JP2021505197A - 微生物感染を防ぐための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年12月4日にPCT国際特許出願として出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2017年12月5日に出願された米国仮出願第62/594,943号の優先権の権益を主張する。
本出願は、2018年12月3日に作成され、128,065キロバイト(KB)のサイズを有する「配列表」という名称のtxtファイルとしての電子フォーマットの配列表を含む。txtファイル「配列表」の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
20世紀初頭以来、すべての病原菌の最も致命的なものとして分類されており、毎年米国の病院の約50万人の患者が、主にStaphylococcus aureusによるブドウ球菌感染症に罹っている。米国では毎年最大50,000人の死者がStaphylococcus aureus感染症と関連している。Staphylococcus aureusは、健康な人の40〜44%の皮膚または鼻孔内に存在する。Staphylococcus aureusは、口、胃腸、泌尿生殖器、および上気道にも見られることがある。いくつかの研究は、より高い定着率を示している。たとえば、Eriksenらは、有病率を増加させる一時的または断続的な保菌者の割合が高く、75%を超えることもあると主張している。
BioPlx−01WT(登録商標)と呼ばれるStaphylococcus aureus 502a WT株が実施例1で使用されており、比較的非感染性であることが知られている天然の「野生型」生物であり、既知の副作用はない。BioPlx臨床試験では、この意図されたアプリケーションで非常に効果的であることが示されている(MRSAの再発を防ぐために必要な微生物学的ニッチを占有してブロックする)。
Staphylococcus aureus感染症は、病院と地域の健康環境の両方で深刻な問題である。メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)は、他のStaphylococcus aureus株とは遺伝的に異なり、抗生物質メチシリン、および通常Staphylococcus aureus感染症の治療に使用される他の(通常はベータ−ラクタム)抗生物質に対する耐性を与える遺伝的要素を有する。MRSA株は、MRSA株が代替ペニシリン結合タンパク質(PBP2A)を生成できるようにするmecA発現カセットを担持しており、耐性を付与するのはこの変異である。この耐性のために、MRSAは治療が困難であり、多くの場合生命を脅かす問題となっている。MRSAは、病院またはその他の種類の医療施設で頻繁に感染している(Hospital Associated [HA])。これらの感染症は、通常、手術、静脈内カテーテル法、挿管、または人工関節留置などの侵襲的処置時に発生する。地域社会関連(CA)MRSAは通常、皮膚と皮膚の接触により感染し、最初の症状は皮膚の大きな炎症性の腫物となる傾向がある。
別の適応症は「再発性侵襲性MRSAの予防」である。侵襲性MRSA感染のエピソードを既に経験している患者は、その後の侵襲性MRSA感染に対する感受性が非常に高くなる。本明細書で提供されるBioPlx技術は、通常は病原性形態のMRSAによって占有される可能性があるマイクロバイオームのニッチを占有することによって機能する。
バリアントMRSAを含むSAは、すべての人類の少なくとも40%の皮膚と粘膜の表面に無害な共存状態で存在する可能性があるため、細菌自体は疾患を説明するものではなく、むしろ、その臨床症状は明確である。
この疾患の明確な定義は、2005年から米国でこの状態を積極的にモニターしているため、疾病管理予防センター(CDC)によって発表されている。機関は、新興感染症プログラム(EIP)を介して積極的細菌コアサーベイランスシステムを利用してこのモニタリングを実行する。この文脈での症例は、通常は無菌の身体部位からのMRSAの分離によって定義される。通常は無菌の部位には、血液、脳脊髄液、胸膜液、心膜液、腹膜液、関節/滑液、骨、体内部位(リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、もしくは卵巣)、または他の通常は無菌の部位が含まれる。
BioPlx非再発法の対象となる希少疾患集団は、以前にMRSA(感受性が高いことが知られている集団)に侵襲的に感染(全身感染)し、MRSAによる再コロニー化が進行し続けている人々の群である。CDCは、侵襲性MRSA感染のすべての米国のケースをモニターする。複数の研究者がこの医学的に異なる集団である侵襲性MRSA感染の1つの定義されたエピソードに既に苦しんでいる患者について述べている。この群は、それらの実証された感受性とそれらの継続的なコロニー化の結果として、生命を脅かす侵襲性疾患のリスクが高まっている。
1)粘膜および真皮のマイクロバイオームからのMRSAの脱コロニー化、および
2)合成Staphylococcus aureus(例えば、BioPlx01株)によるこれらのマイクロバイオームの再コロニー化。合成Staphylococcus aureus(例えば、BioPlx01株)が特定のニッチを占有し、MRSA再コロニー化をブロック/防止(再発をブロック)するため、この方法は、細菌の干渉の影響を通じて、標的真皮/粘膜のマイクロバイオーム生態系内のニッチダイナミクスを通じて機能する。この方法の有効性は、本明細書に提供されている原理の証明研究で明確に示されている。
MRSAは1961年に英国の科学者によって同定され、最初の米国の臨床症例は1968年に記録された。次の25年間、MRSAは主に発生率が増加している風土病の病院ベースの問題と見なされていたが、1990年代半ばから後期にかけて、地域社会に関連したMRSAの発生率の増加は主に表在性皮膚と軟部組織の感染においてもっとも発現しているのが見られた。学界にとって最大の関心事は、MRSAによって引き起こされる侵襲性感染の増加である。侵襲性MRSA疾患の発生率の増加傾向は1990年代を通じて見られ、2005年にピークに達した。
Staphylococcus aureusによって媒介されるMRSA侵襲性細菌感染症は、一般的または文献では、MRSA菌血症または敗血症、全身性MRSA感染症、MRSA血流感染症、侵襲性MRSA感染症とも呼ばれる。特定のMRSA誘発全身状態は、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎、心内膜炎、菌血症、トキシックショック症候群から敗血症性ショックまでの範囲である。ハイリスク集団における侵襲性MRSA疾患の再発を予防または低減する方法の開発は、望ましくない株のコロニー化を永続的に妨害するメカニズムを通じて、侵襲性MRSA感染に通常必要とされる状態の予防において大きな進歩となり、これらの患者がその後の侵襲性MRSA感染に苦しむ可能性を低減するであろう。
非共コロニー化(「細菌置き換え」とも呼ばれる)の原則では、1つの種の1つのバリアント/株のみが、いつでもバイオーム内の任意の特定のニッチを占有することができるとされている。
ある大規模な研究では、2年間までの長期間追跡した英国のオックスフォードシャー州の健康な患者から採取されたStaphylococcus aureusの陽性試料3,197例における共コロニー化の有病率を調べた。鼻孔の試料に黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの複数の株が存在する点有病率は3.4〜5.8%であった。Votintseva et al.,2014 J Clin Microbiol,52(4):1192−1200.2年間ほぼ2か月ごとにスワブを提出したStaphylococcus aureus保菌者のうち、11%が一過性の共保菌を有していた。研究では、低コロニー形成株を見つけるための高感度の手順を可能にする効果的なスパタイピングプロトコルを使用した。このデータセットの解釈は、Staphylococcus aureusのコロニー形成が、時間の経過とともに同じニッチの存在を争う有病率が低い複数のStaphylococcus aureus株との動的プロセスであることを示している。簡単な計算により、観察された結果が単に非特定のニッチの独立した占有ではないことが確認できる。この例では、1000人の患者がスクリーニングされ、360人がStaphylococcus aureus陽性であることが判明した。非特定のニッチシナリオでは、.36×.36、または13%(130人)は、共コロニー化を示すと予想される。しかしながら、その主要な時点で360保菌者(14人)のわずか3.9%が実際に共コロニー化し、Staphylococcus aureusのマイクロバイオームニッチの株特異性を示した。
対象における病原性微生物感染の再発を永続的かつ安全に防止するための方法および組成物が提供され、病原性微生物の抑制、病原体微生物を永続的に排除するために同じニッチを占有することができる合成微生物による置き換え、およびニッチ内の永続的な常在のための合成微生物の促進を含む。この方法は、上述のように、BioPlx(登録商標)法と呼ばれる。いくつかの実施形態では、対象は、抑制ステップの前に病原性微生物がコロニー化していることが判明している。
皮膚のマイクロバイオームは、動的であるが永続的な構造を有する−たとえば、大量の細胞死(例えば、洗浄、エタノールの使用、手指消毒剤など)の条件下でも、バイオームは同様の形で再生する。
ヒトのマイクロバイオームは、回復力の質を有し、これは、穏やかな混乱が、種の混合と濃度の以前に確立されたベースラインに向かって再補正する傾向があることを意味する。しかしながら、各ニッチのメンバーは、急性の外部破壊イベント(すなわち、抗菌薬や消毒剤の使用)の結果として、または遅い競争者の置き換えとして、その安定した混合物の中で自分の場所に挑戦することができる。
対象における望ましくない微生物の病原性感染の再発を防止または低減するための方法であって、(i)対象の少なくとも1つの部位で望ましくない微生物を抑制(脱コロニー化)し、その部位から望ましくない微生物の存在を低減または排除するステップと、(ii)望ましくない微生物と同じ属および種を有する合成の第2の微生物を少なくとも1つの部位で対象に投与することによって、望ましくない微生物を置き換えるステップと、を含む方法が提供される。任意選択的に、方法は、(iii)例えば、投与部位での合成微生物のコロニー化を促進することをさらに含む。
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も含むことを意図している。
例えば、キルスイッチを含む合成微生物において、誘導可能な第1のプロモーターは、血液、血清、血漿、および/またはヘムの存在によって活性化され得、作動可能に結合する細胞死遺伝子の上方制御および転写/発現は、微生物の細胞死または微生物の増殖の停止により、合成微生物の安全性を向上させる。
また、ポリヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのようなベクターで形質転換された標的細胞も本明細書に記載されている。本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子は、目的の増殖宿主に対する、選択マーカーおよび複製起点を含むベクターに結合され得る。標的細胞は、これらのベクターを含むように遺伝子操作され、それによりRNAを転写し、ポリペプチドを発現する。本明細書のベクターは、微生物標的細胞のものなどの適切な転写または翻訳の調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。本明細書に記載のヌクレオチド配列は、本明細書の調節配列が、例えば、ポリヌクレオチドをコードする細胞死遺伝子に作動可能に結合する場合、作動可能に連結される。
標的微生物は、望ましくない微生物と同じ種の抗生物質感受性微生物であり得る。一実施形態では、望ましくない微生物はMRSA株であり、置き換え標的微生物は抗生物質感受性のStaphylococcus aureus株である。抗生物質感受性微生物は、Staphylococcus aureus株502a(「502a」)であり得る。502aは、コアグラーゼ陽性、ペニシリン感受性、非ペニシリナーゼ産生ブドウ球菌で、通常はファージ7、47、53、54、および77によって溶解される。血清型(b)ci。この株502aはテトラサイクリン(5μgに耐性があるが、10μgのテトラサイクリンに感受性がある)を除くほとんどの抗生物質の低濃度に感受性があるため、異常なディスク抗生物質感受性パターンが502aによって示される。いくつかの実施形態では、502a株は、Staphylococcus aureus亜種Aureus Rosenbach ATCC(登録商標)27217(商標)として商業的に購入され得る。
標的微生物の選択は、本明細書に記載されるように、標的微生物を脱コロニー化し、推定標的微生物で置き換えることにより行われ得る。たとえば、望ましくない微生物であるメチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)は、世界中で不均衡な量の侵襲性細菌感染の原因である。Staphylococcus aureusのコロニー形成状態は、ほとんどの侵襲性感染に必要な前提条件とみなされる。しかしながら、MRSAのコロニー化と感染を軽減する方法として、標準的な消毒レジメンによる脱コロニー化が検討されており、結果はまちまちである。本明細書で提供される一例では、候補の標的微生物として異なるStaphylococcus aureus株による意図的な再コロニー化を使用することによる望ましくない微生物MRSAに対する新規の脱コロニー化アプローチの実現可能性と永続性が、効果の持続時間と標準的な脱コロニー化の改善を期待して行われた。実施例1は、合計765人の健康な志願者がStaphylococcus aureusコロニー化についてスクリーニングされた研究を開示している。スクリーニングを受けた集団の全体的なMRSA率は8.5%であった。53人のMRSAコロニー形成個体のコホートが、Staphylococcus aureus 502a WT株BioPlx−01と標準の脱コロニー化のみの対照群を使用した脱コロニー化/再コロニー化療法の対照研究に参加した。コロニー化状態からのMRSA不在の期間、および意図的なMSSA再コロニー化の持続を6か月間モニターした。MRSA脱コロニー化プロトコルの有効性部分の対照群(n=15)は、4週間の時点で60%のMRSA再発を示した。BioPlx−01WTププロトコルを使用した試験群(n=34)は、8週間の主要評価項目で0%のMRSA再発を示し、26週間までMRSA再発の証拠を示さなかった。代わりに、これらの参加者は、MSSAによるコロニー化の驚くべき持続性を示し、Staphylococcus aureus 502a BioPlx−01WT菌株製品による26週間までのコロニー化の継続を示している可能性がある。さらに、脱コロニー化/再コロニー化療法で使用されるリン酸緩衝生理食塩水組成物中のBioPlx−01WTのコンポーネントは、55人の参加者の別のコホートで皮膚刺激の証拠を示さなかった。したがって、標的株Staphylococcus aureus 502a BioPlx−01WTの脱コロニー化/再コロニー化プロトコルは、標準的な脱コロニー化よりもMRSA株からの脱コロニー化の耐久性が長く、皮膚への悪影響は観察されなかった。
微生物の属、種、および株の検出可能な存在を決定するために、当該技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。方法の概要は、Aguilera−Arreola MG.Identification and Typing Methods for the Study of Bacterial Infections: a Brief Review and Mycobacterial as Case of Study.Arch Clin Microbiol.2015,7:1に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
望ましくない微生物は、消毒剤、防腐剤、または殺生物性組成物を対象の皮膚または粘膜に直接局所的に適用することにより、例えば、消毒剤、防腐剤、または殺生物剤組成物で対象の患部、任意選択的に患部と隣接領域、または外部もしくは粘膜表面領域の25%、50%、75%、もしくは90%を超える領域を、スプレー、浸漬、またはコーティングすることにより、抑制または脱コロニー化することができる。いくつかの実施形態では、患部、または追加の表面領域は、空気乾燥させるか、穏やかな熱の下でエアドライヤーで乾燥させるか、または対象に衣服を着せるか包帯をする前に紫外線または日光にさらすようにさせる。一実施形態では、抑制は、対象の患部、および任意選択的に1つ以上の隣接または遠位領域を紫外線で露光することを含む。様々な実施形態では、一般的に使用される任意の消毒剤、防腐剤、または殺生物性組成物を使用することができる。一実施形態では、クロルヘキシジンまたはその薬学的に許容される塩を含む消毒剤が使用される。
望ましくない微生物が永続的に合成微生物で置き換えられる方法が提供される。合成微生物は、病原微生物と同じ生態学的ニッチを満たす能力を有し、および/または病原微生物と同じ種、異なる株であり得る。同じ種、異なる株(または同じ株)を使用することにより、病原性微生物の環境ニッチは、良性の合成微生物で満たされるか、永続的に置き換えられる。
いくつかの実施形態では、望ましくない病原性微生物は合成微生物で置き換えられる。例えば、置き換え株は、望ましくないまたは病原性微生物と同じ種、または望ましくないまたは病原性微生物と同じ株の、分子改変された株である合成微生物であり得る。
特定の実施形態では、病原性微生物は抗菌剤耐性微生物であり、置き換え微生物は病原性微生物と同じ種の合成微生物である。合成微生物は、分子改変された抗生物質感受性微生物であってもよい。
(i)(ii)に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、(ii)合成微生物の環境における状態の変化によって誘導される第1の誘導性プロモーターを含む第1の調節領域とを含む、少なくとも1つの分子改変(例えば、キルスイッチ)を含む組換えヌクレオチドを含む合成微生物が提供される。合成微生物は、(iii)第1の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子であって、ここで抗毒素遺伝子は(iv)に作動可能に結合する、抗毒素遺伝子と、(iv)真皮もしくは粘膜のコロニー形成時または培地中で活性(例えば、構成的)であり、好ましくは、合成微生物の環境の状態の変化によって下方制御される、第2のプロモーターを含む第2の調節領域とを含む、少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)をさらに含み得る。
(i)(ii)に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、(ii)血液、血清、または血漿に応答して条件付きで組換えヌクレオチドの、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100の基礎生産性の増加の高レベル遺伝子発現を示す第1の誘導性プロモーターを含む第1の調節領域と、を含む少なくとも1つの分子改変(例えば、キルスイッチ)を含む組換えヌクレオチドを含み得る合成微生物が提供される。
本明細書に記載されるように、合成微生物は、誘導性の第1のプロモーターに作動可能に結合する細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変を含み得る。細胞死遺伝子は、過剰発現すると、誘導の所定の期間内、好ましくは15分、30分、60分、90分、120分、240分、または360分以内に、合成微生物の細胞死または増殖の大幅な減少をもたらす任意の遺伝子から選択され得る。
1つのKSで合成微生物に望ましい特性を持たせるには十分であり得るが、1つを超えるKSによって次のようにして株をさらに強化することができる:i)KSを不活性化する変異の割合を劇的に減少させる、ii)細胞を1つを超える経路で殺傷し、より速い細胞死を引き起こし得る(生成物強化特性)。細胞死遺伝子は、以下に示されるプロモーターの下流の1つ以上のDNA配列(7)を含み得る。塩基対番号は、pCN51ベクターの位置に対応している。
(i)(ii)に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、(ii)血液または血清への曝露によって誘導される第1の誘導性プロモーターを含む第1の調節領域とを含む、キルスイッチ分子改変を含む合成微生物が提供される。合成微生物が対象の真皮または粘膜ニッチを永続的に占有するために、血液または血清がない場合、キルスイッチはサイレント(発現されない)であるべきことが好ましい。
合成微生物でキルスイッチのような表現型を作成する別の方法は、血液での生存および/または臓器の感染に必要であるが培地または皮膚上の増殖に必要(または重要)ではない1つ以上の遺伝子を破壊する(「ノックアウト」)ことである。いくつかの実施形態では、表5に示される6つの遺伝子のうちの1つ以上、または2つ以上が、KO法において使用され得る。
キルスイッチを含む合成微生物が提供される。本明細書に記載されるように、キルスイッチは、誘導性プロモーターを含む調節領域(RR)に作動可能に連結された細胞死遺伝子を含む。
合成微生物は発現クランプを含み得る。ヒト鼻孔のStaphylococcus aureusのコロニー形成に関与する遺伝子を表7に示す。これらは、合成株が皮膚または粘膜環境にコロニー形成されたときに漏洩毒素の発現をブロックする抗毒素遺伝子をさらに含む発現クランプで使用する2番目のプロモーターとして使用できる。第2のプロモーターは、ハウスキーピング遺伝子などの構成的プロモーターであり得る。第二のプロモーターは、好ましくは、血液または血清の存在下で下方制御され得る。
細胞死誘導の評価のための方法が提供され、遺伝子をE.coli−SAシャトルベクターにクローニングすることと、評価のためにこのベクターをBioPlx−01にトランスフェクトすることとを含む合成微生物の組換え構築が含まれる。
PCN51(BEI経由で入手可能)などの市販のシャトルベクターが得られる。これには次のものが含まれているため、優れた選択肢の1つである:i)毒素が発現して機能していることを証明するために陽性対照株で使用できるカドミウム誘導プロモーター、ii)我々のすべてのコンストラクトに適用される汎用の転写終結因子(TT)、iii)E.coliとStaphylococcus aureusの確立されたレプリコン。市販のシャトルベクターpCN51(BEIカタログ番号NR−46149)の概略図を図2に示す。pCN51シャトルプラスミドの遺伝的要素を表8に示す。
候補の血清応答性RRのシャトルベクター(E.coli宿主)へのクローニングには、次のものが含まれる:(a)BioPlx−01ゲノムDNA(gDNA)からの2つの好ましい血清応答性RRのPCR増幅、(b)カドミウム誘導性プロモーターをpCN51のこれらのRRフラグメントで置き換えて、2つの新しいプラスミド(RR1およびRR2)を作成する、(3)E.coli DH10B(またはDH5α)でクローンを選択し、挿入のシーケンシングを行う。
1.CD誘導性プロモーター−sprA1
2.Cd誘導性プロモーター逆方向sprA1
3.血清応答性RR1−sprA1
4.血清応答性RR1逆方向sprA1
5.血清応答性RR1−sprA1+PclfB−sprA1AS
6.血清応答性RR2−sprA1
7.血清応答性RR1−rsaE
8.血清応答性RR1−rsaE−逆方向
9.血清応答性RR2−rsaE
10.血清応答性RR1−kpnI
11.血清応答性RR1−kpnI逆方向
12.血清応答性RR2−kpnI
細胞死遺伝子が増殖培地中でさえいくつかの基礎毒性を有する場合、順方向コンストラクトを得ることができない可能性があるため、逆方向コンストラクトがこのプロセスで作成される。このような否定的な結果は、逆方向のコンストラクトが並列して簡単に得られない限り、決定的なものではない。
A.RN4220にエレクトロポレーションする、
B.エリスロマイシンを含むプレートで形質転換体を選択する、
C.プラスミドIDを単離し、制限消化で確認する。
A.ステップ3CからのプラスミドをコンピテントなBioPlx−01にエレクトロポレートする、
B.エリスロマイシン耐性によって形質転換体を選択する、
C.プラスミドIDを単離し、制限酵素消化で確認する、9株のストックを保存する。
A.血中/血清中の曝露前後のリアルタイムPCRによるキル遺伝子の発現の定性的試験。これにより、i)株構築を確認する、ii)毒素産生の開始と死亡の開始を相関させる、iii)KSの文脈でプロモーターの「漏出性」を判定する。
B.TSBと比較した血清/血液中の細胞死誘導曲線(殺傷の程度とCFUによる動態);そして
C.空のベクターを含むBioPlx−01とKSプラスミドを使用したBioPlx−01の単純な増殖率の比較。
連続継代により、血清または血液寒天プレート上および/または血清含有液体培地で数百世代にわたって増殖するコロニーを計数する。変異率が許容できるかどうかを判断する。KS機能の喪失率は、KS遺伝子の1コピーでは10-6であるが、2つの異なるプロモーターからの同じまたは異なるKS遺伝子の2コピーでは10-10と低いことが報告されている(Knudsen 1995;実際の変異率のアッセイ測定)。
最良のKS株(複数可)は、増殖率(およびコロニー形成の能力)に影響を与えない株である。そして、それは血液および/または血清に応答して急速かつ完全な死を示す。そしてそれは安定した分子改変を有する。
1つのKSの分子安定性が不十分とみなされた場合、9つの候補のリストから2番目の異なる機能的なKS(別の機能的なものが存在する場合)がプラスミドに追加され、殺傷と安定性の再試験が行われる。KS安定性の劇的な改善は、Knudsen 1995および理論計算に基づいて予想される。
最適な血清/血液応答性KSコンストラクト(複数可)は、特に細胞の生物学を変化させることなく挿入を許容することが知られている事前に選択された場所で正確に染色体に組み込まれる。
最適な組み込みベクターを注意深く検討した後、プラスミドpKOR1またはpIMAYを使用できる。これらは、組み込み部位を選択する機能を提供するため、他の方法で発生する可能性があるゲノムの生物学的に重要な領域の混乱を回避できるためである。両方のベクターは、逆選択のための便利な手段(secY)を備えているため、KSが組み込まれた後、プラスミドバックボーンとそのマーカーをゲノムから削除できる。pKOR1の遺伝地図を図5Aに示し、特徴はBae et al.2006 Plasmid 55,pp.58−63に記載されており、表9に簡単に記載されている。pKORの利点は、特定の制限酵素の制限なしにインサートをクローニングできる能力である。
BioPlx−01は、アンピシリン(50μg/mLおよび100μg/mL)、クロラムフェニコール(10μg/mL)、およびエリスロマイシンに感受性である(Drury 1965)。一実施形態では、クロラムフェニコール(cat+)遺伝子を使用して、組み込みプロセス中にクロラムフェニコールプレート上の形質転換体を選択する。
次のエレメントをタンデムに含むシャトルベクターpTK1でプラスミドを調製する:[aTTB2]−[置き換える標的領域の上流の1Kbの配列]−[KSカセット−AmpR]−[標的領域の下流の1Kbの配列]Bae et al.,2006の改変によるATTB1。制限酵素でこのプラスミドからフラグメントを削除し、それを単離する。「KSカセット」は、実際にはKSの1つまたは2つのコピーであってよいが、遺伝的安定性試験の結果は保留されている。
プラスミドPKOR1を使用してステップ3のフラグメントのin vitro組換えを行い、組換え混合物をDH5αにトランスフェクトし、制限マッピングを使用してE.coliで標準的なスクリーニング方法により目的のプラスミドコンストラクトを取得し、構築を確認する。
RN4220にプラスミドをエレクトロポレーションする。このようにトランスフェクトされたRN4220からプラスミドDNAを単離し、このDNAをBioPlx−01にエレクトロポレーションし、クロラムフェニコール(10μg/mL)を含むTSAプレートで形質転換体を選択する。
菌を非許容温度(43℃)に移行して、標的部位へのプラスミド組み込みを促進し、クロラムフェニコールプレート(10μg/mL)でコロニーを選択する。
許容温度(30℃)でステップ6からのコロニー分離株を増殖させ、プラスミドの切除を促進し、2μg/mLおよび3μg/mLのアンヒドロテトラサイクリン(aTc)寒天上に播種して、標的遺伝子が組み込まれ、プラスミドが削除および失われたコロニーを取得する(逆選択ステップ)。2μg/mL以上のaTcを含むプレートで増殖する任意のコロニーにはプラスミドが含まれていない。これは、プラスミドバックボーンが致命的なaTc抑制解除可能なSecYアンチセンス遺伝子が含まれているためである。
KS株からゲノムDNAを単離し、ノックインカセットと隣接構造をPCR(およびPCRアンプリコンのシーケンシング)で確認する。
確認したら、まずTSB中で細胞を増殖させ、次にヒトの血液または血清に移行して、TSA中でのCFUプレーティングアッセイにより死亡率を決定することにより、細胞死率アッセイを実施する(10日間)。
血液、血清、TSB中における標的遺伝子の発現変化を確認する。
これらの方法で作成された合成微生物BioPlx−XXによって動物実験を行うことができる。キルスイッチ株機能を試験するためのIn vivo機能研究が行うことができる。可能な研究には、wt BioPlx−01対KS株の静脈内または腹腔内注射の病原性の違いを示すためのマウス研究が含まれる。in vitro皮膚コロニー化試験も行わうことができる。マウスでの追加の試験には、LD50試験が含まれ、BioPlx−01対BioPlx−XXが行われる。別の例として、ラットまたはその他の:コロニー形成試験では、BioPlx−01対BioPlx−XXが行われる。
いくつかの実施形態では、BioPlx−01から合成Staphylococcus aureus株を調製する方法が提供され、CRISPR−Cas誘導相同組換え修復を使用して、長期安定発現のための最適なKS候補の直接挿入を含む。いくつかの実施形態では、BioPlx−01から合成黄色ブドウ球菌株を調製する方法であって、(1)コンピテントセルを取得することと、(2)CRISPRガイドRNA(gRNA)配列の設計および試験を行うこと、および同時にpCasSAを試験することと、(3)構成的レポーターによって制御される蛍光レポーターを使用して相同性依存修復テンプレートを設計および試験することと、(4)蛍光レポーターでKSプロモーターを確認することと、(5)KSをBioPlx−01に挿入して組み込みを検証することと、(6)有効性と寿命を試験することと、を含む、方法が提供される。任意選択的に、追加のKSカセットをBioPlx−01ゲノム内の別の場所に挿入することも行われる。
いくつかの実施形態では、合成微生物と、賦形剤または担体と、を含む組成物が提供される。組成物は、適切な担体マトリックス内で、経口、静脈内、口腔内、経鼻、粘膜、真皮または他の方法を含む、それらの特定の免疫原性または生物学的または免疫学的反応特性に適した任意の方法で投与できる。一実施形態では、組成物は、対象の真皮部位および/または粘膜部位への局所投与のために提供される。別の特定の実施形態は、本開示の組成物の経口投与を含む。
合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、緩衝剤、増粘剤、湿潤剤、または吸収剤と、を含む組成物が提供される。
上述の組成物または合成微生物のいずれも、キットの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、生菌を収容する容器または凍結乾燥生菌を収容する容器を含む。キットには、培地を含む第2の容器を含めることができる。キットはまた、1つ以上の脱コロニー化剤を含み得る。キットはまた、組成物を投与するための説明書を含み得る。特定の実施形態では、細菌株を組成物の他の成分と混合するための説明書が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、微生物組成物を対象に適用するためのアプリケーターをさらに含む。
特定の実施形態では、組成物は、溶液組成物である局所投与のために、または溶液組成物への再構成のために提供される。一実施形態では、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの水溶液中の、約1×105〜1×1012cfu/ml、1×106〜1×1010cfu/ml、または1.2×107〜1.2×109CFU/mLの合成微生物を含み得る。対象の予備的な刺激試験には、より低い用量を使用することができる。
いくつかの実施形態では、マイクロバイオーム(ナノファクトリー)の部位で所望の物質の生成を生み出す方法が提供される。ナノファクトリー分子改変を含み得る合成微生物が提供される。「ナノファクトリー」という用語は、生成物−タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸もしくは核酸などの一次生成物、または有益な効果をもたらす小分子などの二次生成物のいずれか−の生成をもたらす標的微生物の分子改変を指す。生成物は合成微生物から分泌されてもよいし、封入体の形態であってもよい。そのようなナノファクトリー細菌株は、以下を含む幅広い永続的な利点を宿主対象に提供する可能性がある:(i)宿主が以前に欠損していた細胞産物および酵素の取得、(ii)多様な治療的および予防的利益のための微生物学的に製造された小分子、ポリペプチド、またはタンパク質医薬品の送達システムの取得。本明細書に記載されるように、バイオームに永続的に組み込まれる場合、そのようなナノファクトリー細菌株は、直接の生成物適用よりも、生成物の有用な永続的な代替定常状態生産を提供するであろう。
いくつかの実施形態では、既存のコロニー形成を、望ましくない病原性または抗生物質耐性遺伝子の遺伝的移入を受け入れることができない合成細菌株で置き換える方法が提供される。「病原性ブロック」または「Vブロック」を含み得る合成微生物が提供される。「病原性ブロック」または「Vブロック」という用語は、微生物が他の株または種から外来DNAを受け入れる能力が低下し、外因性の病原性または抗生物質耐性遺伝子を獲得する能力が低下した微生物を効果的にもたらす微生物の分子改変を指す。
そのような「病原性ブロック」操作株は、脱コロニー化イベントの後にマイクロバイオームに組み込むことができ、競争排除のプロセスを通じて、望ましくない病原性または抗生物質耐性特性を再取得することなく、その特定のニッチ内の主要株としてしばらく留まることができる。マイクロバイオーム内の潜在的な病原体に対して実行されるそのような概念は、水平伝播方式で病原性も抗菌耐性遺伝子も獲得できない安定したマイクロバイオームをもたらし、マイクロバイオームの全体をより堅牢にして変換可能性を低下させる。
この同じ技術は、細菌細胞に脅威を与えないDNA配列を標的とするように操作できるが、いったん取得すると、生物は疾患を引き起こし、以前は居住性が低かった環境で存続することができる。Cas−9酵素をゲノムに統合するか、可能であれば内因性のCas−9を利用して、抗生物質耐性遺伝子を標的とする構成的に発現したガイドRNAをゲノムに導入することが可能である。標的遺伝子が遺伝子水平伝播などによって細胞に導入されると、入ってくるDNAが切断され、ゲノムに組み込まれたい、機能的なペプチドを生成したりできなくなる。CRISPR−Casシステムが標的とする前に遺伝子がゲノムに組み込まれた場合、操作されたCRISPR−Casシステムはそれをゲノムで見つけ、標的化された場所で配列を切断し、生存不能な細胞を作り、抗生物質耐性カセットの拡散を停止する。
臨床研究−抑制および置き換え
臨床研究は、MRSA陽性の対象を特定し、MRSA株を抑制し、Bioplx−01(すなわち、MSSA 502a)を投与してMRSAを置き換え、対象のMRSA再発を定期的に再検査するように設計された。研究集団は、主にメーラト地域の医療関係者と医学生から集められた。症状のある対象はこの研究に登録されていない。
1)一般集団における無症候性Staphylococcus aureusとMRSAの発生率を決定する−Meerut、UP(北インド)−この研究のさらなる段階のために参加者を適格とする。
2)BioPlx脱コロニー化された参加者におけるMRSA再発率を決定する。
3)BioPlx01−WT再コロニー形成された参加者のMRSA再発率を決定する。
4)MRSA再発の防止におけるBioPlx01−WTの永続性を決定する(8および12週間まで);
5)許容される研究の再発レベル=40%、目標の再発レベル=20%。
脱コロニー化
最初に、参加者に対して完全な脱コロニー化が行われる。以下は、主要な部位におけるMRSA根絶の確認である。全身の脱コロニー化はクロルヘキシジンで行われ、鼻の脱コロニー化はムピロシンで行われ、「脱コロニー化プロトコル」のセクションにある通りにリステリンオリジナルの防腐剤でうがいされる。脱コロニー化手順の全過程(5日間)の後、確認MRSA試験が実施され、主要な領域にMRSAが存在しないことを確認し、Staphylococcus aureus試験が実施され、コロニー化後のStaphylococcus aureusレベルに関する情報を収集する。参加者は5日間の脱コロニー化プロセスを経、それは研究担当者によって管理され、観察された。皮膚の脱コロニー化は研究担当者によって行われ、1日1回、5日間以上の(1)クロルヘキサジンの全身スプレー塗布(4%)、(2)ムプリオシンによる鼻(粘膜)脱コロニー化(2%)、および(3)リステリンの適用による喉(粘膜)脱コロニー化が含まれる。参加者は、5日間の脱コロニー化プロセスを経、BioPlx Pvt Ltdのスタッフによって管理および監視される。
皮膚−クロルヘキサジン
鼻(粘膜)−ムプリオシン
喉(粘膜)−リステリン
脱コロニー化/再コロニー化後MRSA再発:0、群1=0、群2=0、群3=0。脱コロニー化後のMRSA陰性期間:18週間=16例:0再発; 17週間=18例:0再発。
有効性試験の対象は、ペニシリナーゼディスクを使用する置き換え用BioPlx 01 WTの存在を検出するために、Staphylococcus aureus陽性結果について試験された。結果を表11に示す。
上述のように、MRSA陽性の参加者は、試験監督者(Garg博士)によって有効性試験の対象として選択された。Staphylococcus aureus陽性の参加者は、研究監督者によって刺激研究のために選ばれた。MRSA患者はスクリーニングに多くの労力を必要とするため、研究の主な有効性評価のためにそれらを保存する試みが行われた。MRSA以外の陽性コロニー形成率は、スクリーニングされた全参加者の約33%〜66%であるため、より豊富な供給があった。MRSAはStaphylococcus aureusの抗生物質耐性株であるため、Staphylococcus aureus陽性の参加者に対する刺激試験は、MRSA陽性の参加者に対する刺激試験と同等である。
有効性研究では、水に溶解して100mMリン酸緩衝液、2.7mM KClおよび137mM NaCl、pH7.4を25℃で提供するPBS(Fisher)BP2944100リン酸緩衝生理食塩水錠剤中のBioPlx−01(1.2×108CFU/mL)を使用した。
8×109CFU/mLの濃縮BioPlx−01ストックの10mLアリコートを完全に解凍し、完全に1分間振とうして混合した。この溶液8.5mLを無菌(室温)PBS275mLに加え、2.4×108CFU/mLのストックを生成した。これを転倒混和し、使用するまで4℃で保存した。有効性研究で使用されているように、PBSマトリックス1.2×108ワーキングソリューション−BioPlx−01を提供するために、「2.4×108CFU/mL」溶液のバイアルを激しく転倒混和し、その200mLを200mL PBSに加えて「1.2×108CFU/mL作業溶液−BioPlx−01」を作成する。この後者の溶液は、有効性研究の対象に適用された材料であった。ボトルにしっかりと蓋をし、振盪して混合し、使用するまで4℃で保管した。
この例では、プロモーター候補が評価された。MSSA株BioPlx−01における6つのプロモーター候補の誘導倍数および基礎発現を、ヒト全血および血清とのインキュベーションにより評価した。発現はハウスキーピング遺伝子(gyrB)に正規化され、液体トリプシン消化大豆ブロス(TSB)培地で対数増殖している細胞のものと比較された。
PhlgAは、血清および血液において高い上方制御を示し、鼻のコロニー形成中に下方制御を示したので、別の好ましいプロモーターとして選択された。Phlgの欠点の1つは、TSBの基礎発現でる。これはhlgAの発現クランプを含めることで対処できる。ペプチドHlgAは、宿主の赤血球と白血球を溶解する、分泌された孔形成毒素のサブユニットである。HlgA(クラスS)はHlgB(クラスF)と会合し、ガンマ溶血素とロイコシジンの両方を産生する株でAB毒素を形成する(HlgAとLukF−PVも複合体を形成できる)。
この実施例では、細胞死遺伝子候補は、第1の誘導性プロモーターを含む第1の調節領域に作動可能に連結された第1の細胞死遺伝子を含む少なくとも1つの分子改変を有する合成微生物を調製するために評価される。死遺伝子の相対的効力は不明である。最良の死遺伝子のように見えるものは、漏出性の発現のため、必ずしも最も強力なものではない。作用機序の多様性により、2つ以上の死遺伝子の組み合わせの相乗効果が失われる可能性がある。死遺伝子の候補には以下が含まれる:SprA1:膜破壊; sma1:ゲノム破壊;およびrsaE:中枢代謝を遮断する。死遺伝子のさまざまな組み合わせを表14に示す。これらのプラスミドは、PleuAおよびPhlgAによって駆動されるKSバリアントを試験するために作成およびシーケンシングされたプラスミドである。
すべてのゲル電気泳動アガロースゲルは、1×TAE緩衝液中1.0〜2.0%アガロースで、製造元の説明書に従ってミドリグリーン(Nippon Genetics Europe GmbH)が追加されている。
1.次のように、pCN51ならびにsprA1、sma1、およびrsaEプラスミドのミニプレップ量を調製する。
A.株をLB+カルベニシリン(100μg/mL)プレートにストリークし、37℃で15〜18時間インキュベートする。
B.LB+カルベニシリン(100μg/mL)の液体にそれぞれ単一のコロニーを接種し、37℃で15〜18時間攪拌(240rpm)しながらインキュベートする。
C.製造元の説明書に従って、Qiagenスピンミニプレップキットで各株の5×複製ミニプレップを調製し、各カラムからDNAを30μLで溶出し、複製プラスミドプレップを一緒にプールする(−20℃でDNAを凍結)。
2.1.PstIとEcoRIでpCN51を切断して直線状にする(37℃、30分)。予想されるサイズは約6400bpである(マルチクローニング部位(MCS)からの35bpフラグメントが脱落/ゲル上で可視化されない)。
2.2.KCN1とBamHIでpCN51プラスミドを切断して、直線状にする(37℃、30分)。予想されるサイズは6400bpである(MCSからの35bpフラグメントが脱落/ゲル上で可視化されない)。
2.3 DNA2.0からのsprA1プラスミドをPst1とEcoRIで切断し、目的の233bp sprA1インサートを遊離させる。
2.4 DNA2.0からのsprA1プラスミドをKpn1とBamHIで切断し、目的の233bp sprA1インサートを遊離させる。
2.5.記載されているように、DNA消化中に電気泳動用の1.5%アガロースゲルであるゲルを注ぐ。
2.6.4つの反応すべてと、1kbプラスDNAサイズラダーに、8μLの6×ローディング色素を添加する(30μLに3μL)。
2.7.100Vで1.5時間ゲルを泳動する。
2.8.清浄なかみそりの刃で上述の目的のバンドを切り抜く。
2.9.Qiagenゲル抽出キットの3倍量の緩衝液QGでスライスを溶解し(56℃)、時々ボルテックスする。
2.10.対のベクターを単離し、1つのカラムに一緒に挿入し、Qiagenの溶出緩衝液30μl中に材料を溶出する。
A.Pst1+EcoRIインサートとpCN51 Pst1/EcoRIベクター。
B.Kpn1+BamHIインサートとpCN51 Kpn1/BamHI。
2.11 発泡スチロールの箱の中で500mLのRT水に氷を加えることにより、ウォーターバスをセットアップする。16℃に達するのに十分な氷を追加する。
2.12.3.4μLの10 XT4 DNAリガーゼ緩衝液を加え、混合する。1μLのT4 DNAリガーゼ(NEBからの4×105U/mLストック)を添加し、16℃で2時間インキュベートする。
2.13 エレクトロポレーションユニットを1500V/200オーム/25μFに設定する。
2.14.2バイアルのDH5α E.coliを解凍し、それぞれに40μLを2つのエッペンドルフチューブに追加する。2エレクトロポレーションキュベットを氷上で冷却する。
2.15.1μLの未希釈ライゲーションを40μLの解凍したDH5α E.coliに添加し、氷冷した1mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。
2.16.準備する:1mLピペットに1mLのSOC培地、無菌1mLチップ、および2つの無菌14mL培養チューブ
2.17.細胞をエレクトロポレーションし(最初にライゲーションA)、次にASAPで1mLのSOCをキュベットに加え、ピペットで6回上下し、全量を新しい14mL培養チューブに移して回収する。ライゲーションBのエレクトロポレーションのためにこのプロセスを繰り返す。2つの回収試料を37℃の振とうウォーターバスに1時間入れる。
2.18.細胞が回復する間、2 LB+カベニシリン(100μg/mL)寒天プレートを37℃のインキュベーター(加湿されていない)で蓋を少し外して逆さにする
2.19.1時間の回復期間後、それに応じてLB+カベニシリン(1050μg/mL)寒天プレートを取り外してラベルを付け、ウォーターバスから14mLチューブを回収する。
2.20.滅菌ガラスビーズを使用して、1mLの各回復混合物150μLをプレートに延展する。
2.21 プレートを37℃のインキュベーターに16〜18時間置く。
2.22.以下ののコロニー数を記録する
ライゲーションA(Pcad::sprA1フォワード)および
ライゲーションB(Pcad::sprA1リバース)。
3.1 スクリーニングする6つのコロニーを選ぶ
3.2 ライゲーションAのコロニー6個とライゲーションBのコロニー6個を、それぞれ14mL培養チューブ内の液体LB+カベニシリン(1050μg/mL)3mLに播種する。
3.3 37℃で16時間振とうする。
3.4 製造元の説明書に従ってQiagenスピンミニキットを使用してプラスミドDNAを単離し、40μLの溶出緩衝液にDNAを溶出する。
3.5 12個のプラスミドDNAをそれぞれ以下の5μLで消化する。
A.PST1+ECOR1
B.Kpn1+BamHI
C.Xmn1のみ
Pst1+EcoRIの場合、7つの反応物を混合する。5μLのDNA溶液を15μLの消化液に添加し、37℃で2時間インキュベートする。Kpn1+BamHIおよびXmn1の消化についても同じようにする。
1.Qiagenの「All prep」キットを使用して、BioPlx−01の対数期培養からgDNAを抽出する。
2.pph1 SprA1をSph1とPst1で消化して、カドミウム誘導性プロモーター(Pcad)を脱落させる。
3.上流にSph1制限配列、下流にPst−1制限配列を含むPCRプライマーを使用して、Bioplx−01 gDNAからのleuA調節領域(PleuA)をPCR増幅する。(以下のTKO1およびTKO3配列、またはバックアップTKO2+TKO4)。前述のようにゲル電気泳動で制限を検証する。
PCR混合物:
BioPlx−01からの1.0μLのgDNA 50ng/μL
25.0μLのdI水
10.0μLの5×HF緩衝液
5.0μLの2mM dTNPミックス
4.0μLのプライマーTKO1(5pmol/μLストック)
4.0μLのTKO3(5pmol/μLストック)
1.0μLのphusionポリメラーゼNEB
_________________________
合計50.0μL
サイクル:
98℃で2分間
20サイクル:98℃15秒−−64℃30秒−−72℃1分
15サイクル:98℃で15秒−−55℃で30秒−−72℃で1分
保持:4℃、無期限
4.上流にSph1制限配列、下流にPst−1制限配列を含むPCRプライマーを使用して、Bioplx−01 gDNAからのhlgA調節領域(PhlgA)をPCR増幅する。(TKO9およびTKO11またはバックアップセットTKO10またはTKO12)。プライマーの同一性を除いて、PCR条件は上記のPleuAと同じである。
5.Qiagen PCRクリーンアップキットを使用して、PCR反応物を清浄化し、43μLの溶出緩衝液に溶出する
6.ステップ3からのPleuAPCR産物とステップ4からのPhlgAPCR産物をSPH1およびPstIで切断する。5μLの10X CutSmart(NEB)とそれぞれ1μLのSph1とPst1を添加し、37℃で2時間インキュベートして、これを行う。
7.Sph1/Pst1でpTK1を消化する。
8.pTK1 Sph/Pst消化物とSph/Pst消化したPleuAとPhlgAを1.5%アガロースゲルで分画し、約6000 pTK1バックボーンとPleuA(390 bp)とPhlgA(253bp)フラグメントを清浄な剃刀の刃で切り出す。
9.pTK1バックボーンスライスを2つに分割し、半分をLeuAスライスと混合し、残りの半分をHlgAスライスと混合する。一緒に溶かし、Qiagenゲル抽出キットを使用して一緒に単離する。それぞれ30uL EBに溶出する。
10.10X T4 DNAリガーゼ緩衝液3.4μLとT4 DNAリガーゼ1μLを添加し、16℃で少なくとも1時間インキュベートする。
11.エレクトロポレーション、回収、およびコロニー播種については、セクション2.13〜2.22の手順に従う。
12.2つのライゲーションは、順方向(pTK3)にPleuA::sprA1 wtおよび順方向(pTK6)にPhlgA::sprA1 wtを生成することを目的とする。
1.gDNA単離キットを使用して、BioPlx−01の対数期培養からgDNAを抽出する。
2.Sph1とPst1でpTK2(センスsprA1)を消化し、Pcadを脱落させる(消化条件については上記を参照されたい)。
3.Sph1/Pst1で消化された上からのPleuAフラグメントをSph1/Pst1で消化されたpTK2に挿入して、PleuA::sprA1 wtを逆方向(pTK4)で生成する。ゲル抽出、ライゲーション、およびエレクトロポレーションプロセスの詳細は、上記のクローニングのセクション2と同じである。
3.1 スクリーニングのために各ライゲーションの6つのコロニーを選ぶ
3.2 6つのpTK3コロニーと6つpTK4と6つのpTK6を、それぞれ14mL培養チューブ内のLB+カベニシリン(100μg/mL)3mLに接種する。
3.3 攪拌しながら16時間(37℃、240rpm)インキュベートする。
3.4 ミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを単離し、40μLの溶出緩衝液でDNAを溶出する。
3.5 次のように18個のプラスミドDNAのそれぞれを5μLで消化する(ピペッティングエラーを考慮して20回の反応に十分な消化反応混合物を調製する)。
A.Sph1+Pst1
B.Xmn1。
5μLのDNAを15μLの消化反応液に添加し、37℃で2時間インキュベートする
3.6 ゲル電気泳動で消化を検証し、
pTK3、pTK4、およびpTK6の予想されるゲルパターンと比較する。
1.上記で調製したBioPlx−01のgDNAを使用する。
2.上流にEcoRI制限配列、下流にBamHI制限配列を持つプライマーを使用して、BioPlx−01ゲノムDNAからclfB RR(PclfB)をPCR増幅する(プライマー:TKO5およびTKO7)
PCR混合液(総容量50μL)
BioPlx−01からの1.0μLのgDNA 50ng/μL
25.0μLのdI水
10.0μLの5×HF緩衝液(NEB)
5.0μLの2mM dTNPミックス
4.0μLのプライマーTKO5(5pmol/μLストック)
4.0μLのTKO7(5pmol/μLストック)
1.0μLのphusionポリメラーゼ(NEB)
サイクル:
98℃で2分間
20サイクル:98℃15秒−−64℃30秒−−72℃1分
15サイクル:98℃で15秒−−55℃で30秒−−72℃で1分
保持:4℃、無期限
3.前述のように、ゲル電気泳動には5μLのPCR反応物を使用する。
4.PCRクリーンアップキットを使用して、PCR反応物を清浄化し、30μLの溶出緩衝液で溶出する。
5.BamH1とEcoR1でPclfBPCR産物を消化し、それをEcoR1/BamH1で消化されたpTK3バックボーンに挿入してpTK5を生成する。このプラスミドには、PleuAによって制御されるsprA1と、PclfBによって制御されるsprA1ASが含まれる。同じPclfBフラグメントを使用して、EcoR1/BamH1で消化したpTK6に挿入して、pTK7を生成する。このプラスミドには、PhlgAによって制御されるsprA1と、PclfBSprA1によって制御されるsprA1ASが含まれる。
ゲル抽出、ライゲーション、およびエレクトロポレーションプロセスの詳細は、上記のクローニングのセクション2と同じである。
3.1 ライゲーションpTK5の6コロニーとライゲーションpTK7の6コロニーを、14mL培養チューブ内のLB+カベニシリン(100μg/mL)3mLに播種する。
3.3 攪拌しながら16時間(37℃、240rpm)インキュベートする。
3.3 ミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを単離し、40μLの溶出緩衝液中にDNAを溶出する。
3.5 12個のプラスミドDNAをそれぞれ以下の5μLで消化する。
A.BamHI + EcoRI
B.Xmn1のみ
メーカーの推奨に従って、BamHI/EcoRIとXmn1で消化反応混合物を調製する。
5μLのプラスミド溶液を15μLの消化反応液に添加し、37℃で2時間インキュベートする。前述のようにゲル電気泳動で消化を検証する。
sma1遺伝子は、上流にPst1制限部位、下流にEcoR1制限部位を有するDNA2.0から注文し、以下への挿入を可能にした。
●Pcad::smaIを作成するためのpCN51はpTK8をもたらす
●Pst1/EcoR1を使用してsprA1を削除したpTK6により、PhlgA−sma1が作成され、pTK9をもたらす
●Pst1/EcoR1でsprA1を削除したpTK3により、PleuA−sma1が作成され、pTK10をもたらす
1.pCN51、pTK6、およびpTK3をPst1およびEcoR1 bysprA1で消化する。37℃で2時間それぞれインキュベートする。
2.Pst1とEcoR1で遺伝子を含む注文されたプラスミドを消化して(37℃で2時間)、sma1フラグメントを生成する。ゲル電気泳動で消化を検証する(予想フラグメントサイズは757bp)。
3.ゲル抽出、ライゲーション、エレクトロポレーション、回復、および抗生物質の選択については、ステップ2.5〜2.22に従う。
3.1 ライゲーションpTK8の6コロニーとライゲーションpTK9の6コロニーとライゲーションpTK10の6コロニーを、14mL培養チューブ内のLB+カベニシリン(100μg/mL)3mLに播種する。
3.3 攪拌しながら16時間(37℃、240rpm)インキュベートする。
3.3 ミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを単離し、40μLの溶出緩衝液中にDNAを溶出する。
3.5 12個のプラスミドDNAをそれぞれ以下の5μLで消化する。
A.Pst1およびEcoRI
B.Sph1およびXcm1
C.Xmn1のみ
前述の制限反応およびゲル電気泳動手順に従う。
rsaE遺伝子は、上流のPst1制限部位と下流のEcoR1制限部位を有するDNA2.0から注文し、次のプラスミドへの挿入を可能にした。
●Pcad−rsaEを作成するためのpCN51はpTK11をもたらす
●Pst1/EcoR1制限によりsprA1が削除されたpTK6により、PhlgA−rsaEが作成され、pTK12をもたらす
●Pst1/EcoR1制限によりsprA1SprA1が削除されたpTK3により、PleuA−rsaEが作成され、pTK13をもたらす
1.前のセクションで説明したように、pCN1、pTK6、およびpTK3をPst1およびEcoRI sprA1で消化する。
2.メーカーの提案に従って、rsaE Pst1およびEcoR1を含む注文したDNAを消化する。
ゲル電気泳動で消化を確認する(rsaEフラグメントは142bpであるはずである)。
3.ゲル単離、ライゲーション、エレクトロポレーション、回復、および抗生物質の選択については、ステップ2.5〜2.22に従う。
ここでは、カドミウム誘導プロモーター(Pcad)、Blaターミネーター、E.coliのアンピシリン耐性、Staphylococcus aureusのエリスロマイシン耐性があるため、pCN51がベクターバックボーンとして採用される。Drutz 1965では、502aは2μg/mLのエリスロマイシンに感受性であることが示された。
1.Kpn1とBamHIでpTK1のインサートを切り出し、Kpn1とBamHIで消化したpCN51に挿入する。これにより、毒素遺伝子のアンチセンス方向が作成され、毒素がカドミウムで誘導されるかどうかにかかわらず、毒素はまったく発現されない。製品はpTK2である。
1.Sph1とPst1でpTK1(センスsprA1)を消化して、Pcadを脱落させる。
2.PCRは、上流Sph1制限部位とPst1下流制限部位を含むPCRプライマーを使用して、502a株からhlgA調節領域(PhlgA)を増幅する。(プライマー:TKO1およびTKO2)
3.PhlgA PCR産物をSph1とPst1で切り出し、それをSph1/Pst1で消化したpTK1に挿入して、順方向にPhlgA::sprA1 wtを生成し、pTK3を生成する。
1.STK1とPst1でpTK2(逆向きsprA1)を消化して、カドミウムプロモーターを脱落させる。
2.同じSph1/Pst1で消化したPhlgA PCR産物を挿入する。これにより、逆方向のSprA1が提供される。
1.プライマーを使用して502a gDNAからPclfBをPCRで増幅し、上流のEcoR1制限部位とBamHIの下流制限部位を生成する。
2.EcoR1とBamHIでpTK3を消化し、EcoR1/BamHIで消化したPclfBを挿入する。
MQGFKEKHQELKKALCQIGLMRSISEVKQLNIA 配列番号113
1.Sph1とPst1でpTK1(センスsprA1を含む)を消化して、Pcadを脱落させる。
2.上流Sph1制限部位と下流Pst1制限部位(プライマー:TKO5およびTKO6)を含むPCRプライマーを使用して、Staphylococcus aureus 502a gDNAからのPleuAをPCR増幅する。
3.PleuA PCR産物をSph1とPst1で消化し、それをSph1/Pst1で消化したpTK1に挿入して、順方向にPleuA::SprA1 wtを生成し、pTK6を生成する。
エレクトロコンピテント細菌は、対数期の細胞を採取し、滅菌脱イオン水で広範囲に洗浄して、導電率を下げ、細胞をエレクトロポレーションプロセスに適した浸透状態にすることで調製される。
形質転換の手法は、Chen,W.,et al.2017,Rapid and Efficient Genome Editing in Staphylococcus aureus by Using an Engineered CRISPR/Cas9 Systemから採用されている。。J Am Chem Soc 139,3790−3795.手元にある材料:50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレート。12クローンのPCRスクリーニング用のシーケンシングプライマー;カナマイシン、細菌増殖用滅菌チューブを有するTSBブロス、コロニーPCRを行うためのPCR試薬(500μlのマスターミックス)、およびPCRグレードH2O。
1.インサートのDNAシーケンシング
TKO13からTKO20までのプライマーは、これらの13個のプラスミドのインサートをシーケンシングするためにさまざまに使用される。各プラスミドに使用するプライマーを表15に示す。キル遺伝子インサートはDNA2.0から取得される。PleuAおよびPhlgAプロモーターをPCRで増幅し、これらのフラグメントのポリメラーゼエラーの可能性を評価した。
2.1 生のクロマトグラムが検査され、高品質の領域(非常に高い信号/ノイズと良好なピーク分離)のみが、組み立てプロセスで使用するために選択される。
エレクトロコンピテント細菌は、対数期の細胞を採取し、滅菌脱イオン水で広範囲に洗浄して、導電率を下げ、細胞をエレクトロポレーションプロセスに適した浸透状態にすることで調製される。
1.500mLオレンジキャップ付きV底コーニング遠心分離ボトル
1.新規にストリークした抗生物質を含まないプレートから、250mLのTSB培地に各株を接種し、攪拌しながらインキュベートする(37℃、250rpm)。
この例では、Addgene(Addgene plasmid repository,Cambridge,MA)からStaphylococcus aureus(pCasSA)に有効なCRISPR−Casシステムが取得され、以前の実験から標的とする遺伝子間領域を特定し、最後に遺伝子間領域を目的とするgRNAを設計および試験する。
Staphylococcus aureusの標的遺伝子のNGG(NGGはスペーサーに含まれない)の前に20bpのスペーサー配列を選択する(40%〜60%のGC比が最適である)。2つのオリゴを以下の形式で(上述のように)合成する。
表17に示すようにリン酸化混合物を調製する。
c.アニーリング
2.5μlの1M NaClをリン酸化オリゴペアに追加する。
95℃で3分間インキュベートし、ゆっくりと室温まで冷却する(サーモサイクラーを使用)。(代替的に、ヒートブロックを使用して、ブロックをヒーターから取り出し、2時間自然冷却させる。)ddH2Oを使用して、アニールしたオリゴを20倍に希釈する。
表18に示すように1〜2ugのpCas9をBsaI(NEB)で消化する。
表19に示すようにライゲーション混合物を調製する。
カナマイシン(50ug/mL)を含むLB寒天プレート上に細胞を播種することにより、プラスミドの取り込みを選択する。注:pCasSAプラスミドは、E.coliを30℃で非常にゆっくりと増殖させるため、コロニーを確認するためにプレートを24〜36時間インキュベートする必要がある場合がある。
上記の手順6で生成されたテンプレートで21BPC FOR(配列番号63)および22BPC REV(配列番号64)を使用して試験する。
上述で生成したPCR産物をシーケンシング用に調製する。メーカーのプロトコールに従ってスピンカラムクリーンアップキットを使用してPCR反応物をクリーンアップする。
a.相同アームは、上記で同定された約600bpの遺伝子間領域に対応するさまざまな長さ(200、300、および400bp)で設計されている。生存能力の証明のために、蛍光レポーター遺伝子(例えば、mCherry)が構成的プロモーター(rspL)の制御下に挿入される。プロモーターとレポーターは、導入遺伝子スワッピングを可能にするために制限部位(Not1およびXma1)に隣接する。現在の設計には単一の停止コドンが含まれている。必要に応じて、追加の停止コドンを追加できる。コンストラクトは、ATUM(以前のDNA2.0)を介して設計および注文される。この配列全体(相同アーム+プロモーター+mCherry)は、Xho1およびXba1制限部位を使用してpCasSAベクターに配置される。
完全なpCasSA−XX−XXXベクターが組み立てられ、Staphylococcus aureus株に形質転換されたら、次のことを確認する。1)mCherryの発現、および2)mCherry配列のゲノムの取り込み。現在、これらを確認する実行可能な方法がいくつかある。注:mCherryの発現は、プラスミドを維持する細菌だけでなく、組み込みが成功したバクテリアでも発生するはずである。これらを区別するために、2つを区別できるPCRの場合を除いて、プラスミドを修復(削除)する必要がある。
mCherryフルオロフォアは、約587nmの光で励起され、約610nmを放射する。
組み込みを確認するために挿入された領域全体でPCR。増幅用に設計されたプライマー:挿入領域全体(41/42および43/44)。mCherry(51/45)の存在を試験する。ゲノムDNAの存在を確認する(TKO 1/3)。挿入とmCherryプライマーの混合とマッチングは、mCherryの組み込みの試験にも役立つ。
蛍光レポーターは、組換えアプローチで同定されたプロモーター(PleuA、Phlgaなど)の制御下にある。この組み合わせにより、選択したプロモーターの有効性を測定可能な(陽性)結果で試験できる。好ましくは、mCherryは、pCN51バックボーンに基づくコンストラクト中に配置されるであろう。この組み合わせを使用して、考えられる複数の問題を試験する。
選択したKSは、各配列に隣接するNot1およびXma1制限部位を使用してpCasSAベクターに挿入される。pTKは、Xma1制限部位を付加するプライマーBP−40を使用して増幅される。KSはStaphylococcus aureus 502a細胞に挿入され、ゲノムの組み込みが検証される。組み込まれた細胞は、プラスミドが回復し、血液/血清に曝されたときにKS活性について試験される。次いで、「BioPlx−XX」と名付けられたKS細胞を、本明細書に記載されるように継代して、寿命および生存能力を分析する。
KSを有するKS細胞BioPlx−XXは、TSB中でBioPlx−01(Staphylococcus aureus 502a WT)と並列して増殖させ、次いで洗浄し、新鮮なヒト血清に移す。KS株は移動直後に「フラットライン」になるが、WT株は血清中で増殖し始める。
この実験は、BioPlx−XXのKSが、in vitro増殖中に表現型および遺伝子型的に安定していることを示すために実行される。
1.11、17、41の倍加の各時点からのBioPlx−02細胞の試料を見出す。ステップ5Aを参照されたい。
概要。この実施例では、潜在的なStaphylococcus aureusプロモーターを血液および/または血清中の活性について試験した。候補プロモーターは、血液または血清への曝露後の遺伝子発現の上方制御に基づいて、文献から選択された。次いで、これらのプロモーターを、プロモーターが活性化されると蛍光を発するレポーター分子、緑色蛍光タンパク質(GFP)の上流にクローニングした。いくつかの増殖ステップの後、このプロモーター−GFPカセットを含むStaphylococcus aureus細胞を血液または血清に曝露し、GFPの活性を蛍光顕微鏡で観察した。このスクリーニングの結果は、キルスイッチ、病原性ブロック、ナノファクトリーなどの分子改変を調節するために使用できる、血液および/または血清におけるさまざまな程度の活性を持ついくつかのプロモーターを示している。
クローニング文献から選択された各血液または血清応答性遺伝子について、開始コドンのすぐ上流にある300塩基対の配列をプロモーター領域として選択した。プロモーターは502aStaphylococcus aureusゲノムから増幅され、ギブソンアセンブリ(GA)または制限酵素(RE)消化のいずれかを使用してGFPの前にクローニングされた。ギブソンアセンブリでは、ベクターバックボーンに相同性のあるプライマーを使用してプロモーターを増幅した。以下の表では、プロモーターと一致するプライマー配列は大文字であるが、ベクターのバックボーンと相同なプライマー配列は小文字である。制限酵素消化のために、プロモーターは、SphIまたはPstI制限部位を持つプライマーを使用して増幅された。以下の表では、制限部位を含むプライマー配列が太字で示されている。ベクターのバックボーンであるプラスミドpCN56(BEI Resources)は、ギブソンアセンブリー用のPCRを使用して増幅するか、または制限酵素クローニングのために制限酵素で単純に消化した。dpsプロモーターがGFPで正常にクローニングされたことはない。複数回試行した後、dps−GFPカセット脱落した。スクリーニング用の最終プラスミドカセットは、pCN56−プロモーター−GFPである。プロモーターの増幅に使用したプライマーを表21に示す。ベクターバックボーンの増幅に使用したプライマーを表22に示す。
顕微鏡画像は蛍光顕微鏡の接眼レンズを通してiPhone(登録商標)で撮影された。
この実施例では、qRT PCRは、文献で血液および/または血清応答性であることが判明している20種類の内因性Staphylococcus aureus遺伝子に対して行われた。スクリーニングは、細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変の構築に使用するための候補血液および/または血清応答性プロモーターの同定を助けるために使用された。簡潔に述べると、502a細胞をTSB培地、血液、または血清中で増殖させ、RNAをさまざまな時点で抽出した。さらに、血液または血清では反応しないと予測されるStaphylococcus aureusの遺伝子がいくつか試験された。これらは、細胞死遺伝子に特異的な抗毒素に作動可能に連結される第2のプロモーターの候補であると考えられる。結果は、血液または血清で上方制御されているいくつかの遺伝子と、血液または血清で安定しているいくつかの遺伝子を示している。
この実施例ではまた、qRT PCRは、文献で血液および/または血清応答性であることが判明しているStaphylococcus aureus遺伝子をさらにスクリーニングするためにも実行される。簡潔に述べると、502a細胞をTSB培地、または血清中で増殖させ、RNAをさまざまな時点で抽出した。結果は、血清中で高度に上方制御されているいくつかの遺伝子を示している。本質的に、実験プロトコールは、cDNAに変換する前にRNA試料を正規化し、試料をT= 90分で収集したことを除いて、上記の実施例と同様であった。
試料をプローブして、経時的および異なる培地での遺伝子発現の変化を調べ、ハウスキーピング遺伝子であるgyrB、sigB、rho、または3つの平均で、ΔΔCt法を使用して正規化した。各RNA試料の遺伝子転写産物のCt値から、ハウスキーピング遺伝子転写産物のCt(閾値までのサイクル数)値を差し引いた。次いで、これらのΔCt値を初期時点に正規化した。TSBと血清の両方で90分の遺伝子発現は、T=0の値に正規化された。
この実施例では、候補細胞死遺伝子sprA1が、2つのStaphylococcus aureus株で2つの異なるプラスミドベースの誘導系を使用して評価された。
実施例17AStaph aureus細胞(RN4220)の細胞増殖の阻害剤としてのsprA1の初期試験は、カドミウム誘導性プロモーターを使用して行われた。spra1毒素遺伝子は、pCN51(pTK1)のカドミウムプロモーターの後ろにクローニングされた。pCN51ベクターは、カドミウム誘導性プロモーターを含む低コピープラスミドである。
CCCCTCACTACCGCAAATAGTGAGGGGATTGGTGTATAAGTAAATACTTATTTTCGTTGT(配列番号273)sprA1抗毒素遺伝子
カドミウムの最小サブ阻害濃度を決定する実験は、Staphylococcus aureus RN4220細胞を使用して、10nM、100nM、および1uMカドミウムを使用して2回繰り返した。2時間後、カドミウム試験の細胞増殖結果は1uMまで良好な耐性を示す(データ示さず)。
次の実験には、RN4220細胞に形質転換されたpCN51プラスミド(pTK1)のカドミウムプロモーターの後ろに毒素(sprA1)が含まれていた。500nMと1uMの両方の濃度を、2つのpTK1クローンピックとRN4220細胞(wt)で試験した。wt RN4220細胞の一晩培養物およびRN4220細胞におけるpTK1の2つのクローンを0.5ODに希釈した。野生型(WT)RN4220細胞を3ml/チューブで3本の培養チューブに分けた。2本のチューブに500nMと1uMのカドミウムを接種し、誘導後2時間でODを読み取った。各pTK1クローンを、3ml/チューブで3本の培養チューブに分割した(合計6本のチューブ)。各pTK1クローンは500nmと1uMで誘導され、1つは対照である。誘導後2時間でODを読み取った。結果を表27および図14に示す。
誘導文献では、100ng/mlのATcでの誘導が有効であることを示しているため、これらの実験では、この濃度を誘導用に選択した。各セットからの1つのチューブは、100ng/mlの最終濃度で誘導された。エタノール中の1mg/ml ATcストックをEtOHで100ug/mlに希釈した。最終的に100ng/mlになるように1マイクロリットルを適切なチューブに加えた。
この実施例は、Staphylococcus aureus502aのキルスイッチに使用できるさまざまな候補細胞死毒素遺伝子の有効性を示す。この実験には、プラスミドベースの誘導性毒素発現を使用した。pRAB11は、Staph aureus Staphylococcus aureusの高コピープラスミドであり、Ptetプロモーターは、100ng/mLのAtC(アンヒドロテトラサイクリン)を添加することで抑制を解除し、高い転写率を可能にする。pRAB11は、Helle,Leonie,et al."Vectors for improved Tet repressor−dependent gradual gene induction or silencing in Staphylococcus aureus." Microbiology 157.12(2011):3314−3323に記載されている。4つの候補細胞死毒素遺伝子が評価のために選択された:sprA1、187−lysK、Holin、およびsprG。
−BP_068(502a pRAB11−Ptet−sprA1)
−BP_069(502a pRAB11−Ptet−187lysK)
−BP_070(502a pRAB11−Ptet−holin)
−BP_071(502a pRAB11−Ptet−sprG1)
−BP_001(502a wt)。
プラスミド構築は以下のように行った。
1)空のベクターをテンプレートとして使用し、プライマーBPC_670およびBPC_671を使用してpRAB11バックボーンをPCR増幅する。
2)PCRは合成されたプラスミドDNA(Genscript)から毒素遺伝子を増幅する。これにより、標的遺伝子の下流のプラスミドバックボーンに結合するプライマーを設計できるため、各遺伝子の両端に固有のプライマーを設計して注文する必要がなくなる。
3)プライマーペア
a)sprA−BPC_672/BPC_677
b)187−lysK−BPC_675/BPC_678
c)Holin−BPC_676/BPC_678
d)sprG−BPC_674/BPC_678
4)PCR産物を実行して正しいサイズを確認し、テンプレートDNAをDpnI(NEB)で消化し、Zymoスピンカラムで反応物をクリーンアップする。
5)ギブソンアセンブリーによってクリーンアップされたPCR産物を組み立て、メーカーのプロトコール(NEB)を使用してエレクトロコンピテントIM08BE.coli細胞に形質転換する。
6)プラスミド上のプロモーターと毒素の正しい配列を確認する。
7)配列検証済みのプラスミドをエレクトロコンピテントStaphylococcus aureusに形質転換する。
1)5mLのBHIブロス培地での各株の一晩培養を開始する。BP_068−BP_071株の培地に10ug/mLのクロラムフェニコールを加える。
2)一晩培養物を新鮮なBHIに1:100希釈する。BP_068−BP_071株の培地に10ug/mLのクロラムフェニコールを加える。37℃、250rpmで2時間振とう培養する。各株のプレートをストリークし、37℃で一晩インキュベートして、培養が良好であることを確認する。
3)2時間培養のOD600読み取り値を取得し、培養物を0.05のODに希釈する。
a)各株は、(4)BHIブロスを含む5mLチューブを受け取る
b)次の表は、記録されたODの読み取り値、および0.05のODまで新鮮な培養物に接種するために使用された各培養物の計算された量を示す。
5)培養液をODが0.5に達するまで37℃でインキュベートする。各株の2つのチューブに150ng/mLのアンヒドロテトラサイクリン(AtC)を添加し、それらに+の標識を付けて、誘導物質(抑制解除因子)を受け取ったことを示す。下記のように試料を採取して、さらに4時間細胞を増殖させ続ける。
6)T=30分、60分、120分、および240分でOD600の測定値を取得する。以下の表に値を記録する。
a)T=0、60分、および240分で希釈播種を実行し、次のプレート(BHI、BHI Chlor10、BHI Chlor10 + AtC 0.1)に正しい希釈を播種する。
1)毒素遺伝子が存在するプラスミドを含む株から増殖しているコロニーをBHI(Chlor 10、AtC 0.1)寒天プレートで同定する。T240からのプレートが最適である。
2)可能であれば、株ごとに8つのコロニーを選ぶ。コロニーを新しいBHI(Chlor 10、AtC 1)寒天プレートにパッチし、Staphylococcus aureus溶解手順を実行する。Q5/PhusionなどのHFポリメラーゼを使用してプライマーDR_215/DR_216を使用するコロニーPCRのテンプレートとして、溶解反応の5uLを使用する。
a)良好なバンドを生成する反応は、DpnI消化を1時間行い、PCR反応をカラム精製する。プライマーDR_215/DR_216を使用したシーケンシング用の精製済み製品を送付する。
概要。この実施例では、Staphylococcus aureus 502aバリアント株(BP_076)のゲノムからの緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)で確認された。gfp遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Ptet)およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質遺伝子(tetR)とともにゲノムに組み込まれた。組換え遺伝子の制御可能な発現を可能にするために、Ptet−gfp発現システムが自殺プラスミドpIMAYzを介してゲノムに導入された。野生型株(BP_001)は陰性対照として機能し、同じPtet−gfp発現系を持つ高コピープラスミドを担持する株は陽性対照として機能した。テトラサイクリンよりも毒性が低いため、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)を使用して100ng/mLで発現を誘導した。
株
BP_001(Staphylococcus aureus 502a)
BP_055(SA 502a、p229_pRAB11−Ptet−GFP)
BP_076(SA 502a、ΔsprA1::Ptet−GFP)
1.Staph aureus Staphylococcus aureusのゲノムに改変を加えるには、まず必要な遺伝的エレメントをそれらの改変を行うことができるプラスミドに追加する必要がある。
2.プラスミドバックボーンは、E.coli−Staphylococcus aureusのシャトルベクターであるpIMAYzであり、クロラムフェニコール耐性、低複製E.coli複製起点、低複製温度感受性Staphylococcus aureus複製起点(30℃での許容複製、しかし37℃ではない)、Ptetプロモーターの制御下にあるsecY毒素、およびStaphylococcus aureusへの組み込み中の青/白スクリーニング用のlacZ遺伝子を含む。
3.プラスミドは、ギブソンアセンブリを使用して環状コンストラクトに組み立てられた直線状のPCR産物を使用して構築された
a.プライマーDR_022/DR_023を使用してpIMAYzベクターのバックボーンをPCR増幅し、下流のアセンブリーで使用するために直線状化する。バックグラウンドテンプレートDNAは、さらに使用する前に、製造元の説明書に従ってDpnI(NEB)で酵素消化する必要がある。
b.プライマーDR_255/DR_241を使用して、pRAB11プラスミドをテンプレートとして使用し、tetR−Ptet−GFP領域をPCR増幅する。
c.プライマーDR_256/DR_257、およびDR_240/DR_236を使用して、Staphylococcus aureus 502aゲノムからの1kb領域をPCR増幅する。これらは、Staphylococcus aureusゲノムに組み込む領域を標的にするホモロジーアームとして使用される。
d.これらの直線状フラグメントは、製造元の説明書に従ってギブソンアセンブリマスターミックス(NEB)で環状プラスミドに組み立てられ、IM08B細胞に形質転換される。
4.新しいプラスミドDNAの配列を確認できたら、エレクトロポレーションによるStaphylococcus aureus 502aへの形質転換に十分な量を得るために、50mLの培養を開始する。
5.相同組換えによる黄色ブドウ球菌への組み込み
a.1〜5マイクログラムのプラスミドDNAを使用して、Staphylococcus aureusにエレクトロポレーションする。37℃で1時間回復し、BHI+10ug/mLクロラムフェニコールと100ug/mL x−Galに播種し、37℃で一晩インキュベートする。
b.翌日、複数の青いコロニーを選び、室温で5mLのBHIブロス培養を開始し、回転振とうユニットで12〜20時間増殖させる。
c.BHI+1ug/mLアンヒドロテトラサイクリン(AtC)と100ug/mL X−galで段階希釈(通常は10-4〜10-6)を実行して播種する。37℃で一晩インキュベートする。
d.翌日、BHI、BHI+1ug/mLアンヒドロテトラサイクリン(AtC)、および100ug/mL X−gal、およびBHI+10ug/mLクロラムフェニコールおよび100ug/mL x−Gal寒天プレートにパッチを当てて、白いコロニーを選択してスクリーニングし、クロラムフェニコール感受性とAtC耐性を確認する。
e.望ましい表現型を示すコロニーは、プライマーDR_237/DR_238を使用したPCRでスクリーニングする必要がある。新しい遺伝子を取り込んだコロニーは4.4kbのバンドを生成し、野生型に戻ったコロニーは2.86kbのバンドを含むはずである。正しい配列を確認するために、いくつかの陽性クローンのシーケンシングを行う必要があり、配列検証済みのクローンの1つを下流の実験で使用するためにピックアップする。
1.BHIブロス培地(5mL)で各株の一晩培養を開始し、攪拌しながらインキュベートする(37℃、240rpm)。クロラムフェニコール(最終濃度10μg/mL)をBP_055の培地に追加する。
2.一晩培養の光学密度(OD)を測定し、記録する。
培養物の光学密度(OD)を630nmで測定し、新規の培地をブランクとして使用した。一晩培養物のODを初期ODとして示す。表36に示すように、新しい培地5mLに移した接種物はODを0.05に低下させたため、新しい培養物は接種後2時間で指数増殖期になった。
4.攪拌しながら(37℃、240rpm)、ODが0.5〜1に達するまでインキュベートする(「2時間培養」)。
5.t=0分のRNA試料の培養液1mLを取り出し、1.5mLマイクロチューブに移す。試料をスピンダウンし(16,000×g、1分、RT)、上清を吸引除去し、ペレットを200μLRNAlaterに再懸濁する。室温(RT)で数分間インキュベートした後、−20℃で保存する。
6.各株の最初の14mL培養チューブにaTc(4μL、100μg/mL)を追加する。誘導対象として各株の2番目のチューブに4μLの100%エタノールを追加する(aTcは100%エタノールに溶解した)。
7.他のサンプリング時点まで、培養物を攪拌しながら(37℃、240rpm)インキュベートする。
8.t=30分と90分でRNAサンプリングを繰り返し、t=90分でODを測定する。
qPCR試料処理およびデータ分析
上述の実施例のプロトコールに従って、Ambion RiboPure Bacteria Kitを使用して、RNALaterに保存された凍結細胞ペレットからRNAを抽出した。gfp発現レベルはハウスキーピング遺伝子gyrBに対して正規化され、ΔΔCt法を使用して定量された。表37のプライマー配列を参照されたい。
図20は、Staphylococcus aureusにゲノムを組み込むために構築されたプラスミド地図を示す。
表39は、野生型株BP_001の発現誘導前の閾値(CT)値までのサイクル数を示し、プラスミドベースのPtet−gfp BP_055担持株、およびPtet−gfp遺伝子改変株BP_076が示されている。閾値は0.4に設定された。
この実験では、TSBと比較してヒト血清で増殖させた場合の502aStaphylococcus aureusバリアント株BP_001 WTのRNAシーケンシングを実行して、循環系に入ったときに微生物内で発生する転写変化の全体的な理解を得た。RNAシーケンシングは、実験室の増殖培地とヒト血清から収集された試料に対して実行された。
この実験では、血清または血液中で増殖できないStaphylococus aureus(SA)502aの株を作製する目的で、血清応答性キルスイッチカセットを設計および構築した。このカセットは、SAの内因性sprA1毒素抗毒素システムをベースにしている。これは、毒素がアンチセンスRNAによって翻訳抑制される小さな膜ポリンペプチド(PepA1)であるタイプのIT/ATシステムである。アンチセンスRNAはsprA1の5’UTRに結合してRBSを覆い、一本鎖mRNAに結合してタンパク質を合成するその能力をブロックする。
502a−Staphylococcus aureus野生型
BP_011−502aΔsprA1−sprA1(AS)
BP_084−502aΔPsprA::PsbnA
1)SA 502aゲノムから相同領域をPCR増幅する
a.上流ホモロジーアーム−DR_233/DR_296
b.下流ホモロジーアーム−DR_280/DR_236
2)IDTから合成された直線状DNAフラグメントからPsbnA−sprA1をPCR増幅
a.PsbnA−sprA1−DR_297/DR_228
3)pIMAYzバックボーンベクターをPCR増幅する
a.DR_022/DR_023
4)製造元の説明書に従って、Qiagenキットですべての試薬をゲル精製する
5)直線状DNAフラグメントを環状プラスミドに組み立て、製造元の説明書に従ってエレクトロコンピテントIM08B大腸菌細胞に形質転換する
6)コロニーPCRを実行して、完全に組み立てられたプラスミドのコロニーをスクリーニングする
a.DR_117/DR_228(1571bpフラグメント)
7)複数の陽性コロニーを選び、培養物を一晩培養し、プラスミドをシーケンシングして、新しく組み立てられたプラスミドに変異がないことを確認する
8)配列確認済みのプラスミドをエレクトロコンピテントSA 502aに形質転換し、相同組換えを使用してSAゲノムを編集するためのプロトコールに従う
9)プライマー対DR_303/DR_304を使用して、組み込み体をPCRにより最終コロニーをスクリーニングする
a.正しいバンドサイズが観察された場合、PCR産物を配列確認のために送る。
材料
●BHI寒天(クロラムフェニコール10ug/mL)(X−Gal 100ug/mL)
●BHI寒天(AnhydroTet 1ug/mL)(X−Gal 100ug/mL)
●BHI寒天
●BHIブロス
●一次および二次組換えイベント後にコロニーをスクリーニングするプライマー
プロトコール
1.高濃度のpIMAYz組み込みプラスミドを調製する約25mLの一晩培養液を、(4)2倍容量のミニプレッププロトコールにスピンダウンする。これは、必要に応じて2つのカラムを通して精製し、DNAの収量を最大化するために実行できる。溶出液をプールし、Zymoコンセントレーターキットを使用して濃縮して、濃度を最大化する必要がある。
2.実験室で最適化されたエレクトロポレーションプロトコールを使用して、上述から最大5uLの濃縮プラスミドを使用して502aを形質転換する。
3.シェーカーで30℃で1時間細胞を回復する
4.3〜4のBHI(Chlor 10、X−Gal 100)寒天プレートで回復混合物全体を播種する。30℃で1プレートをインキュベートし、残りを37℃で一晩インキュベートする(インキュベーターが37℃以上であることを確認する)
5.プライマーDR_116/DR_117を使用して、環状プラスミドの存在についてプレート上の青いコロニーをスクリーニングする。プライマーはpIMAYzのマルチクローニング部位に隣接しており、30Cプレートの場合、ホモロジーアームプラス組み込まれた任意の領域と同じサイズのバンドが生成される。37℃プレートはバンドを全く生成しない。
6.37℃プレート上の青いコロニーは、ホモロジーアームの外側に結合するプライマーを使用して、ゲノムに組み込まれたプラスミドをスクリーニングする必要がある。各プライマーは、DR_116またはDR_117と対にする必要がある。これにより、プラスミドがゲノムの適切な場所に組み込まれていることが確認される。
7.37℃プレート上のコロニーが、プラスミドが組み込まれたことを示すバンドを生成しない場合、30℃プレート上のプラスミドバンドを示すコロニーを希釈して、BHI寒天(Chlor 10、X−Gal 100)に播種し、37℃でインキュベートした。ステップ5〜6を繰り返して、組み込みのための新しいコロニーを再スクリーニングする。
8.PCRが組み込まれたプラスミドを示す場合は、いくつかのコロニーを選択し、可能であれば、それぞれの方法で組み込まれたクローンを選択する。室温のシェーカーで5mLのBHIブロスで一晩(約16時間)増殖させる
9.10^−5と10^−6に希釈し、BHI寒天(AnhydroTet 1ug/mL、X−Gal 100ug/mL)に50uLを播種する。37℃で一晩プレートをインキュベートする。
10.白色コロニーをBHI寒天(Chlor 10uG/mL、X−Gal 100)、BHI寒天(AnhydroTet 1ug/mL、X−Gal 100ug/mL)、BHI寒天にパッチして、アンヒドロテットに対する耐性とクロラムフェニコールに対する感受性をスクリーニングする。両方の表現型を持つコロニーをBHI寒天プレートから選び、ノックアウトまたはノックインについてスクリーニングする必要がある。最終的な遺伝子型のスクリーニングに使用するプライマーの少なくとも1つは、ホモロジーアームとして使用される領域の外側に結合する必要がある。
11.いくつかの陽性クローンのパッチプレートからプレートをストリークし、ホモロジーアームの外側に結合するプライマーを使用してHF PCRを実行し、シーケンシングに送る。37℃で一晩プレートをインキュベートする。
12.ストリークされたプレートから少なくとも3つのコロニーを選び、コロニーPCRを実行して遺伝子型を確認する。PCRがすべて陽性の場合、プレートを使用して株ストックを作製し、新しい株番号を割り当てる。
1)試験する株と野生型対照株の5mL TSB培養を開始し、250RPMで軌道振とうしながらインキュベーター内で37℃で一晩増殖させる
2)翌日、新規のTSB培地で1:100に希釈し、培養液を2時間増殖させる。
3)OD600の読み取り値を取得し、値を記録する。5mLの培養液にODが0.05になるまで接種するのに必要な細胞培養液の量を計算する。計算された量の新しい培養物を予熱された培地(TSB/血清)に接種する
4)37℃で増殖培養を続ける。連続希釈を行い、いくつかの細胞希釈液をBHIまたはTSB寒天プレートに播種する。37℃で一晩プレートをインキュベートし、それらが出現した後(>16時間)、各プレート上のコロニーを計数する。
発現クランプによるキルスイッチ構築は以下のように行う。以前の実施例では、ヒト血清および血液に曝露されたときにStaphylococcus aureusで上方制御または下方制御される特定の遺伝子が同定された。例えば、isdBは、血液および血清応答性プロモーターを著しく上方制御するプロモーターとして選択される。また、clfBは、血清または血液の非存在下では活性であるが、血清または血液の存在下では下方制御される発現クランプで使用するための第2のプロモーターとして選択される。
Claims (108)
- 合成微生物であって、
誘導可能な第1のプロモーターを含む第1の調節領域に作動可能に結合されている第1の細胞死遺伝子を含む、少なくとも1つのキルスイッチ分子改変を含む、組換えヌクレオチドを含み、
前記第1の誘導性プロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露に応答して、基礎生産性の少なくとも3倍の前記組換えヌクレオチドの条件的に高いレベルの遺伝子発現を示す、合成微生物。 - 前記合成微生物が、
前記第1の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含む、少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)をさらに含み、前記抗毒素遺伝子が、
真皮または粘膜のコロニー形成時または完全培地で活性(構成的)であるが、血液、血清、または血漿への少なくとも30分の曝露後に誘導されないか、1.5倍未満誘導されるか、または抑制される、第2のプロモーターを含む第2の調節領域に作動可能に結合されている、請求項1に記載の合成微生物。 - 前記合成微生物が、望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、または少なくとも360分以内に、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍、上方制御される、請求項1または2に記載の合成微生物。
- 前記第1のプロモーターが、血液、血清、または血漿の非存在下で誘導されないか、1.5倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項1または2に記載の合成微生物。
- 前記第2のプロモーターを含む第2の調節領域が、真皮もしくは粘膜のコロニー形成時またはTSB培地中で活性であるが、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、および少なくとも360分からなる群から選択される期間の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも2倍抑制される、請求項2に記載の合成微生物。
- 前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第1のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の合成微生物。
- 前記測定可能な平均細胞死が、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分からなる群から選択される少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項7に記載の合成微生物。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記予め設定された期間後の、少なくとも50%cfu、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%cfu数の低減である、請求項8に記載の合成微生物。
- 前記キルスイッチ分子改変が、対象の全身状態下で前記合成微生物の感染性増殖を低減または防止する、請求項1〜9のいずれかに記載の合成微生物。
- 前記少なくとも1つの分子改変が、前記合成微生物の染色体に組み込まれている、請求項1または2に記載の合成微生物。
- 前記標的微生物が、少なくとも1つの抗菌剤に対して感受性である、請求項3に記載の合成微生物。
- 前記標的微生物が、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される、請求項12に記載の合成微生物。
- 前記標的微生物が、真皮および/または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項13に記載の方法。
- 前記合成微生物が、Staphylococcus aureus株に由来する、請求項14に記載の合成微生物。
- 前記細胞死遺伝子が、sprA1、sprA2、kpn1、sma1、sprG、relF、rsaE、yoeB、mazF、yefM、またはリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択される、請求項15に記載の合成微生物。
- 前記細胞死遺伝子が、配列番号122、124、125、126、127、128、274、275、284、286、288、290、315、および317からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項16に記載の合成微生物。
- 前記誘導可能な第1のプロモーターが、isdA(鉄調節表面決定因子タンパク質A)、isdB(鉄調節表面決定因子タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ溶血素コンポーネントA)、hlgA1(ガンマ溶血素)、hlgA2(ガンマ溶血素)、hlgB(ガンマ溶血素コンポーネントB)、hrtAB(ヘム調節トランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロフォア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロフォア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼレギュレーターA)、lrgB(ムレインヒドロラーゼレギュレーターB)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアABCトランスポーター遺伝子、SAM dep Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(推定シデロフォア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌属タンパク質A)からなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれに由来する、請求項16または17に記載の合成微生物。
- 前記第1のプロモーターが、配列番号114、115、119、120、121、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、および163からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項18に記載の合成微生物。
- 前記抗毒素遺伝子が、前記第1の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるアンチセンスRNA配列をコードする、請求項15〜19のいずれか1項に記載の合成微生物。
- 前記抗毒素遺伝子が、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子もしくはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187−lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子からなる群より選択される、請求項20に記載の合成微生物。
- 前記抗毒素遺伝子が、配列番号273、306、307、308、309、310、311、312、314、319、もしくは322からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載の合成微生物。
- 前記第2のプロモーターが、clfB(クランピングファクターB)、sceD(オートライシン、エキソプロテインD)、walKR(病原性レギュレーター)、atlA(主要な自己溶菌酵素)、oatA(O−アセチルトランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC遺伝子、DeoRファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース−6−リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、DeoRトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびrhoからなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれらに由来する、請求項21または22に記載の合成微生物。
- 前記第2のプロモーターがPclfB(クランピングファクターB)であり、配列番号117、118、129、もしくは130のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項23に記載の合成微生物。
- 病原性ブロック分子改変およびナノファクトリー分子改変からなる群から選択される分子改変をさらに含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の合成微生物。
- 前記病原性ブロック分子改変が、前記望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する、請求項25に記載の合成微生物。
- 前記ナノファクトリー分子改変が、酵素、アミノ酸、代謝中間体、および小分子からなる群から選択される産物をコードする遺伝子の挿入、それをコードする遺伝子のノックアウト、またはそれをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む、請求項25に記載の合成微生物。
- 有効量の請求項1〜27のいずれか1項に記載の合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味料、香味料、湿潤剤、保存料、緩衝剤、もしくは吸収剤、またはそれらの組み合わせと、を含む、組成物。
- 栄養素、プレバイオティクス、共生および/またはプロバイオティクス細菌種をさらに含む、請求項28に記載の薬学的組成物。
- 請求項28または29に記載の組成物を含む単回用量単位。
- 少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010CFU、または少なくとも1011の合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む、請求項30に記載の単回用量単位。
- 局所投与用に製剤化された、請求項31に記載の用量単位。
- 対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための医薬の製造において使用するための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の合成微生物または請求項28または29に記載の組成物。
- マイクロバイオームの宿主となる対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための方法であって、
a.前記宿主マイクロバイオームを脱コロニー化することと、
b.非ネイティブ属性を付与する少なくとも1つの要素を含む合成微生物を前記対象に投与することにより、前記望ましくない微生物を永続的に置き換えることであって、前記合成微生物が、前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれること、および前記宿主マイクロバイオームにおいて前記望ましくない微生物と同じニッチを占有することが可能である、置き換えることと、を含む、方法。 - 前記脱コロニー化することが、前記対象の少なくとも1つの部位で行われ、前記少なくとも1つの部位からの前記望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に低減または排除する、請求項34に記載の方法。
- 前記望ましくない微生物の前記検出可能な存在が、表現型法および/または遺伝子型法を含む方法により判定され、任意選択的に、前記表現型法が、生化学反応、血清学的反応、抗菌剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および/または細胞タンパク質のプロファイルからなる群から選択され、
任意選択的に、前記遺伝子型法が、ハイブリダイゼーション、プラスミドプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびそのバリアント、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ならびに転写ベースの増幅システム(TAS)からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。 - 前記ニッチが、前記少なくとも1つの部位での前記望ましくない微生物の安定したコロニー形成を可能にする真皮または粘膜環境である、請求項35に記載の方法。
- 前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる能力が、前記投与するステップ後の少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間の期間の、前記少なくとも1つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在によって判定される、請求項37に記載の方法。
- 前記望ましくない微生物を永続的に置き換える能力が、前記投与するステップ後の少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間の期間の、前記少なくとも1つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在の不在によって判定される、請求項38に記載の方法。
- 前記同じニッチを占有する能力が、前記投与するステップ後の前記少なくとも1つの部位における前記望ましくない微生物と前記合成微生物との共コロニー化の不在によって判定され、
任意選択的に、前記共コロニー形成の不在が、前記投与するステップ後の少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間で判定される、請求項39に記載の方法。 - 前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも1つの要素が、前記合成微生物に永続的に組み込まれる、請求項34に記載の方法。
- 前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも1つの要素が、前記合成微生物を介して前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる、請求項41に記載の方法。
- 前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも1つの要素が、キルスイッチ分子改変、病原性ブロック分子改変、代謝改変、およびナノファクトリー分子改変からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記分子改変が、前記合成微生物の染色体に組み込まれている、請求項43に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する病原性ブロック分子改変を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記対象の全身状態下で前記合成微生物の感染性増殖を低減または防止するキルスイッチ分子改変を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する、請求項43に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記脱コロニー化された宿主マイクロバイオームに生物的に組み込まれる能力を有する標的微生物に由来する、請求項43に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記宿主マイクロバイオームから単離された標的微生物に由来する、請求項43に記載の方法。
- 前記標的微生物が、少なくとも1つの抗菌剤に感受性である、請求項48または49に記載の方法。
- 前記標的微生物が、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記標的微生物が、真皮および/または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項51に記載の方法。
- 前記標的微生物が、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter baumannii、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus warneri、Staphylococcus saprophyticus、Corynebacterium acnes、Corynebacterium striatum、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium minutissimum、Cutibacterium acnes、Propionibacterium acnes、Propionibacterium granulosum、Streptococcus pyogenes、Streptococcus aureus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mitis、Streptococcus viridans、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus anginosis、Steptococcus constellatus、Streptococcal intermedius、Streptococcus agalactiae、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas putida、およびPseudomonas fluorescensからなる群から選択され、任意選択的に、前記標的株が、Staphylococcus aureus 502a株またはRN4220株である、請求項52に記載の方法。
- 前記合成微生物のキルスイッチ分子改変が、第1の誘導性プロモーターを含む第1の調節領域に作動可能に連結された第1の細胞死遺伝子を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、前記対象の前記少なくとも1つの部位での正常な生理学的(ニッチ)状態とは対照的な微生物環境の状態変化によって活性化(誘導)される、請求項54に記載の方法。
- 前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第1のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項55に記載の方法。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記状態の変化後、少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分からなる群から選択される少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項56に記載の方法。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記予め設定された期間後の、少なくとも50%cfu、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%cfu数の低減である、請求項57に記載の方法。
- 前記状態の変化が、pH、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、金属濃度、キレート化金属濃度、1つ以上の免疫因子の組成物または濃度の変化、ミネラル濃度、および電解質濃度のうちの1つ以上から選択される、請求項55に記載の方法。
- 前記状態の変化が、前記対象の前記少なくとも1つの部位における正常な生理学的(ニッチ)状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度および/または組成物の変化である、請求項59に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、血液、血清、血漿、および/またはヘム応答性プロモーターである、請求項60に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、前記状態の変化後、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、および少なくとも360分からなる群から選択される期間内に、少なくとも1.5倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍、上方制御される、請求項55〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、前記状態の変化の非存在下で誘導されないか、1.5倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項62に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、血清または血液の存在下で一定期間内に少なくとも1.5、2、3、4、5、または少なくとも6倍誘導される、請求項63に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、前記少なくとも1つの部位での正常な生理学的(ニッチ)状態下で誘導されないか、1.5倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項64に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、血液、血清、または血漿の非存在下で誘導されないか、1.5倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項64に記載の方法。
- 前記合成微生物がStaphylococcus aureus株である標的微生物に由来し、前記第1のプロモーターが、isdA(鉄調節表面決定因子タンパク質A)、isdB(鉄調節表面決定因子タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ溶血素コンポーネントA)、hlgA1(ガンマ溶血素)、hlgA2(ガンマ溶血素)、hlgB(ガンマ溶血素コンポーネントB)、hrtAB(ヘム調節トランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロフォア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロフォア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼレギュレーターA)、lrgB(ムレインヒドロラーゼレギュレーターB)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアABCトランスポーター遺伝子、SAM dep Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(推定シデロフォア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌属タンパク質A)からなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項54〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、配列番号114、115、119、120、121、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、および163からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列に由来するか、またはそれを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記望ましくない微生物がStaphyloccoccus aureus株であり、前記検出可能な存在が、前記対象の前記少なくとも1つの部位から試料を得ることと、発色寒天を前記試料と接触させることと、前記接触させた寒天をインキュベートすることと、所定の時間後に前記細菌種の陽性cfusを計数することと、を含む方法によって測定される、請求項54〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞死遺伝子が、sprA1、sprA2、kpn1、sma1、sprG、relF、rsaE、yoeB、mazF、yefM、およびリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択される毒素遺伝子から選択される、請求項54〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞死遺伝子が、配列番号122、124、125、126、127、128、274、275、284、286、288、290、315、および317からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記合成微生物が、前記第1の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含む発現クランプ分子改変をさらに含み、前記抗毒素遺伝子が、真皮または粘膜のコロニー形成時またはTSB培地中で活性であるが、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、および少なくとも360分からなる群から選択される期間の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも2倍抑制される、第2のプロモーターを含む第2の調節領域に作動可能に連結されている、請求項54〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗毒素遺伝子が、前記第1の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるアンチセンスRNA配列をコードする、請求項72に記載の方法。
- 前記抗毒素遺伝子が、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子もしくはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187−lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子からなる群より選択される、請求項73に記載の方法。
- 前記抗毒素遺伝子が、配列番号273、306、307、308、309、310、311、312、314、319、もしくは322からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記第2のプロモーターが、clfB(クランピングファクターB)、sceD(オートライシン、エキソプロテインD)、walKR(病原性レギュレーター)、atlA(主要な自己溶菌酵素)、oatA(O−アセチルトランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC遺伝子、DeoRファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース−6−リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、DeoRトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびrhoからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項72〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のプロモーターがPclfB(クランピングファクターB)であり、配列番号117、118、129、もしくは130のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項76に記載の方法。
- 前記脱コロニー化するステップが、前記少なくとも1つの部位から前記望ましくない微生物の存在を低減または排除するために、前記対象の前記少なくとも1つの部位に脱コロニー化剤を局所投与することを含む、請求項43〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脱コロニー化するステップが、前記脱コロニー化剤の局所投与を含み、全身性抗菌剤が同時に投与されない、請求項78に記載の方法。
- 前記脱コロニー化剤の第1の局所投与から1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、または1年以内に全身性抗菌剤を投与しない、請求項78または79に記載の方法。
- 前記脱コロニー化剤が、消毒剤、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および抗菌剤からなる群から選択される、請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脱コロニー化剤が、アルコール(エチルアルコール、イソプロピルアルコール)、アルデヒド(グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤(ノキシチオリン=オキシメチレンチオ尿素、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン)、o−フタルアルデヒド)、アニリド(トリクロカルバン=TCC=3,4,4’−トリクロルカルバニリド)、ビグアニド(クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアニド(MW>3,000g/molのポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル)、ジアミジン(プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン)、フェノール(フェンチクロル、p−クロロ−m−キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン)、ビスフェノール(トリクロサン、ヘキサクロロフェン)、クロロキシレノール(PCMX)、第4級アンモニウム化合物(セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム)、銀化合物(スルファジアジン銀、硝酸銀)、ペルオキシ化合物(過酸化水素、過酢酸、過酸化ベンゾイル)、ヨウ素化合物(ポビドンヨード、ポロキサマーヨード、ヨウ素)、塩素放出剤(次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン−T)、銅化合物(酸化銅)、イソトレチノイン、硫黄化合物、植物抽出物(メラロイカ属(ティーツリーオイル)、(スノキ属(例えば、Aタイププロアントシアニジン)、Cassia fistula Linn、Baekea frutesdens L.、Melia azedarach L.、Muntingia calabura、Vitis vinifera L、Terminalia avicennioides Guill&Perr.、Phylantus discoideus muel.Muel−Arg.、Ocimum gratissimum Linn.、Acalypha wilkesiana Muell−Arg.、Hypericum pruinatum Boiss.&Bal.、Hypericum olimpicum L.およびHypericum sabrum L.、Hamamelis virginiana(アメリカマンサク)、チョウジ油、ユーカリ属、ローズマリー属(ローズマリー)、イブキジャコウソウ属(タイム)、イワダレソウ属(オレガノ)、レモングラス属、シナモン属、ゼラニウム属、ラベンデュラ属)、アミノレブロン酸、および局所抗生物質化合物(バクテリオシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB、ゲンタマイシン)からなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記抗菌剤が、バンコマイシン、セファゾリン、セパハロチン、セファレキシン、リネゾリド、ダプトマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB、ゲンタマイシン、ウリフロキサシン、フィダキソマイシン、ミノサイクリン、メトロニダゾール、メトロニダゾール、スルファメトキサゾール、アンピシリン、トリメトプリム、オフロキサシン、ノルフロキサシン、チニダゾール、ノルフロキサシン、オルニダゾール、レボフロキサシン、ナリジクス酸、セフトリアキソン、アジスロマイシン、セフィキシム、セフトリアキソン、セファレキシン、セフトリアキソン、リファキシミン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルフロキサシン、ウリフロキサシン、モキシフロキサシン、ナイスタチン、アンホテリシンB、フルシトシン、ケトコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、ボリコナゾール、グリセオフルビン、硝酸ミコナゾール、およびフルコナゾールからなる群から選択される、請求項81または82に記載の方法。
- 前記脱コロニー化することが、前記置き換えるステップの前に少なくとも1、2、3、4、5または6回またはそれ以上の回数、前記脱コロニー化剤を局所投与することを含む、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脱コロニー化するステップが、0.5〜48時間の間隔をあけて1〜6回もしくはそれ以上または2〜4回、前記対象の前記少なくとも1つの宿主部位に前記脱コロニー化剤を投与することを含み、前記置き換えるステップが、前記最後の脱コロニー化するステップの後に実行される、請求項84に記載の方法。
- 前記置き換えるステップが、前記対象の前記少なくとも1つの部位に対する、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010CFU、または少なくとも1011の前記合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物の最初の局所投与を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記最初の置き換えるステップが、前記脱コロニー化するステップの12時間、24時間、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、または7日以内に行われる、請求項86に記載の方法。
- 前記置き換えるステップが、前記最後の脱コロニー化するステップの後、2週間ごとから6ヶ月ごとに1回以下の間隔で繰り返される、請求項86または87に記載の方法。
- 前記脱コロニー化するステップおよび前記置き換えるステップが、2週間ごとから6ヶ月ごとに1回以下の間隔で繰り返される、請求項86または87に記載の方法。
- 前記置き換えることが、前記合成微生物を前記少なくとも1つの部位に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回投与することを含む、請求項86〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 前記置き換えることが、前記合成微生物を前記少なくとも1つの部位に、月に1回以下、2回以下、3回以下、または4回以下投与することを含む、請求項90記載の方法。
- 前記対象における前記合成微生物のコロニー形成を促進することをさらに含む、請求項43〜91のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象における前記合成微生物のコロニー形成を促進することが、前記対象に促進剤を投与することを含み、任意選択的に、前記促進剤が栄養素、プレバイオティクス、共生、安定剤、保湿剤、および/またはプロバイオティクス細菌種である、請求項92に記載の方法。
- 前記促進することが、前記最初の脱コロニー化ステップの後に、106〜1010cfu、または107〜109cfuのプロバイオティクス細菌種を前記対象に投与することを含む、請求項93記載の方法。
- 前記栄養素が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、ペプチド、および酵母エキスから選択される、請求項93に記載の方法。
- 前記プレバイオティクスが、短鎖脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸)、グリセロール、農業副産物由来のペクチン由来オリゴ糖、フルクトオリゴ糖(例えば、イヌリン様プレバイオティクス)、ガラクトオリゴ糖(例えば、ラフィノース)、コハク酸、乳酸、およびマンナンオリゴ糖からなる群から選択される、請求項93に記載の方法。
- 前記プロバイオティクスが、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis、Streptococcus thermophiles、およびEnterococcus fecalisからなる群から選択される、請求項93に記載の方法。
- 前記共生が、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter baumannii、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus warneri、Staphylococcus saprophyticus、Corynebacterium acnes、Corynebacterium striatum、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium minutissimum、Cutibacterium acnes、Propionibacterium acnes、Propionibacterium granulosum、Streptococcus pyogenes、Streptococcus aureus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mitis、Streptococcus viridans、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus anginosis、Steptococcus constellatus、Streptococcal intermedius、Streptococcus agalactiae、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas putida、およびPseudomonas fluorescensからなる群から選択される、請求項93に記載の方法。
- 前記望ましくない微生物が抗菌剤耐性微生物である、請求項43〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗菌剤耐性微生物が抗生物質耐性細菌である、請求項99に記載の方法。
- 前記抗生物質耐性細菌が、ストレプトコッカス属、クチバクテリウム属、およびブドウ球菌属からなる群から選択されるグラム陽性細菌種である、請求項99に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス属が、Streptococcus pneumoniae、Steptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus pyogenes、およびStreptococcus agalactiaeからなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記クチバクテリウム属が、Cutibacterium acnes亜種acnes、Cutibacterium acnes亜種defendens、およびCutibacterium acnes亜種elongatumからなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌属が、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、およびStaphylococcus saprophyticusからなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記望ましくない微生物が、1つ(SCCmecタイプI)または複数の抗生物質耐性遺伝子(SCCmecタイプIIおよびIII)をコードする、および/または毒素を生成する、ブドウ球菌染色体カセット(SCCmecタイプI〜III)を含むメチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)株である、請求項104に記載の方法。
- 前記毒素が、パントン−バレンタインロイコシジン(PVL)毒素、トキシックショック症候群毒素−1(TSST−1)、ブドウ球菌性アルファ溶血素毒素、ブドウ球菌性ベータ溶血素毒素、ブドウ球菌性ガンマ溶血毒素、ブドウ球菌性デルタ溶血毒素、エンテロトキシンA、エンテロトキシンB、エンテロトキシンC、エンテロトキシンD、エンテロトキシンE、およびコアグラーゼ毒素からなる群から選択される、請求項105に記載の方法。
- 前記対象が、前記投与するステップの後、少なくとも2週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも24週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間、前記少なくとも1つの部位で前記対象をスワブすることによって証明されるとき、前記望ましくない微生物の再発を示さない、請求項43〜106のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの容器内に、請求項1〜27のいずれか1項に記載の合成微生物、請求項28または29に記載の組成物、または請求項30〜32のいずれか1項に記載の単回投与、および任意選択的に、脱コロニー化剤を含む少なくとも第2の容器、説明書のシート、促進剤を含む少なくとも第3の容器、および/またはアプリケーターを含む、キット。
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