JPWO2020139783A5 - - Google Patents
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Claims (45)
- RNA誘導型ヌクレアーゼ（RGN）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号1、16、24、35、43、または50と少なくとも95％配列が一致するアミノ酸配列を含むRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；
前記RGNポリペプチドが、標的DNA配列にハイブリダイズすることのできるガイドRNA（gRNA）に結合するとき、RNA誘導型配列に特異的なやり方で前記標的DNA配列に結合し；
RGNポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、このポリヌクレオチドにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている核酸分子。 - 前記RGNポリペプチドがヌクレアーゼデッドであるか、ニッカーゼとして機能する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記RGNポリペプチドが塩基編集ポリペプチドに機能可能に融合されている、請求項2に記載の核酸分子。
- 請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ガイドRNAをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、このガイドRNAが、配列番号2、17、25、36、44、51、または63と少なくとも95％配列が一致するCRISPR反復配列を含むCRISPR RNAを含む、請求項4に記載のベクター。
- 前記ガイドRNAが、配列番号3、18、26、37、45、52、または62と少なくとも95％配列が一致するtracrRNAを含む、請求項4または5に記載のベクター。
- 請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項4～6のいずれか1項に記載のベクターを含む細胞。
- CRISPR RNA（crRNA）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記crRNAがスペーサ配列とCRISPR反復配列を含み、前記CRISPR反復配列が、配列番号2、17、25、36、44、51、または63少なくとも95％配列が一致する核酸配列を含み；
a）前記crRNAと；
b）前記crRNAの前記CRISPR反復配列にハイブリダイズするトランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）
を含むガイドRNAが、RNA誘導型ヌクレアーゼ（RGN）ポリペプチドに結合するとき、前記crRNAの前記スペーサ配列を通じて配列特異的なやり方で標的DNA配列にハイブリダイズすることができ；
crRNAをコードする前記ポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている核酸分子。 - 請求項8に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記tracrRNAをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項9に記載のベクター。
- 配列番号3、18、26、37、45、52、または62と少なくとも95％配列が一致するヌクレオチド配列を含むトランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、
a）前記tracrRNAと；
b）スペース配列とCRISPR反復配列を含むcrRNA（ただし前記tracrRNAが前記crRNAの前記CRISPR反復配列にハイブリダイズする）
を含むガイドRNAが、RNA誘導型ヌクレアーゼ（RGN）ポリペプチドに結合するとき、前記crRNAの前記スペーサ配列を通じて配列特異的なやり方で標的DNA配列にハイブリダイズすることができ；
tracrRNAをコードする前記ポリヌクレオチドが、このポリヌクレオチドにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている核酸分子。 - 請求項11に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記crRNAをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項12に記載のベクター。
- 標的DNA配列に結合させるためのシステムであって、
a）前記標的DNA配列にハイブリダイズすることのできる1つ以上のガイドRNA、またはこれら1つ以上のガイドRNA（gRNA）をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と；
b）配列番号1、16、24、35、43、または50と少なくとも95％配列が一致するアミノ酸配列を含むRNA誘導型ヌクレアーゼ（RGN）ポリペプチド、またはこのRGNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；
前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記RGNポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、それぞれ、前記ヌクレオチド配列のそれぞれにとって異種のプロモータに機能可能に連結され；
前記1つ以上のガイドRNAが前記標的DNA配列にハイブリダイズし、
前記1つ以上のガイドRNAが前記RGNポリペプチドと複合体を形成し、そのことによって前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させるシステム。 - 前記標的DNA配列が真核細胞の中にある、請求項14に記載のシステム。
- 前記RGNポリペプチドがヌクレアーゼデッドであるか、ニッカーゼとして機能し、前記RGNポリペプチドが塩基編集ポリペプチドに機能可能に連結されている、請求項14または15に記載のシステム。
- 1つ以上のドナーポリヌクレオチド、またはこれら1つ以上のドナーポリヌクレオチドをコードする1つ以上のヌクレオチド配列をさらに含み、前記1つ以上のドナーポリヌクレオチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、それぞれ、前記ヌクレオチド配列のそれぞれにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている、請求項14または15に記載のシステム。
- 標的DNA配列に結合させる方法であって、請求項14～17のいずれか1項に記載のシステムを、前記標的DNA配列、またはこの標的DNA配列を含む細胞に送達することを含む方法。
- 標的DNA配列を切断および／または改変する方法であって、前記標的DNA配列を、
a）RNA誘導型ヌクレアーゼ（RGN）ポリペプチド（ただし前記RGNは、配列番号1、16、24、35、43、または50と少なくとも95％配列が一致するアミノ酸配列を含む）に接触させるとともに；
b）このRGNを前記標的DNA配列に向かわせることのできる1つ以上のガイドRNAに接触させることを含み、
前記1つ以上のガイドRNAが前記標的DNA配列にハイブリダイズし、そのことによって前記RGNポリペプチドを前記標的DNA配列に結合させ、前記標的DNA配列の切断および／または改変を起こす方法。 - 前記改変された標的DNA配列が、前記標的DNA配列からの少なくとも1個のヌクレオチドの欠失または変異を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記RGNポリペプチドがヌクレアーゼデッドであるか、ニッカーゼとして機能し、前記RGNポリペプチドが塩基編集ポリペプチドに機能可能に連結されている、請求項19または20に記載の方法。
- 前記改変された標的DNA配列が、前記標的DNA配列への異種DNAの挿入を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記標的DNA配列が細胞の中にある、請求項19～22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞を、前記RGNポリペプチドが発現して前記標的DNA配列を切断し、改変されたDNA配列を生成させる条件下で培養し；前記改変されたDNA配列を含む細胞を選択することをさらに含む、請求項23または24に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法による改変された標的DNA配列を含む細胞。
- デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号399、420、374、383、397、407、408、411、414、または416と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列を含むデアミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；
前記デアミナーゼポリペプチドが、標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のヌクレオチドを脱アミノ化し；
デアミナーゼポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている核酸分子。 - 前記デアミナーゼポリペプチドが、前記デアミナーゼポリペプチドを前記標的ポリヌクレオチドに局在させるRNA誘導型ヌクレアーゼポリペプチドに機能可能に融合されている、請求項27に記載の核酸分子。
- 前記RNA誘導型ヌクレアーゼポリペプチドがニッカーゼである、請求項28に記載の核酸分子。
- 請求項27～29のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項27～29のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項30に記載のベクターを含む細胞。
- アデノシンデアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、
a）配列番号514と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
b）配列番号572と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号572の102位に対応する位置にリシンを含み、配列番号572の104位に対応する位置にチロシンを含み、配列番号572の106位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
c）配列番号573と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
d）配列番号574と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号574の101位に対応する位置にグルタミン酸を含み、配列番号574の103位に対応する位置にセリンを含み、配列番号574の105位に対応する位置にリシンを含むアミノ酸配列；
e）配列番号575と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号575の101位に対応する位置にリシンを含み、配列番号575の103位に対応する位置にロイシンを含み、配列番号575の105位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
f）配列番号576と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号576の105位に対応する位置にアラニンを含み、配列番号576の107位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
g）配列番号577と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号577の102位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号577の104位に対応する位置にセリンを含み、配列番号577の106位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
h）配列番号578と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号578の105位に対応する位置にセリンを含み、配列番号578の107位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
i）配列番号579と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号579の102位に対応する位置にセリンを含み、配列番号579の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号579の106位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
j）配列番号580と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号580の111位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
k）配列番号581と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号581の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号581の106位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号581の108位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
l）配列番号582と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号582の102位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号582の104位に対応する位置にトリプトファンを含み、配列番号582の106位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
m）配列番号583と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号583の104位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号583の106位に対応する位置にセリンを含むアミノ酸配列；
n）配列番号584と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号584の110位に対応する位置にフェニルアラニンを含み、配列番号584の112位に対応する位置にセリンを含み、配列番号584の114位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列
からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；
前記アデノシンデアミナーゼポリペプチドが、標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のアデノシンを脱アミノ化し；
アデノシンデアミナーゼポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドにとって異種のプロモータに機能可能に連結されている核酸分子。 - 前記アデノシンデアミナーゼポリペプチドが、前記アデノシンデアミナーゼポリペプチドを前記標的ポリヌクレオチドに局在させるRNA誘導型ヌクレアーゼポリペプチドに機能可能に融合されている、請求項32に記載の核酸分子。
- 前記RNA誘導型ヌクレアーゼポリペプチドがニッカーゼである、請求項33に記載の核酸分子。
- 請求項32～34のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項31～33のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項35に記載のベクターを含む細胞。
- a）標的ポリヌクレオチドに結合するDNA結合ポリペプチドと；
b）デアミナーゼポリペプチドを含んでいて、前記デアミナーゼポリペプチドが、配列番号399、420、374、383、397、407、408、411、414、または416と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列を含み、前記デアミナーゼポリペプチドが、前記標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のヌクレオチドを脱アミノ化する融合タンパク質。 - 前記DNA結合ポリペプチドが、ニッカーゼ活性を有するRNA誘導型ヌクレアーゼである、請求項37に記載の融合タンパク質。
- a）標的ポリヌクレオチドに結合するDNA結合ポリペプチドと；
b）i）配列番号514と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
ii）配列番号572と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号572の102位に対応する位置にリシンを含み、配列番号572の104位に対応する位置にチロシンを含み、配列番号572の106位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
iii）配列番号573と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
iv）配列番号574と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号574の101位に対応する位置にグルタミン酸を含み、配列番号574の103位に対応する位置にセリンを含み、配列番号574の105位に対応する位置にリシンを含むアミノ酸配列；
v）配列番号575と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号575の101位に対応する位置にリシンを含み、配列番号575の103位に対応する位置にロイシンを含み、配列番号575の105位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
vi）配列番号576と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号576の105位に対応する位置にアラニンを含み、配列番号576の107位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
vii）配列番号577と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号577の102位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号577の104位に対応する位置にセリンを含み、配列番号577の106位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
viii）配列番号578と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号578の105位に対応する位置にセリンを含み、配列番号578の107位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
ix）配列番号579と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号579の102位に対応する位置にセリンを含み、配列番号579の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号579の106位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
x）配列番号580と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号580の111位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
xi）配列番号581と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号581の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号581の106位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号581の108位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
xii）配列番号582と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号582の102位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号582の104位に対応する位置にトリプトファンを含み、配列番号582の106位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
xiii）配列番号583と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号583の104位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号583の106位に対応する位置にセリンを含むアミノ酸配列；
xiv）配列番号584と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号584の110位に対応する位置にフェニルアラニンを含み、配列番号584の112位に対応する位置にセリンを含み、配列番号584の114位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列
からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼポリペプチドを含み；
前記アデノシンデアミナーゼポリペプチドが、標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のアデノシンを脱アミノ化する融合タンパク質。 - 前記DNA結合ポリペプチドが、ニッカーゼ活性を有するRNA誘導型ヌクレアーゼである、請求項39に記載の融合タンパク質。
- 標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのシステムであって、
a）前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることのできる1つ以上のガイドRNA、またはこれら1つ以上のガイドRNA（gRNA）をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と；
b）請求項37～40のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記1つ以上のガイドRNAをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、それぞれ、前記ヌクレオチド配列にとって異種のプロモータに機能可能に連結され；
前記1つ以上のガイドRNAが前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし；
前記1つ以上のガイドRNAが前記融合タンパク質の前記RNA誘導型DNA結合ポリペプチドと複合体を形成し、そのことによって前記融合タンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列に結合させて前記標的ポリヌクレオチド配列を改変するシステム。 - 標的ポリヌクレオチドを脱アミノ化する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを、配列番号399、420、374、383、397、407、408、411、414、または416と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに接触させることを含み、前記デアミナーゼポリペプチドが、前記標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のヌクレオチドを脱アミノ化する方法。
- 標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のアデノシンを脱アミノ化する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを、
a）配列番号514と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
b）配列番号572と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号572の102位に対応する位置にリシンを含み、配列番号572の104位に対応する位置にチロシンを含み、配列番号572の106位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
c）配列番号573と少なくとも90％配列が一致するアミノ酸配列；
d）配列番号574と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号574の101位に対応する位置にグルタミン酸を含み、配列番号574の103位に対応する位置にセリンを含み、配列番号574の105位に対応する位置にリシンを含むアミノ酸配列；
e）配列番号575と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号575の101位に対応する位置にリシンを含み、配列番号575の103位に対応する位置にロイシンを含み、配列番号575の105位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
f）配列番号576と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号576の105位に対応する位置にアラニンを含み、配列番号576の107位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
g）配列番号577と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号577の102位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号577の104位に対応する位置にセリンを含み、配列番号577の106位に対応する位置にアルギニンを含むアミノ酸配列；
h）配列番号578と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号578の105位に対応する位置にセリンを含み、配列番号578の107位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列；
i）配列番号579と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号579の102位に対応する位置にセリンを含み、配列番号579の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号579の106位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
j）配列番号580と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号580の111位に対応する位置にグリシンを含むアミノ酸配列；
k）配列番号581と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号581の104位に対応する位置にグルタミンを含み、配列番号581の106位に対応する位置にグリシンを含み、配列番号581の108位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
l）配列番号582と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号582の102位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号582の104位に対応する位置にトリプトファンを含み、配列番号582の106位に対応する位置にグルタミン酸を含むアミノ酸配列；
m）配列番号583と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号583の104位に対応する位置にアルギニンを含み、配列番号583の106位に対応する位置にセリンを含むアミノ酸配列；
n）配列番号584と少なくとも90％配列が一致していて、配列番号584の110位に対応する位置にフェニルアラニンを含み、配列番号584の112位に対応する位置にセリンを含み、配列番号584の114位に対応する位置にトレオニンを含むアミノ酸配列
からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼポリペプチドに接触させることを含み、
前記アデノシンデアミナーゼポリペプチドが、前記標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のアデノシンを脱アミノ化する方法。 - 標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを請求項37または39に記載の融合タンパク質に接触させることを含み、前記DNA結合ポリペプチドが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記デアミナーゼが前記標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1個のヌクレオチドを脱アミノ化する方法。
- 標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを請求項38または40に記載の融合タンパク質に接触させ、1つ以上のガイドRNA（gRNA）、またはこれら1つ以上のgRNAをコードする 1つ以上のヌクレオチド配列を導入することを含み；
前記1つ以上のgRNAが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして前記融合タンパク質の前記RNA誘導型DNA結合ポリペプチドと複合体を形成し、そのことによって前記融合タンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列に結合させ、前記融合タンパク質の前記デアミナーゼポリペプチドが前記標的ポリヌクレオチドの中の少なくとも1つのヌクレオチド配列を脱アミノ化し、そのことによって前記標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法。
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