JPWO2020026979A1 - 膜タンパク質活性測定法 - Google Patents
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Abstract
Description
(項目1) シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せであって、該コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第1〜第Nの因子をコードする第1〜第Nのヌクレオチド配列を含み、ここで、Nは2以上の整数である、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
(項目2) 前記項目に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、
前記第1〜第Nの因子の少なくとも1つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトと
を含む、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
(項目3) シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトの組合せであって、
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードするヌクレオチド配列に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは3〜Nまでの自然数である、コンストラクトの組合せ。
(項目4) キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトをさらに含む、前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
(項目5) 前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキット。
(項目6)
前記コンストラクトを細胞に導入するための薬剤をさらに含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目7) 前記タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子を特定することを含む、前記項目のいずれかに記載のコンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットの製造方法。
(項目8) 前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む細胞。
(項目9) シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第1〜第Nの因子をコードする第1〜第Nのヌクレオチド配列と、
該第1〜第Nの因子の少なくとも1つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、Nは2以上の整数である、細胞。
(項目10) シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードする遺伝子に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは3〜Nの自然数である、細胞。
(項目11) 膜タンパク質を発現する細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第1の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第1の因子をコードする第1のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第2の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第2の因子をコードする第2のヌクレオチド配列と、
該第1の因子によって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該第2の因子は、該第1の因子の標識の発現を惹起させる活性を惹起または促進するように構成されている、細胞。
(項目11−1) 前記第1の因子が、転写因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−2) 前記転写因子が、不活性化した状態で発現されるように構成されている、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−3) 前記転写因子が、細胞膜アンカー型転写因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−4) 前記第2の因子が、前記転写因子を細胞膜から解離させる活性を有する、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−5) 前記第2の因子が、プロテアーゼである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−6) 前記細胞膜アンカー型転写因子が、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、前記第2の因子によって切断される切断可能リンカーを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−7) 前記第2の因子が、細胞膜型因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目11−8) 前記膜タンパク質が、Gタンパク質共役受容体、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、チャネル、トランスポーターまたは細胞接着分子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目12) 前記細胞は、HeLa細胞、HEK293細胞、CHO細胞、COS−1/7細胞、HL60細胞、K562細胞、Jurkat細胞、HepG2細胞、Saos−2細胞、F9細胞、C2C12細胞、PC12細胞、NIH/3T3細胞、U2OS細胞、Vero細胞、MDCK細胞、MEF細胞、U937細胞、C6細胞、Neuro2A細胞、SK−N−MC細胞、SK−N−SH細胞、HUVEC細胞、THP−1細胞、BW5147細胞、Ba/F3細胞、Y−1細胞、H295R細胞、MIN6細胞、NIT−1細胞およびMDA−MB435S細胞から選択される少なくとも1つを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目12A) 前記細胞がHeLa細胞又はHEK293T細胞である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目13) 前記遺伝子は、ARC、CCL20、CTGF、DUSP5、EGR1、EGR2、EGR3、FOSB、NR4A1、NR4A3、CYR61及びFOSからなる群から選択される、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目13A) 前記第1の遺伝子が、NR4A1である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目13B) 前記第2の遺伝子が、CTGFである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目13C) 前記第1の遺伝子が、FOSである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目13D) 前記第2の遺伝子が、FOSBである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目14) 膜タンパク質を発現するHeLa細胞又はHEK293T細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第1の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第1のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、第1のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第2の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第2のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、第2のヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含み、該細胞がHeLa細胞のときは、該第1の遺伝子がNR4A1、及び該第2の遺伝子がCTGFであり、該細胞がHEK293T細胞のときは、該第1の遺伝子がFOS、及び該第2の遺伝子がFOSBである、細胞。
(項目15) キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニットを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目16) それぞれ異なる膜タンパク質を発現する複数の細胞を含むキットであって、該複数の細胞の各々は、前記項目のいずれかに記載の細胞である、キット。
(項目17) 被験化合物の膜タンパク質への作用を網羅的に解析するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目18) 前記項目のいずれかに記載の細胞、または前記項目のいずれかに記載のキットを用いることを特徴とする、被験化合物の膜タンパク質への作用の解析方法。
(項目19) 前記項目のいずれかに記載の細胞の製造方法であって、
細胞に、前記膜タンパク質またはGPCRをトランスフェクトする工程と、
前記第1〜第Nの遺伝子の遺伝子座に、各遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるように前記第1〜第Nのヌクレオチドを導入する工程と
を含む、方法。
(項目20) キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が、該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニット。
(項目21) 前記異なるGαは、Gαsである、前記項目に記載のキメラGタンパク質αサブユニット。
(項目22) 第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端の約6アミノ酸が前記異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、前記項目のいずれかに記載のキメラGタンパク質αサブユニット。
(項目23) 前記項目のいずれかに記載のキメラGタンパク質αサブユニットを含む、キメラGタンパク質。
(項目24) 前記項目のいずれかに記載のキメラGタンパク質と、該キメラGタンパク質と共役しているGタンパク質共役型受容体(GPCR)とを含む、複合体。
(項目25) 前記項目のいずれかに記載の複合体を含む、細胞。
(項目26) 前記項目のいずれかに記載のコンストラクトをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
(項目27) GPCRの機能分析に用いるための、前記項目のいずれかに記載の細胞を含む組成物。
(項目28) 細胞のGPCRの機能分析に用いるためのコンストラクトであって、該コンストラクトは、Gタンパク質サブユニットα12の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と、置き換えられるGα12とは異なるGタンパク質αサブユニットの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列とを含み、Gα12のアミノ酸配列におけるC末端のアミノ酸配列が置き換えられるGα12とは異なるGタンパク質αサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有するキメラGタンパク質αサブユニットを発現するように構成されている、コンストラクト。
(項目29) シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するために、ある細胞において、該タンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該活性化因子と接触させなかった場合と比較して該活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
(項目30) ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該タンパク質の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
(項目31) 前記タンパク質は、Gタンパク質G12/13と特異的に共役するGPCRである、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目32) 前記細胞において、前記候補遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるようにヌクレオチド配列を導入する工程をさらに含む、項目9〜15のいずれか1項に記載の細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載の方法。
細胞膜に発現する膜タンパク質にリガンドが結合した後に、同じ時相において生じる複数の細胞内シグナル伝達経路の活性化、すなわちある膜タンパク質の活性化とその下流においてほぼ同時期に生じる複数の異なる遺伝子発現について考える。
図1に示すように、タンパク質1を、プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜アンカー型人工転写因子とし、タンパク質2をプロテアーゼとすると、リガンドが膜タンパク質(例えばGPCR)に結合することによりシグナル伝達が起こり、転写調節領域1が機能して細胞膜アンカー型人工転写因子が発現し、発現及び生成した当該転写因子は細胞膜に結合する。この段階では、この転写因子は細胞膜に結合したままなので不活性型である。
この活性型転写因子が結合する配列(人工転写因子結合配列)とレポーター遺伝子とを連結したコンストラクト(図1では「人工転写因子結合配列−ルシフェラーゼレポーター」)を作製して、これをコンストラクト1及びコンストラクト2とともに細胞に導入しておけば、上記の通り切り離された転写因子が人工転写因子結合配列に結合し、その下流のレポーター遺伝子が発現する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義及び/又は基本的技術内容を適宜説明する。
本明細書において、「シグナル伝達を担う」分子とは、その分子における変化が、他の分子における変化をもたらす任意の分子を指す。このような分子には、Gタンパク質共役型受容体などの受容体、イオンチャネル等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明は、シグナル伝達を担う分子への化合物の作用を調査する手段を提供する。ここで、シグナル伝達を担う分子としては、当該分子の活性化によって下流にシグナルが伝達される分子であれば特段制限はされない。シグナル伝達を担う分子は、被験化合物が直接作用する分子(例えば、受容体そのもの)でもよく、また、被験化合物が作用した分子からのシグナル伝達によって活性化されて下流にシグナルを伝達する分子(例えば、受容体と共役しているタンパク質)でもよい。シグナル伝達を担う分子としては、下流で何らかの遺伝子の発現を誘導するものを用いることができる。シグナル伝達を担う分子としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖、またはこれらの複合体などが挙げられるが、好ましくは、シグナル伝達を担うタンパク質である。
1)評価したい受容体を過剰発現させた細胞において、リガンド刺激前後でその発現量が有意に上昇する遺伝子群を同定する。
2)この遺伝子群から刺激応答比(リガンド刺激後の発現量/リガンド刺激前の発現量)の高い遺伝子をひとつ選択し、その遺伝子の転写調節領域を同定する。
3)同定された転写調節領域をクローニングし、その下流にレポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼなど)を連結させた人工遺伝子(外因性レポーター遺伝子プラスミド)を作製する。
4)評価したい受容体を過剰発現させた細胞に、上記の人工遺伝子を外因性に遺伝子導入し、リガンド刺激前後の外因性レポーター遺伝子産物の活性を測定する。
本発明では、タンパク質の活性化(例えば、リガンド、イオンによる刺激による)によって発現が変化する遺伝子の転写調節領域における変化を複数の因子を介在させて統合することによって、当該タンパク質の活性化を検出する系が提供される。
(1)「遺伝子#1の転写調節領域」を「酵素反応の基質(S)をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第1のコンストラクト
(2)「遺伝子#2の転写調節領域」を「酵素反応の酵素(E1)をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第2のコンストラクト
(3)「遺伝子#3の転写調節領域」を「SとE1の生産物P1を基質とする酵素(E2)をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第3のコンストラクト
(4)「遺伝子#4の転写調節領域」を「P1とE2の生産物P2を基質とする酵素(E3)をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第4のコンストラクト
↓
(N)「遺伝子#Nの転写調節領域」を「P(n−3)とE(n−2)の生産物P(n−2)を基質とする酵素(E(n−1))をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第nのコンストラクト
(N+1)一連の酵素反応の最終生産物P(n−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように設計されたレポーター遺伝子コンストラクト
酵素[E]+基質[S]→酵素基質複合体[ES]→酵素[E]+生産物[P]
([ ]は濃度を表す)
で表され、反応速度は[S]と[E]の積に比例する。このため、[S]と[E]が経過中一定であると仮定すると、反応開始から一定時間後の[P]も[S]と[E]の積に比例する。よって上記の一連の酵素反応で生産される最終生産物P(n−1)の濃度は、
[P(n−1)]=[S]×[E1]×[E2]×・・・×[E(n−1)]となり、最終的なレポーター遺伝子の刺激応答比は理論上、
(遺伝子#1の刺激応答比)×(遺伝子#2の刺激応答比)×(遺伝子#3の刺激応答比)×(遺伝子#4の刺激応答比)×・・・×(遺伝子#Nの刺激応答比)、すなわちN個の遺伝子がそれぞれ有する刺激応答比のすべてをかけあわせたものとなる(相乗的増幅)。但し、本想定は原理を非常に単純化したモデルであるため、実際の連鎖反応において各反応の[S]と[E]は一定ではない。
NR4A2, LOC100506747, NR4A1, EPPK1, JUN, AMOTL2, FLNA, ARC, IER2, JUNB(少なくともいずれかの実験で5倍以上の発現変動);ならびに
CNN2, DUSP1, MAFF, GPR3, TPM1, PTGS2, ATF3, G0S2, TRIB1, SNAI2, PDLIM7, NFKBIZ, TIMP3, FHL2, SPRY2, FOSL2, FERMT2, VCL, NUPR1, TPM4, GRASP, NKX2-5, TUFT1, ID1, FOSL1, MYADM, ACTB, LPP, KLF7, KLF6, ADAMTS1, BTG2, ACTG1, CSRNP1, WDR1, SRF, GEM, ZYX, NR2F1, LOC101928358, ITPRIP, FUT1, COL3A1, LIMA1, SLC8A1, JAG1, SLC6A9, PMAIP1, SLC2A10, PCK2, ZFP36L1, MAFB, CBX4, FZD10, ZBTB10, JDP2, ZNF214, RHOB, ID2, RND3, IRF2BPL, BMP2, SOX4, JUND, SLC1A4, PNRC1, SYBU(少なくともいずれかの実験で2倍以上の発現変動)
また、本発明の別の態様において、細胞がHEK293Tの場合は、選択された2つの異なる遺伝子座(FOS locusおよびFOSB locus)の3’UTRに細胞膜型人工転写因子とプロテアーゼをノックインすることにより、HeLa細胞と同様の機能を持つインディケーター細胞を作成することができる。
1.Luciferaseと目的GPCRの遺伝子をレポーター細胞に導入する。
2.GPCR刺激により膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼが発現誘導されるようにあらかじめアッセイに使用する細胞のゲノムは改変されている。
3.GPCR刺激で誘導された転写因子とプロテアーゼが相乗的にルシフェラーゼ発現を誘導する。
1つの実施形態において、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せが提供される。コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第1〜第Nの因子をコードする第1〜第Nのヌクレオチド配列を含み得る。Nは2以上の整数である。このコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、上記第1〜第Nの因子の少なくとも1つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトとを含む、コンストラクトの組合せも提供され得る。
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードするヌクレオチド配列に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは1〜Nまでの自然数である、キットであり得る。キットには、本明細書に記載されるキメラGタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトがさらに含まれ得る。キットは、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せを細胞に導入するため、あるいはコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを細胞内で形成するための薬剤をさらに含んでもよい。上記タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子を特定することによって、上記コンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットを製造することができる。
本発明において、本明細書に記載されるアッセイ系を組み込んだ細胞が提供される。細胞としては、例えば、HeLa細胞、HEK293細胞、CHO細胞、COS−1/7細胞、HL60細胞、K562細胞、Jurkat細胞、HepG2細胞、Saos−2細胞、F9細胞、C2C12細胞、PC12細胞、NIH/3T3細胞、U2OS細胞、Vero細胞、MDCK細胞、MEF細胞、U937細胞、C6細胞、Neuro2A細胞、SK−N−MC細胞、SK−N−SH細胞、HUVEC細胞、THP−1細胞、BW5147細胞、Ba/F3細胞、Y−1細胞、H295R細胞、MIN6細胞、NIT−1細胞およびMDA−MB435S細胞からなる群から選択される1または複数の細胞を使用することが可能である。
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードする遺伝子に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは1〜Nの自然数である。
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第1の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第1のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、ヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第2の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第2のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、ヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Gタンパク質共役受容体、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含む細胞である。
当該細胞としては、HeLa細胞又はHEK293T細胞が挙げられる。そして、細胞がHeLa細胞のときは、例えば、該第1の遺伝子はNR4A1であり、該第2の遺伝子はCTGFである。また、細胞がHEK293T細胞のときは、例えば、該第1の遺伝子はFOSであり、該第2の遺伝子はFOSBである。
別の局面において、本発明はまた、キメラGタンパク質、それをコードする核酸、それを発現する細胞、およびそれを用いる方法も提供する。本明細書において、キメラとなっているGタンパク質αサブユニット、およびそれを含むキメラGタンパク質が提供される。Gタンパク質の受容体への配向性はGαサブユニットのC末端のアミノ酸配列で決定されるため、キメラGタンパク質を用いることによって、あるGタンパク質と共役するGPCRの活性化を、異なるGタンパク質が活性化されたときに生じる細胞内シグナルを用いて検出することが可能になる。本発明では、あるG12/13のαサブユニットにおいて、C末端のアミノ酸配列が、異なるGタンパク質αサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているキメラGタンパク質αサブユニットが提供される。
また、他の局面において、本発明は、ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法を提供する。この方法で見いだされた活性化可能な遺伝子は、本発明のタンパク質の網羅的アッセイにおいて利用することができ、本発明のコンストラクトの一部として用いることができる。
上記分子を発現する細胞を活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
上記分子を発現しない細胞を、上記分子の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
上記分子を発現しない細胞を、上記分子の活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程とを含み得る。また、上記分子を発現する細胞を上記分子の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程を含み得る。
本発明は、網羅的に被験化合物の膜タンパク質への作用を調査するのに利用可能である。網羅的な調査は、意図されるある特定の標的への作用を調査するのみではなく、意図される標的とは異なる分子への作用、すなわちオフターゲット活性を検出するのに有用である。特定の標的への作用を調べることで、被験化合物の医薬等への有用性を調べることができるのに加え、オフターゲット活性の検出により、化合物の安全性試験または毒性試験を行うことができる。したがって、本発明は、創薬の支援に有用である。1つの利用法としては、標的となる受容体を活性化させる被験化合物の、標的となる受容体を含めた、1または複数の受容体への結合をスクリーニングすることができる。結合をスクリーニングできる受容体として、本明細書に挙げられるものを標的とすることができるが、例えば、GPCR(例えば、今まで活性化の検出が難しかったG12/13に共役するGPCR)を標的とすることができる。GPCRには味覚に関する受容体(例えば、苦味受容体)が含まれ、一例として、苦味受容体への作用を調べることで、被験化合物の呈味特性を調べることができる。また、網羅的なスクリーニングにより、リガンドが未知であるいわゆるオーファン受容体を標的とすることもできる。加えて、本明細書の実施例に示されるように、受容体型チロシンキナーゼの活性化を検出することも可能である。
[概要]
本実施例において、異なる転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示す。より詳細には、異なる転写調節領域(本実験においてはNFAT(nuclear factor of activated T−cells)転写調節領とSRF(serum response factor)転写調節領域)を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示す。
GPCR群に属するアンジオテンシン1型受容体(hAgtr1)はそのリガンドであるアンジオテンシンIIにより活性化され、アッセイに使用する細胞種に依存せず(どの細胞種においてもほぼ共通して)、NFAT(nuclear factor of activated T−cells)転写調節領域やSRF(serum response factor)転写調節領域をもつ遺伝子の発現を上昇させることが既に知られている。そこで、これらの二つの転写調節領域に連結する因子として、以下に示す二つの人工遺伝子(TMGVとTM3C)を作成した。
ストップコドンを欠失させたヒトIL2受容体アルファ鎖(NM_000417)のC末端に、HRVプロテアーゼ3C認識切断配列(LEVLFQGP(配列番号1))を含むアミノ酸配列GSSSLEVLFQGPGSSS(配列番号2)をin−frameで連結し、そのC末端にさらに開始コドンを欠失させたGal4VP64(GV:人工転写因子)をin−frameで連結した。
ストップコドンを欠失させたヒトIL2受容体アルファ鎖(NM_000417)のC末端に、GSリンカー配列(GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号3))、開始コドンとストップコドンを共に欠失させたHRVプロテアーゼ3C(アミノ酸配列はヒト化されている)を順にin−frameで連結し、さらにそのC末端に当該膜タンパク質を不安定化させる目的でPEST配列を付加した。
(1) hAgtr1+NFAT−TMGV+Constitutive−promotor(Cp)−TM3C+UAS−luciferase
(TMGVのみにリガンド刺激により発現誘導がかかる)
(2) hAgtr1+Cp−TMGV+SRF−TM3C+UAS−luciferase
(TM3Cのみリガンド刺激により発現誘導がかかる)
(3)hAgtr1+NFAT−TMGV+SRF−TM3C+UAS−luciferase
(TMGVとTM3Cの両者においてリガンド刺激により発現誘導がかかる)
結果は図3に示される。(3)において、(1)および(2)と比較してより良好なリガンド濃度依存的なシグナルが検出された。異なる転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することが実証された。
[概要]
本実施例は、同一の転写調節領域(本実験においてはSRF(serum response factor) 転写調節領域)を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示すことを目的とする。
GPCR群に属するアンジオテンシン1型受容体(hAgtr1)はそのリガンドであるアンジオテンシンIIにより活性化され、アッセイに使用する細胞種に依存せず(どの細胞種においてもほぼ共通して)、SRF(serum response factor)転写調節領域をもつ遺伝子の発現を上昇させることが既に知られている。
(1) hAgtr1+SRF−TMGV+Constitutive−promotor(Cp)−TM3C+UAS−luciferase
(TMGVのみリガンド刺激により発現誘導がかかる)
(2) hAgtr1+Cp−TMGV+SRF−TM3C+UAS−luciferase
(TM3Cのみリガンド刺激により発現誘導がかかる)
(3) hAgtr1+SRF−TMGV+SRF−TM3C+UAS−luciferase
(TMGVとTM3Cの両者においてリガンド刺激により発現誘導がかかる)
結果は図4に示される。(3)において、(1)および(2)と比較してより良好なリガンド濃度依存的なシグナルが検出された。同一の転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することが実証された。
[概要]
G12/13タンパク質の活性化前後で高い応答比をもって反応する転写調節領域が現時点では明らかになっていないため、G12/13にカップルするGPCRを通常のレポーターアッセイ系によって評価することは困難である。そこで、前述の実施例での知見を利用して、G12/13にカップルするGPCRの評価を行うことができるかを検証した。
リガンドにより刺激されたGPCRはヘテロ三量体GTP結合タンパク質(Gタンパク質:α、β、γの3つのサブユニットから構成される)を介して細胞内へとシグナルを伝達する。Gタンパク質はαサブユニットの配列に基づき、Gs、Gi、Gq、G12/13に大別され、GPCRはそれぞれ、「GsにカップルするGPCR」、「GqにカップルするGPCR」、「GiにカップルするGPCR」、「G12/13にカップルするGPCR」の4群に分類される。
そこで10倍程度の中等度の刺激応答比を有する二つの遺伝子(遺伝子#1と遺伝子#2)に着目した。(遺伝子#1:NR4A1、遺伝子#2:CTGF)
Suzuki K et al Nature 540:144−149,2016に記載されるゲノム編集手順を参考として、インディケーターHeLa細胞を以下のとおり作成した。
(CRISPR認識配列:一番目の標的部位用)−(flox−Blastcidinカセット)−(IRES−TMGV)−(CRISPR認識配列:一番目の標的部位用)
以後これをTMGV donor plasmid(DP−TMGV)と記す。
(CRISPR認識配列:二番目の標的部位用)−(flox−Neomycinカセット)−(IRES−TM3C)−(CRISPR認識配列:二番目の標的部位用)
以後これをTM3C donor plasmid (DP−TM3C)と記す。
使用するプラスミド
(1)評価したいGPCRを発現するプラスミド (GPCR発現プラスミド)
(2)UAS−luciferase(sGVによりluciferaseの発現が誘導される人工レポーター遺伝子)
NCP19(図6)
Day1:NCP19細胞を24000cells/wellの密度で96穴プレートに播種する。
GPR55およびLPAR6について、従来法での検出も試みた。詳細は以下のとおり。
使用する細胞:HeLa細胞(ATCCより購入)、HEK293T細胞
使用するプラスミド
(1)評価したいGPCRを発現するプラスミド(GPCR発現プラスミド)
本実験においてはGPR55およびLPAR6発現プラスミド
(2)SRF−luciferase
使用する細胞:N182細胞(TMGVのみが既にゲノムにノックインされている細胞)
使用するプラスミド
(1)評価したいGPCRを発現するプラスミド(GPCR発現プラスミド)
本実験においてはGPR55およびLPAR6発現プラスミド
(2)TM3C発現プラスミド(プロテアーゼを構成的なプロモーターで発現するプラスミド)
(3)UAS−luciferase
使用するプラスミド
(1)評価したいGPCRを発現するプラスミド (GPCR発現プラスミド)
本実験においてはGPR119、Adrb2およびADORA2A発現プラスミド
(2)CRE−luciferase
各濃度のリガンドの添加により、各アッセイ系から得られたシグナル(発光強度・リガンド最低濃度時のシグナルからの変化倍率)を、図7〜図11に示す。上記アッセイプロトコールにより、リガンド濃度の増加に伴うシグナルの増大が観察された。
上記のアッセイプロトコールにより、「G12/13にカップルするGPCR」の活性化は問題なく評価できた(図7および8)。本アッセイ系の目的の1つであった「G12/13にカップルするGPCR」の高感度の評価が達成された。従来法では活性化が評価できていない(図7)。
[概要]
本実施例は、NCP19細胞を用いたアッセイ系により、GPCRだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることを示すことを目的とする。本実施例ではGPCR以外の細胞膜受容体の一例として受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するヒトFlt3(hFlt3)を実験対象とした。
使用する細胞:NCP19
使用するプラスミド
(1) hFlt3を発現するプラスミド(hFlt3発現プラスミド)
(2) UAS−luciferase
結果を、図12に示した。図12に示されるように、Flt3−Ligandの添加によるhFlt3の活性化がルシフェラーゼの発光として検出された。NR4A1およびCTGF遺伝子の転写調節領域にTMGVおよびTM3CがノックインされているNCP19細胞を用いたアッセイ系により、GPCRだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることが示された。
[概要]
本実施例は、NCP19細胞を用いたアッセイ系により、GPCRだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターでうることを示すことを目的とする。本実施例ではGPCR以外の細胞膜受容体の一例として受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するヒトEGF受容体を実験対象とした。尚、ヒトEGF受容体であるhEGFR、hErbB2、hErbB3はNCP19細胞に内在性に発現している。
使用する細胞:NCP19
使用するプラスミド
UAS−luciferase
結果を、図13に示した。図13に示されるように、EGFの添加によるEGF受容体の活性化がルシフェラーゼの発光として検出された。NR4A1およびCTGF遺伝子の転写調節領域にTMGVおよびTM3CがノックインされているNCP19細胞を用いたアッセイ系により、GPCRだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることが示された。
上記実施例に記載される方法に従って、以下のGPCRのいずれかを細胞に発現させる。上記実施例に記載される方法に従って、GPCRを発現させた細胞をリガンド刺激し、受容体の活性化状態をモニターする。
[概要]
GsにカップルするGPCRの一部(Adrb2、ADORA2A)については、上記のアッセイプロトコールを用いた場合に活性化が検出されなかった(図10)。プロトコールの変更により、「GsにカップルするGPCR」の効率の良い評価を実現するため、以下の実験を行った。
実施例A3のプロトコールにおいて、Day2を以下のとおり変更し、その他は同様にしてAdrb2およびADORA2A(Gs)の活性化の評価を行った。
Day2:96穴プレートに播種してから24時間以内に1wellあたりDNA120ng(GPCR 60ng+UAS−luciferase 30ng+G12/s chimera 30ngからなるプラスミドカクテル)をリポフェクション法により遺伝子導入する。
Gタンパク質の受容体への配向性はGαサブユニットのC末端の数個のアミノ酸配列で決定される。よって、胴体部分はすべてGα12由来で、C末端最後の6アミノ酸のみGαs由来となるGα12/sキメラ(今後は単にG12/sキメラと呼ぶ)を作成した(下記アミノ酸配列を参照のこと)。このG12/sキメラは「GsにカップルするGPCR」とカップルすることが可能で、しかも野生型G12が活性化されたときに生じる細胞内シグナルと同じシグナルを細胞内に惹起することができる。
本実施例のプロトコールを用いた場合、Adrb2およびADORA2Aのいずれについても、リガンド濃度依存的なシグナルの増大を検出することができた(図10)。
上記変更により、「GsにカップルするGPCR」の活性も効率よく評価することが可能であることが示される。また、この結果から、「どのGタンパク質にカップルするか不明のGPCR(オーファンGPCR)」を評価する際にも上記のように変更したプロトコールの使用が望ましいと考えられる。
[概要]
本実施例は、NCP19細胞を用いたアッセイ系において、G12/sキメラ以外のキメラGタンパク質も有用であることを示すことを目的とする。Giに共役する受容体として知られるヒトソマトスタチン2型受容体(hSSTR2)およびG12/iキメラを実験対象とした。
使用する細胞:NCP19
使用するプラスミド
(1)hSSTR2を発現するプラスミド(hSSTR2発現プラスミド)
(2)UAS−luciferase
(3)G12/iキメラ蛋白質を発現するプラスミド(G12/i発現プラスミド)
結果を図11に示した。G12/iキメラタンパク質なしでも活性は十分に検出できる(図11左)が、キメラ存在下では、その活性検出能が有意に改善される(図11右)。なお、左図と右図において、縦軸のスケールが約20倍程異なることに注意されたい。
[概要]
本発明のアッセイ系の構築のための、使用する細胞において目的タンパク質の活性化によって発現が誘導される遺伝子の同定方法を実証する。
Gタンパク質G12/13を特異的に活性化させるGPCRとしてGPR55およびLPAR6の2つの受容体が知られている。そこでHeLa細胞と、GPR55およびLPAR6とを用いて、以下のような7条件で実験を施行した。なお、LPIはGPR55のリガンド、LPA(Lysophosphatidic acid)はLPAR6のリガンド、としてそれぞれ機能することが既に知られている物質である。
条件1 HeLa細胞(野生型)
条件2 HeLa細胞(野生型)+mock+LPI10uM:1時間刺激
条件3 HeLa細胞(野生型)+GPR55+Vehicle:1時間刺激
条件4 HeLa細胞(野生型)+GPR55+LPI10uM:1時間刺激
条件5 HeLa細胞(野生型)+mock+LPA10uM:1時間刺激
条件6 HeLa細胞(野生型)+LPAR6+Vehicle:1時間刺激
条件7 HeLa細胞(野生型)+LPAR6+LPA10uM:1時間刺激
Day2:LPAR6を発現するプラスミド 2ugをリポフェクション法にてHeLa細胞に遺伝子導入
Day3:遺伝子導入より24時間経過後、細胞をLPA10uMにて1時間刺激。刺激後すぐに細胞よりtotal RNAを回収。
実験(1):条件1、2、3および4の4群間で比較
実験(2):条件1、5、6および7の4群間で比較
この二つの実験において共通してリストアップされた遺伝子を目的の遺伝子群とした。
THBS1、AREG、SLFNL1、SLFNL1-AS1、CDH5、NR4A2、CYR61およびCRISPLD2(少なくともいずれかの実験で10倍以上の発現変動);
FOSL1、TNFAIP3、EPPK1、NUAK2、CXCL2、KDM6B、PHLDA1、CSRNP1、TAGLN、PTGER4、JUN、ATF3、NCOA7、ADAMTS1、EDN1、ZC3H12C、PTGS2、DCUN1D3、ITPRIP、JUNB、SDC4、ERRFI1、SRF、MYADM、MMP12、MAFF、RCAN1、F3、IL6、LDLR、KRT34、EDN2、GADD45A、KRT17、TUFT1、MN1、DUSP4、KLF6、REL、ABL2、CITED2、MAFK、RND3、KLF2、TRIB1およびPHLDB2(いずれの実験でも5倍以上の発現変動);
RASD1、SOWAHC、DUSP8、OTUD1、ARL5B、ETV3、ZFP36、NAV2、ITGB8、SERPINE1、NOCT、ZBTB10、BMP2、TRAF1、EPHA2、IER2、TNS4、ELMSAN1、ADAMTS5、TSC22D2、ZNF281、BCL10、RNF217、BTG2、ELL2、KIAA1217、GPCPD1、NAB2、MCL1、TIPARP、EPGN、RIMKLB、IER5、C8orf4、ADM、KRT16、NFKBID、ZNF331、SERTAD1、PSD4、DAPP1(いずれかの実験で5倍以上の発現変動);ならびに
WEE1、TBX3、PMAIP1、ARID5B、BACH1、ZFP36L2、VGLL3、GATA6、AKAP2、PLAUR、TICAM1、JAG1、SLC7A11、FOXC2、HBEGF、GPRC5A、KCNJ12、STARD4、YOD1、RHOB、IRS2、SLC30A7、C19orf71、PPP1R15B、USP36、BHLHE40、LIFR、STK38L、LOC100129550、RUNX1、CEBPD、KLF7、KLF5、LATS2、HECA、PPP1R3B、GADD45B、BIRC3、NT5DC3、ATXN7、ZNF644、FOSL2、PER2、MAP3K14、NABP1、FGF2、NFKBIA、JUND、RC3H1、RUSC2、DUSP16、ELF3、NEDD9、FAM86B3P、CREM、IQCJ-SCHIP1、HK2、ZNF548、ZNF217、PER1、AHR、SLC2A13、PDP1、HRH1、PFKFB3、TPPP、JPH2、CPEB4、MB21D2、HLA-H、SLC38A2、FRMD4B、PTPRH、SSC5D、PLEKHO2、EGLN1、FOXC1、PDE4D、CPEB3、ZSWIM4、TGFBR1、PRG2、CCDC68、IER3、FBLIM1、RASSF8、USP2、PPTC7、CDC42EP2、ZFAND5、SGK1、TNFRSF8、LYPD3、CITED4、MYH9、SIK1、SGMS2、ZC3H12A、DUSP1、IRF2BPL、ZFP36L1、EPAS1、TMEM160、NCEH1、KLF9、TMEM158、NAB1、RNF19A、KCNK1、PRDM1、IRF2BP2、CHD1、MXD1、KIAA0355、ELL、PIGA、CNN2、ABHD13、MESDC1、SCML1、TGFBR3、DDAH1、ANKRD33B、MAP3K8、MAP2K3、SOCS6、MPZL3、UGCG、AEN、CDKN1A、C9orf72、CHD2、RNF19B、VCL、MFSD2A、RELT、HELZ2、ZNF529、ADAP1、RP2、FBXO46、ETS2、ANKRD1、NFKBIE、SH3RF1、SFMBT2、AEBP2、ZYX、HES4、CBX4、GLI2、SNRK、MTCL1、MITF、ARHGAP28、ELAVL2、PMP22、SOCS3、MALAT1、WDR37、SLC2A3、COQ10B、CCNL1、PXDC1、SLC26A2、PIM1、FAM60A、OLR1、STX11、ZBTB21、SPRED2、CTTNBP2NL、CCNT1、ZNF324、UBALD1、LIMA1、ACTG1、SLC19A2、PRRG1、TLE4、ICAM1、IFFO2、PLEKHG3、ARHGAP23、GAB2、NYAP2、DKK1、NT5E、DENND3、USP53、CD83、MC1R、PANX1、SLC20A1、KLF4、TNFRSF10A、SIRT1、DNAJB4、STEAP4、PHLDA3、FAT4、C1QTNF1、AP1AR、KRT80、ZC3HAV1、SAV1、ACKR3、TP53I11、CMIP、RGS2、CDKN2AIP、ADRB2、TSC22D1、TM4SF1、FBXO33、CSRP1、BMPR1B、RELB、NTN4、ATP2B1、CDC42SE1、ALDH1B1、TRMT44、ROR1、VPS37B、TRAF4、PPP2R3A、HSPA2、DAAM1、LINC00657、CASZ1、DAW1、ALPK2、GRAMD3、RAB20、MAMDC2、SAMD4A、RASAL2、WWC2、RAP1GAP2、DNAJC6、PPP1R3C、TPM4、KIAA0825、WDR1、NFKB2、FSTL3、ARHGAP32、NFIL3、ZNF267、HMGCS1、FHL2、TPM1、KLHL29、CRB1、SLC25A16、MFAP5、FHL1、MMP24、RAB32、IL32およびARHGDIB(いずれの実験でも2〜5倍の発現変動)。
上述の手順によって、特定のタンパク質の活性化によって発現が誘導される遺伝子群を同定できることが示された。このような遺伝子群を用いて、本明細書に記載される複数因子を連結したレポーター系を構築することができる。
実際に、後述する実施例Eに示すように、本実施例の手順によってHEK293T細胞を使用して同様のアッセイ系を作製することに成功した。
上述の実施例AおよびBに記載される手順に従い、それぞれが複数の異なる受容体を過剰発現する複数の細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、それぞれの細胞を各ウェル内で維持する。被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、複数の受容体に対する被験化合物の作用の網羅的な調査を簡便に行うことができる。
ある膜タンパク質によって発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域の配列を用いて、第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域の配列をそれぞれ含む第1〜第Nのコンストラクトを提供する。それぞれのコンストラクトは、特定の因子をコードする配列を、転写調節領域と作動可能に連結した状態で含む。それぞれの因子は、他の因子の活性を促進するものである。それぞれのコンストラクトは、一連の核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。
全ヒトGPCRに対応する細胞を含む実施例D1のアレイを用いて、被験化合物の全ヒトGPCR(匂い受容体を除く)に対する活性を調査する。アレイの各ウェルの反応から、被験化合物が、どのGPCRに対して活性を有するかを調べることができる。これにより、被験化合物が、いずれかのヒトGPCRに対してOff−Target活性を有するか、あるいはOff−Target活性がないことを確認することができる。これにより、例えば、臨床試験開始後に予想外の副作用で臨床試験が中止になるリスクを軽減出来る。また、ある活性が知られた化合物についても、全ヒトGPCRに対する活性を評価することで新規の活性を同定することができる。
マイクロ流路ディスクあるいはその他の1細胞アッセイシステムを用い、各チェンバーに1個の細胞を培養する。多数の異なる受容体プラスミドを含む適当に低濃度なトランスフェクション試薬を用意し、これを多数のチェンバーの細胞に一気にアプライする。こうすることで、試薬に含まれる受容体群のサブセットを各細胞にトランスフェクトさせることができる(試薬に100種類の受容体プラスミドが含まれるとして、そのうち数種類が各々の細胞にトランスフェクトすることが想定される)。試薬中の受容体プラスミド濃度が低いので、各細胞にトランスフェクトされる受容体は確率論的に決まる。最後に単一の化合物あるいは複数の化合物の混合物を複数のチェンバーの細胞に一気にアプライする。洗浄し別の化合物をアプライすることを繰り返してもよい。反応があったチェンバーの細胞にシングルセルPCRを掛けることで、化合物に応答する受容体候補を効率よく絞りこむことができる。
本明細書で記載されているノックインレポーター細胞であるNCP19細胞は、様々な細胞膜受容体がそれらに対応するリガンドで刺激された際に惹起されるシグナルを感知できるだけでなく、細胞そのものがストレスを受けた際のストレス応答もモニターできるものと予想される。よって、細胞膜受容体などを外因性に遺伝子導入することなしに、NCP19細胞そのものに被検化合物を作用させることで、その化合物が細胞にストレス応答を誘導する化合物であるかを検討できるアッセイ系となりうる。
本明細書の実施例A4およびA5で示すように、本明細書で記載されているノックインレポーター細胞であるNCP19細胞は、GPCRだけでなく、受容体型チロシンキナーゼがそのリガンドで活性化された際に生じる細胞内シグナル(増殖シグナル)も感知できる。このことはすなわち、遺伝子変異によって恒常的な活性化状態にある受容体型チロシンキナーゼ変異体(これらは多くの場合、細胞において癌遺伝子として機能する)をNCP19に一過性に外因性に遺伝子導入すれば、NCP19細胞におけるレポーター活性はリガンド刺激非依存的に高値を示す事が予想される。よって、NCP19細胞に様々な癌遺伝子候補変異体を一過性に導入し、それらの変異体それぞれが惹起するレポーター活性を調べれば、どの候補変異体分子がより強力な細胞増殖活性を有するかワンステップで検証することが可能となる。
上述の実施例AおよびBに記載される手順に従い、それぞれが複数の苦味受容体を過剰発現する複数の細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、それぞれの細胞を各ウェル内で維持する。被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、被験化合物の苦味受容体への作用の網羅的な調査を簡便に行うことができる。
上述の実施例AおよびBに記載される手順に従い、リガンド未知の受容体を過剰発現する細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、細胞を各ウェル内で維持する。複数の被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、オーファン受容体を活性化させる化合物の網羅的なスクリーニングを簡便に行うことができる。
[概要]
HeLa細胞以外の細胞株を用いて、本発明のアッセイ系を構築し、被験化合物のスクリーニングを行うことができることを実証する。
(発現変動遺伝子の同定)
HEK293T細胞において、Gタンパク質G12/13を特異的に活性化させるGPCR(GPR55もしくはLPAR6)と、当該GPCRのリガンドとして機能することが既に知られている物質を用いて実験を施行する。
条件1 HEK293T細胞(野生型)
条件2 HEK293T細胞(野生型)+mock+リガンド10uM:1時間刺激
条件3 HEK293T細胞(野生型)+GPCR+Vehicle:1時間刺激
条件4 HEK293T細胞(野生型)+GPCR+リガンド10uM:1時間刺激
リストアップされた遺伝子を目的の遺伝子群とした。当該遺伝子群を以下の表6に示す。
NR4A2, LOC100506747, NR4A1, EPPK1, JUN, AMOTL2, FLNA, ARC, IER2, JUNB(少なくともいずれかの実験で5倍以上の発現変動);ならびに
CNN2, DUSP1, MAFF, GPR3, TPM1, PTGS2, ATF3, G0S2, TRIB1, SNAI2, PDLIM7, NFKBIZ, TIMP3, FHL2, SPRY2, FOSL2, FERMT2, VCL, NUPR1, TPM4, GRASP, NKX2-5, TUFT1, ID1, FOSL1, MYADM, ACTB, LPP, KLF7, KLF6, ADAMTS1, BTG2, ACTG1, CSRNP1, WDR1, SRF, GEM, ZYX, NR2F1, LOC101928358, ITPRIP, FUT1, COL3A1, LIMA1, SLC8A1, JAG1, SLC6A9, PMAIP1, SLC2A10, PCK2, ZFP36L1, MAFB, CBX4, FZD10, ZBTB10, JDP2, ZNF214, RHOB, ID2, RND3, IRF2BPL, BMP2, SOX4, JUND, SLC1A4, PNRC1, SYBU(少なくともいずれかの実験で2倍以上の発現変動)
リストアップされた遺伝子から遺伝子#1としてFOS、遺伝子#2としてFOSBを選択した。
上記細胞にGPCR発現プラスミドおよびUAS-レポーター遺伝子のプラスミドを導入し、当該GPCRリガンドで細胞を刺激した。GPCRとして、以下の受容体:GPR55(G12/13), LPAR6(G12/13), Adrb2(Gs), HRH1(Gq/11), OPRM1(Gi/o), SSTR2(Gi/o)を用いた。また、上記細胞を使用して受容体型チロシンキナーゼ(Flt3およびEGFR)の活性化も測定した。
各濃度のリガンドの添加により、各アッセイ系から得られたシグナル(発光強度・リガンド最低濃度時のシグナルからの変化倍率)を図15-図18に示す。HeLa細胞で作製されたインディケーター細胞と同様に、HEK293T細胞で作製されたインディケーター細胞においても、検定した各受容体においてリガンド濃度の増加に伴うシグナルの増大が観察された。
[考察]
本実施例の結果より、本発明のインディケーター細胞は、実施例A3の方法により細胞株の種類によらず作製されうることが示された。
細胞において、Gタンパク質G12/13の活性化により発現が増加する遺伝子#1および遺伝子#2の遺伝子座に、第1の因子および第2の因子をノックインする。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、上述の説明および実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
配列番号2:TMGV中のリンカー配列
配列番号3:GSリンカー配列
配列番号4:ヒトG12アミノ酸配列
配列番号5:ヒトGsアミノ酸配列
配列番号6:G12/sキメラアミノ酸配列
配列番号7:ヒトGi1アミノ酸配列
配列番号8:G12/i1キメラアミノ酸配列
Claims (26)
- シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せであって、該コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第1〜第Nの因子をコードする第1〜第Nのヌクレオチド配列を含み、ここで、Nは2以上の整数である、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。 - 請求項1に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、
前記第1〜第Nの因子の少なくとも1つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトと
を含む、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。 - シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトの組合せであって、
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードするヌクレオチド配列に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは3〜Nまでの自然数である、コンストラクトの組合せ。 - キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキット。
- 前記タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子を特定することを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のコンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む細胞。
- シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第1〜第Nの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第1〜第Nの因子をコードする第1〜第Nのヌクレオチド配列と、
該第1〜第Nの因子の少なくとも1つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、Nは2以上の整数である、細胞。 - シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
(1)第1の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質(S)をコードする遺伝子に連結させた第1のコンストラクトと;
(2)第2の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素(E1)をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、SとE1との酵素反応により生産物P1が生成される、第2のコンストラクトと;
Nが3以上である場合に、3〜Nの自然数であるnのそれぞれについて、
(n)第nの遺伝子の転写調節領域をP(n−2)を基質として生産物(P(n−1))を生成する酵素(E(n−1))をコードする遺伝子に連結させた第nのコンストラクトと;
(N+1)酵素反応の生産物P(N−1)によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第1〜第NのN個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Nは2以上の自然数であり、nは3〜Nの自然数である、細胞。 - 膜タンパク質を発現する細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第1の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第1の因子をコードする第1のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第2の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第2の因子をコードする第2のヌクレオチド配列と、
該第1の因子によって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該第2の因子は、該第1の因子の標識の発現を惹起させる活性を惹起または促進するように構成されている、細胞。 - 前記第1の因子が、転写因子である、請求項10に記載の細胞。
- 前記転写因子が、不活性化した状態で発現されるように構成されている、請求項11に記載の細胞。
- 前記転写因子が、細胞膜アンカー型転写因子である、請求項12に記載の細胞。
- 前記第2の因子が、プロテアーゼである、請求項10〜13のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記第2の因子が、細胞膜型因子である、請求項10〜14のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞がHeLa細胞又はHEK293T細胞である、請求項7〜15のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記遺伝子は、ARC、CCL20、CTGF、DUSP5、EGR1、EGR2、EGR3、FOSB、NR4A1、NR4A3、CYR61およびFOSからなる群から選択される、請求項7〜16のいずれか1項に記載の細胞。
- 膜タンパク質を発現するHeLa細胞又はHEK293T細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第1の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第1のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、第1のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第2の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第2のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、第2のヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含み、該細胞がHeLa細胞のときは、該第1の遺伝子がNR4A1、及び該第2の遺伝子がCTGFであり、該細胞がHEK293T細胞のときは、該第1の遺伝子がFOS、及び該第2の遺伝子がFOSBである、細胞。 - キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニットを含む、請求項7〜18のいずれか1項に記載の細胞。
- それぞれ異なる膜タンパク質を発現する複数の細胞を含むキットであって、該複数の細胞の各々は、請求項7〜19のいずれか1項に記載の細胞である、キット。
- 被験化合物の膜タンパク質への作用を網羅的に解析するための、請求項20に記載のキット。
- 請求項7〜19のいずれか1項に記載の細胞、または請求項5または20〜21のいずれか1項に記載のキットを用いることを特徴とする、被験化合物の膜タンパク質への作用の解析方法。
- 請求項7〜19のいずれか1項に記載の細胞の製造方法であって、
細胞に、前記膜タンパク質またはGPCRをトランスフェクトする工程と、
前記第1〜第Nの遺伝子の遺伝子座に、各遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるように前記第1〜第Nのヌクレオチドを導入する工程と
を含む、方法。 - キメラGタンパク質αサブユニットであって、Gα12/13に属する第1のGαサブユニットのアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸配列が、該第1のGαサブユニットとは異なるGαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラGタンパク質αサブユニット。
- シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するために、ある細胞において、該タンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該活性化因子と接触させなかった場合と比較して該活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。 - ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該タンパク質の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
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