JPWO2021076682A5

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Publication number: JPWO2021076682A5
Application number: JP2022523132A
Authority: JP
Publication date: 2023-10-17

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改変されたＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ）Ｃａｓ１２ａ（ＬｂＣａｓ１２ａ）ポリペプチドであって、
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドは、配列番号１（ＬｂＣａｓ１２ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性および配列番号１の位置ナンバリングに関して以下の位置：Ｋ１１６、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２５、およびＹ６１６の１つ以上における突然変異を有するアミノ酸配列を含み、
任意選択で、配列番号１の位置ナンバリングに関して以下の位置：Ｋ１１６、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２５、Ｔ１５２、Ｄ１５６、Ｅ１５９、Ｇ５３２、Ｄ５３５、Ｋ５３８、Ｄ５４１、および／またはＫ５９５の１つ以上における突然変異を含んでよい、
改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドが、配列番号１の位置ナンバリングに関して、Ｋ１１６Ｒ、Ｋ１１６Ｎ、Ｋ１２０Ｒ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２０Ｔ、Ｋ１２０Ｙ、Ｋ１２０Ｑ、Ｋ１２１Ｓ、Ｋ１２１Ｔ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｇ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｑ、Ｄ１２２Ｒ、Ｄ１２２Ｋ、Ｄ１２２Ｈ、Ｄ１２２Ｅ、Ｄ１２２Ｎ、Ｅ１２５Ｒ、Ｅ１２５Ｋ、Ｅ１２５Ｑ、Ｅ１２５Ｙ、Ｔ１４８Ｈ、Ｔ１４８Ｓ、Ｔ１４８Ａ、Ｔ１４８Ｃ、Ｔ１４９Ａ、Ｔ１４９Ｃ、Ｔ１４９Ｓ、Ｔ１４９Ｇ、Ｔ１４９Ｈ、Ｔ１４９Ｐ、Ｔ１４９Ｆ、Ｔ１４９Ｎ、Ｔ１４９Ｄ、Ｔ１４９Ｖ、Ｔ１５２Ｒ、Ｔ１５２Ｋ、Ｔ１５２Ｗ、Ｔ１５２Ｙ、Ｔ１５２Ｈ、Ｔ１５２Ｑ、Ｔ１５２Ｅ、Ｔ１５２Ｌ、Ｔ１５２Ｆ、Ｄ１５６Ｒ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｙ、Ｄ１５６Ｗ、Ｄ１５６Ｑ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｉ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｌ、Ｄ１５６Ｅ、Ｅ１５９Ｋ、Ｅ１５９Ｒ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｙ、Ｅ１５９Ｑ、Ｑ５２９Ｎ、Ｑ５２９Ｔ、Ｑ５２９Ｈ、Ｑ５２９Ａ、Ｑ５２９Ｆ、Ｑ５２９Ｇ、Ｑ５２９Ｇ、Ｑ５２９Ｓ、Ｑ５２９Ｐ、Ｑ５２９Ｗ、Ｑ５２９Ｄ、Ｇ５３２Ｄ、Ｇ５３２Ｎ、Ｇ５３２Ｓ、Ｇ５３２Ｈ、Ｇ５３２Ｆ、Ｇ５３２Ｋ、Ｇ５３２Ｒ、Ｇ５３２Ｑ、Ｇ５３２Ａ、Ｇ５３２Ｌ、Ｇ５３２Ｃ、Ｄ５３５Ｎ、Ｄ５３５Ｈ、Ｄ５３５Ｖ、Ｄ５３５Ｔ、Ｄ５３５Ｓ、Ｄ５３５Ａ、Ｄ５３５Ｗ、Ｄ５３５Ｋ、Ｋ５３８ＲＫ５３８Ｖ、Ｋ５３８Ｑ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｈ、Ｋ５３８Ｌ、Ｋ５３８Ｍ、Ｋ５３８Ｃ、Ｋ５３８Ｇ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５３８Ｐ、Ｄ５４１Ｎ、Ｄ５４１Ｈ、Ｄ５４１Ｒ、Ｄ５４１Ｋ、Ｄ５４１Ｙ、Ｄ５４１Ｉ、Ｄ５４１Ａ、Ｄ５４１Ｓ、Ｄ５４１Ｅ、Ｙ５４２Ｒ、Ｙ５４２Ｋ、Ｙ５４２Ｈ、Ｙ５４２Ｑ、Ｙ５４２Ｆ、Ｙ５４２Ｌ、Ｙ５４２Ｍ、Ｙ５４２Ｐ、Ｙ５４２Ｖ、Ｙ５４２Ｎ、Ｙ５４２Ｔ、Ｌ５８５Ｇ、Ｌ５８５Ｈ、Ｌ５８５Ｆ、Ｋ５９１Ｗ、Ｋ５９１Ｆ、Ｋ５９１Ｙ、Ｋ５９１Ｈ、Ｋ５９１Ｒ、Ｋ５９１Ｓ、Ｋ５９１Ａ、Ｋ５９１Ｇ、Ｋ５９１Ｐ、Ｍ５９２Ｒ、Ｍ５９２Ｋ、Ｍ５９２Ｑ、Ｍ５９２Ｅ、Ｍ５９２Ａ、Ｋ５９５Ｒ、Ｋ５９５Ｑ、Ｋ５９５Ｙ、Ｋ５９５Ｌ、Ｋ５９５Ｗ、Ｋ５９５Ｈ、Ｋ５９５Ｅ、Ｋ５９５Ｓ、Ｋ５９５Ｄ、Ｋ５９５Ｍ、Ｖ５９６Ｔ、Ｖ５９６Ｈ、Ｖ５９６Ｇ、Ｖ５９６Ａ、Ｓ５９９Ｇ、Ｓ５９９Ｈ、Ｓ５９９Ｎ、Ｓ５９９Ｄ、Ｋ６００Ｒ、Ｋ６００Ｈ、Ｋ６００Ｇ、Ｋ６０１Ｒ、Ｋ６０１Ｈ、Ｋ６０１Ｑ、Ｋ６０１Ｔ、Ｙ６１６Ｋ、Ｙ６１６Ｒ、Ｙ６１６Ｅ、Ｙ６１６Ｆ、Ｙ６１６Ｈ、Ｙ６４６Ｒ、Ｙ６４６Ｅ、Ｙ６４６Ｋ、Ｙ６４６Ｈ、Ｙ６４６Ｑ、Ｙ６４６Ｗ、Ｙ６４６Ｎ、Ｗ６４９Ｈ、Ｗ６４９Ｋ、Ｗ６４９Ｙ、Ｗ６４９Ｒ、Ｗ６４９Ｅ、Ｗ６４９Ｓ、Ｗ６４９Ｖ、および／またはＷ６４９Ｔのアミノ酸突然変異の１つ以上を含む、
請求項１に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドが、変更されたＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）特異性を有する、請求項１または２に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
ヌクレアーゼ活性部位内に突然変異をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
改変されたＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ）Ｃａｓ１２ａ（ＬｂＣａｓ１２ａ）ポリペプチドであって、
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドは、配列番号１（ＬｂＣａｓ１２ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性および配列番号１の位置ナンバリングに関してＫ５９５Ｙの突然変異を有するアミノ酸配列を含み、
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドは、野生型のＬｂＣａｓ１２ａ（配列番号１）と比較して、低下したＰＡＭストリンジェンシー、および、新たなプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の向上された認識を示す、
ＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
請求項５の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドであって、
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドは、配列番号１の位置ナンバリングに関して、Ｋ１１６、Ｋ１２０、Ｋ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２５、Ｔ１４８、Ｔ１４９、Ｔ１５２、Ｄ１５６、Ｅ１５９、Ｑ５２９、Ｄ５３５、Ｇ５３２、Ｋ５３８、Ｄ５４１、Ｙ５４２、Ｌ５８５、Ｋ５９１、Ｍ５９２、Ｋ５９５、Ｖ５９６、Ｓ５９９、Ｋ６００、Ｋ６０１、Ｙ６１６、Ｙ６４６、または、Ｗ６４９の１つ以上に位置するさらなる突然変異を含む、
ＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
請求項６の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドであって、
さらなる突然変異が、配列番号１の位置ナンバリングに関して、Ｋ１１６Ｒ、Ｋ１１６Ｎ、Ｋ１２０Ｒ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２０Ｔ、Ｋ１２０Ｙ、Ｋ１２０Ｑ、Ｋ１２１Ｓ、Ｋ１２１Ｔ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｇ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｑ、Ｄ１２２Ｒ、Ｄ１２２Ｋ、Ｄ１２２Ｈ、Ｄ１２２Ｅ、Ｄ１２２Ｎ、Ｅ１２５Ｒ、Ｅ１２５Ｋ、Ｅ１２５Ｑ、Ｅ１２５Ｙ、Ｔ１４８Ｈ、Ｔ１４８Ｓ、Ｔ１４８Ａ、Ｔ１４８Ｃ、Ｔ１４９Ａ、Ｔ１４９Ｃ、Ｔ１４９Ｓ、Ｔ１４９Ｇ、Ｔ１４９Ｈ、Ｔ１４９Ｐ、Ｔ１４９Ｆ、Ｔ１４９Ｎ、Ｔ１４９Ｄ、Ｔ１４９Ｖ、Ｅ１５９Ｋ、Ｅ１５９Ｒ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｙ、Ｅ１５９Ｑ、Ｑ５２９Ｎ、Ｑ５２９Ｔ、Ｑ５２９Ｈ、Ｑ５２９Ａ、Ｑ５２９Ｆ、Ｑ５２９Ｇ、Ｑ５２９Ｇ、Ｑ５２９Ｓ、Ｑ５２９Ｐ、Ｑ５２９Ｗ、Ｑ５２９Ｄ、Ｄ５３５Ｎ、Ｄ５３５Ｈ、Ｄ５３５Ｖ、Ｄ５３５Ｔ、Ｄ５３５Ｓ、Ｄ５３５Ａ、Ｄ５３５Ｗ、Ｄ５３５Ｋ、Ｄ５４１Ｎ、Ｄ５４１Ｈ、Ｄ５４１Ｒ、Ｄ５４１Ｋ、Ｄ５４１Ｙ、Ｄ５４１Ｉ、Ｄ５４１Ａ、Ｄ５４１Ｓ、Ｄ５４１Ｅ、Ｙ５４２Ｒ、Ｙ５４２Ｋ、Ｙ５４２Ｈ、Ｙ５４２Ｑ、Ｙ５４２Ｆ、Ｙ５４２Ｌ、Ｙ５４２Ｍ、Ｙ５４２Ｐ、Ｙ５４２Ｖ、Ｙ５４２Ｎ、Ｙ５４２Ｔ、Ｌ５８５Ｇ、Ｌ５８５Ｈ、Ｌ５８５Ｆ、Ｋ５９１Ｗ、Ｋ５９１Ｆ、Ｋ５９１Ｙ、Ｋ５９１Ｈ、Ｋ５９１Ｒ、Ｋ５９１Ｓ、Ｋ５９１Ａ、Ｋ５９１Ｇ、Ｋ５９１Ｐ、Ｍ５９２Ｒ、Ｍ５９２Ｋ、Ｍ５９２Ｑ、Ｍ５９２Ｅ、Ｍ５９２Ａ、Ｋ５９５Ｒ、Ｋ５９５Ｑ、Ｋ５９５Ｙ、Ｋ５９５Ｌ、Ｋ５９５Ｗ、Ｋ５９５Ｈ、Ｋ５９５Ｅ、Ｋ５９５Ｓ、Ｋ５９５Ｄ、Ｋ５９５Ｍ、Ｖ５９６Ｔ、Ｖ５９６Ｈ、Ｖ５９６Ｇ、Ｖ５９６Ａ、Ｓ５９９Ｇ、Ｓ５９９Ｈ、Ｓ５９９Ｎ、Ｓ５９９Ｄ、Ｋ６００Ｒ、Ｋ６００Ｈ、Ｋ６００Ｇ、Ｋ６０１Ｒ、Ｋ６０１Ｈ、Ｋ６０１Ｑ、Ｋ６０１Ｔ、Ｙ６１６Ｋ、Ｙ６１６Ｒ、Ｙ６１６Ｅ、Ｙ６１６Ｆ、Ｙ６１６Ｈ、Ｙ６４６Ｒ、Ｙ６４６Ｅ、Ｙ６４６Ｋ、Ｙ６４６Ｈ、Ｙ６４６Ｑ、Ｙ６４６Ｗ、Ｙ６４６Ｎ、Ｗ６４９Ｈ、Ｗ６４９Ｋ、Ｗ６４９Ｙ、Ｗ６４９Ｒ、Ｗ６４９Ｅ、Ｗ６４９Ｓ、Ｗ６４９Ｖ、および／またはＷ６４９Ｔの１つ以上である、
ＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド。
請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、および、ペプチドリンカーであってもよいリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に連結される、
融合タンパク質。
請求項１～８のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、および目的ポリペプチドを含む、融合タンパク質であって、
任意選択で、前記目的ポリペプチドが、前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に連結されてよい、
融合タンパク質。
請求項８または９に記載の融合タンパク質であって、
前記目的ポリペプチドが、デアミナーゼ（脱アミノ化）活性、ニッカーゼ活性、リコンビナーゼ活性、トランスポサーゼ活性、メチラーゼ活性、グリコシラーゼ（ＤＮＡグリコシラーゼ）活性、グリコシラーゼ阻害剤活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、制限エンドヌクレアーゼ活性、核酸結合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、および／またはフォトリアーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記目的ポリペプチドが、デアミナーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質ドメインを含んでよい、
融合タンパク質。
前記少なくとも１つのポリペプチドが、グリコシラーゼ阻害剤活性を有しており、前記少なくとも１つのポリペプチドは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）であってもよい、請求項８～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、または請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、プロモーターと作動可能に関連しており、前記プロモーターは、イントロンを含むプロモーター領域であってもよい、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、または請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、およびガイド核酸を含む、複合体。
請求項１４に記載の複合体をコードする、核酸構築物。
（ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、または請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および（ｂ）ガイド核酸を含む、組成物。
請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１５に記載の核酸構築物を含む、発現カセットまたはベクター。
Ｖ型ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムであって、
以下を含み：
（ａ）以下を含む融合タンパク質：（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドまたは請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉ）目的ポリペプチドまたは前記目的ポリペプチドをコードする核酸；および
（ｂ）スペーサー配列とリピート配列とを含むガイド核酸、
ここで前記ガイド核酸は、前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドまたは前記融合タンパク質と複合体を形成することが可能であり、前記スペーサー配列は、標的核酸にハイブリダイズすることが可能であり、それにより、前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドおよび前記目的ポリペプチドを前記標的核酸にガイドし、それにより、前記標的核酸が改変または調整される、
システム。
前記目的ポリペプチドが、前記改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に、ペプチドリンカーであってもよいリンカーを介して連結される、請求項１８に記載のシステム。
請求項１８または１９に記載のシステムであって、
前記目的ポリペプチドが、デアミナーゼ（脱アミノ化）活性、ニッカーゼ活性、リコンビナーゼ活性、トランスポサーゼ活性、メチラーゼ活性、グリコシラーゼ（ＤＮＡグリコシラーゼ）活性、グリコシラーゼ阻害剤活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、制限エンドヌクレアーゼ活性、核酸結合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、および／またはフォトリアーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記目的ポリペプチドが、デアミナーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質ドメインを含んでよい、
システム。
前記目的ポリペプチドが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のシステム。
標的核酸を改変する方法であって、
前記標的核酸を、
（ａ）（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、または請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および（ｉｉ）ガイド核酸；
（ｂ）請求項１４に記載の複合体およびガイド核酸；
（ｃ）（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の改変されたＬｂＣａｓ１２ａポリペプチド、または請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および（ｉｉ）ガイド核酸を含む組成物；および／または
（ｄ）請求項１８～２０のいずれか一項に記載のシステム
と接触させるステップを含み、それにより前記標的核酸を改変する、
方法。
プロトスペーサーの５’末にＰＡＭ認識部位を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件／特異性を判定するためのランダム化ＤＮＡライブラリーであって、
前記ランダム化ＤＮＡライブラリーは、２以上の二本鎖核酸分子を含み、それぞれが以下を含む：
（ａ）非標的オリゴヌクレオチド（第１）鎖および標的オリゴヌクレオチド（第２）鎖、
ここで、前記非標的オリゴヌクレオチド鎖は、５’から３’に、以下を含む：
（ｉ）約５～約１５ヌクレオチドを有する第１の配列、
（ｉｉ）少なくとも４つのランダム化ヌクレオチドを有する第２の配列、
（ｉｉｉ）約１６～約２５ヌクレオチドを含む、プロトスペーサー配列、および
（ｉｖ）約５～約２０ヌクレオチドを有する第３の配列、
ここで、（ｉ）の約５～１５ヌクレオチドを有する第１の配列は、（ｉｉ）の第２の配列の５’末にすぐ隣接しており、（ｉｉ）の第２の配列は（ｉｉｉ）のプロトスペーサー配列の５’末にすぐ隣接しており、前記プロトスペーサー配列は（ｉｖ）の第３の配列の５’末にすぐ隣接しており；前記標的オリゴヌクレオチド（第２）鎖は前記非標的オリゴヌクレオチド鎖に相補である；および
（ｂ）前記非標的オリゴヌクレオチド鎖は、前記相補の標的オリゴヌクレオチド鎖にアニーリングして、二本鎖核酸分子を産生し、ここで前記第１の配列は制限部位を（その５’末に）含み、前記第３の配列は制限部位を（その３’末に）含み、ここで、前記２以上の二本鎖核酸分子のそれぞれの前記第１の配列（ｉ）、前記プロトスペーサー配列（ｉｉｉ）および前記第３の配列（ｉｖ）は同一である、
または、
それぞれが以下を含む：
（ａ）非標的オリゴヌクレオチド（第１）鎖および標的オリゴヌクレオチド（第２）鎖、
ここで、前記非標的オリゴヌクレオチド鎖は、５’から３’に、以下を含む：
（ｉ）約５～約２０ヌクレオチドを有する第１の配列、
（ｉｉ）約１６～約２５ヌクレオチドを含む、プロトスペーサー配列、
（ｉｉｉ）少なくとも４つのランダム化ヌクレオチドを有する第２の配列、および
（ｉｖ）約５～約１５ヌクレオチドを有する第３の配列、
ここで（ｉ）の約５～２０ヌクレオチドを有する第１の配列は（ｉｉ）のプロトスペーサー配列の５’末にすぐ隣接しており、（ｉｉｉ）の第２の配列は（ｉｉｉ）のプロトスペーサー配列の３’末にすぐ隣接しており、（ｉｖ）の第３の配列は（ｉｉｉ）の第２の配列の３’末にすぐ隣接しており；前記標的オリゴヌクレオチド（第２）鎖は前記非標的オリゴヌクレオチド鎖に相補である；および
（ｂ）前記非標的オリゴヌクレオチド鎖は、前記相補の標的オリゴヌクレオチド鎖にアニーリングして、二本鎖核酸分子を産生し、ここで前記第１の配列は制限部位を（その５’末に）含み、前記第３の配列は制限部位を（その３’末に）含み、ここで、前記２以上の二本鎖核酸分子のそれぞれの前記第１の配列（ｉ）、前記プロトスペーサー配列（ｉｉ）および前記第３の配列（ｉｖ）は同一である、
ランダム化ＤＮＡライブラリー。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を判定する方法であって、
前記方法は、
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを請求項２３に記載のランダム化ＤＮＡライブラリーと接触させるステップ；および
前記ヌクレアーゼとの接触前（コントロール）および接触後に前記ランダム化ＤＮＡライブラリーの二本鎖核酸分子をシーケンシングするステップ、
を含み、
ここで、前記ヌクレアーゼとの接触前は前記ランダム化ＤＮＡライブラリー内に存在するが前記ヌクレアーゼとの接触後は前記ランダム化ＤＮＡライブラリー内に存在しない二本鎖核酸分子は、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼのＰＡＭ認識配列を特定し、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの前記ＰＡＭ特異性を判定する、
方法。
請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド、および／または、それを含む発現カセットまたはベクターを含み、
任意選択で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａガイド核酸および／またはそれを含む発現カセットまたはベクター、および／または、その使用のための説明書を含んでもよい、
キット。