JP2022505421A - 肺疾病を処置および予防するための生きた生物学的製剤 - Google Patents

Abstract

方法および組成物は、生きた生物学的製剤、とりわけ環境選択圧によって産生され、および肺疾病の処置または予防について治療的に有益である特徴についてスクリーニングされた、キメラ微生物のハイブリッドまたは微生物の突然変異体などの改変された微生物を使用する肺疾病の処置について記載される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願された米国仮出願第６２／７４６，７４２の利益を主張し、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれている。

本発明の分野
本発明は、嚢胞性線維症の患者における慢性感染症などの肺疾病を処置および／または予防するよう設計された生きた生物学的製剤の株に関する。とりわけ、生きた生物学的製剤は、環境ストレッサー（単数または複数）からの選択圧を使用して産生される、キメラ微生物のハイブリッドまたは微生物の突然変異体などの１以上の改変された微生物（単数または複数）を包含する。

背景
肺の健康状態および疾患は、肺の微生物叢によって影響を受ける。肺疾病の多様性は、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性疾患から、感染性疾患（肺炎など）まで、肺がんまでに及び－これらの疾患の多くが生命を脅かす帰結を有する。これらの疾患のいくつかについては、細菌性の病因と病状との間の直接的なつながりが既に知られている。他のものについて、細菌性の要因が疑われているが、原因としていまだ証明されていない。近年まで、細菌により誘起される疾患を処置する唯一の方法は、抗生物質を用いることであった。抗生物質が、多くの生命を救い、いまだに有用である一方で、それらの作用の無差別な様式は、有害な株のほかに有益である共生細菌をも除去する傾向がある。嚢胞性線維症（ＣＦ）などの疾患が慢性感染を示し、抗生物質の使用が、低減した肺の微生物叢の多様性および乏しい臨床成果につながるために、肺の微生物叢の多様性へのこの意図しない、付随的な損傷の帰結は、現在より理解されている。

嚢胞性線維症は、２０００人の白色人種の出生のうち１人に存在する劣性の、遺伝性の遺伝的疾患である。嚢胞性線維症の患者は、第７染色体上に位置付けられるＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子中の１以上の遺伝子突然変異（単数または複数）によって肺環境が変化している。ＣＦＴＲ突然変異は、影響を受けた人の細胞膜において塩化物チャネルの機能不全を引き起こす。正常な遺伝子型の肺と比較した、上皮表面上の塩化物イオンの減少は、浸透による上皮の水の吸収に起因して、より厚い粘液および非効率性をもたらす（Clunes, M., et al (2007) Drug Discov Today Dis Mech 4(2):63-72）。このより厚い粘液は、Pseudomonas aeruginosaなどの生物がＣＦ肺においてバイオフィルムを形成することを可能にする。加えて、ＣＦ患者の自然免疫系は、変化した環境に起因して、微生物を一掃するのに有効に働かない。これは、ＣＦ肺におけるより高いＤＮＡの含量につながり、このこともまたより厚い粘液に寄与する（Wang, Y., et al (2014) Int J Biochem Cell Biol 52:47-57）。病原体がＣＦ患者のより厚い粘液または唾液中に隠れることができるために、それらは抗生物質および免疫応答の両方を避けることができる。Staphylococcus aureusの最も高い有病率は、６～１０歳のＣＦを有する子どもたちにおいて見出された（LiPuma, J. (Apr. 2010) Clinical Microbiology Reviews 23(2):299-323）。患者が加齢するにつれて、P. aeruginosaの発生率は、１０歳のＣＦ患者の３０％から、１８歳までには８０％の患者が慢性P. aeruginosa感染症を有するまでに増大する。標準的な抗生物質処置は、積極的な発生を制御するのに役立つが、感染を完全に取り除くための処置はない。ＣＦ患者の９０％が、肺疾患、主に慢性Pseudomonas感染症のせいで死亡する（Gaspar, M.C., et al (2013) Eur J Clin Microbiol Infect Dis DOI 10.1007/s10096-103-1876-y）。

慢性肺感染症、とくにＣＦ患者の肺に現れるそれらを一掃する代替の治療法が必要とされている。さらに、無差別な抗生物質の使用の寄与は、遠くにまで及ぶ帰結を有し、世界規模で抗生物質耐性の広がりを増大させている。抗生物質の安全かつ有効な代替手段が切実に必要とされている。

本発明の簡潔な概要
方法、組成物、およびキットは、肺(例として、肺および/または呼吸器の)疾病の処置または予防のために提供される。

一側面において、方法は、肺疾病の処置または予防のために提供される。方法は、治療的または予防的有効量の改変された微生物（生きた生物学的製剤）、例として、選択圧によって産生されたキメラ微生物のハイブリッドまたは微生物の突然変異体を、それを必要とする個体へ投与することを包含し、ここで投与は、個体における肺疾病の少なくとも１つの症状の予防、寛解または除去をもたらす。例えば、改変された微生物は、これらに限定されないが、以下の能力などの特徴を有していてもよい：Pseudomonasバイオフィルムなどのバイオフィルムを分解する；ムチンを分解する；Staphylococcus aureusを競合的に阻害する；および／またはPseudomonas aeruginosaに対して向けられたバクテリオシンを分泌する。

一態様において、肺疾病は、微生物の感染症を包含する。例えば、微生物の感染症は、Pseudomonas、Staphylococcus、Burkholderia、Mycobacterium、Stenotrophomonas、Achromobacter、Ralstonia、Pandoraea、Escherichia、Mycobacterium、Moraxell、Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus、Veillonella、Prevotella、Propionibacterium、Haemophilus、および／またはListeria属からの１以上の細菌種を包含する感染症などの、細菌感染症を包含してもよい。

一態様において、微生物の感染症は、Pseudomonas aeruginosa感染症である。一態様において、P. aeruginosa感染症は、慢性P. aeruginosa感染症である。

一態様において、微生物の感染症は、Staphylococcus aureus感染症である。一態様において、S. aureus感染症は、慢性S. aureus感染症である。

一態様において、肺疾病は、Candida、Malassezia、Neosartorya、Saccharomyces、および／またはAspergillus属からの１以上の真菌種を包含する感染症などの真菌感染症を包含する。

一態様において、肺疾病は、Ascaris、Schistosoma、Toxoplasma、Cryptosporidium、Cyclospora、および／またはParagonimus属からの１以上の真核生物の種などの真核生物の感染症を包含する。

一態様において、肺疾病は、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コロナウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、カリシウイルス、および／またはパルボウイルスから選択される１以上のウイルスなどのウイルス感染症を包含する。

一態様において、肺疾病は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、または間質性肺炎などの線維症（ＦＤ）を包含する。

一態様において、肺疾病は、喘息、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、または肺炎などの炎症性疾患を包含する。

一態様において、肺疾病は、リウマチ性関節炎、ループス、サルコイドーシス、強皮症またはシェーグレン症候群（肺線維症（ＰＦ）についてのリスク因子）などの自己免疫疾患を包含する。

一態様において、肺疾病は、がん、例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌、または大細胞癌を包含する。

いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物は、肺疾病の少なくとも１つの症状を処置、予防、または寛解するための１以上の追加の処置と組み合わせて投与される。例えば、追加の処置は、抗生物質、バクテリオファージ、抗体、ペプチド、酵素、糖、糖重合体、バクテリオシン、および／または芽胞を包含してもよい。

いくつかの態様において、治療的または予防的有効量の本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、乾燥粉末などの固体剤形、溶液などの液体剤形、または半固体の剤形で処方される。一態様において、固体または液体剤形は、吸入によって投与される。例えば、固体剤形は、肺における噴霧、例として、中枢気道（large airway）、末梢気道、および／または呼吸器の細気管支における吸入および放出のために処方されてもよい。別の態様において、改変された微生物は、鼻腔内に、例えば、鼻腔用スプレーまたは肺／経鼻の洗浄液として投与される。

別の側面において、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、治療的または予防的有効量の本明細書に記載のとおりの改変された微生物、および薬学的に許容し得る担体を包含し、肺疾病の処置または予防のために処方される。

別の側面において、本明細書に記載のとおりの医薬組成物を包含する剤形が提供される。例えば、剤形は、治療的または予防的に有効な用量または治療的または予防的に有効な用量のパーセンテージの本明細書に記載のとおりの医薬組成物を包含してもよい。剤形は、固体、液体、または半固体であってもよく、例えば、吸入溶液または乾燥粉末、鼻腔用スプレー、または肺／経鼻の洗浄液として処方されてもよい。

別の側面において、医薬組成物、例として、単位用量、および任意に、本明細書に記載のとおりの肺疾病の処置または予防のための方法に関する使用のための指示または患者指示を包含するキットが提供される。

図面の簡単な説明
図１は、プレート上に広げられたPsuedomonas aeruginosa（Ｘｅｎ－５）のルシフェラーゼ産生株に対する４８時間での嫌気性バクテリオシン活性からのクリアランスを有する白色のパッチとしてＦ２ＢＨ２（上方の２つのパッチ）およびＦ２ＢＨ３（下方の２つのパッチ）；ＩＶＩＳ機械装置における生物発光からの写真を示す。

図２は、アルギン酸寒天プレート上の目に見える区域の一掃によって描かれる、親および改変された株のアルギン酸リアーゼ活性を示す。

図３は、ムチン寒天プレート上の目に見える区域の一掃によって描かれる、親および改変された株のムチナーゼ活性を示す。

図４Ａ～４Ｂは、API 50 CH炭水化物発酵ストリップ（bioMerieux, Inc.、Marcy l'Etoile、France）によって特徴付けられる親および改変された株の炭水化物代謝プロファイルを示す。図４Ａは、定量的クロスストリークアッセイを用いて実証された、生きた生物学的製剤であるＬＨ１バクテリオシンに対する感受性を有する例示の細菌を示す。図４Ｂは、定量的クロスストリークアッセイを用いて実証された、生きた生物学的製剤であるＬＨ１親株バクテリオシンに対して感受性のある例示の細菌を示す。

図５は、改変されたクロスストリークアッセイを示す。嫌気性増殖の４８時間後に、７つの多剤耐性S. aureus株をＬＨ１を越えて画線し、および阻害された増殖の測定を表Ｉにおいて試験された他のものの中で記録した。

図６は、２４時間の嫌気性インキュベーション後の、嚢胞性線維症関連抗生物質であるトブラマイシン（ＴＢ）およびアズトレオナム（ＡＺ）に対するＬＨ１の抗生物質感受性のレベルを指し示すETEST（登録商標）の２つの例を示す。

図７は、寒天プレート上の目に見える区域の阻害を示す、定性的な滴下試験における改変された株ＬＨ１およびLactobacillus親株によるS. aureusのＣＦ臨床分離株に対する定性的な抗細菌活性を示す。

図８は、ＷＴ、ＬＨ１、およびビヒクル対照の酢酸エチル全細胞抽出物を用いたP. aeruginosaのＣＦ臨床分離株に対する滴下試験を示す。

図９は、ＷＴ株Ａ、ＷＴ株Ｂ、ＬＨ１、ビヒクル対照の酢酸エチル全細胞抽出物を用いたS. aureusのＣＦ臨床分離株に対する滴下試験を示す。

図１０は、酢酸エチル粗抽出物（上清、ペレット、および３ｋＤのろ過上清）を用いたS. aureusのＣＦ臨床分離株に対する滴下試験を示す。

図１１は、ＷＴ親株でのＬＨ１が、２：１の比率で混ぜ合わせたときに、浮遊性P. aeruginosa株ＰＡ０１を殺傷し、最大で８時間増殖を阻害し続けることを示す。

図１２は、カルバペネム耐性P. aeruginosa（ＡＲ０２４３、CDC AR Bank）の３日の嫌気性バイオフィルムを取り除くＬＨ１の能力を示す。P. aeruginosaのバイオフィルムは、１０^５～１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＬＨ１で処置した後に、すすがれ、クリスタルバイオレットを用いて染色された（strained）。残余バイオフィルムを、光学密度またはエタノール中に可溶化したクリスタルバイオレット染色を介して定量化した（ＯＤ５９５）。

図１３は、ＷＴ親と比較してのＬＨ１のカルバペネム耐性P. aeruginosa（ＡＲ０２４３、CDC AR Bank）の３日の嫌気性バイオフィルムを取り除く能力を示す。P. aeruginosaのバイオフィルムは、１０^５～１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＬＨ１で処置した後に、すすがれ、クリスタルバイオレットを用いて染色された（strained）。残余バイオフィルムを、光学密度またはエタノール中に可溶化したクリスタルバイオレット染色を介して定量化した（ＯＤ５９５）。

図１４は、ＣＦムチン培地中で最大４時間増殖するＬＨ１の能力を示す。ＬＨ１を、ＣＦムチン培地内に播種し、３７℃で４時間嫌気的に増殖させた。ＬＨ１を、生菌数について嫌気的にプレーティングすることによって定量化した。

図１５は、ＣＦの唾液中で最大４時間増殖するＬＨ１の能力を示す。ＬＨ１を、ＣＦの唾液内に播種し、３７℃で４時間嫌気的に増殖させた。ＬＨ１を、生菌数について嫌気的にプレーティングすることによって定量化した。

図１６は、time-killアッセイにおいて、プールされたＣＦの唾液中の内在性S. aureusを低減させるＬＨ１の能力を示す。プールされたＣＦの唾液を、１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｍＬのＬＨ１で処置して、２４時間嫌気的にインキュベートし、次いでS. aureus選択培地（フォーゲル－ジョンソン寒天）上で生菌数についてプレーティングして、内在性S. aureusの用量および時間依存的な低減を示した。

図１７は、プールされたＣＦの唾液中の内在性S. aureusを低減させるＬＨ１の粗抽出物の能力を示す。プールされたＣＦの唾液を、１：１ＬＨ１で処置し、２４時間嫌気的にインキュベートして、次いでS. aureus選択培地（フォーゲル－ジョンソン寒天）上に生菌数についてプレーティングし、１時間の処置後に内在性S. aureusの根絶を示した。

図１８は、増殖阻害アッセイにおいてカルバペネム耐性P. aeruginosaを低減させるＬＨ１の粗抽出物の能力を示す。無希釈、１：２および１：１００希釈のＬＨ１の粗抽出物で処置し、２４時間好気的にインキュベートしたP. aeruginosaの菌叢は、ビヒクル対象と比較して、用量依存的なやり方で増殖の阻害を示した。

図１９は、パーミアーゼ遺伝子におけるフレームシフト突然変異に起因する予測されるタンパク質の生理化学的特性を示す。分析される特性は、予測されるタンパク質のアミノ酸配列に沿った分子量、減衰係数、等電点、生理学的ｐＨでの正味荷電、推定される可溶性およびハイドロパシー（Hopp-Woodsのスケール）を包含する。

図２０は、Kyte-Doolittleのスケールを使用してそのアミノ酸配列に沿った予測される新しいたんぱく質の疎水性を示す。疎水性および親水性の交互の領域が見られ得る。

図２１は、フレームシフト突然変異をコードするパーミアーゼ遺伝子中の領域を配列決定するために使用される増幅されたＰＣＲ産物を示す。Hot Start Taq DNAポリメラーゼ（NEBiolabs）とともにプライマーPerm03-F（5’-GCCGCCATAAAGCAAATGATCA-3’）（配列番号１）およびPerm01-R（5’-AGCCATCATGAACCGTCTCTTC-3’）（配列番号２）が、ＰＣＲ産物を増幅するために使用された。ＰＣＲ産物の可視化は、SYBR Safe DNA gel stain（Invitrogen）を用いてＰＣＲ反応物のアガロースゲル電気泳動を染色することによって達成された。１０コロニーからのＰＣＲ産物は、精製され、Sanger配列決定法に送られた。

図２２は、ビヒクル対照と比較しての、１：１０希釈の１００ＸＬＨ１の粗抽出物での４時間の処置の後の嚢胞性線維症患者の唾液試料の注入可能性（pourability）を示す。

図２３は、健常のＢＡＬＢ／ｃマウスへ鼻腔内に送達される１０^７ＣＦＵのＬＨ１の安全性研究が５日後に１００％の生存をもたらしたことを示す。

詳細な説明
本発明は、生きた生物学的製剤として、選択圧を使用して産生されるキメラ微生物のハイブリッドおよび／または微生物の突然変異体などの改変された微生物の株を使用する肺疾病の処置のための方法および組成物を提供する。例えば、改変された微生物は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれている米国特許第９，７６５，３５８号に記載されるように産生されてもよい。例えば、Bacillus subtilisおよびLactobacillus delbrueckii sspdelbruickiiなどのＧＲＡＳ（一般に安全であると認識される）種の改変された微生物、例として、これら２種のキメラ微生物のハイブリッドまたはこれらの種の片方または両方の微生物の突然変異体（単数または複数）が、本明細書に記載の方法に使用されてもよい。改変された微生物は、：Pseudomonasのバイオフィルムなどのバイオフィルムを分解する；ムチンを分解する；Staphylococcus aureusを競合的に阻害する；および／またはPseudomonas aeruginosaに対して向けられたバクテリオシンを分泌する、能力などの特徴を所有していてもよい。いくつかの態様において、生きた生物学的製剤は、経鼻のおよび／または吸入ルートのいずれかによって送達されてもよい。

生きた生物学的製剤は、肺および／または鼻洞の感染性疾患および炎症性疾患を処置するために合理的に設計される。

安全なプロバイオティック微生物は、微生物の感染症などの疾患の症状および／または根本的原因を予防するための特定の欠かせない特徴についてスクリーニングされ、および次いで生存性が改変された微生物の株の産生によって改善される。その結果得られる株は、抗細菌性の特徴などの症状および／または根本的原因を予防および／または処置するための欠かせない特徴のすべてを保持すると同時に、肺環境でよりよく生き残ることができる。本明細書に記載の改変された微生物を産生するために使用される選択圧は、抗真菌物質、有機化合物、溶媒、高温、低温、紫外線光、浸透性のストレッサー、無機化学物質、電離放射線、大気気体の組成、ビタミンまたは補因子、ビタミンまたは補因子の不在、酸、塩基、炭水化物供給源、窒素供給源、生物学的毒素、ペプチド、保存物質、除草剤、殺真菌剤、駆除剤、または別の微生物に使用された発酵ブロスの濾過物を包含してもよい。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物の株は、炎症を低減する、肺の病原体に向けた嫌気性／微好気性の殺菌活性を維持する、代謝特性を拡張する、および／またはバイオフィルム、ＤＮＡ、および瘢痕組織に対する活性を有する酵素を産生するよう働いてもよい。いくつかの態様において、生きた生物学的製剤を伴う処置はまた、処置への肺がん患者の包含を支持するためにがんの病原性機構を妨害してもよい。

本明細書において別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994)、およびHale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明に使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載のそれらと同様または等価であるいずれの方法および材料も、本発明の実践または試験において使用され得る。

本明細書に提供される数値の範囲は、範囲を定義する数を包含する。他に指し示されない限り夫々、核酸は、左から右に５’から３’の方向で書かれる；アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの方向で書かれる。

定義
「A」、「an」および「the」は、文脈が他を明確に規定しない限り、複数形の言及（例として、１以上の）を包含する。

「栄養要求株」は、増殖のために必要とされる栄養素を産生することのできる生物または細胞である。その中の例において、大抵は、細胞が必須アミノ酸（単数または複数）を作製することができないことを指す。

略語「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を指す。

「キメラ生物」または「キメラ」は、２以上の微生物種からの遺伝情報を含有する単細胞生物を指す。

「抱合」は、細胞間の直接の接触による、または２つの細胞間の橋のようなつながりによる、微生物間の遺伝子材料の移動である。

用語「培養する」は、細胞の集団、例として、微生物の細胞を、増殖のための好適な条件下で、液体または固体培地において増殖させることを指す。

略語「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指す。

用語「由来する」は、一般に、ある特定された材料が別の特定された材料にその起源を見出すか、または別の特定された材料を参照して記載され得る特徴を有することを指し示す。

用語「剤形」は、投与される個体のための単位投薬量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、好適な医薬賦形剤とともに、所望される治療的または予防的効果を産生するために算出された予め決められた分量の活性材料を含有する。「単位用量」は、個体にある時間中治療的または予防的に有効なレベルを提供するのに充分な物質の量を指す。

「環境ストレッサー」は、ホメオスタシスを脅かす細胞の周囲における因子である。

「遺伝子型」は、生物の遺伝的構成である。

「ホメオスタシス」は、相互依存する要素間の、とくに生理学的プロセスによって維持されるような、相対的に安定した平衡へ向かう傾向である。

「遺伝子の水平伝播」は、異なる種のゲノム間のＤＮＡの伝達である。

「ハイブリッド」は、２つの遺伝子学的に別個の品種、種、または属から交配された生物である。

「個体」または「対象」は、脊椎動物、典型的にはヒトなどの哺乳動物を指す。用語「個体」または「対象」はまた、例えば、イヌ、ネコ、齧歯類の動物等の非ヒト哺乳動物を指す。

「生きた生物学的製剤」は、人間、動物、または植物の疾患または疾病の予防、処置、または治癒に適用できる生きた微生物を指す。

「肺疾病」は、これらに限定されないが、微生物の感染症、炎症性疾患、およびがんを包含する、肺またはより大きな呼吸器の疾患または急性もしくは慢性の有害な疾病を指す。

略語「ＭＩＣ」は、最小阻止濃度を指す。

「微生物」または「微生物の株」は、細菌または真菌細胞、例えば、酵母などの単細胞生物を指す。

用語「改変された」は、１以上の環境ストレッサー（単数または複数）を使用した、遺伝子の表現型の発現または下層のゲノムＤＮＡの配列を改変するプロセスを指す。

「改変された微生物」または「改変された微生物の株」は、組換え技術またはベクターなどの外来性供給源からの核酸の付加を使用せずに、１以上の環境ストレッサー（単数または複数）の適用によって誘導される、それの由来する親生物との比較において、ゲノムのヌクレオチド配列（単数または複数）または遺伝子の表現型の発現中に１以上の変更（単数または複数）を有する単細胞生物を指す。

「突然変異体」は、それの由来する親生物との比較において、ゲノムのヌクレオチド配列（単数または複数）中に１以上の変更（単数または複数）を有する生物を指す。

「オリゴ芽胞形成（oligo-sporogenic）」は、コロニーの少ないメンバーのみが芽胞を形成する、微生物の株である。

「有機化合物」は、それらの分子が炭素を含有する、気体、液体、または固体の化学化合物の大きなクラスのいずれかのメンバーである。

「浸透性のストレッサー」は、細胞の周囲の溶質の濃度において変化を引き起こし、その細胞膜を越えた水の運動において迅速な変化を引き起こす、環境中の因子である。

「親株」は、キメラまたは突然変異体が由来する、微生物の株を指す。

「親ドナー」は、抱合、形質転換、または他のＤＮＡ移動プロセスを通して別の種または株へと移される遺伝的材料を提供することによって直接的に；または親宿主においてＤＮＡおよび／または表現型の変更を促進する条件、ストレッサー、化学的誘導因子、等々を提供することによって間接的に、のいずれかで親宿主において遺伝的変更に寄与する株である。

「親宿主」は、そのＤＮＡが、環境ストレッサーの作用を通してかまたは抱合、形質転換、もしくは他のＤＮＡ移動プロセスを通して別の種または株から外来性のＤＮＡを受け取ることによってのいずれかで変更されている株である。

「薬学的に許容し得る」は、連邦政府の規制当局もしくは州政府によって承認されているかまたは米国薬局方もしくは動物、およびより具体的にヒトにおける使用のための他の一般に認識される薬局方中に挙げられていることを意味する。

「薬学的に許容し得るビヒクル」または「薬学的に許容し得る賦形剤」は、本明細書に記載のとおりの生きた生物学的製剤（改変された微生物）とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。

「表現型」は、遺伝子型および環境に依存する、生物の観測可能な特徴である。

「表現型の可塑性」は、異なる環境にさらされたときに、１より多い表現型を産生するある遺伝子型の能力である。表現型の可塑性は、環境の変化に応えてその表現型を変化させる生物の能力である。

「プラスミド」は、様々な細菌の株の間で見られる染色体外の遺伝的要素である。

「倍数体」は、生物が染色体の１以上の追加のセットを獲得する状態である。

「予防する」または「予防」は、疾患または障害を獲得するリスクにおける低減を指す（すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも１つが、疾患にさらされているであろうかまたは疾患の素因があるであろうが、疾患の症状を経験していないかまたは表に出ていない対象において発症しないようにする、または症状が、処置の不在においてよりも低い重症度で発症するようにする）。「予防」または「予防法」は、疾患または障害の発病を遅延させることを指してもよい。

「予防的有効量」は、疾患または疾病の予防のために個体に投与されるときに、疾患または疾病のかかる予防をもたらすかもしくは疾患または疾病の少なくとも１つの症状の発症を予防するのに充分である、または化合物の投与の不在よりもより低いレベルの重症度で症状の発症をもたらす、本明細書に記載のとおりの改変された微生物の量を意味する。「予防的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、および処置されるべき対象の年齢、重量、等々に応じて変わり得る。

「予防法」は、疾患もしくは疾病またはそれらの少なくとも１つの症状の予防のためにとられる手段を意味する。

「原栄養株」は、必要とされる栄養素を合成することができる生物または細胞である。その内の例において、大抵は、必須アミノ酸の自己合成を指す。

「組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子」は、遺伝子組換え（分子クローニングなど）の実験的方法によって形成されるＤＮＡ分子であり、複数の供給源からの遺伝的材料をまとめて、別の方法ではゲノム中に見られない配列を作り出す。

用語「組換え」は、染色体間の遺伝子の交換のプロセスまたは行為であり、異なる遺伝的組み合わせおよび最終的には親におけるそれらとは異なる染色体を有するユニークな子孫の形成をもたらす。

「株変更」は、種における遺伝子発現を変更する、天然または人工の手段を通したＤＮＡの付加または欠失である。

本明細書に使用されるとき「生存性」は、微生物が所与の環境において存続する能力、すなわち、所与の場所において存在を維持し、ほかの場所での増殖のためにその場所で再生できることを指す。微生物は、活発に分裂する、または代謝的に活発である必要はない。例えば、本明細書に記載のとおりの、肺の文脈において、肺が採取された場合に、微生物は肺試料から増殖され得る。

「治療的有効量」は、疾患または疾病を処置するために個体に投与されるときに、疾患または疾病についてのかかる処置に影響を与えるかまたは疾患または疾病の少なくとも１つの症状の重症度を低減するかもしくは除去するのに充分である、本明細書に記載のとおりの改変された微生物の量を意味する。「治療的有効量」は、医学博士または他の臨床医によって探し求められている対象の生物学的または医学的応答を引き出すであろう改変された微生物の量を意味する。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、および処置されるべき対象の年齢、重量、等々に応じて変わり得る。

「トランスポゾン」は、転位を受け得る染色体セグメント、とくに宿主ＤＮＡにおける相補的配列の不在下での染色体、ファージ、およびプラスミドＤＮＡ間で全体として転位置され得る細菌性ＤＮＡのセグメントである。

いずれかの疾患または障害の「処置する」または「処置」は、一態様において、疾患または障害を寛解することを指す（すなわち、疾患またはそれらの臨床症状の少なくとも１つの発症を止めるかまたは低減すること）。別の態様において、「処置する」または「処置」は、対象によって認められるであろう、少なくとも１つの物理的なパラメータを改善することを指す。もう１つの態様において、「処置する」または「処置」は、物理的（例として、認められる症状の安定化）、生理学的（例として、物理的なパラメータの安定化）のいずれかまたは両方で疾患または障害を調節することを指す。

「ベクター」は、外来の遺伝的材料を別の細胞内に人工的に運ぶためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子であり、そこでそれは複製および／または発現され得る。外来のＤＮＡを含有するベクターは、組換えＤＮＡと呼ばれる。

「野生型」は、天然に生じる微生物を指す。

処置の方法
方法は、改変された微生物を使用する、肺疾病、例として、炎症性、感染性および線維性関連の肺および／またはより大きな呼吸器疾患または慢性疾病の処置のために提供される。改変プロセスの一環として、１つまたは一連の環境圧力および選択ツールが、表現型の発現の改変またはゲノムのヌクレオチド配列（単数または複数）における変更を試みるために、親微生物に適用される。一態様において、改変された微生物は、キメラ微生物のハイブリッドである。別の態様において、改変された微生物は、微生物の突然変異体である。本明細書に記載のとおりの改変された微生物を産生するために用いられるであろう環境圧力および選択ツールの非限定例は、抗真菌物質、有機化合物、溶媒、高温、低温、紫外線光、浸透性のストレッサー、無機化学物質、電離放射線、大気気体の組成、ビタミンまたは補因子、ビタミンまたは補因子の不在、酸、塩基、炭水化物供給源、窒素供給源、生物学的毒素、ペプチド、保存物質、除草剤、殺真菌剤、駆除剤、または別の微生物に使用された発酵ブロスの濾過物を包含する。これらの改変された微生物は、次いで所望される形質についてスクリーニングされる。このケースにおいて、所望される形質は、改変された微生物が肺（例として、肺または呼吸器の）起源の疾患を処置することを可能にする特性を包含する。これらの形質は、数ある中でも、肺における改善された生存性、標的化細菌を殺傷する能力、上皮細胞および／または粘液への接着、炎症を阻害する能力、細菌のバイオフィルムを取り除く能力、および粘液溶解活性を示す能力を包含する。改変された微生物の産生のための非限定的な方法は、米国特許第９，７６５，３５８号において見出され得、その全体および以下の例が参照されることによって本明細書に組み込まれる。

肺起源の疾患の処置に有益である特性を包含する親微生物の例は、Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus、Lactococcus、Leuconostoc、Oenococcus、Weaselly、Bifidobacterium、Bdellovibrio、Micavibrio、Vampirovibrio、Vampirococcus、Daptobacter、Lysobacter、Myxococcus、Aristabacter、Cytophaga、Gardnerella、Clostridium、Deinococcus、Faecalibacterium、Anaerobacter、Caprobacillus、Oxobacter、Sporobacter、Eubacterium、Heliobacterium、Ocillospira、Peptococcus、Dehalobacter、Butyrivibrio、Coprococcus、Lachnospira、Ruminococcus、Peptostroptococcus、Moorella、Listeria、Mycoplasma、Bacillus、Paenibacillus、Staphylococcus、Enterococcus、Enterobacter、Escherichia、Salmonella、Klebsiella、Pseudomonas、Vibrio、Helicobacter、Haemophilus、halomonas、Bacteroides、Prevotella、Bartonella、Porphyromonas、Actinomyces、Streptomyces、Corynebacterium、Propionibacterium、Mycobacterium、Caulobacter、Bradyrhizobium、Agrobacterium、Rhodobacter、Rhodopseudomonas、Magnetospirillum、Magnetobacterium、Acetobacter、Zymomonas、Rikettsia、Eleftheria、Saccharomyces、Schizosacchoromyces、Schefferomyces、Zygosaccharmomyces、Yarrowia、Pichia、Dekkera、Kluyveromyces、Candida、Metschnikowia、およびTorulasporaの種を包含する。一態様において、菌株は、Lactobacillus種、例えば、L. plantarum、L. delbrueckii、L. acidophilus、L. brevis、L.casei、L. sanfransciscensis、L. rahamnosus、L. helveticus、L. curvatus、L. sakei、L. buchneri、L. fermentum、またはL. reuteriである。

肺の改善された生存性に有益である特性を包含する親微生物の例は、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、放線菌門、フソバクテリウム門、およびシアノバクテリア門からの微生物を包含し、より具体的に言うとBifidobacteriu、Gardnerella、Clostridium、Deionococcus、Faecalibacteriu、Anaerobacter、Coprobacillus、Oxobacter、Sporobacter、Eubacteriu、Heliobacteriu、Oscillospira、Peptococcus、Dehalobacter、Butyrivibrio、Coprococcus、Lachnospira、Ruminococcus、Bacteroides、Prevotella、Bartonella、Bdellovibrio、Micavibrio、Vampirovibrio、Vampirococcus、Daptobacter、Lysobacter、Myxococcus、Aristabacter、Cytophaga、Bacillus、Paenibacillus、Staphylococcus、Enterococcus、Enterobacter、およびEscherichiaの種からの微生物を包含する。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、肺疾病の少なくとも１つの症状を処置、予防、または寛解するために個体に投与され得る。例えば、固体、液体、または半固体形態における改変された微生物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物における肺疾病を処置または予防するために使用されてもよい。

本明細書に記載のとおりの処置の方法が治療的または予防的に有益であるだろう肺疾病の例は、肺感染症、炎症性疾患、およびがんを包含する。肺感染症は、細菌、ウイルス、寄生体および／または真菌によって引き起こされ得る。改変された微生物によって処置または予防され得る細菌感染症によって引き起こされる肺疾患の例は、これらに限定されないが、以下を包含する：Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Moraxella catarrhalis、Streptococcus pyogenes、Neisseria meningitidis、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumonia、Chlamydophilia pneumonia、およびLegionella pneumonophiliaによって引き起こされる肺炎。改変された微生物を使用して低減または除去され得る肺の細菌感染症に関連する症状の例は、これらに限定されないが、以下を包含する：胸部疼痛、胃疼痛、発熱、頭痛、食欲の喪失、嘔吐、咳、息切れ、および粘液産生。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、肺の炎症性疾患を処置または予防するために使用され得る。ヒト肺は、大量の微生物を含有する。大部分について、これらの微生物は、宿主の健康状態において有益な役割を担う；しかしながら、肺の微生物の存在量、多様性、および／または組成に対する障害は、有害となり得、多数の疾患、障害、および／または症候群を引き起こし得る。改変された微生物を使用して処置または予防され得る肺の炎症性疾患の例は、これらに限定されないが、以下を包含する：喘息、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、および肺炎。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、肺に関連するかまたは肺に源を発する他の疾患または症候群を処置または予防するために使用され得る。かかる疾患の例は、これらに限定されないが、以下を包含する：代謝障害、リウマチ性関節炎、ループス、サルコイドーシス、強皮症またはシェーグレン症候群などの自己免疫疾患、嚢胞性線維症（ＣＦ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺炎などの線維症（ＦＤ）、およびがん（例として、腺癌、扁平上皮細胞癌、または大細胞癌）。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、様々な手法で対象に投与され得る。例えば、固体、液体、または半固体形態における改変された微生物は、例として、吸入溶液または粉末、鼻腔用スプレー、または経鼻の／肺洗浄液として、個体に投与され得る。例えば、吸入送達は、１日当たり１回、２回、３回、または４回を１～２１日間またはそれ以上、例として、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、または２１日間生じてもよい。

本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、単独で、または複数の微生物の混合物としてのいずれかで投与されてもよい。投薬量は、具体的な使用された改変された微生物（単数または複数）、処置される特定の病気、患者の年齢、重量、および健康状態、処置に対する患者の応答、および／または医者または他の医療従事者によって評価されるであろう他のパラメータに基づいて変わってもよい。吸入、鼻腔内、および／または気管内の設置／洗浄によって送達されるであろう改変された微生物の投薬量の例は、単回用量において、約１０～約１０^１２またはそれ以上、例として、約１０、約１００、約１０００、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、または約１０^１２、またはそれ以上の微生物を包含する。例えば、約１０～約１００、約１００～約１０００、約１０^４～約１０^５、約１０^５～約１０^６、約１０^６～約１０^７、約１０^７～約１０^８、約１０^８～約１０^９、約１０^９～約１０^１０、約１０^１０～約１０^１１、約１０^１１～約１０^１２、約１０～約１０００、約１００～約１０^４、約１０００～約１０^５、約１０^４～約１０^６、約１０^５～約１０^７、約１０^６～約１０^８、約１０^７～約１０^９、約１０^８～約１０^１０、約１０^９～約１０^１、約１０^１０～約１０^１２、約１０～約１０００、約１００～約１０^５、約１０００～約１０、約１０^５～約１０^８、約１０^６～約１０^９、約１０^９７～約１０^１０、約１０^８～約１０^１１、約１０^９～約１０^１２、約１０～約１０^５、約１０００～約１０^８、または約１０^６～約１０^１２またはそれ以上のいずれか。

本明細書に記載の改変された微生物は、肺疾病を治療するために、他の治療剤と組み合わせて使用されてもよい。改変された微生物と組み合わせて使用されてもよい他の治療剤の例は、これらに限定されないが、抗生物質、抗真菌薬、バクテリオファージ、ペプチド、酵素、糖、糖重合体、バクテリオシン、プロバイオティクス、抗体、および芽胞を包含する。例えば、相乗または相加効果が、改変された微生物を１以上の追加の治療剤（単数または複数）と組み合わせて、同時にかまたは連続してのいずれかで投与することによって達成されるであろう。追加の治療剤は、改変された微生物の投与に先立ち、投与と同時に、または投与後に投与されてもよい。

いくつかの態様において、追加の治療剤は、改変された微生物に先立ち投与されてもよい。このことの例は、肺から不要な微生物を一掃するために、１以上の抗生物質（例として、アモキシシリンおよびクラブラン酸、クロキサシリンおよびクラブラン酸、クロキサシリンおよびジクロキサシリン、セファレキシン、セフジニル、セフプロジル、セファクロル、セフロキシム、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリム、エリスロマイシン／スルフィソキサゾール、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、バンコマイシン、イミペネム、メロペネム、コリスチメタート／コリスチン、メチシリン、オキサシリン、およびナフシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、メズロシリン、およびアズロシリン、チカルシリンおよびクラブラン酸、ピペラシリンおよびタゾバクタム、セファレキシン、セフジニル、セフプロジル、およびセファクロル、セフェピム、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、クラリスロマイシン、およびアジスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アズトレオナム、およびリネゾリド）またはバクテリオファージを投与し、これに続きさらなる感染症を予防するために１以上の用量の改変された微生物を投与することである。別の例は、P. aeruginosaなどの微生物の感染症の一次感染を一掃するためにトブラマイシンなどの抗生物質を投与し、これに続き感染症の慢性化の確立を予防するために１以上の用量の改変された微生物を投与することである。いくつかの態様において、追加の治療剤は、改変された微生物の投与と同時に投与されてもよい。

組成物
本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物を包含する組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤を包含する。いくつかの態様において、組成物は、担体分子を包含する。

いくつかの態様において、組成物は、それが投与される個体内の所望される作用部位への送達のために運動性菌（または感染症を標的化するために最適された他のもの）とともに処方される。例えば、組成物は、経鼻投与のために処方されてもよい。

いくつかの態様において、組成物は、それが投与される個体内の所望される作用部位への送達のために処方される。例えば、組成物は、肺における、または細気管支における中枢気道および末梢気道への投与のために処方されてもよい。

医薬として、すなわち、肺疾病の処置または予防法のために用いられるとき、本明細書に記載の組成物は、典型的には医薬組成物の形態で投与される。かかる組成物は、薬学分野において周知であるやり方で調製され得、少なくとも１つの活性化合物、すなわち、本明細書に記載のとおりの改変された微生物を包含する。

一般に、組成物は、薬学的有効量、すなわち、治療的または予防的有効量で投与される。実際に投与される活性剤、すなわち、本明細書に記載のとおりの改変された微生物の量は、処置されるべき疾病、選択される投与のルート、投与される改変された微生物の活性、個々の患者の年齢、重量、および応答、患者の症状の重症度等を包含する、関係のある状況に照らし合わせて、典型的には医者によって決定されるだろう。

医薬組成物は、吸入、鼻腔内、または気管内の点滴注入を包含する、様々なルートによって投与され得る。意図される送達のルートに応じて、医薬組成物は、好ましくは、乾燥粉末組成物または溶液として処方される。

吸入投与のための組成物は、バルク液体溶液または懸濁液、またはバルク粉末の形態をとり得る。より一般的に、しかしながら、組成物は、正確な投薬を容易にするために単位剤形において提示される。典型的な単位剤形は、液体組成物のプレフィルドの、予め測定されたアンプルまたはシリンジ、ゼラチンカプセル、ホイル－ホイルブリスター、または計量された薬物リザーバまたは固体組成物のケースにおける同種のものを包含する。かかる組成物のいくつかの態様において、活性剤、すなわち、本明細書に記載のとおりの改変された微生物は、微量の構成要素（約０．１重量％～約５０重量％、または約１重量％～約４０重量％）であってもよく、残りは所望される投薬形態を形成するために役立つ様々なビヒクルまたは担体および加工助剤である。

吸入投与に好適な液体形態は、緩衝剤、懸濁剤および分配剤、着色剤、フレーバー等とともに好適な水性または非水性ビヒクルが包含してもよい。固体形態は、例えば、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を包含してもよい：ガラクトースまたはマンノースなどの賦形剤。

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法に使用するための剤形内への製剤化のために、改変された微生物は、タンパク質の産生または生存性を増大させて、貯蔵寿命を延長し、および産物のパラメータを最適化するために、凍結乾燥され（例として、凍結乾燥した）、および次いで粉末形態で他の成分と一緒に混ぜられ得る。いくつかの態様において、これらの成分は、以下を包含する：水；塩；単糖類（例として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース）、二糖類（例として、スクロース、ラクトース、セロビオース、マルトース、トレハロース）、三糖類（例として、ラフィノース、メレチトース、マルトトリオース）、および／またはオリゴ糖類（例として、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キシラン、フラクトオリゴ糖、イヌリン）などの糖；糖アルコール（例として、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール）。

医薬組成物についての上記の構成要素は、ただ単に代表的なものにすぎない。他の材料ならびにプロセシング技法等は、Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, 2005, Publisher: Lippincott Williams & WilkinsのPart 8に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

キット
キットが、本明細書に記載のとおりの肺疾病の処置の方法において使用するために提供される。例えば、キットは、１以上の単位用量の本明細書に記載のとおりの改変された微生物を包含してもよい。改変された微生物は、医薬組成物で、例として、処置されるべき肺疾病について１以上の治療的または予防的有効量、例として、１以上の剤形で処方されてもよい。任意に、本明細書に記載の方法における、組成物の使用および／または投与、例として、吸入または鼻腔内投与のための指示が提供される。

本明細書に記載のとおりのキットについての指示は、印刷された形態またはＣＤまたはＤＶＤなどの電子媒体の形態、またはかかる指示が得られるであろうｗｅｂサイトのアドレスもしくはモバイルアプリケーションの形態で提供されてもよい。

キットは、好適なパッケージングで提供されてもよい。本明細書に使用されるとき、「パッケージング」は、システムにおいて習慣的に使用され、および本明細書に記載のとおりの方法において使用するのに好適な組成物を固定された境界内に保持することができる、固体マトリックスまたは材料を指す。かかる材料は、ガラスおよびプラスチック（例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリカーボネート）瓶、バイアル、紙、プラスチック、およびプラスチックホイルでラミネートされたエンベロープ等を包含する。ｅビーム滅菌技法が用いられる場合に、パッケージングは、内容物の滅菌を可能にするために充分に低密度であるべきである。

以下の例は、本発明を説明することを意図しており、本発明を限定するものではない。

例
例１
作用の複数の様式を有する肺感染症の処置のための治療的形質を有する改変された微生物
改変された微生物を、これまでに記載された方法（米国特許第９，７６５，３５８号）を使用して産生した。改変された微生物ＬＨ１は、Lactobacillus delbrueckiiおよびBacillus. subtilisの夫々に対して代謝（タンパク質）ストレッサーおよび大気（酸素）ストレッサーを適用するプロセスを起源とした。このことは、嫌気性呼吸を保持すると同時に８つの新しい炭水化物を代謝する能力を所有する、ＬＨ１をもたらした。

手短に言えば、親培養物（B. subtilisおよびＬＨ１）を一緒に混合し、滅菌ニトロセルロース０．２μｍフィルターで濾過した。次いで、フィルターを１０ｍｌの滅菌ＰＢＳでシリンジを介して洗浄した。フィルターを、逆さまにして脱酸素化したＭ９アルギン酸プレート上に置いた。プレートを、３７℃で７２時間嫌気性チャンバー内にてインキュベートした。

インキュベーション後に、各条件からのフィルターを、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内の１ｍｌのＰＢＳ内に入れた。フィルターを含有するマイクロ遠心チューブをボルテックスして、次いで８０００ＲＦＣで１０分間スピンダウンした。細胞ペレットをＰＢＳで懸濁し、２つの新たな嫌気性Ｍ９ ＮＢプレート上に広げた。プレートを、嫌気性チャンバー内で９６時間インキュベートした。コロニーは見られず、そのためにプレートを好気性インキュベーターに１６時間移し、いずれかの芽胞を発芽させた。

１６時間の好気性のインキュベーション後に、プレートをコロニーについてチェックした。次いで、単一のコロニーをＭ９ ＮＢ好気性プレート上に再度画線し、および４時間後に嫌気性チャンバーに移した（B. subtilis親は、芽胞形態からの発芽のために４時間の酸素への曝露を必要とする）。コロニーについての２４から１２０時間の嫌気性のインキュベーション後に、プレートを検査した。

１０のコロニーが４８時間以内に増殖した。すべての改変された微生物を、Pseudomonas、嫌気性増殖、炭水化物代謝プロファイル、アルギン酸リアーゼ産生、タンパク質分解酵素およびムチナーゼ産生に対してバクテリオシン活性について分析した。これら１０の改変された微生物のうちの３つは、胞子形成する前に４～８倍になり得（Ｆ２ＢＨ１、Ｆ２ＢＨ２、Ｆ２ＢＨ３）、およびこれらの株のうち２つは、Pseudomonasに対するバクテリオシンもまた獲得した（Ｆ２ＢＨ２、Ｆ２ＢＨ３）。

図１は、プレート上に広げられたルシフェラーゼ産生株のPsuedomonas aeruginosaに対する４８時間での嫌気性バクテリオシン活性からのクリアランスを伴う白色のパッチとして、Ｆ２ＢＨ２（上方の２つのパッチ）およびＦ２ＢＨ３（下方の２つのパッチ）；ＩＶＩＳ機械装置における生物発光からの写真を示す。野生型B. subtilis親は、その白色のパッチおよびクリアランスがバクテリオシン活性を示す野生型L. delbrueckii親と比較して、Pseudomonasに対する嫌気性活性を示さなかった。改変された微生物ＢＨ３は、L. delbrueckiiおよびB. subtilisの夫々に代謝（タンパク質）ストレッサーおよび大気（酸素）ストレッサー適用するプロセスを起源とした。このことは、好気性呼吸、アルギン酸リアーゼ、およびムチナーゼ活性を保持すると同時に、１つの新しい炭水化物を代謝する能力を所有する、ＢＨ３をもたらした。この改変された微生物であるＢＨ３は、そのL. delbrueckii親の殺菌活性を保持するＬＨ１と比較して、Pseudomonasに対する最小限の嫌気性活性を示した（クリアランスの４つの小さいドット）。

改変されたＢＨＩにおいて増殖された２０μｌの体積の終夜好気性培養物を、ナトリウムアルギン酸プレート上に滴下した。図２は、ヨウ素で染色されたナトリウムアルギン酸を含有するプレートを使用したアルギン酸リアーゼ産生を描く。ヨウ素は、アルギン酸ナトリウムと結合し、アルギン酸リアーゼによって分解されたクリアランス区域を示す。野生型Lactobacillus親からはアルギン酸リアーゼ活性は観察されなかったが、アルギン酸リアーゼ産生は、野生型Bacillus親において存在した。改変の最初のラウンドの後に、１つの改変された微生物（ＬＨ１）が生成され、およびアルギン酸リアーゼ活性を示さなかった。別の改変された微生物（ＢＨ３）は、アルギン酸リアーゼ産生を保持した。アルギン酸リアーゼ産生は、３つすべての二次的に改変された微生物、Ｆ２ＢＨ１、Ｆ２ＢＨ２、およびＦ２ＢＨ３において観察された。

株を改変されたＢＨＩにおいて好気的に終夜増殖させて、２０μｌを、０．３％ムチンプレートの中央に滴下した。プレートを、３．５Ｍ酢酸中の０．１％アミドブラックに３０分間浸し、および次いで１．２Ｍ酢酸で洗浄した。コロニーの周囲のムチン溶解区域（変色した輪）を、３７℃での好気性インキュベーションの２４時間後に観察した。図３は、野生型Bacillus、ＢＨ３、および３つすべての二次的に改変された微生物、Ｆ２ＢＨ１～３が、ムチン分解を示すことを示す。

株を、Biomerieux社のapi 50 CH試験を使用して３７℃での嫌気性インキュベーションの４８時間後の嫌気性の炭水化物代謝について試験した。図４に見られるとおりに、野生型Bacillus親は、嫌気性条件において炭水化物代謝を示さなかった。ＢＨ３は、ラクトースの代謝のみを示し、およびＦ２ＢＨ１～３は、様々なレベルの嫌気性炭水化物代謝を示し、Ｆ２ＢＨ２が嫌気性条件において形態的なB. subtilisの改変された微生物について最大数の代謝された炭水化物を実証した。

例２
生きた生物学的製剤は、多剤耐性病原体を包含する病原性生物に対して抗微生物活性を実証する
改変された菌株は、病原性細菌に対する抗微生物活性を有する代謝体およびバクテリオシンを産生した。抗細菌活性を、改変されたクロスストリークアッセイにおいて薬剤耐性病原体に対して実証した。改変されたクロスストリークアッセイのために、改変された微生物を（ＬＨ１または野生型Lactobacillus親）、ＢＨＩＬブロス中で終夜増殖し、および嫌気性条件に順化したＢＨＩＬ寒天にわたって単一の線で画線した。ARBank（CDC）から得られた病原性株および対照細菌を、改変された微生物に対して垂直にクロスストリークし、好気的に２４時間増殖させる前に、プレートを、３７℃で嫌気的に４８時間インキュベートした。病原性細菌の増殖が阻害されたところの改変された微生物の増殖からの距離を、測径器を用いて測定し（ｍｍ）、および対照に対して正規化した。

表Ｉは、改変された微生物（ＬＨ１）に対する感受性を実証している例示の細菌を示す。

改変されたクロスストリークアッセイによって測定された抗微生物活性は、疾患に寄与する感染またはコロニー形成に関連することが知られている、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方の増殖を阻害することにおいて広い範囲であったことに注意されたい。クロスストリークアッセイの例は、上方の対照株（B. methylotrophicus）が、嫌気性増殖の４８時間後に寒天を通して拡散したＬＨ１バクテリオシンに耐性がある一方で、CDC AR Bankからの多剤耐性S. aureus株（ＡＲ０５６２～ＡＲ０５６８）は、高い感受性であり、およびＬＨ１からの距離を測定し、記録した図５に示される。表ＩＩは、ＣＦ関連剤、アズトレオナムおよびトブラマイシンを包含する感受性に対するLH1 ETEST（登録商標）の結果を示す（図６）。

抗微生物の活性は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方の増殖を阻害することにおいて広い範囲であった。抗生物質感受性は、肺感染症の間に共に投与されるであろう重要な抗生物質（トブラマイシン）に対する先天性の耐性を実証するが、ほとんどの抗生物質に対して主として感受性が強い。

同様の定性分析において、滴下試験を使用して改変された微生物の蛍光P. aeruginosaの増殖を阻害する能力を実証した。別の滴下試験（上方の２つの滴下は細菌、下方の２つの滴下は濾過した上清）において、ＬＨ１の生細胞および／または濾過した上清による増殖の阻害を実証した（図１）。別の滴下試験は、２４時間の嫌気性増殖にわたって蓄積された代謝体を含有するＬＨ１およびLactobacillus親株の上清によるS. aureus CF臨床分離株の増殖の阻害の区域を示す（図７）。Bacillus親株は、好気性増殖の２４時間後に阻害の区域を示さなかった。

追加の滴下試験において、全細胞粗抽出物は、P. aeruginosa（図８）およびS. aureus（図９）ＣＦ臨床分離株に対するＬＨ１の抗細菌活性が、親株と比較してＬＨ１において増大したことを示す。３ｋＤａで濾過した粗抽出物のさらなる滴下試験は、およそ１０ｋＤａの分泌されたタンパク質は、S. aureusのＣＦ分離株に対する増大した抗細菌活性の原因であることを指し示す（図１０）。

In vitro抗細菌活性を、浮遊性状態においてもまた試験した。P. aeruginosa株ＰＡ０１（２ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）ならびにＷＴ親株（１ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）およびＬＨ１（１ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を、２：１の比率で混合した。生存能力のあるP. aeruginosaの数を、曝露の４時間後および８時間後で決定した。このことは、P. aeruginosaが殺傷され、およびＷＴおよびＬＨ１の両方によって最大で８時間まで増殖が阻害されたことを示した（図１１）。

例３
嫌気性P. aeruginosaのバイオフィルムを取り除くための生きた生物学的製剤の能力
改変された微生物（ＬＨ１）の嫌気性P. aeruginosaのバイオフィルムを取り除く能力を調査した。カルバペネム耐性P. aeruginosa臨床分離株（ＡＲ０２４３；CDC ARBank）の培養物を、ＬＢブロス中に１：１０００で播種し、および対数期の中間まで増殖させ、次いで遠心分離し、等しい体積のＬＢＮ培地に再懸濁し（１０ｇ／Ｌニトラートを伴うＬＢ）、およびバイオフィルムを、９６ウェル組織培養プレートにおいて３７℃で３日間嫌気性条件下にて静的に増殖させた。バイオフィルムをＰＢＳで洗浄し、非接着性の細胞を取り除き、次いでＬＨ１で４時間処置した。処置したバイオフィルムをＰＢＳで洗浄し、非接着性の細胞を取り除き、および１％クリスタルバイオレット染料で３０分間染色した。ＰＢＳでの洗浄の後に、エタノールをウェル中に５分間入れて、次いで取り除き、新たな９６ウェルプレート中に入れた。ＯＤ６００を測定し、残存するバイオフィルムを定量した。

図１２は、改変された微生物が、嫌気性環境においてカルバペネム耐性P. aeruginosa臨床分離株を取り除くのに有効であったことを示す。１０^６および１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＬＨ１でのバイオフィルムの処置は、４時間後に、ＰＢＳ対照と比較して、夫々最大７０％までのバイオフィルムの低減をもたらした。図１３は、ＬＨ１によるP. aeruginosaのバイオフィルムの低減が、ＷＴ親によって観察されるものよりも大きいことを示す。これらのデータは、ＬＨ１が肺感染症中の多剤耐性病原体を処置するのに有効であろうことを示唆する。

例４
ＣＦの唾液中の抗細菌活性
ＣＦムチン培地およびＣＦの唾液中でのＬＨ１の増殖。ＣＦムチン培地に約１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、および０時間および４時間後の生菌数をプレーティングした。また、４～５人のＣＦ対象からプールされた唾液を、１：２の唾液：ＰＢＳ（ｗ／ｖ）に希釈し、およびビーズ破砕（bead beating）によって均質化した。アリコートを、およそ１０^５ｃｆｕ／ｍＬのＬＨ１で播種した。播種した唾液を非選択的培地上にプレーティングし、および嫌気的に増殖させて経時的にＬＨ１を数えあげた。

ＣＦの唾液中のＬＨ１の活性を検査するため、４～５人のＣＦ対象からプールされた唾液を、１：２の唾液：ＰＢＳ（ｗ／ｖ）に希釈し、およびビーズ破砕により均質化した。アリコートを、嫌気性のtime-killアッセイにおいてＬＨ１で処置した。処置した唾液を、S. aureus選択培地（フォーゲル－ジョンソン寒天）上で生菌数についてプレーティングした。

同様の研究において、酢酸エチルを使用して、増殖４日後の１００Ｘに濃縮されたＬＨ１に使用した培地の粗抽出物を得た。抽出物を唾液中に１：１０の比率で希釈し、および最大２時間までインキュベートした。抽出物をまた希釈し、および１０μｌを、菌叢の増殖のために0.5 MacFarland P. aeruginosa（ＡＲ０２４３）で画線したプレート上に置く前に、１：２および１：１００の比率でブランクの抗生物質試験ディスク内に入れた。粗抽出物ディスクとともにプレート（および５％ジメチルスルホキシド対照、ＤＭＳＯ）を、３７℃で終夜インキュベートした。

全ゲノム配列決定を使用して、ＬＨ１の改変された抗細菌活性および代謝活性を支持する遺伝的バリエーションを同定した。２つの追跡可能であり、安定した遺伝的改変を同定した。プライマーPerm03-F（5’-GCCGCCATAAAGCAAATGATCA-3’）（配列番号１）およびPerm01-R（5’- AGCCATCATGAACCGTCTCTTC-3’）（配列番号２）と共にOneTaq Hot Start DNAポリメラーゼ（NEBiolabs）を使用して、遺伝的改変の１つ（Ｔ欠失）を含有することが示されている薬物／代謝体トランスポーター（ＤＭＴ）スーパーファミリーのパーミアーゼにおける領域を増幅した。このＰＣＲツールを使用して、６０世代以上の継代の後に得られた１０の単一コロニーにおいて遺伝的改変の安定性を確認した。１０のコロニーからのＰＣＲ産物を、精製し、Sanger配列決定に送った。

図１４は、ＬＨ１が、４時間後にＣＦムチン培地において増殖し続けており、１０^７ｃｆｕ／ｍＬでの播種後にＬＨ１の２０倍の増大をもたらすことを示す。図１５は、ＬＨ１が、４時間後にＣＦの唾液において増殖し続けており、１０^５ｃｆｕ／ｍＬでの播種後にＬＨ１の２倍の増大をもたらすことを示す。ＣＦの唾液中に存在する抗生物質は、未知のものであることに留意されたい。図１６は、ＬＨ１が、時間および用量依存的なやり方においてＣＦの唾液中のS. aureusを低減させたことを示す。１０^８ＣＦＵ／ｍＬのＬＨ１で４時間または２４時間、または１０^７ｃｆｕ／ｍＬで２４時間処置した唾液中の夫々において、S. aureusは検出されず、＞４ｌｏｇの低減が実証された。

ＬＨ１の粗抽出物とのインキュベーションは、１時間以内でのS. aureusの完全な根絶（１０^４から０ｃｆｕ／ｍＬへの）を示し、ＬＨ１によって産生されるバクテリオシンの強力な抗S. aureus活性を実証した（図１７）。さらに、５％ＤＭＳＯ対照と比較して、ＬＨ１粗抽出物ディスクの周囲にP. aeruginosaの菌叢の終夜のインキュベーション後に、阻害の区域を観察した（図１８）。阻害の区域は、希釈の際に区域の直径が減少するという点で用量依存性を示した。

全ゲノム配列決定は、ＬＨ１が、薬物／代謝体トランスポーター（ＤＭＴ）スーパーファミリーのパーミアーゼ遺伝子において欠失を有し、それが新規タンパク質の発現をもたらすフレームシフトを引き起こし、およびS. aureusに対する抗細菌活性の増大の原因であることを示した。この新しいタンパク質を、実行可能な分泌シグナルペプチドリーダー、ｐＨ１１．８７の等電点、生理学的ｐＨでの正味の正電荷（１３）および水への乏しい可溶性を示唆するハイドロパシープロファイルを有し、１０．２ｋＤａであると特徴付け、および示した（図１９、２０）。新しいタンパク質配列のさらなる特徴付けは、負に帯電した細菌膜に引き付けられ、その中に組み込まれる、タンパク質分泌および正味の正電荷を促進するであろう実行可能なリーダー配列の存在もまた指し示す（図１９）。第２の遺伝子変化は、ＰＴＳ、フルクトース特異的トランスポーターサブユニットＩＩＣにおける点突然変異である；置換（Ａ＞Ｇ）は、ＯＲＦの５’末端を拡張する遺伝子間領域におけるストップコドンの喪失をもたらした。このことは、改変された代謝活性に寄与するであろうが、いまだ完全に特徴付けられていない。

６０世代を超える継代の後に、ＰＣＲを使用して、改変されたパーミアーゼ領域の１０の個々のコロニーを増幅させた。これらのＰＣＲ産物を配列決定し、および遺伝子変化が、安定したおり追跡可能であると示唆する遺伝的改変を保持していることを見出した（図２１）。

例５
生きた生物学的製剤およびバクテリオシンは、粘液溶解活性を実証し、および粘液の粘度を低減した
唾液試料を、ルーチンの臨床診療の間に７人の嚢胞性線維症の患者から得、プールし、１：２の唾液：ＰＢＳ（ｗ／ｖ）で希釈し、およびビーズ破砕によって均質化した。１００μＬの体積のプールされた唾液を、マイクロチューブに入れて、１０^７～１０^８ＣＦＵ／ｍＬの生きた生物学的製剤（この例のＬＨ１にける）で処置した。短時間の混合ステップの後に、チューブを、３７℃で４時間嫌気的にインキュベートし、患者における疾病をシミュレートした。同様に、７０μＬの体積のプールされた唾液およびＬＨ１の１００Ｘ粗抽出物または滅菌ＰＢＳ（１：１）を、嫌気的に４時間インキュベートして、次いで注入可能性について試験した。

非処置の唾液試料は、注ぐことができず、しかしながら生きた生物学的製剤の粗抽出物処置の唾液は、図２２に示されるとおり注入可能であった。生きた生物学的製剤（ＬＨ１）での処置は、嚢胞性線維症の唾液の粘度を低減させる能力を実証した。

例６
生きた生物学的製剤の肺送達は、マウスにおいて死亡率を誘導しない
生きた生物学的製剤（改変された微生物）の安全性プロファイルは、重要な考慮すべき事柄である。最初のin vivo研究は、マウスモデルを使用して、予備的な評価を提供した。３群のマウスを、Ｆ２ＢＨ２の生きた生物学的製剤またはP. aeruginosaいずれかを１０^６または１０^７ＣＦＵ／ｍＬのいずれかで鼻腔内に接種した後、５日にわたって評価した。

マウス肺感染症モデルにおけるこの重大な安全性研究は、１０^８ＣＦＵ／ｍＬでマウスに鼻腔内適用されたＦ２ＢＨ２が、５日後に１００％の生存をもたらすことを示した。１０^６または１０^７ＣＦＵ／ｍＬで鼻腔内にP. aeruginosaを感染させられたマウスは、夫々５日後に６０％および０％の生存を示した（図２３）。

例７
改変された微生物は、免疫回避のための肺がん機構を妨害する
in vitro細胞培養方法を使用して、がんへの免疫応答に対する改変された微生物の影響を検査する。生きた生物学的製剤（１以上の本明細書に記載のとおりの改変された微生物（単数または複数））での処置を、処置後の宿主の応答について評価する。

例８
生きた生物学的製剤は、肺および副鼻腔（sinus）における炎症を低減する
動物モデルを使用して、疾患および炎症のバイオマーカーを検査する。肺における疾患の炎症及びマーカーを低減するための生きた生物学的製剤（本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物（単数または複数））での処置を、肺における処置後に評価する。

例９
生きた生物学的製剤は、肺および副鼻腔における慢性感染症を低減する
動物モデルを使用して、感染した動物の肺における感染症の低減を検査する。肺における感染症を低減するための生きた生物学的製剤（本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物（単数または複数））での処置を、肺における処置後に評価する。

例１０
生きた生物学的製剤は、健常または疾患の肺および副鼻腔における慢性使用についての安全性を実証する
動物モデルを使用して、健常および疾患の動物の肺／副鼻腔における生きた生物学的製剤の慢性使用の安全性を検査する。肺における安全な使用を実証するための生きた生物学的製剤（本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物（単数または複数））での処置を、肺または副鼻腔における処置後に評価する。

例１１
生きた生物学的製剤は、健常または疾患の肺および副鼻腔における肺のマイクロバイオームに対する影響を実証する
動物モデルを使用して、健常および疾患の動物の肺／副鼻腔における生きた生物学的製剤（本明細書に記載のとおりの１以上の改変された微生物（単数または複数））の使用後の肺、副鼻腔、および中咽頭、およびＧＩマイクロバイオームに対する影響を検査する。マイクロバイオームに対する影響を実証するための生きた生物学的製剤での処置を、肺または副鼻腔における処置後に評価する。

前述の発明は、理解の明確化の目的で、説明および例示を手段として少し詳しく記載されるが、ある種の変更および修飾が、添付の請求の範囲において説明される、発明の精神および範囲から逸脱することなく、実行され得ることは、当業者に明らかだろう。それ故、説明は、本発明の範囲の制限と解釈されるべきではない。

本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のため、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているのと同程度まで全体として参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (36)

1. 肺疾病の処置または予防のための方法であって、該方法は、治療的または予防的有効量の改変された微生物を、それを必要とする個体に投与することを含み、ここで該投与することが、個体における肺疾病の少なくとも１つの症状の予防、寛解、または除去をもたらす、前記方法。
2. 該改変された微生物が、１以上の環境圧力条件の適用によって産生されるキメラ微生物のハイブリッドまたは微生物の突然変異体を含む、請求項１に記載の方法。
3. 該改変された微生物が、該肺疾病の処置に有益である特性、および/または肺の改善された生存性に有益である特性を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 該改変された微生物が、Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus、Lactococcus、Leuconostoc、Oenococcus、Weissella、Bifidobacterium、Bdellovibrio、Micavibrio、Vampirovibrio、Vampirococcus、Daptobacter、Lysobacter、Myxococcus、Aristabacter、Cytophaga、Gardnerella、Clostridium、Deinococcus、Faecalibacterium、Anaerobacter、Coprobacillus、Oxobacter、Sporobacter、Eubacterium、Heliobacterium、Oscillospira、Peptococcus、Dehalobacter、Butyrivibrio、Coprococcus、Lachnospira、Ruminococcus、Peptostreptococcus、Moorella、Listeria、Mycoplasma、Bacillus、Paenibacillus、Staphylococcus、Enterococcus、Enterobacter、Escherichia、Salmonella、Klebsiella、Pseudomonas、Vibrio、Helicobacter、Haemophilus、Halomonas、Bacterioides、Prevotella、Bartonella、Porphyromonas、Actinomyces、Streptomyces、Corynebacterium、Propionibacterium、Mycobacterium、Caulobacter、Bradyrhizobium、Agrobacterium、Rhodobacte、Rhodopseudomonas、Magnetospirillum、Magnetobacterium、Acetobacter、Zymomonas、Rikettsia、Eleftheria、Saccharonmyces、Schizosacchoromyces、Scheffereromyces、Zygosaccharomyces、Yarrowia、Pichia、Dekkera、Kluyveromyces、Candida、Metschnikowia、およびTorulasporaの種から選択される、該肺疾病の処置に有益である特性を含む親微生物に由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 該改変された微生物が、Bifidobacterium、Gardgnerella、Clostridium、Deinococcus、Faecalibacterium、Anaerobacter、Coprobacillus、Oxobacter、Sporobacter、Eubacterium、Heliobacterium、Oscillospira、Peptococcus、Dehalobacter、Butyrivibrio、Coprococcus、Lachnospira、Ruminococcus、Bacteroides、Prevotella、Bartonella、Bdellovibrio、Micabibrio、Vampirobibrio、Vampirococcus、Daptobacter、Lysobacter、Myxococcus、Aristabacter、Cytophaga、Bacillus、Paenibacillus、Staphylococcus、Enterococcus、Enterobacter、およびEscherichiaの種から選択される、肺の改善された生存性に有益である特性を含む親微生物に由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 該肺疾病が、微生物の感染症を含む、請求項１に記載の方法。
7. 該微生物の感染症が、Pseudomonas、Staphylococcus、Burkholderia、Mycobacterium、Stenotrophomonas、Achromobacter、Ralstonia、Pandoraea、Escherichia、Mycobacterium Moraxell、Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus、Veillonella、Prevotella、Propionibacterium、Haemophilus、およびListeria属から選択される細菌を含む、請求項６に記載の方法。
8. 該微生物の感染症が、Pseudomonas感染症を含む、請求項７に記載の方法。
9. 該P. aeruginosa感染症が、慢性P. aeruginosa感染症である、請求項８に記載の方法。
10. 該微生物の感染症が、Staphylococcus aureus感染症を含む、請求項７に記載の方法。
11. 該S. aureus感染症が、慢性S. aureus感染症である、請求項１０に記載の方法。
12. 該微生物の感染症が、Candida、Malassezia、Neosartorya、Saccharaomyces、およびAspergillus属から選択される真菌を含む、請求項６に記載の方法。
13. 該肺疾病が、真核生物の感染症を含む、請求項６に記載の方法。
14. 該真核生物の感染症が、Ascaris、Schistosoma、Toxoplasma、Cryptosporidium、Cyclospora、およびParagonimus属から選択される真核生物を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 該肺疾病が、ウイルス感染症を含む、請求項１に記載の方法。
16. 該ウイルス感染症が、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コロナウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザ、アデノウイルス、アストロウイルス、カリシウイルス、およびパルボウイルスから選択されるウイルスを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 該肺疾病が、線維症（ＦＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、または間質性肺炎を含む、請求項１に記載の方法。
18. 該肺疾病が、P. aeruginosa、S. aureus、メチシリン耐性Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ）、セパシア菌群（Ｂｃｃ）、非結核性抗酸菌（ＮＴＭ）、Stenotraphomonas maltophilia、Achromobacterium spp.、Ralstonia spp.、およびPandorae a spp.から選択されるＣＦ関連肺感染症を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 該肺疾病が、炎症性疾患を含む、請求項１に記載の方法。
20. 炎症性疾患が、喘息、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、または肺炎を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 該肺疾病が、リウマチ性関節炎、ループス、サルコイドーシス、強皮症、およびシェーグレン症候群から選択される、自己免疫疾患を含む、請求項１に記載の方法。
22. 該肺疾病が、がんを含む、請求項１に記載の方法。
23. 該がんが、腺癌、扁平上皮細胞癌、または大細胞癌を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 該改変された微生物が、該肺疾病の少なくとも１つの症状を処置、予防、または寛解するために少なくとも１つの他の処置と組み合わせて投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
25. 該少なくとも１つの他の処置が、抗生物質、バクテリオファージ、抗体、ペプチド、酵素、糖、糖重合体、バクテリオシン、または芽胞を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 該治療的または予防的有効量が、乾燥粉末において、または溶液として処方されている１つ以上の改変された微生物を含む、請求項１に記載の方法。
27. 乾燥粉末または溶液が、吸入によって投与される、請求項２６に記載の方法。
28. 乾燥粉末または溶液が、肺における局所沈着のために処方される、請求項２７に記載の方法。
29. 乾燥粉末または溶液の内容物が、中枢気道（large airway）、末梢気道、または細気管支中に放出される、請求項２７に記載の方法。
30. 該治療的または予防的有効量が、鼻腔内に投与される１つ以上の改変された微生物を含む、請求項１に記載の方法。
31. 治療的または予防的有効量の改変された微生物、および薬学的に許容し得る担体を含み、肺疾病の処置または予防のために処方される、医薬組成物。
32. 肺における局所沈着のために処方される、請求項３１に記載の医薬組成物。
33. 副鼻腔（sinus cavity）中への放出のために処方されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
34. 治療的または予防的に有効な用量の請求項３１～３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、剤形。
35. 乾燥粉末または溶液の形態である、請求項３４に記載の剤形。
36. 請求項３５に記載の剤形、および肺疾病の処置または予防方法における使用のための指示を含む、キット。

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