JPWO2021030344A5 - - Google Patents

Claims (19)

1. ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、
   ａ）配列番号１１７、３０、７５、１、９、１６、２３、３８、４６、６１、６９、８２、８９、９５、１０３、又は１１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＲＧＮポリペプチド；
   ｂ）配列番号５４で示されるアミノ酸配列を含むＲＧＮポリペプチド
   からなる群から選択されるＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
   前記ＲＧＮポリペプチドが、前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合した場合に、ＲＮＡガイド配列特異的な様式でＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列に結合することができ、
   ＲＧＮポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに異種性のプロモーターに機能的に連結されている上記核酸分子。
2. 前記ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ不活性であるか、又はニッカーゼとして機能することができる、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに機能的に融合される、請求項１又は２に記載の核酸分子。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
5. 前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる前記ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、ガイドＲＮＡが、配列番号１１８、３１、７６、２、１０、１７、２４、３９、４７、５５、６２、７０、８３、９０、９６、１０４、又は１１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＲＩＳＰＲ反復配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを含む、請求項４に記載のベクター。
6. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１１９、３２、７７、３、１１、１８、２５、４０、４８、５６、６３、７１、８、９１、９７、１０５、又は１１２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項４～６のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
8. （Ａ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、配列番号１１８、３１、７６、２、１０、１７、２４、３９、４７、５５、６２、７０、８３、９０、９６、１０４、又は１１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズすることができるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド；または
   （Ｂ）配列番号１１９、３２、７７、３、１１、１８、２５、４０、４８、５６、６３、７１、８４、９１、９７、１０５、又は１１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド
   を含む核酸分子であって、
   ここで、
   ｉ）（Ａ）の前記ｃｒＲＮＡ；又は
   ｉｉ）（Ｂ）の前記ｔｒａｃｒＲＮＡ
   を含むガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドに結合した場合に、（Ａ）又は（Ｂ）の前記ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を介して配列特異的にＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、
   （Ａ）の前記ｃｒＲＮＡ又は（Ｂ）のｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに異種性のプロモーターに機能的に連結されている上記核酸分子。
9. 請求項８記載の核酸分子を含むベクター。
10. ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を結合するためのシステムであって、前記システムは、
    ａ）１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチド又は前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる１つ以上のガイドＲＮＡ；及び
    ｂ）ｉ）配列番号１１７、３０、７５、１、９、１６、２３、３８、４６、６１、６９、８２、８９、９５、１０３、又は１１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び
    ｉｉ）配列番号５４で示されるアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド；
    又はＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    を含み、
    １つ以上のガイドＲＮＡをコードし、ＲＮＡＧＮポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、各々、前記ヌクレオチド配列に異種性のプロモーターに機能し得るように連結され；
    １つ以上のガイドＲＮＡが、該ＲＧＮポリペプチドをＤＮＡ分子の該標的ＤＮＡ配列に結合させるために、該ＲＧＮポリペプチドと複合体を形成することができる上記システム。
11. 標的ＤＮＡ配列が細胞内にある、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ不活性であるか、又はニッカーゼとして機能し得る、請求項１０又は１１に記載のシステムであって、前記ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに機能的に連結されている、システム。
13. 前記システムが、１つ以上のドナーポリヌクレオチド、又は１つ以上のドナーポリヌクレオチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０又は１１に記載のシステム。
14. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載のシステムを、前記標的ＤＮＡ配列又は前記標的ＤＮＡ配列を含む細胞に送達することを含む、ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を結合する方法。
15. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載のシステムを、前記標的ＤＮＡ配列又は前記ＤＮＡ分子を含む細胞に送達し、前記標的ＤＮＡ配列の切断又は修飾が起こることを含む、ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を切断又は修飾する方法。
16. ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を切断及び／又は修飾するための方法であって、該ＤＮＡ分子を
    ａ）ｉ）配列番号１１７、３０、７５、１、９、１６、２３、３８、４６、６１、６９、８２、８９、９５、１０３、又は１１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び
    ｉｉ）配列番号５４で示されるアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド；
    ｂ）（ａ）のＲＧＮを標的ＤＮＡ配列に標的化することができる１つ以上のガイドＲＮＡ
    と接触させることを含み、
    １つ以上のガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、それによって、該ＲＧＮポリペプチドを該標的ＤＮＡ配列に結合させ、該標的ＤＮＡ配列の切断及び／又は修飾が起こる上記方法。
17. 前記ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ不活性であるか、又はニッカーゼとして機能し、前記ＲＧＮポリペプチドが塩基編集ポリペプチドに機能的に連結されている、請求項１６に記載の方法。
18. 標的ＤＮＡ配列が細胞内にある、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記ＲＧＮポリペプチドが発現され、前記標的ＤＮＡ配列を切断して修飾されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を生成する条件下で前記細胞を培養する工程；及び前記修飾された標的ＤＮＡ配列を含む細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。