JPWO2020137421A1 - 宿主細菌特異的ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の発明は以上の成果に基づく。
[1]以下のステップ(1)及び(2)を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法:
(1)ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
(2)前記組換えベクターと、欠失させたビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
[2]前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、[1]に記載の調製方法。
[3]前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニング又はギブソンアッセンブリーである、[2]に記載の調製方法。
[4]欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の調製方法。
[5]欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の調製方法。
[6]前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の調製方法。
[7]ステップ(2)が、以下のステップ(2−1)及び(2−2)からなる、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の調製方法:
(2−1)欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
(2−2)導入操作後の前記宿主細菌を培養するステップ。
[8]以下のステップ(3)を更に含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法:
(3)パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
[9]ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
[10]欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、[9]に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
[11]欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、[9]に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
[12]前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、[9]〜[11]のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
[13][9]〜[12]のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分とした抗菌剤。
[14][13]に記載の抗菌剤を含む組成物。
[15]細菌感染症に対する医薬、消毒薬、洗浄剤又は口腔用組成物である、[14]に記載の組成物。
[16]以下のステップ(1)及び(2)を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法:
(1)パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
(2)前記組換えベクターと、欠失させたパッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
[17]前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、[16]に記載の調製方法。
[18]前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニングである、[17]に記載の調製方法。
[19]前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、[16]〜[18]のいずれか一項に記載の調製方法。
[20]前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、[16]〜[19]のいずれか一項に記載の調製方法。
[21]ステップ(2)が、以下のステップ(2−1)及び(2−2)からなる、[16]〜[20]のいずれか一項に記載の方法:
(2−1)欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
(2−2)導入操作後の前記宿主細菌を培養した後、溶菌させるステップ。
[22]以下のステップ(3)を更に含む、[16]〜[21]のいずれか一項に記載の方法:
(3)パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
[23]パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
[24]前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、[23]に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
[25]前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、[23]又は[24]に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
[26][23]〜[25]のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分として含む、形質導入用組成物。
本発明の第1の局面は、ビリオン構成遺伝子の一部が欠失した組換えファージに関する。抗菌剤の有効成分として利用可能なものであることと(詳細は後述する)、ナノオーダーのサイズであることから、説明の便宜上、この局面の組換えファージのことを「本発明の抗菌性ナノ粒子」と呼称することがある。
<抗菌性ナノ粒子の調製方法>
本発明の調製方法は、以下のステップ(1)及び(2)を含む。
(1)ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ
(2)前記組換えベクターと、欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ
本発明の抗菌性ナノ粒子はその特徴的な構造により、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たないという特性を示すとともに、宿主細菌特異的な殺菌能力を発揮する。従って、安全性が高く、特異性に優れた殺菌剤の有効成分として有用である。「抗菌剤」とは、細菌の増殖を抑制(静菌)する作用・効果、又は細菌を死滅(殺菌)する作用・効果を有する剤をいう。本発明の抗菌剤はそれを含む組成物として各種用途の利用に供される。以下、代表的な用途として、本発明の組成物を用いた医薬(治療薬又は予防薬)、消毒薬、洗浄剤及び口腔組成物を説明する。
本発明の医薬は細菌感染症の治療又は予防に用いられる。本発明の医薬は細菌感染症に対して治療的効果又は予防的効果(これら二つの効果をまとめて「医薬効果」と呼ぶ)を発揮し得る。ここでの医薬効果には、(1)細菌感染の阻止、(2)細菌感染症の発症の阻止、抑制又は遅延、(3)細菌感染症に特徴的な症状又は随伴症状の緩和(軽症化)、(4)細菌感染症に特徴的な症状又は随伴症状の悪化の阻止、抑制又は遅延、等が含まれる。尚、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であることから、明確に区別して捉えることは困難な場合があり、またそうすることの実益は少ない。
本発明の消毒薬又は洗浄剤は、例えば、居室(病室を含む)、調理室、トイレ、洗面所、浴室等の消毒又は洗浄、食器、カトラリー(ナイフ、フォーク、スプーン等)、調理器具(包丁、ナイフ、鍋、ミキサー、電子レンジ、オーブン等)、医療器具・装置等の消毒又は洗浄、手、指先や口腔等の消毒又は洗浄に用いられる。本発明の消毒薬又は洗浄剤は、例えば、液状(例えばスプレー剤、ローション)、ゲル状、固形状(例えば粉末)に構成され、塗布、噴霧、散布等によって適用される。天然繊維や合成繊維等からなる担体(例えばシート状)に本発明の消毒薬又は殺菌剤を担持ないし付着させ、拭き取り用途等に使用される製品や感染予防用マスク等としてもよい。
本発明の口腔用組成物は口腔内の衛生状態の維持、口腔内環境の改善等に用いることができる。特に、歯周病又はその関連疾患の予防や治療への適用を期待できる。本発明の口腔用組成物によれば、標的細菌特異的な殺菌効果を期待できる。標的となる典型的な細菌は歯周病の原因となる細菌であり、例えば、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プレボテーラ・インテルメディア(Prevotella intermedia)、トレポネーマ・デンティコーラ(Treponema denticola)等が該当する。本発明の口腔用組成物を歯科用殺菌剤とすることも可能であり、例えば、インプラント術後の殺菌剤としての利用や、マウスウォッシャー(洗口液)や歯磨き粉に添加すること等が想定される。
本発明の第2の局面は宿主細菌への形質導入に利用可能な組換えファージに関する。説明の便宜上、この局面の組換えファージのことを「本発明の形質導入ナノ粒子」と呼称することがある。本発明の形質導入ナノ粒子では、パッケージングサイト(「PACサイト」と略称することがある)を有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドが頭部に格納されている。ファージゲノムの代わりに特定のプラスミドが頭部に格納されることにより、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たず(1度限りしか感染することができない)、標的細菌特異的な形質導入用ツールとして機能する。尚、頭部に格納されるプラスミドが保持するPACサイトは、本発明の形質導入ナノ粒子の調製過程を反映するものであり、本発明に特徴的である。以下、本発明の形質導入ナノ粒子の調製方法を説明するが、第1の局面と同様の事項についてはその説明を省略し、上記の記載を援用する。
本発明の調製方法は、以下のステップ(1)及び(2)を含む。
(1)パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ
(2)前記組換えベクターと、欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ
上記の通り、本発明の形質導入ナノ粒子では、ファージゲノムの代わりにPACサイト保持プラスミド(PACサイトを有し且つ目的遺伝子をコードする)が頭部に格納されている。この特徴により、宿主細菌に対して特異的な感染能を持つが再感染能を持たず(1度限りしか感染することができない)、標的細菌特異的な形質導入用ツールとして機能する。そこで本発明は、形質導入ナノ粒子を有効成分とした形質導入用組成物も提供する。上記の通り、種々の目的遺伝子を採用することができることから、本発明の形質導入用組成物は広範な用途(例えば、産業用酵素の生産、食品・飲料(特に発酵食品・発酵飲料)、医薬、工業製品(化学製品等)の製造、バイオエネルギー(例えばバイオエタノール)の生産、バイオレメデーション)に利用されうるものであり、その産業上の利用価値は極めて高い。また、上記の通り、抗菌ペプチドをコードする遺伝子又はバクテリオファージの標的細菌特異的な殺傷能力をもたらす遺伝子群を目的遺伝子とすれば、標的細菌特異的な抗菌剤として機能することになり、第1の局面の場合と同様に、医薬(治療薬又は予防薬)、消毒薬、洗浄剤、口腔組成物として利用可能となる。また、本発明の形質導入ナノ粒子は、研究(実験)用のツールとしても有用である。
1.ビリオン構成遺伝子欠失ファージ(抗菌性ナノ粒子)の調製と確認
1−1.デザイナーファージゲノム(改変ファージゲノム)の設計と再構成
デザイナーファージゲノムは全てPCR断片もしくは人工合成DNA断片から再構成する。その際、各断片の5’末端と3’末端には連結する断片との相同配列を20〜40 nt付加しておく。例えば、PCRによって断片を増幅する際には、図1のようにプライマーを設計する。
(断片1)
フォワードプライマーの配列:CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCC(配列番号8)
リバースプライマーの配列:ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG(配列番号9)
(断片2)
フォワードプライマーの配列:TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT(配列番号10)
リバースプライマーの配列:ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG(配列番号11)
(断片3)
フォワードプライマーの配列:ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA(配列番号12)
リバースプライマーの配列:AGGGAGAATATTTAAATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTC(配列番号13)
(断片4)
フォワードプライマーの配列:GAAAGGAGGAACTATTTAAATATTCTCCCTGTGGTGGCTCG(配列番号14)
リバースプライマーの配列:GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT(配列番号15)
(断片5)
フォワードプライマーの配列:GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT(配列番号16)
リバースプライマーの配列:CTTGTGATTTACCAATTGACCTCCTTAAAGTAAATCTAAGAGAC(配列番号17)
(断片6)
フォワードプライマーの配列:CTTTAAGGAGGTCAATTGGTAAATCACAAGGAAAGACGTGTAGTC(配列番号18)
リバースプライマーの配列:CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATAGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAACAC(配列番号19)
フォワードプライマーの配列:ATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATG(配列番号20)
リバースプライマーの配列:GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG(配列番号21)
(断片1’)
フォワードプライマーの配列:CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCC(配列番号23)
リバースプライマーの配列:ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG(配列番号24)
(断片2’)
フォワードプライマーの配列:TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT(配列番号25)
リバースプライマーの配列:ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG(配列番号26)
(断片3’)
フォワードプライマーの配列:ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA(配列番号27)
リバースプライマーの配列:GCCCCAAGGGGTTATGCTAGATTTCGAAGTCTATCAGAAGTTCGAATCGATTAC(配列番号28)
(断片4’)
フォワードプライマーの配列:CTTCTGATAGACTTCGAAATCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGG(配列番号29)
リバースプライマーの配列:GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT(配列番号30)
(断片5')
フォワードプライマーの配列:GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT(配列番号31)
リバースプライマーの配列:CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATAGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAACAC(配列番号32)
(1) 酵母をYPD培地5 mLで30℃、一晩培養する。
(2) YPD培地45 mLに酵母一晩培養液を全量加え、30℃で3時間培養する。
(3) 8000g、室温で15分間、遠心処理する。
(4) 培養上清を捨て、超純水25 mLに懸濁する。
(5) 8000g、室温で15分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、100 mM LiAc 1mLに懸濁する。
(7) 12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(8) 上清を捨て、100 mM LiAc 400 μLに懸濁する。これをコンピテントセルとする。
(1) コンピテントセル50 μLを12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(2) 上清を捨て、以下の試薬を順に加える。
PEG3350 (50% w/v) 240 μL
1M LiAc 36 μL
ssDNA(100℃に5分、氷上に3分以上置いたもの)25 μL
DNAサンプル 50 μL(デザイナーゲノムを構成するために必要な全ての断片。尾部遺伝子欠失の場合は断片1〜6とベクターDNAをまとめたもの。頭部遺伝子欠失の場合は断片1’〜5’とベクターDNAをまとめたもの)
(3) 混合液をピペッティングで穏やかに混ぜて30℃で30分静置する。
(4) 42℃で20分静置する。
(5) 12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、LB液体培地200 μLに懸濁する。
(7) 選択寒天培地に塗布する。
(8) 30℃で静置する(約3日間でコロニーが目視できる)。
使用している酵母親株は栄養要求性であり、選択培地上で生育することができない。酵母内でデザイナーゲノムが連結されベクターと繋がると、親株が必要な栄養源を供給できるようになり、選択培地上で生育が可能になる。尚、本法ではギャップリペアクローニング(Gap-repairing)を利用してデザイナーゲノムを再構成する。Gap-repairingはDNA修復機構の一部であると考えられている。Gap-repairingの機序の概要を図5に示す。
(1) 選択液体培地にファージゲノムを保持した酵母を植え、30℃で一晩培養する。
(2) 培養液2 mLを12000g、室温で2分間、遠心処理し、酵母を回収する。
(3) 培養上清を捨て、YeaStar Genomic DNA Kit(Zymo Researh)を使ってファージゲノムを抽出する。
ファージゲノム再構成時に除いたビリオン構成遺伝子(尾部遺伝子又は頭部遺伝子)をプラスミドベクターpBR322(図6)にクローニングした後、プラスミドベクターを大腸菌に導入し、プラスミド上にビリオン構成遺伝子を保持した大腸菌を調製する。尚、ビリオン構成遺伝子のすぐ上流にプロモーターがない場合は、PCRでプラスミドベクターにクローニングする際、プライマーにプロモーター配列を持たせる(図7)。以下、尾部遺伝子の場合と頭部遺伝子の場合の操作手順(例)を説明する。
(1) 1段階目のPCRで尾部遺伝子gene11、gene12、gene17をそれぞれ増幅し、2段階目のPCRによって各断片を連結するとともにプロモーター(TAATACGACTCACTATAGGG:配列番号33)を付加する。各PCRに使用するプライマーの配列を以下に示す。尚、DNA断片の末端には制限酵素サイトをもたせておく。
1段階目のPCR:尾部遺伝子の増幅
(断片1)
フォワードプライマーの配列:CCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGCGCTCATACGATATGAACG(配列番号34)
リバースプライマーの配列:CGTTAGCCATTGGTATATCTCCTTCTTTTAAATACCGGAACTTCTCCG(配列番号35)
(断片2)
フォワードプライマーの配列:CCGGTATTTAAAAGAAGGAGATATACCAATGGCTAACGTAATTAAAACCG(配列番号36)
リバースプライマーの配列:CCCGCGGATCCTTACTCGTTCTCCACCATGATTG(配列番号37)
フォワードプライマーの配列:CCCGGAATTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAG(配列番号38)
リバースプライマーの配列:CCCGCGGATCCTTACTCGTTCTCCACCATGATTG(配列番号39)
(3) 反応物と大腸菌ケミカルコンピテントセル45 μLを混ぜ、氷上で30分静置する。
(4) 42℃、1分間静置する。
(5) LB液体培地1 mLを加え、37℃で30分静置する。
(6) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドを保持する大腸菌は薬剤(耐性)マーカー(薬剤耐性遺伝子)を獲得しているため、薬剤入り寒天培地上で生育することが可能になる。
(1) 頭部遺伝子(gene10AB)をプロモーターを含む形で増幅する。PCRに使用するプライマーの配列を以下に示す。DNA断片の末端には制限酵素サイトをもたせておく。
フォワードプライマーの配列:CCCGCGGATCCTTATTGCTCAGCGGTGGCAG(配列番号40)
リバースプライマーの配列:CCCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAC(配列番号41)
(2) DNA断片(頭部遺伝子)とベクターDNAを制限酵素処理し、ライゲーションする(計5 μL)。
(3) 反応物と大腸菌ケミカルコンピテントセル45 μLを混ぜ、氷上で30分静置する。
(4) 42℃、1分間静置する。
(5) LB液体培地1 mLを加え、37℃で30分静置する。
(6) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドを保持する大腸菌は薬剤(耐性)マーカー(薬剤耐性遺伝子)を獲得しているため、薬剤入り寒天培地上で生育することが可能になる。
(1) ビリオン構成遺伝子(尾部遺伝子又は頭部遺伝子)を持つ細菌を薬剤入りLB液体培地に植え、37℃で一晩培養する。
(2) 薬剤入りSOB液体培地20 mLに対して1/100倍量になるように培養液を加え、OD600 = 0.4になるまで37℃で培養する。
(3) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(4) 培養上清を捨て、冷10%グリセロール10 mLに懸濁する。
(5) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、冷10%グリセロール10 mLに懸濁する。
(7) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(8) 上清を捨て、冷10%グリセロール約70 μLに懸濁する。これをエレクトロポレーション用コンピテントセルとする。
(1) 抽出したビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム(尾部遺伝子欠失ファージゲノム又は頭部遺伝子欠失ファージゲノム)2 μLとエレクトロポレーション用コンピテントセル 20 μLを混ぜ、キュベットに入れる。
(2) エレクトロポレーション(2.5 kV、10 μF、600 Ω)。
(3) LB液体培地 500 μLをキュベットに加え、回収する。
(4) 混合液を軟寒天培地と混ぜ、LB寒天培地上に重層する。
(5) 37℃でプラーク(溶菌斑)ができるまで静置する。
(1) プラークを爪楊枝もしくはチップでつついて、phage buffer 100 μLに懸濁する。
(2) ビリオン構成遺伝子(尾部遺伝子又は頭部遺伝子)を発現する細菌もしくは発現しない細菌を軟寒天培地と混ぜLB寒天培地上に重層する。そこへプラークを懸濁したphage buffer 2.5 μLを滴下して乾燥させる。
(3) 37℃でプラークができるまで静置する。
ビリオン構成遺伝子(尾部遺伝子又は頭部遺伝子)を発現する細菌ではプラークを形成し、発現しない細菌ではプラークを形成しないことを確認する。
(1) 薬剤入りLB液体培地にビリオン構成遺伝子(尾部遺伝子又は頭部遺伝子)を発現する細菌を植え、37℃で一晩培養する。
(2) 薬剤入りLB液体培地 50 mLに対して1/100量の細菌培養液を添加する。
(3) 37℃でOD600 = 0.4になるまで培養する。
(4) ファージを懸濁したphage bufferを添加し、溶菌しきるまで培養する。
(5) クロロホルム1 mLを加える(残っている細菌を完全に殺す)。
(6) 12000g、4℃で5分間、遠心処理する。これにより、溶菌液とクロロホルムの層ができる。
(7) 溶菌液を0.22 μmフィルターでろ過滅菌し、ファージ液とする。
(1) LB液体培地に細菌を植え、37℃で一晩培養する。
(2) LB液体培地に細菌培養液を1×106 cfu/mlになるように加えたものを5本用意し、そこにLB液体培地もしくはMOI = 1、MOI = 10、MOI = 100、MOI = 1000になるようにファージ液を加える。
(3) 37℃で培養し、2時間毎に1 mLサンプリングする。
(4) サンプルを5000g、4℃で5分間、遠心処理する。
(5) 培養上清を捨て、PBS 1 mLに懸濁する。
(6) 5000 g、4℃で5分間、遠心処理する。
(7) 上清を捨て、PBS 1 mLに懸濁する。これを原液とする。
(8) PBSで原液を10-1から10-7まで10倍段階希釈し、LB寒天培地上に2.5 μLずつ添加し、乾燥させる。
(9) 37℃で一晩静置する。
(10) 生菌数(コロニー数)を数える。
デザイナーファージゲノムの設計と再構成、酵母コンピテントセルの作製、酵母の形質転換、酵母からのファージゲノム抽出については、ビリオン遺伝子欠失ファージの場合と同様である。ファージDNAにはパッケージング(以下、PAC)サイトと呼ばれるファージの頭部に詰め込まれるために必要な配列が存在している。その配列を除くようにプライマーを設計し、PCRで増幅する一方、ベクターpTOW40836(図3)を増幅する。本検討ではPACサイトを除いたファージゲノムを4つに分け、4断片(5'末端側から3'末端側に向かって順に断片I、断片II、断片III、断片IVと呼ぶ)をPCRで増幅させた。各断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
(断片I)
フォワードプライマーの配列:CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCGTCCATCCTAAAGCCAACACCTAAAGCC(配列番号42)
リバースプライマーの配列:ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG(配列番号43)
(断片II)
フォワードプライマーの配列:TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT(配列番号44)
リバースプライマーの配列:ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG(配列番号45)
(断片III)
フォワードプライマーの配列:ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA(配列番号46)
リバースプライマーの配列:GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT(配列番号47)
(断片IV)
フォワードプライマーの配列:GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT(配列番号48)
リバースプライマーの配列:CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATTGCATAAATCACCACTCAATGAAAGACG(配列番号49)
フォワードプライマーの配列:ATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATG(配列番号20)
リバースプライマーの配列:GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG(配列番号21)
(1) 抽出したPACサイト欠失ファージゲノム2 μLとエレクトロポレーション用コンピテントセル 20 μLを混ぜ、キュベットに入れる。
(2) エレクトロポレーション(2.5 kV、10 μF、600 Ω)。
(3) エレクトロポレーション後、PACサイト欠失ファージゲノムとコンピテントセルを入れたキュベットにLB液体培地 1mLを加え、37℃で2時間静置する。
(4) 混合液にクロロホルム 100 μLを加え、タッピングで混ぜる。
(5) 12000g、4℃で5分間、遠心処理する。これにより、混合液とクロロホルムの層ができる。
(6) 混合液を0.22 μmフィルターでろ過滅菌する。
(7) 回収した溶液を形質導入ナノ粒子液とする。
(8) 形質導入ナノ粒子液と細菌培養液を混ぜ、37℃で30分静置する。
(9) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドは薬剤マーカーを持つため、形質導入ナノ粒子が感染した細菌はプラスミドが注入されて、薬剤耐性を獲得する。プラスミドが注入された細菌(=形質導入ナノ粒子が機能したもの)は薬剤入り寒天培地上で生育することができる。
1.方法
ファージは、ゲノムを格納している頭部と、細菌への接着に必要な尾部から成る(図9)。尾部先端の足(尾繊維)を介して細菌表面に接着する。ファージゲノムの尾部遺伝子以外の領域及びファージゲノムの両端に対して相同配列を持ったベクターをPCRで増幅し、それらの断片を酵母内で連結し、人工ファージゲノム(配列番号7)を構築した(図10)。尚、この実験ではギャップリペアクローニングを利用して人工ファージゲノムを構築したが、ギブソンアッセンブリーによっても人工ファージゲノムの構築に成功している。
大腸菌を1 mLあたり1×106になるように調製し、大腸菌数に対して1、10、100、1000倍(MOI = 1、10、100、1000)の数の尾部遺伝子欠失ファージを加えて、経時的に大腸菌の生菌数を測定した(Killing assay)。大腸菌と同程度の尾部遺伝子欠失ファージを加えること(MOI = 1)で生育の阻害が見られ、MOI = 10、100、1000では大腸菌の生菌数が顕著に減少した(図11)。また、各サンプルをそのまま培養し続け、そこから新たなファージが産生されるかどうかを確認した(プラーク形成アッセイ)。大腸菌とファージを軟寒天と混合して寒天培地に重層し、培養を続けると図12の「WT」のように、溶菌斑(プラーク)と呼ばれる透明な斑点が形成される。これは、ファージが細菌に感染して溶菌させることで生じる。各培養液を大腸菌と混ぜても溶菌斑はみられなかった。これは、少なくとも本実験系において再感染できるファージが産生されていない可能性を強く示唆するものである。尚、頭部遺伝子欠失ファージも作製し(作製方法については上記参照)、同様の実験結果が得られた。
1.方法
ファージゲノムが頭部に格納されることをパッケージングという。ファージゲノム上にはパッケージング(PAC)サイトと呼ばれる配列があり、これが認識されることでファージゲノムは頭部に格納される。ファージゲノム上のPACサイトを欠失し、プラスミド上にPACサイトを持たせることで、ファージゲノムの代わりに任意のプラスミドをパッケージングできる形質導入ナノ粒子を開発した。上述の尾部遺伝子欠失ファージの開発方法同様、PACサイト以外の領域及びベクターをPCRで増幅し、酵母内で連結することでPACサイトが欠失したファージゲノム(配列番号50)を構築した。次に、酵母からPACサイトが欠失したファージゲノムを抽出し、PACサイトを持つプラスミドを保持した大腸菌にこれを導入した。ファージ形成時、ファージゲノムにはPACサイトが存在しないためファージゲノムはパッケージングされず、代わりにPACサイトを持つプラスミドがパッケージングされる(図13)。このナノ粒子が細菌に感染しても、プラスミドを導入するだけで殺菌効果はない。また、ファージゲノムを持っていないので子孫ファージも形成されない。
PACサイト保持プラスミドに抗生物質耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を挿入し、形質導入ナノ粒子にパッケージングさせた。β-ガラクトシダーゼはβ-ガラクトシドを加水分解し、ガラクトースを産生する酵素である。この酵素を持つ細菌をX-galと呼ばれる試薬を含む培地上で生育させるとコロニーが青くなる。lacZ遺伝子を持たない大腸菌と形質導入ナノ粒子10 μLを混合し、抗生物質及びX-galを含む寒天培地上に塗布した結果(図14)、形質導入ナノ粒子を感染させた大腸菌を塗布したプレート(右上のプレート)からは青いコロニーが観察された。大腸菌のみ(左下のプレート)、もしくは形質導入ナノ粒子100 μLのみ(右下のプレート)を寒天培地上に塗布してもコロニーは形成されなかったことから、形質導入ナノ粒子を感染させた大腸菌を塗布したプレートに見られた青色大腸菌は、形質導入ナノ粒子によって抗生物質遺伝子とlacZ遺伝子を獲得したと考えられる。また野生型のファージが含まれている可能性を考え、プラーク形成アッセイを行ったが、プラークは形成されなかった(左上のプレート)。コロニー数から計算すると、形質導入効率は約4.2×105/Lであった。
二種類の「宿主細菌特異的ナノ粒子」を開発した。一つは殺菌能力を持つナノ粒子、もう一つは形質導入能力を持つナノ粒子として機能する。本手法は原理的にはあらゆるファージに応用できるはずである。ファージセラピーや細菌叢編集への利用、遺伝学的手法が確立していない細菌に対するツールとしての利用などが想定される。また、一回限りの感染であり、実験室レベルでは100%の生物学的封じ込めに成功している。
ビリオン構成遺伝子欠失ファージ(頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージ)の生物学的封じ込めについて検証した。
大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液(頭部遺伝子欠失ファージ(図15Aの上段)又は尾部遺伝子欠失ファージ(図15Aの下段)を含有する)を添加し、培養した。コントロールには野生型ファージのファージ溶液を使用した。野生型のファージの場合(図15Bの左側(BW25113)のT7の列)と対照的に頭部遺伝子欠失ファージ(図15Bの左側(BW25113)のT7Δ10の列)と尾部遺伝子欠失ファージ(図15Bの左側(BW25113)のT7Δtailの列)ではプラークの形成が認められず、封じ込めに成功している。同じ大腸菌株に頭部遺伝子を発現させた場合(図15Bの右側(BW25113/pBR-T7-g10)のT7Δ10の列)又は尾部遺伝子を発現させた場合(図15Bの右側(BW25113/pBR-T7-g11-12-17)のT7Δtailの列)には、封じ込めファージ(頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージ)でも子孫ファージを作ることができ、プラークを形成する。
lysis from withoutは大過剰量のファージを感染させたときに子孫ファージ産生の有無に関わらず宿主細菌が死滅する現象であり、個々のプラークが観察されないのが特徴である。大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液(頭部遺伝子欠失ファージ)を添加し、培養した。コントロールには野生型ファージのファージ溶液を使用した。頭部遺伝子欠失ファージでは封じ込めによって子孫ファージを作ることができず、プラークを形成できない(図16左のプレートのBSPの列)。頭部遺伝子を発現させた場合、頭部遺伝子欠失ファージでも子孫ファージを作ることができ、プラークを形成する(図16右のプレートのBSPの列)。
大腸菌BW25113の溶液に頭部遺伝子欠失ファージ又は尾部遺伝子欠失ファージを添加した後、6時間培養し、殺菌作用を評価した。殺菌作用のある野生型ファージ(T7)(図17の(2))と同様に、頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージは殺菌作用を示した(図17の(3)、(4))。
大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液(頭部遺伝子欠失ファージ)を各濃度で添加した。24時間培養を継続した後、プラークの形成の有無を観察した。MOI=100(大過剰量のファージを添加)でもプラークは観察されなかった(図18)。即ち、封じ込め策を施したファージ(頭部遺伝子欠失ファージ)は増殖性を獲得しておらず、一度限りの感染で終わっている(即ち、生物学的封じ込めに成功している)。
マウスBJ6にサルモネラLT2を0.8〜1.4×105cfuで接種後、SP6又は頭部遺伝子欠失ファージを2.5〜5.0×107pfuで投与し、生存率を比較・評価した。SP6と頭部遺伝子欠失ファージのいずれも投与しないものをコントロール(非治療群)とした。非治療群に比べ、頭部遺伝子欠失ファージ投与群(BSP)の生存率は有意に高く、SP6投与群(SP6)の生存率を凌駕した(図19)。一方、頭部遺伝子欠失ファージ投与群のマウスの血液と脾臓にはファージが検出されず、100%の生物学的封じ込めに成功していた。
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配列番号22:人工配列の説明:頭部遺伝子欠失ファージゲノム
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Claims (26)
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法:
(1)ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
(2)前記組換えベクターと、欠失させたビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。 - 前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、請求項1に記載の調製方法。
- 前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニング又はギブソンアッセンブリーである、請求項2に記載の調製方法。
- 欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製方法。
- 欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製方法。
- 前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の調製方法。
- ステップ(2)が、以下のステップ(2−1)及び(2−2)からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の調製方法:
(2−1)欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
(2−2)導入操作後の前記宿主細菌を培養するステップ。 - 以下のステップ(3)を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法:
(3)パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。 - ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、請求項9に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、請求項9に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分とした抗菌剤。
- 請求項13に記載の抗菌剤を含む組成物。
- 細菌感染症に対する医薬、消毒薬、洗浄剤又は口腔用組成物である、請求項14に記載の組成物。
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法:
(1)パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
(2)前記組換えベクターと、欠失させたパッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。 - 前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、請求項16に記載の調製方法。
- 前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニングである、請求項17に記載の調製方法。
- 前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項16〜18のいずれか一項に記載の調製方法。
- 前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、請求項16〜19のいずれか一項に記載の調製方法。
- ステップ(2)が、以下のステップ(2−1)及び(2−2)からなる、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法:
(2−1)欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
(2−2)導入操作後の前記宿主細菌を培養した後、溶菌させるステップ。 - 以下のステップ(3)を更に含む、請求項16〜21のいずれか一項に記載の方法:
(3)パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。 - パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項23に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、請求項23又は24に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
- 請求項23〜25のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分として含む、形質導入用組成物。
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