探索。其結果，關於健康人與抽煙者之判別以11基因(TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、HILPDA、EGLN3、AREG、FBXO32)、關於抽煙者與COPD病患之判別以4基因(EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG)作為於判別中貢獻高之基因抽出。對於使用變數減少後之基因之邏輯回歸式之截距及係數之值(預估值)或該等之統計值(Std.Error、Z value、Pr(>| Z |))結果表示於以下之表3。
[表3]
Figure 108146322-A0202-12-0036-12
從以各邏輯回歸式算出之機率算出潛在性風險值(Potential Risk Factor，PRF)。以如下所述算出發症機率及潛在性風險值。
(i)以關於11個基因(TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、HILPDA、EGLN3、AREG、FBXO32)之表現之微陣列數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率。
Figure 108146322-A0202-12-0037-13
[於上述式，CNS|SMK為截距，βi為對於各個基因之係數，αi表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值。截距、係數之值表示於表3。]
(ii)以關於4個基因(EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG)表現之微陣列數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率。
Figure 108146322-A0202-12-0037-14
[於上述式，CSMK|COPD為截距，γI為對於各個基因之係數，bi表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值。截距、係數之值表示於表3。]
(iii)從機率PSMK及機率PCOPD算出前述紙捲菸之煙對於抽煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險作為以下之PRF
Figure 108146322-A0202-12-0037-15
使用上述計算式算出健康人(NS)、健康之抽煙者(SMK)、COPD病患(COPD)之PRF。結果表示於第4圖。如第4圖所示，PRF於非抽煙者為0.06、於抽煙者為0.46、於COPD病患為0.83，與非抽煙之健康者比較，看到PRF增加。
[實施例6 評估對於種種濃度、種種曝露期間之香味吸煙器之風險]
使用實施例5記載之回歸式，對於各種菸製品之種種濃度、種種曝露期間，算出頻繁曝露試驗之PRF。結果表示於第5圖。明瞭NGP曝露群PRF之平均值於任何濃度、任何曝露期間，都在上述設定之範圍。
於藉由抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法進行風險評估時明瞭與既有之紙捲菸比較，NGP之PRF非常低。
[產業上之利用可能性]
本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法可利用於統計學上定量評估抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病以往未知之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險。藉由本發明之抽煙或吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法可利用於研究/開發風險降低之製品(可降低抽煙或吸煙伴隨之健康風險之製品)。

Claims (16)

  1. 一種體外評估方法，為吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法，包含：
    (1)以關於11個以上基因之表現之數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PSMK，其中，該11個以上基因係含有曝露於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
    TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列11個基因：
    TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32，
    Figure 108146322-A0202-13-0001-16
     於上述式，CNS|SMK為截距，βi為對於各個基因之係數，αi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值，x表示11-15中之任一整數；
    (2)以關於4個以上基因之表現為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之截距及係數，算出以下之機率PCOPD，其中，該4個以上基因係含有曝露於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液之氣道上皮細胞中的下列15個基因：
    TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中之至少下列4個基因：
    EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG，
    Figure 108146322-A0202-13-0002-17
    於上述式，CSMK|COPD為截距，γi為對於各個基因之係數，bi為基因表現數據，表示藉由微陣列數據之GC-RMA正規化後之值或藉由qPCR法之基因表現之定量值，y表示4-10中之任一整數；
    (3)從機率PSMK及機率PCOPD，將因為前述加熱式菸之吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險作為以下之PRF算出
    Figure 108146322-A0202-13-0002-18
  2. 如申請專利範圍第1項所述之體外評估方法，其中，該體外評估方法為於步驟(1)藉由以關於11個基因：
    TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之所有基因表現之數據為基礎之邏輯回歸分析算出機率PSMK。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之體外評估方法，其中，該體外評估方法為於步驟(2)藉由以關於4個基因：
    EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG 之所有基因表現之數據為基礎，使用藉由事先使用公共數據之邏輯回歸分析算出之係數，算出機率PCOPD。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之體外評估方法，其中，該氣道上皮細胞為哺乳類之氣道上皮細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之體外評估方法，其中，該氣道上皮細胞為人類氣道上皮細胞、小鼠氣道上皮細胞或大鼠氣道上皮細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之體外評估方法，其中，該氣道上皮細胞為三次元培養細胞。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之體外評估方法，其中，該氣道上皮細胞為氣液界面培養下。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之體外評估方法，其中，於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，於PRF為0.8以下範圍之情況判斷因為該加熱式菸之吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險為低或無。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之體外評估方法，其中，對於2種加熱式菸比較PRF，將PRF較低之加熱式菸判斷為因為吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病之風險較低。
  10. 一種下列數據之對於吸煙引起之慢性閉塞性肺疾病風險之體外評估方法的利用，其中，該數據為：
    (1)關於含有下列15個基因：
    TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中至少下列11個基因：
    TXNIP、EFNA1、ADM、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、HILPDA、EGLN3、CXCR4、AREG、FBXO32之11個以上基因之表現的數據，及
    (2)關於含有下列15個基因：
    TXNIP、EFNA1、CYP1B1、ADM、AREG、DUSP6、SLC7A11、IGFBP3、WNT5A、CXCR4、PHLDA1、HILPDA、ZBED2、EGLN3、FBXO32中至少下列4個基因：
    EFNA1、TXNIP、DUSP6、AREG之4個以上基因之表現之數據。
  11. 一種加熱式菸，
    具有將由再構成菸所形成之氣溶膠源直接或間接進行電加熱之構造性特徵，
    於使用含有該加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之試料溶液，進行如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之體外評估方法時，於含有加熱式菸之氣溶膠或氣溶膠中之粒狀物質之溶液以最大濃度2000抽吸/L曝露24小時之氣道上皮細胞中，PRF為0.8以下之範圍。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之加熱式菸，其中，該再構成菸為平均粒徑0.2mm以下之再構成菸顆粒，
    由多孔性物質或纖維構成之載體全部或其一部分藉由以電加熱器加熱產生丙二醇與甘油之混合蒸氣，藉此使再構成菸顆粒加熱。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之加熱式菸，其中，再構成菸為平均短邊長1mm以上、平均長邊長5mm以下之再構成菸片，裹在捲紙中，構成菸桿，
    前述菸桿係在電加熱器與捲紙之外周接觸後藉由電加熱器加熱。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有1.4μg/支以下之乙醛。
  15. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有1.2μg/支以下之丙烯醛。
  16. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述之加熱式菸，其產生之氣溶膠含有68.4μg/支以下之甲醛。
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