JP2021505197A5

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Publication number: JP2021505197A5
Application number: JP2020550034A
Authority: JP
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-12-04

Claims

合成微生物であって、
誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に結合されている第１の細胞死遺伝子を含む、少なくとも１つのキルスイッチ分子改変を含む、組換えヌクレオチドを含み、
前記第１の誘導性プロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露に応答して、基礎生産性の少なくとも３倍の前記組換えヌクレオチドの条件的に高いレベルの遺伝子発現を示す、合成微生物。
前記合成微生物が、
前記第１の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含む、少なくとも第２の分子改変（発現クランプ）をさらに含み、前記抗毒素遺伝子が、
真皮または粘膜のコロニー形成時または完全培地で活性（構成的）であるが、血液、血清、または血漿への少なくとも３０分の曝露後に誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に結合されている、請求項１に記載の合成微生物。
前記合成微生物が、望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
前記第１のプロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、または少なくとも３６０分以内に、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、上方制御され、
好ましくは、前記第１のプロモーターが、血液、血清、ヘム、または血漿の非存在下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項１または２に記載の合成微生物。
前記第２のプロモーターを含む第２の調節領域が、真皮もしくは粘膜のコロニー形成時またはＴＳＢ培地中で活性であるが、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分からなる群から選択される期間の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも２倍抑制される、請求項２に記載の合成微生物。
前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第１のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こり、
好ましくは、前記測定可能な平均細胞死が、血液、血清、ヘム、または血漿への曝露後、少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分以内に起こり、
前記測定可能な平均細胞死が、前記予め設定された期間後の、少なくとも５０％ｃｆｕ、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％ｃｆｕ数の低減であり、
好ましくは、前記キルスイッチ分子改変が、対象の全身状態下で前記合成微生物の感染性増殖を低減または防止する、
請求項１〜５のいずれかに記載の合成微生物。
前記少なくとも１つの分子改変が、前記合成微生物の染色体に組み込まれている、請求項１または２に記載の合成微生物。
前記標的微生物が、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択され、
任意により、前記標的微生物が、真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、大腸菌属（Escherichia）、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーであり、
任意により、前記標的微生物が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Staphylococcus warneri）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、アシネトバクター・ジョンソニイ（Acinetobacter johnsonii）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、コリネバクテリウム・アクネス（Corynebacterium acnes）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・ミヌチシマム（Corynebacterium minutissimum）、キューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）、プロピオニバクテリウム・グラヌローサム（Propionibacterium granulosum）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アウレウス（Streptococcus aureus）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、緑色連鎖球菌（Streptococcus viridans）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Steptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcal intermedius）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、及びシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、からなる群から選択され、
任意により、前記標的微生物が、少なくとも１つの抗菌剤に感受性である、
請求項７に記載の合成微生物。
前記合成微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ株に由来し、
前記細胞死遺伝子が、ｓｐｒＡ１、ｓｐｒＡ２、ｋｐｎ１、ｓｍａ１、ｓｐｒＧ、ｒｅｌＦ、ｒｓａＥ、ｙｏｅＢ、ｍａｚＦ、ｙｅｆＭ、またはリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択され、
任意により、前記細胞死遺伝子が、配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、および３１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、
請求項８に記載の合成微生物。
前記誘導可能な第１のプロモーターが、ｉｓｄＡ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ａ）、ｉｓｄＢ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ｂ）、ｉｓｄＧ（ヘム分解モノオキシゲナーゼ）、ｈｌｇＡ（ガンマ溶血素コンポーネントＡ）、ｈｌｇＡ１（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＡ２（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＢ（ガンマ溶血素コンポーネントＢ）、ｈｒｔＡＢ（ヘム調節トランスポーター）、ｓｂｎＣ（ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＩ、ｓｂｎＥ（ｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｉｓｄＩ、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＡ）、ｌｒｇＢ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＢ）、ｅａｒ（Ｅａｒタンパク質）、ｆｈｕＡ（フェリクロム輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｆｈｕＡ）、ｆｈｕＢ（フェリクロム輸送パーミアーゼ）、ｈｌｂ（ホスホリパーゼＣ）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子、ｉｓｄＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子、ＳＡＭｄｅｐＭｅｔｒａｎｓ遺伝子、ＨａｒＡ、ｓｐｌＦ（セリンプロテアーゼＳｐｌＦ）、ｓｐｌＤ（セリンプロテアーゼＳｐｌＤ）、ｄｐｓ（一般ストレスタンパク質２０Ｕ）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７（推定コバルトＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８（ナトリウム／胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６（コバルトファミリー輸送タンパク質）、ｓｒｔＢ（ソルターゼＢ）、ｓｂｎＡ（推定シデロフォア生合成タンパク質ｓｂｎＡ）、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＧ、ｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄輸送膜タンパク質）、ｓｉｒＡ（鉄ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質）、ｉｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、およびｓｐａ（ブドウ球菌属タンパク質Ａ）からなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれに由来し、
任意により、前記第１のプロモーターが、配列番号１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、
請求項９に記載の合成微生物。
前記抗毒素遺伝子が、前記第１の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるアンチセンスＲＮＡ配列をコードし、
好ましくは、前記抗毒素遺伝子が、ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子、ｓｐｒＡ２抗毒素遺伝子、ｓｐｒＧ抗毒素遺伝子もしくはｓｐｒＦ、ホリン抗毒素遺伝子、１８７−ｌｙｓＫ抗毒素遺伝子、ｙｅｆＭ抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはｍａｚＥ抗毒素遺伝子、ｋｐｎ１抗毒素遺伝子、ｓｍａ１抗毒素遺伝子、ｒｅｌＦ抗毒素遺伝子、ｒｓａＥ抗毒素遺伝子、またはｙｏｅＢ抗毒素遺伝子からなる群より選択され、そして、
任意により、前記抗毒素遺伝子が、配列番号２７３、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１４、３１９、もしくは３２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、
請求項９又は１０に記載の合成微生物。
前記第２のプロモーターが、ｃｌｆＢ（クランピングファクターＢ）、ｓｃｅＤ（オートライシン、エキソプロテインＤ）、ｗａｌＫＲ（病原性レギュレーター）、ａｔｌＡ（主要な自己溶菌酵素）、ｏａｔＡ（Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＡ）；ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子、ガラクトース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ＮａｒＺ、ＮａｒＨ、ＮａｒＴ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、ＤｅｏＲトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、およびｒｈｏからなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれらに由来し、
任意により、前記第２のプロモーターがＰclfB（クランピングファクターＢ）であり、配列番号１１７、１１８、１２９、もしくは１３０のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、
請求項１１に記載の合成微生物。
病原性ブロック分子改変およびナノファクトリー分子改変からなる群から選択される分子改変をさらに含み、
前記病原性ブロック分子改変が、前記望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止し、そして、
前記ナノファクトリー分子改変が、酵素、アミノ酸、代謝中間体、および小分子からなる群から選択される産物をコードする遺伝子の挿入、それをコードする遺伝子のノックアウト、またはそれをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の合成微生物。
有効量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味料、香味料、湿潤剤、保存料、緩衝剤、もしくは吸収剤、またはそれらの組み合わせと、を含む、組成物であって、
任意により、栄養素、プレバイオティクス、共生および／またはプロバイオティクス細菌種をさらに含む、組成物。
請求項１４に記載の組成物を含む単回用量単位であって、
少なくとも１０⁵、少なくとも１０⁶、少なくとも１０⁷、少なくとも１０⁸、少なくとも１０⁹、少なくとも１０¹⁰ＣＦＵ、または少なくとも１０¹¹の合成株と、薬学的に許容される担体と、を含み、
任意により、局所投与用に製剤化された、単回用量単位。
マイクロバイオームの宿主となる対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための方法において使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の合成微生物または請求項１４に記載の組成物であって、前記方法は、
ａ．前記宿主マイクロバイオームを脱コロニー化することと、
ｂ．非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素を含む合成微生物により、前記望ましくない微生物を永続的に置き換えることであって、前記合成微生物が、前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれること、および前記宿主マイクロバイオームにおいて前記望ましくない微生物と同じニッチを占有することが可能である、置き換えることと、を含み、
ここで、前記脱コロニー化することが、前記対象の少なくとも１つの部位で行われ、前記少なくとも１つの部位からの前記望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に低減または排除し、
任意により、前記ニッチが、前記少なくとも１つの部位での前記望ましくない微生物の安定したコロニー形成を可能にする真皮または粘膜環境であり、
ここで、前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる能力が、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、前記少なくとも１つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在によって判定され、
ここで、前記望ましくない微生物を永続的に置き換える能力が、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、前記少なくとも１つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在の不在によって判定され、そして
ここで、前記同じニッチを占有する能力が、前記少なくとも１つの部位における前記望ましくない微生物と前記合成微生物との共コロニー化の不在によって判定され、
任意選択的に、前記共コロニー形成の不在が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間で判定され、そして
好ましくは、前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも１つの要素が、前記合成微生物に永続的に組み込まれる、
合成微生物または組成物。
少なくとも１つの容器内に、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の合成微生物、請求項１４に記載の組成物、または請求項１５に記載の単回用量単位、および任意選択的に、脱コロニー化剤を含む少なくとも第２の容器、説明書のシート、促進剤を含む少なくとも第３の容器、および／またはアプリケーターを含む、キット。