JPWO2020050294A1

JPWO2020050294A1 - 相同組換え効率上昇剤及びその使用

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Publication number: JPWO2020050294A1
Application number: JP2020541254A
Authority: JP
Inventors: 岡野　栄之; 栄之岡野; 誠司塩澤; 祥吉松
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2021-08-30
Also published as: WO2020050294A1

Abstract

マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞よりも、マーモセットの細胞における発現量が高い、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する、相同組換え効率上昇剤。

Description

本発明は、相同組換え効率上昇剤及びその使用に関する。より詳細には、相同組換え効率上昇剤、相同組換え効率が上昇した細胞の製造方法及び相同組換えによりゲノムＤＮＡが改変された細胞の製造方法に関する。本願は、２０１８年９月５日に日本に出願された特願２０１８−１６５８１３号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。

相同組換えとは、異なるふたつの二本鎖ＤＮＡのうち一方の二本鎖ＤＮＡが切断され、その切断箇所の近傍に相同なＤＮＡ配列が存在する場合に、その相同配列において交叉が起き、前記二本鎖ＤＮＡの間でＤＮＡ配列が交換されることを指す。

部位特異的ヌクレアーゼを用いて任意のゲノム領域にＤＮＡ二本鎖切断を引き起こし、ＤＮＡ修復機構を利用する遺伝子改変技術はゲノム編集と呼ばれ、細胞あるいは個体レベルでの遺伝子ノックイン・ノックアウトが可能である。

例えば、非特許文献１には、ゲノム編集技術を用いて、マウスＥＳ細胞において、５種の遺伝子を同時に変異させた例が示されている。

ＤＮＡ修復機構には２種類あり、一つは非相同末端結合（Ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）である。この経路を用いたゲノム編集は、切断末端の修復過程において頻繁に起こる塩基の欠失・挿入等のエラーによるフレームシフトを利用し、遺伝子機能の喪失（ノックアウト）を起こすものである。

もう一つは相同指向性修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄＤＮＡｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）であり、部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断の際に、標的部位と相同な配列を持つ１本鎖オリゴＤＮＡあるいは二本鎖ＤＮＡ等のドナーＤＮＡを加えることで、相同組換えによって任意の変異あるいはＤＮＡ断片を標的部位に挿入（ノックイン）することが可能である。

多くの遺伝性疾患においては、１塩基置換等の変異により引き起こされることが多いため、ヒト疾患ｉＰＳ細胞や疾患モデルマウスの作製において、ノックイン技術はノックアウトと比較して優位性を持つ。また、時空間特異的なコンディショナル・ノックアウトなど高度な遺伝子改変を行う際にもノックイン技術は欠かせないものとなる。

Wang H et al., One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 153(4), 910-918, 2013.

ＮＨＥＪを介したＤＮＡ修復は、挿入・欠失させるＤＮＡ配列を制御することができない。標的部位に所望のＤＮＡ断片を挿入させるためには、ＨＤＲを介したＤＮＡ修復を利用する必要がある。

しかしながら、ＨＤＲによるＤＮＡ修復はＮＨＥＪよりも頻度が非常に低いため、一般にノックインの効率は単純ノックアウトよりもはるかに劣る。そこで、本発明では、相同組換え効率を改善する技術を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞よりも、マーモセットの細胞における発現量が高い、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する、相同組換え効率上昇剤。
［２］マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、請求項１に記載の相同組換え効率上昇剤。
［３］前記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質が、ＲＡＤ５１パラログ及び乳癌易罹患性に関わる相同組換え因子である［１］または［２］に記載の相同組換え効率上昇剤。
［４］前記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄからなる群より選択される、［３］に記載の相同組換え効率上昇剤。
［５］相同組換え効率が上昇した細胞の製造方法であって、前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、前記細胞に［１］〜［４］のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤を導入することを含む、製造方法。
［６］マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、［５］に記載の製造方法。
［７］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤が導入された、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞。
［８］マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、［７］に記載の細胞。
［９］相同組換えによりゲノムＤＮＡが改変された細胞の製造方法であって、前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、前記細胞に［１］〜［４］のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤を導入することと、前記細胞にドナーＤＮＡを導入することと、前記細胞のゲノムＤＮＡを切断することと、を含む、製造方法。
［１０］マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、［９］に記載の製造方法。

本発明によれば、相同組換え効率を改善する技術を提供することができる。

実験例２における、ＨＰＲＴ遺伝子座において相同組換えを引き起こし、相同組換え効率を算出する実験系について説明する図である。実験例２における、マーモセットＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞においての、ＲＡＤ５１Ｃ遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した結果である。実験例２における、マーモセットＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞においての、ＲＡＤ５１Ｄ遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した結果である。実験例２における、マーモセットＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞においての、ＲＡＤ５１遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した結果である。実験例２における、マーモセットＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞においての、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した結果である。実験例２における、マーモセットＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞においての、ＢＲＣＡ２遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した結果である。実験例３における、ヒトｉＰＳ細胞に各ＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させた時の、ＨＰＲＴ遺伝子における相同組換え効率を算出した結果である。実験例３における、ヒトｉＰＳ細胞に各ＤＮＡ切断修復関連タンパク質（ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄ）を組み合わせて発現させた時の、ＨＰＲＴ遺伝子における相同組換え効率を算出した結果である。実験例４における、Ｓｏｘ２遺伝子座において相同組換えを行う実験系について説明する図である。実験例４における、核においてＳＯＸ２：：Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を発現する細胞の顕微鏡像である。実験例４における、Ｖｅｎｕｓ陽性コロニー率を算出した結果である。

［相同組換え効率上昇剤］
１実施形態において、本発明は、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞よりも、マーモセットの細胞における発現量が高い、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する、相同組換え効率上昇剤を提供する。

本明細書において、相同組換え効率は、下記式（１）にしたがって求めることができる。
（相同組換え効率）＝（ＨＤＲにより修復された例）／｛（ＮＨＥＪにより修復された例）＋（ＨＤＲにより修復された例）｝（１）

マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘｊａｃｃｈｕｓ）は、霊長目に分類される新世界ザルの一種であり、その体型は小型で、世代交代時間が約１年と短いことから、霊長類のモデル動物として位置づけられている。

実施例において詳述するように、発明者らは、相同組換え効率は、ヒトＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）では１％未満であり、マウスＥＳ細胞では１〜５％であるのに対し、マーモセットＥＳ細胞では８０％より高いことを見出した。

マーモセットと相同組換え効率を比較する対象の細胞としては、例えば、多能性幹細胞であってもよいし、分化した細胞であってもよいし、癌細胞等の株化した細胞等であってもよい。多能性幹細胞としては、組織幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。

相同組換え効率が低い種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリ等が挙げられるが、これに限定されない。

発現量を比較する方法としては、例えば、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、マイクロアレイ、二次元電気泳動などが挙げられるが、これに限定されない。

ＤＮＡ切断修復関連タンパク質としては、例えば、ＲＡＤ５１パラログ、乳癌易罹患性に関わる相同組換え因子等が挙げられる。前記タンパク質はヒトタンパク質であってもよいし、マーモセットタンパク質であってもよいし、他動物種のタンパク質であってもよい。

ＲＡＤ５１パラログとしては、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＸＲＣＣ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００５４２２．１）、ＸＲＣＣ３（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００１０９３５８８．１）等が挙げられる。

乳癌易罹患性に関わる相同組換え因子としては、ＡＴＭ（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００００４２．３）、ＢＡＲＤ１（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿０００４５６．２）、ＢＲＩＰ１（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿１１４４３２．２）、ＣＨＥＫ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００１００５７３５．１）、ＭＲＥ１１Ａ（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００１３１７２７６．１）、ＭＳＨ６（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿０００１７０．１）、ＮＢＮ（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００１０１９８５９．１）、ＰＡＬＢ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿０７８９５１．２）、ＰＭＳ２（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿０００５２６．２）、ＲＡＤ５０（ＲｅｆＳｅｑＩＤＮＰ＿００５７２３．２）等が挙げられるが、これに限定されない。

また、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質としては、上述したもののうち一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を混合して用いてもよい。さらに、本実施形態の相同組換え効率上昇剤は、タンパク質に限定されず、そのタンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡ切断修復関連タンパク質は、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２であってもよい。
ＤＮＡ切断修復関連タンパク質としては、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２を混合して用いてもよく、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄを混合して用いてもよく、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄを混合して用いてもよく、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ及びＲＡＤ５１を混合して用いてもよい。

ヒト、マーモセット、マウスのＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄタンパク質、及び、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号の例を表１及び２に示す。

本実施形態の相同組換え効率上昇剤は、相同組換え効率を上昇させる活性を持つ限り、表１と表２に例示したＤＮＡ切断修復関連タンパク質及びそれらをコードする核酸の変異体であってもよい。

相同組換え効率上昇剤がタンパク質又はＲＮＡである場合には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の定法によりこれらを細胞に取り込ませることにより、相同組換え効率を上昇させることができる。

相同組換え効率上昇剤は、上記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質をコードするＤＮＡとプロモーターを連結した発現コンストラクトであってもよい。プロモーターとしては、対象細胞において活性を有するものであってもよいし、薬剤などにより活性を誘導可能な発現誘導型プロモーターであってもよい。

プロモーターとしては、例えば、ほぼ全ての細胞において強いプロモーター活性を有する、サイトメガロウイルス・プロモーター（ＣＭＶプロモーター）やＣＭＶｅａｒｌｙｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎｂｅｔａａｃｔｉｎ（ＣＡＧプロモーター）等であってもよいし、組織特異的なプロモーター活性を有するプロモーター等であってもよい。

発現誘導型プロモーターとしては、人為的にプロモーター活性を制御することのできる、ドキシサイクリン誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター）等が挙げられる。

前記発現コンストラクトは、例えば、トランスポゾンベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に組み込まれたものであってもよい。

ベクターとしては、ベクターがゲノムに組み込まれないもの、又は、一時的にゲノムに組み込まれるが、人為的な操作によってゲノムから除去することのできるベクターが好ましい。

ベクターを細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法等が挙げられる。

［相同組換え効率が上昇した細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、相同組換え効率が上昇した細胞の製造方法であって、前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、上述した相同組換え効率上昇剤を導入することを含む、製造方法を提供する。

本実施形態において、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択されるが、これに限定されない。

［相同組換え効率が上昇した細胞］
１実施形態において、本発明は、前記の相同組換え効率上昇剤が導入された、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞を提供する。本実施形態の細胞は、前記相同組換え効率上昇剤が導入されない場合と比較して、相同組換え効率が上昇している。

［相同組換えによりゲノムＤＮＡが改変された細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、相同組換えによりゲノムＤＮＡが改変された細胞の製造方法であって、前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、前記細胞に前記の相同組換え効率上昇剤を導入することと、前記細胞にドナーＤＮＡを導入することと、前記細胞のゲノムＤＮＡを切断することと、を含む、製造方法を提供する。

本実施形態において、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択されるが、これに限定されない。

ドナーＤＮＡは、５０〜５，０００塩基程度の一本鎖ＤＮＡであってもよいし、５００〜５，０００塩基対程度の二本鎖ＤＮＡであってもよい。ドナーＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断の位置を含む領域と、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。

本明細書において、配列同一性とは、対象の塩基配列が、基準となる塩基配列（基準塩基配列）に対して一致している割合を示す値である。基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００（２）

ドナーＤＮＡは、例えば、蛍光タンパク質やタンパク質タグをコードする遺伝子を含んでいてもよい。ＨＤＲにより、ゲノムＤＮＡ切断の近傍に位置する遺伝子と前記遺伝子が融合タンパク質を発現するように、ドナーＤＮＡを設計してもよい。

通常の生育環境においては、細胞内でゲノムＤＮＡの切断が起こる頻度は非常に低い。人為的にゲノムＤＮＡを切断する酵素を細胞に発現させることにより、特異的にゲノムＤＮＡ切断を起こすことができる。

前記酵素としては、ゲノムＤＮＡを標的配列特異的に切断するものであれば特に制限されない。ゲノムＤＮＡを切断する酵素が認識する標的配列の長さは、例えば、１０〜４０塩基程度であってよい。

ゲノムＤＮＡを切断する酵素は、いわゆるゲノム編集において一般的に用いられる、ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼや人工ヌクレアーゼであってもよい。

ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼとは、ガイドとなる短鎖ＲＮＡが標的配列に結合し、ヌクレアーゼが標的配列特異的にＤＮＡを切断する酵素である。ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓファミリータンパク質が挙げられるが、これに限定されない。

人工ヌクレアーゼは、標的配列に結合するＤＮＡ結合ドメインと、制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインを融合させた人工制限酵素である。人工ヌクレアーゼとしては、Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

また、ゲノムＤＮＡを切断する酵素として、例えばニッカーゼを用いてもよい。ニッカーゼとは、二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖を切断する酵素である。例えば、ゲノムＤＮＡ上の近接した位置において、ニッカーゼが二本鎖ＤＮＡの双方の鎖にニックを形成することにより、二本鎖ＤＮＡ切断が形成される。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（マーモセットＥＳ細胞の相同組換え効率）
マーモセットＥＳ細胞の相同組換え効率を解析した。
マーモセットＥＳ細胞株にＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現ベクター及びターゲティングベクターをリポフェクション法により導入し、薬剤選別によりクローンを得た。それぞれのクローンを増幅し、ＰＣＲあるいはサザンブロッティングにより遺伝型を判定した。

相同組換え効率は、ヒトＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）では１％未満であり、マウスＥＳ細胞では１〜５％であることが知られている。これに対し、マーモセットＥＳ細胞の相同組換え効率は、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞及びマウスＥＳ細胞の相同組換え効率よりも高いことが明らかとなった。

ヒトとマーモセットは近縁種であるにもかかわらず、上述したように、相同組換え効率が大きく異なる。発明者らは、マーモセットにおいては、ヒトに比べて、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質が高発現し、このことが高い相同組換え効率に寄与している可能性を想定した。

［実験例２］
（ＤＮＡ切断修復関連タンパク質の発現解析）
マーモセットＥＳ細胞の高い相同組換え効率に寄与するタンパク質を同定するために、マーモセットＥＳ細胞とヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から、ＲＮＡを分離し、これらＲＮＡについて、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより解析を行った。

その結果、マーモセットＥＳ細胞においては、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞よりも、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄが高発現していることが明らかになった。

続いて、リアルタイムＰＣＲにより、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄ遺伝子の、マーモセットＥＳ細胞とヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞における発現量をより正確に解析した。

マーモセットＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞から、スピンカラムによりＲＮＡを分離し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。検出にはリアルタイムＰＣＲ装置（型式ＶｉｉＡ７、サーモフィッシャー社）を用いた。

各細胞株における各遺伝子の発現量を評価するために、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準とした相対値を算出した。結果を図２〜６に示す。図中、ＤＳＹ１２７はマーモセット胚性幹細胞の細胞株名を示す。２０１Ｂ７、ＷＤ３９及びｅｔＫＡ４はｉＰＳ細胞株であり、ヒトｉＰＳＫｈＥＳ−１はヒトＥＳ細胞株である。

図２は、ＲＡＤ５１Ｃ遺伝子の発現量を比較した結果を示し、図３は、ＲＡＤ５１Ｄ遺伝子の発現量を比較した結果を示し、図４は、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量を比較した結果を示し、図５は、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現量を比較した結果を示し、図６は、ＢＲＣＡ２遺伝子の発現量を比較した結果を示す。

さらに、マーモセットＥＳ細胞については、他の複数のマーモセットＥＳ細胞においてもＤＳＹ１２７細胞と同様の結果が得られている。その結果、マーモセットＥＳ細胞において、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子は、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞と比較して、優位に発現が高いことが確認された。

前記の遺伝子群がコードするタンパク質は、相同組換えに関わることから、前記遺伝子の高い発現レベルが、マーモセットＥＳ細胞における高い相同組換え効率に寄与している可能性が考えられた。

［実験例３］
（相同組換え効率の制御）
実験例２に示されたマーモセットで高発現するＤＮＡ切断修復関連タンパク質である、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１ＤをヒトｉＰＳ細胞において発現させて、相同組換え効率への影響を検討した。

《相同組換え効率の定量化》
まず、相同組換え効率を定量化するために、ヒトｉＰＳ細胞において、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＨＰＲＴ）遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子カセットを相同組換えにより挿入する実験系を用いた。この相同組換えの概略を図１に示した。

図１中、ＨＰＲＴ^ＷＴは、正常なヒトＨＰＲＴ遺伝子座を示し、ＨＰＲＴｔａｒｇｅｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲティングベクターを示し、ＨＰＲＴ^Ｎｅｏは、相同組換え後のＨＰＲＴ遺伝子座を示す。

ＨＰＲＴが正常である細胞をグアニン類似体の６−チオグアニン（６−ＴＧ）存在下で培養すると、ＤＮＡに６−ＴＧが誤って取り込まれてしまうため細胞は死滅するが、ＨＰＲＴ遺伝子が破壊された細胞は６−ＴＧ存在下でも生存可能である。

また、ゲンタマイシン類似体のＧ４１８は、真核生物のタンパク質合成を阻害して細胞を死滅させるが、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入され形質転換した細胞は、Ｇ４１８存在下でも生存可能である。

また、ゲノムＤＮＡを切断する酵素として、Ｃａｓ９タンパク質を用いた。ガイドＲＮＡの配列はＨＰＲＴ遺伝子のエクソン２を標的とするものを用いた。ガイドＲＮＡの標的配列の塩基配列を配列番号１に示す。Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡを、それぞれ、ＣＡＧプロモーター又はＵ６プロモーター制御下で発現させるＤＮＡコンストラクトを作製した。

また、ＨＰＲＴ遺伝子座に相同な配列とネオマイシン耐性遺伝子カセットを有するドナーＤＮＡを作製した。ドナーＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。ドナーＤＮＡは環状二本鎖ＤＮＡを用いた。

前記のＤＮＡ切断修復関連タンパク質の発現コンストラクト、ドナーＤＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡの発現コンストラクトを混合し、エレクトロポレーション法を用いて野生型ヒトｉＰＳ細胞へ導入した。

前記ＤＮＡを細胞へ導入した後、これら細胞を等量の２群に分け、一方にはＧ４１８のみを加え、他方にはＧ４１８と６−ＴＧを加えて、培養し、選別を行った。この２群のコロニー数をそれぞれ計測した。

ここで、ネオマイシン耐性遺伝子カセットがゲノム上のいずれかの位置に挿入されたＧ４１８耐性クローンの数は、相同組換え体と非相同組換え体の合計の数を反映する。一方、ネオマイシン遺伝子カセットがＨＰＲＴ遺伝子座に挿入された、Ｇ４１８と６−ＴＧの両方に耐性を持つクローンの数は、相同組換え体の数を反映する。

そして、Ｇ４１８と６−ＴＧの両方に耐性を持つ細胞と、Ｇ４１８耐性細胞のコロニー数の比を下記式（３）から算出することにより、相同組換え効率を算出することができる。
（相同組換え効率）＝（Ｇ４１８と６−ＴＧの両方に耐性を持つ細胞のコロニー数）／（Ｇ４１８耐性細胞のコロニー数）（３）

《ＤＮＡ切断修復関連タンパク質の過剰発現》
ヒトＲＡＤ５１、ヒトＲＡＤ５１Ｃ及びヒトＲＡＤ５１Ｄをコードする遺伝子配列を、それぞれ、ＣＡＧプロモーターの下流に連結した発現コンストラクトを作製した。また、ヒトＢＲＣＡ１及びヒトＢＲＣＡ２をコードする遺伝子配列を、それぞれ、ＣＭＶプロモーターの下流に連結した発現コンストラクトを作製した。

ＲＡＤ５１のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００２８７５．４であり、ＲＡＤタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００２８６６．２である。ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１ＤのＮＣＢＩアクセッション番号は表１と２に示した通りである。

複数のＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させる場合には、複数の前記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質の発現コンストラクトを、前記ドナーＤＮＡコンストラクト、ゲノムＤＮＡを切断する酵素の発現コンストラクトと共に混合し、ヒトｉＰＳ細胞に導入した。

計測したコロニー数から、上記式（３）を用いて、相同組換え効率を算出した。結果を図７と図８に示す。図７と図８の縦軸は、上記式（３）により算出した相同組換え効率を示す。図７は１種類の、図８は２種以上のＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させた場合の相同組換え効率を示す。図７及び図８中、ｍｏｃｋはＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させなかった場合を示す。

図７に示す結果から、ＣＭＶプロモーター制御下にヒトＢＲＣＡ１及びヒトＢＲＣＡ２を発現するヒトｉＰＳ細胞は、野生型ヒトｉＰＳ細胞に比べて、相同組換え効率が上昇することが明らかになった。

図８に示す結果から、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質を組み合わせて発現させた場合、すなわちＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１ＣとＲＡＤ５１Ｄ、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２とＲＡＤ５１ＣとＲＡＤ５１Ｄを発現させた場合、相同組換え効率は有意に上昇することが明らかになった。

これらの結果から、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄは、相同組換え効率上昇に寄与することが明らかになった。

［実験例４］
マウスＥＳ細胞に、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＲＡＤ５１を発現させ、Ｓｏｘ２遺伝子座にＶｅｎｕｓ遺伝子を相同組換えにより挿入して、相同組換え効率を算出した。

相同組換え効率を定量化するために、マウスＥＳ細胞において、Ｓｏｘ２遺伝子座に緑色蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓを相同組換えにより挿入する実験系を利用した。この相同組換えの実験の概略を図９に示した。

図９中、ＷｉｌｄｔｙｐｅはゲノムＤＮＡ上のＳｏｘ２遺伝子座を示し、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎは、ＶｅｎｕｓがＳｏｘ２遺伝子座にインフレームで挿入された、相同組換え後のＳｏｘ２遺伝子座を示す。

ゲノムＤＮＡを切断する酵素としてＣａｓ９タンパク質を用いた。また、ガイドＲＮＡは、ＳＯＸ２遺伝子の終止コドン周辺を標的とするように設計した。また、マウスＥＳ細胞として、ＥＢ３株を用いた。

ドナーＤＮＡとして、ＶｅｎｕｓをコードするＯＲＦと、ＳＯＸ２遺伝子の終止コドンの上流の約５００塩基対と、ＳＯＸ２遺伝子の終止コドンの下流の約５００塩基対とを有するものを作製した。ＶｅｎｕｓのＯＲＦは、ＳＯＸ２遺伝子とインフレームで連結するように、ドナーＤＮＡを設計した。ドナーＤＮＡは環状二本鎖ＤＮＡを用いた。

ＤＮＡ切断修復関連タンパク質の発現コンストラクトとして、ヒトＢＲＣＡ１遺伝子、ヒトＢＲＣＡ２遺伝子、ヒトＲＡＤ５１Ｃ遺伝子、ヒトＲＡＤ５１Ｄ遺伝子、ヒトＲＡＤ５１遺伝子を、それぞれ、ＣＡＧプロモーターの下流に連結した発現コンストラクトを用いた。

ＤＮＡ切断修復関連タンパク質の発現コンストラクトと、ドナーＤＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの発現コンストラクトとを混合したものを、エレクトロポレーション法によりマウスＥＳ細胞へ導入した。続いて、得られた細胞を播種して培養した。結果を図１０に示す。

図１０は、相同組換え後、Ｖｅｎｕｓを発現する細胞を撮影した顕微鏡像である。その結果、相同組換えによりＶｅｎｕｓがＳｏｘ２遺伝子座に挿入された細胞においては、ＳＯＸ２：：Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質が核に局在することが明らかになった。

また、エレクトロポレーションを行った細胞を培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーのうち、Ｖｅｎｕｓを発現する細胞を有するコロニーの割合（Ｖｅｎｕｓ陽性コロニー率）を計測した。結果を図１１に示す。

図１１は、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させた場合の、Ｖｅｎｕｓ陽性コロニー率を示す結果である。図１１中、４Ｆは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄを同時に発現させた場合を示し、５Ｆは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ及びＲＡＤ５１を同時に発現させた場合を示す。図１１中、ＭｏｃｋはＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させなかった場合を示す。

その結果、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄを単独で発現させた場合、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ及びＲＡＤ５１Ｄを発現させた場合、並びに、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ及びＲＡＤ５１を発現させた場合、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質を発現させなかった場合と比較して、Ｖｅｎｕｓ陽性コロニー率が有意に上昇した。

Claims

マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞よりも、マーモセットの細胞における発現量が高い、ＤＮＡ切断修復関連タンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する、相同組換え効率上昇剤。
マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、請求項１に記載の相同組換え効率上昇剤。
前記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質が、ＲＡＤ５１パラログ及び乳癌易罹患性に関わる相同組換え因子である請求項１または２に記載の相同組換え効率上昇剤。
前記ＤＮＡ切断修復関連タンパク質が、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２からなる群より選択される、請求項３に記載の相同組換え効率上昇剤。
相同組換え効率が上昇した細胞の製造方法であって、
前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、
前記細胞に請求項１〜４のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤を導入することを含む、製造方法。
マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、請求項５に記載の製造方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤が導入された、マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞。
マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、請求項７に記載の細胞。
相同組換えによりゲノムＤＮＡが改変された細胞の製造方法であって、
前記細胞はマーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い種の細胞であり、
前記細胞に請求項１〜４のいずれか一項に記載の相同組換え効率上昇剤を導入することと、
前記細胞にドナーＤＮＡを導入することと、
前記細胞のゲノムＤＮＡを切断することと、
を含む、製造方法。
マーモセットの細胞と比較して相同組換え効率が低い前記種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット、イヌ、ネコ及びニワトリからなる群より選択される、請求項９に記載の製造方法。