JPWO2019163767A1 - エルゴチオネインの製造方法 - Google Patents
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Abstract
安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法および該方法に使用する細菌を提供する。エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地、または該培養により得られた菌体よりエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含み、前記細菌が、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を有するコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている菌株であることを特徴とする方法；およびSer-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を有するコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌。
Description
本発明は、腸内細菌科に属する細菌を用いたエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法に関する。本発明は、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を改変して所定のタンパク質の活性を低下させることにより、エルゴチオネイン生産能を高めたものである。
エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種で、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。また、その抗酸化能はビタミンＣ、ビタミンＥ、システイン、グルタチオンよりも高いことが示唆されている。エルゴチオネインは紫外線吸収効果、メラニン産生抑制作用、活性酸素種の消去能、しわやたるみの形成を抑えるエラスターゼ活性阻害作用、シミの形成を抑えるチロシナーゼ活性阻害作用を有することも示されている。したがって、エルゴチオネインはとりわけ美容・食品業界で注目されている化合物の１つである。
エルゴチオネインは一部の微生物、特に担子菌類に多く含まれており、動植物にも微量含まれている。哺乳動物はエルゴチオネインを生合成することができないが、担子菌類を含むキノコなどを摂食することで体内に取り込み、表皮、脳、肝臓、腎臓、脊髄、目など多くの臓器や器官にエルゴチオネインが蓄積し、細胞を保護することが示唆されている。エルゴチオネインの製造方法として、担子菌類等の微生物の培養・抽出法および有機合成法が知られている（特許文献１、２等参照）。しかしながら、担子菌類等からの抽出法は、生産性が低い、微生物の培養に長期間を有する、菌体内に蓄積するため菌体内から抽出するための製造プロセスが複雑である、微生物の改良が困難である等の理由から普及するに至っていない。有機合成法も、反応が多段階で複雑である、有害な原料を使用することがある、高価な原料を使用するため費用が高くつく等の理由から普及に至っていない。また、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物や、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させたエルゴチオネイン生産能を有する微生物を用いた発酵生産法も開発されているが、さらに効率的なエルゴチオネインの製造方法が望まれている（特許文献３）。
上述のように、現状では、エルゴチオネインは価格が高く、その供給に課題がある。したがって、安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法が求められている。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を改変して、所定のタンパク質の活性を低下させることにより、エルゴチオネインの生産量が顕著に増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、腸内細菌科に属する細菌を用いたエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法を提供するものであり、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を改変して所定のタンパク質の活性を低下させることにより、エルゴチオネイン生産能を高めたものである。
したがって本発明は以下のものを提供する。
［１］エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地、または該培養により得られた菌体よりエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含み、前記細菌が、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている菌株であることを特徴とする方法。
［２］前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、［１］に記載の方法。
［３］前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、［２］に記載の方法：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
［４］前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、［１］に記載の方法：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［５］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、［５］に記載の方法。
［７］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属の細菌である、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が大腸菌である、［７］に記載の方法。
［９］Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌。
［１０］前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、［９］に記載の細菌。
［１１］前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、［１０］に記載の細菌：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
［１２］前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、［９］に記載の細菌：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［１３］エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である［９］から［１２］のいずれかに記載の細菌。
［１４］前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、［１３］に記載の細菌。
［１５］エシェリヒア（Escherichia）属の細菌である、［９］から［１４］のいずれかに記載の細菌。
［１６］大腸菌である、［１５］に記載の細菌。
［１］エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地、または該培養により得られた菌体よりエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含み、前記細菌が、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている菌株であることを特徴とする方法。
［２］前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、［１］に記載の方法。
［３］前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、［２］に記載の方法：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
［４］前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、［１］に記載の方法：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［５］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、［５］に記載の方法。
［７］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属の細菌である、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が大腸菌である、［７］に記載の方法。
［９］Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌。
［１０］前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、［９］に記載の細菌。
［１１］前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、［１０］に記載の細菌：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
［１２］前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、［９］に記載の細菌：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［１３］エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である［９］から［１２］のいずれかに記載の細菌。
［１４］前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、［１３］に記載の細菌。
［１５］エシェリヒア（Escherichia）属の細菌である、［９］から［１４］のいずれかに記載の細菌。
［１６］大腸菌である、［１５］に記載の細菌。
本発明は、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を持つエルゴチオネインを安価かつ大量に製造することを可能とした。
（発明の詳細な説明）
本発明は、第１の態様において、エルゴチオネイン（本明細書においてEGTと略称することがある）もしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地、または該培養により得られた菌体よりEGTもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含み、前記細菌が、所定のタンパク質の活性が低下するように改変されている菌株であることを特徴とする方法に関する。本発明に従って、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌において、所定のタンパク質の活性が低下するような改変を施すことにより、EGTの生産量を飛躍的に増大させることができる。
本発明において、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌の培養によるEGT生産量を増大させるため、当該細菌の改変を行うが、具体的には、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変する。
前記コア配列領域を含むタンパク質は、コア配列領域として
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列を含むタンパク質であってよい。ここで、前記コア配列領域は、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列であることが好ましい：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列を含むタンパク質であってよい。ここで、前記コア配列領域は、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列であることが好ましい：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。
さらに、前記コア配列領域を含むタンパク質は、コア配列領域として
X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aaおよびX19aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号９）で示される配列を含むタンパク質であってよい。ここで、前記コア配列領域は、下記（１）〜（１９）から選択されるアミノ酸を有する配列であることが好ましい：
（１）X1aaが、Glu、SerまたはGlyである
（２）X2aaが、Leu、ValまたはSerである
（３）X3aaが、PheまたはLeuである
（４）X4aaが、PheまたはTyrである
（５）X5aaが、AlaまたはGlyである
（６）X6aaが、Val、LeuまたはIleである
（７）X7aaが、Ala、SerまたはIleである
（８）X8aaが、TrpまたはTyrである
（９）X9aaが、SerまたはAlaである
（１０）X10aaが、ProまたはIleである
（１１）X11aaが、PheまたはGlnである
（１２）X12aaが、ValまたはMetである
（１３）X13aaが、GlyまたはSerである
（１４）X14aaが、Leu、MetまたはIleである
（１５）X15aaが、LeuまたはIleである
（１６）X16aaが、IleまたはValである
（１７）X17aaが、IleまたはValである
（１８）X18aaが、GlnまたはGluである
（１９）X19aaが、PheまたはLeuである。
X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aaおよびX19aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号９）で示される配列を含むタンパク質であってよい。ここで、前記コア配列領域は、下記（１）〜（１９）から選択されるアミノ酸を有する配列であることが好ましい：
（１）X1aaが、Glu、SerまたはGlyである
（２）X2aaが、Leu、ValまたはSerである
（３）X3aaが、PheまたはLeuである
（４）X4aaが、PheまたはTyrである
（５）X5aaが、AlaまたはGlyである
（６）X6aaが、Val、LeuまたはIleである
（７）X7aaが、Ala、SerまたはIleである
（８）X8aaが、TrpまたはTyrである
（９）X9aaが、SerまたはAlaである
（１０）X10aaが、ProまたはIleである
（１１）X11aaが、PheまたはGlnである
（１２）X12aaが、ValまたはMetである
（１３）X13aaが、GlyまたはSerである
（１４）X14aaが、Leu、MetまたはIleである
（１５）X15aaが、LeuまたはIleである
（１６）X16aaが、IleまたはValである
（１７）X17aaが、IleまたはValである
（１８）X18aaが、GlnまたはGluである
（１９）X19aaが、PheまたはLeuである。
前記コア配列領域を含むタンパク質の具体例としては、BetTタンパク質およびCaiTタンパク質が挙げられ、前記BetTタンパク質は下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質は下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
前記コア配列領域を含むタンパク質は、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むBetTタンパク質、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むCaiTタンパク質であるのが好ましい。
本発明において、「１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」とは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味し、好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味し、さらに好ましくは、１個、２個、３個または４個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味する。
本発明において、「EGTの関連物質」とは、EGTの類縁体を意味し、EGT酸化体やアルキル化体等を包含する。EGT酸化体の具体例として、エルゴチオネインスルフェン酸（Ergothioneine sulfenic acid）、エルゴチオネインスルフィン酸（Ergothioneine sulfinic acid）、エルゴチオネインスルホン酸（Ergothioneine sulfonic acid）、ジスルフィド結合体、混合ジスルフィド体、ヘルシニン（Hercynine）などが挙げられる。アルキル化体としては、S-メチルエルゴチオネイン（S-Methyl-Ergothioneine）などが挙げられる。上記の酸化体やアルキル化体は、エルゴチオネインから細胞内の代謝反応、または培養液中の酸素や酸化剤による酸化反応により生じることが報告されている（L. Servillo et al., Free. Radic. Biol. Med., 2015, 79, 228-36、及びR. M. Y. Tang, et al., Sci. Rep., 2018, 8(1), 1601に記載）。また、セレノネインなども類縁体として挙げられる。
EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌に上記改変、すなわち、所定のコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するような改変を行うことにより、EGT生産量を飛躍的に増大させることが可能となる。
本発明に用いるEGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌は、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された細菌、Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示されるコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された細菌、またはX1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aaおよびX19aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号９）で示されるコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された細菌であるが、好ましくは、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質もしくはこれらタンパク質とのアミノ酸配列の同一性が９０％以上のタンパク質の活性が低下するように改変された細菌である。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性の低下の割合は、好ましくはその親株５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性を消失させた細菌が最も好ましい。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性を消失させた細菌とは、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性が全く検出されない細菌である。あるいは、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性を低減または消失させた細菌は、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子発現を低下または消失させた細菌ということもできる。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子発現の低下の割合は、好ましくはその親株の５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子の発現を消失させた細菌が最も好ましい。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子発現を消失させた細菌とは、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子発現が全く検出されない細菌である。なお、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性、およびBetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子の発現は、ノーザンブロッティング法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、ウエスタンブロッティング法など、公知の方法にて測定可能である。
BetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性を低減または消失させる方法、ならびにBetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子発現を低下または消失させる方法も公知であり、例えば、相同組換え、変異処理、ゲノム編集などによりBetTタンパク質またはCaiTタンパク質遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法、あるいはBetTタンパク質またはCaiTタンパク質を阻害する物質を細菌に投与する方法などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。また、本発明に用いる細菌は、自然変異の結果としてBetTタンパク質またはCaiTタンパク質活性が低減または消失しているものであってもよい。
本発明に用いるEGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌は、EGT合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌であることが好ましい。
EGT生合成遺伝子は、EGTの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である。EGTの生合成に関与する酵素およびEGT生合成遺伝子は公知であり、いくつかの遺伝子はヌクレオチド配列も公知である。当業者は、斯かるEGT生合成遺伝子を適宜選択することができる。例えばマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはクロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することが好ましいが、これらの微生物の遺伝子に限定されない。マイコバクテリウム属のEGT生合成遺伝子に関しては、F. P. Seebeck, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 6632-6633を参照することができる。シゾサッカロマイセス属のEGT生合成遺伝子に関しては、T. Pluskal et al, PLOS ONE., 2014, 9(5), e97774を参照することができる。ノイロスポラ属のEGT生合成遺伝子に関しては、W. Hu et al., Org. Lett., 2014, 16, 5382-5385を参照することができる。また、ストレプトマイセス属のEGT生合成遺伝子に関しては、S. Nakajima et al., J. Biosci. Bioeng., 2015, 120, 294-298を参照することができる。また、クロロビウム属のEGT生合成遺伝子に関してはR. Burn, et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2017, 56, 12508-12511.を参照することができる。各種微生物におけるEGT生合成遺伝子に関しては、G. W. Jones et al, Gene, 2014, 549, 161-170を参照することができる。
「遺伝子の発現を増強する」とは、親株と比較して当該遺伝子の発現量が多いことを意味する。親株または野生株の２倍以上の発現量であることが好ましく、５倍以上の発現量であることがより好ましく、１０倍以上の発現量であることがさらに好ましい。遺伝子発現の定量は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて行うことができる。
「相当する遺伝子」とは、ある微生物のEGT生合成経路においてある反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に対して、別の微生物のEGT生合成経路において当該酵素と同じまたは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をいう。ある遺伝子と、それに相当する遺伝子が同じヌクレオチド配列を有していてもよく、異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子と、ある遺伝子に相当する遺伝子のヌクレオチド配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。さらに、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパク質と、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパク質が同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパク質と、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパク質のアミノ酸配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。
EGT生合成遺伝子の発現の増強は、公知の遺伝子発現増強方法を用いて行うことができる。発現の強いプロモーターの制御下にEGT生合成遺伝子を置く方法が一般的である。例えば、EGT生合成遺伝子の発現に適したプロモーターとEGT生合成遺伝子を組み込んだ発現ベクターを微生物に導入することによって、または相同組み換え等により宿主のゲノムにEGT生合成遺伝子を組み込むことによって、EGT生合成遺伝子の発現を増強させてもよい。ベクターとしてはプラスミドベクターやウイルスベクターを用いることができる。ベクターの構築に際して、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子や代謝酵素遺伝子などのマーカー遺伝子などのベクターの構成要素を適宜選択し、使用することができる。細菌への遺伝子導入方法も公知である。導入すべき遺伝子をそのまま、あるいはベクターに組み込んで、細菌に導入することができる。遺伝子導入方法の例としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ポリマーを用いる方法、電気穿孔法、パーティクルガン法などがあり、遺伝子導入する細菌の種類や導入する遺伝子に応じてこれらの方法を適宜選択することができる。また、EGT生合成遺伝子の発現の増強は、ゲノム上の特定の遺伝子もしくは領域を欠失させることで、内在性のEGT生合成遺伝子の発現を誘導させてもよい。
EGT生合成遺伝子の発現の増強方法は上記方法に限定されない。また、本発明に用いる細菌は、自然変異の結果としてEGT生合成遺伝子の発現が増強されたものであってもよい。EGT生合成遺伝子の発現の増強は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて確認することができる。あるいは、実際に細菌を培養して、菌体内または菌体外（培養液中）に生産されるEGTを定量することにより、EGT生合成遺伝子の発現の増強を確認することもできる。
細菌において発現を増強させるEGT生合成遺伝子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。EGT生合成に関与する複数の酵素をコードする遺伝子を、クラスターとして細菌に導入してもよい。異属または異種微生物由来のEGT生合成遺伝子を導入して発現を増強させてもよく、同属または同種微生物由来のEGT生合成遺伝子を導入して発現を増強させてもよい。同属または近縁属由来のEGT生合成遺伝子を導入して発現を増強させることが好ましく、同種または近縁種由来のEGT生合成遺伝子を導入して発現を増強させることがより好ましい。同種由来のEGT生合成遺伝子を導入して発現を増強させることがさらに好ましい。
本発明に用いるEGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、及びサルモネラ（Salmonella）属の細菌が例示されるが、これらに限定されない。特に好ましい腸内細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等のパントエア属などの腸内細菌が挙げられる。
本発明のEGT製造方法における腸内細菌科に属する細菌の培養は、通常の方法にて行うことができる。具体的には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地などを用いることができる。上記の培地を用いて、EGTを生産させることができるが、用いる培地はこれらに限定されない。また、生産させたEGTは菌体内に蓄積してもよいし、菌体外（培養液中）に分泌・蓄積してもよい。
菌体内、または菌体から遊離されたEGTの回収は公知の方法によって行うことができる。例えば、培養物を遠心分離あるいは濾過等の固液分離に供して、菌体内からは溶媒抽出、熱水抽出、破砕処理等によりEGT抽出液を取得できる。EGT抽出液、または培養上清からは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知のクトマトグラフィーに供してEGTを得ることができる。
本発明は、第２の態様において、本発明に従って所定のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌に関する。
本発明に従って所定のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌は、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌、Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示されるコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌、またはX1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aaおよびX19aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号９）で示されるコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であるが、好ましくは、BetTタンパク質またはCaiTタンパク質もしくはこれらタンパク質とのアミノ酸配列の同一性が９０％以上のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌である。BetTタンパク質またはCaiTタンパク質の活性の低下については上で説明したとおりである。
本発明に従って所定のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌は、EGT合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌であることが好ましい。
本発明に従って所定のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、EGT合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌としては、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりEGT生合成遺伝子の発現が増強された細菌が好ましいが、これらの細菌に限定されない。
本発明に従って所定のタンパク質の活性が低下するように改変された、EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌は、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、及びサルモネラ（Salmonella）属の細菌であってよいが、これらに限定されず、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等のパントエア属などの細菌が特に好ましい。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明がない場合には、分子生物学、応用微生物学に関する標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾、改変した方法を用いて実験を実施した。また、％は、特に明記しない限りｗ／ｖ％を表す。
EGT生産用ベクター（egt1-2）構築
大腸菌においてEGTを生産させるために、下記EGT生産ベクターを構築した。EGT生合成遺伝子として、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）由来のegt1（SPBC1604.01：配列番号１）、egt2（SPBC660.12c：配列番号２）を用いた。配列表記載のEGT生合成遺伝子egt1, egt2を含むベクターを鋳型に、表１記載のプライマーを用いてegt1、egt2それぞれを増幅した。
大腸菌においてEGTを生産させるために、下記EGT生産ベクターを構築した。EGT生合成遺伝子として、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）由来のegt1（SPBC1604.01：配列番号１）、egt2（SPBC660.12c：配列番号２）を用いた。配列表記載のEGT生合成遺伝子egt1, egt2を含むベクターを鋳型に、表１記載のプライマーを用いてegt1、egt2それぞれを増幅した。
発現ベクターはp15A複製起点を有する発現ベクターのプロモーターを大腸菌のgapA遺伝子のプロモーターに改変し、さらに薬剤マーカーをテトラサイクリン耐性遺伝子に変更したpACGを用いた。pACGのプロモーター直下のHindIII-BamHI部位に、上記egt1、egt2のPCR産物をIn-Fusion HD cloning Kit（タカラバイオ社）を用いて連結し、EGTの生産用ベクターとしてpACG-EGTを構築した。In-Fusion反応はタカラバイオ社提供のプロトコールに従って行った。
大腸菌の野生株としてMG1655株（ATCC寄託番号：700926）を使用し、構築したpACG-EGTを用いて形質転換を行い、EGT生産株（MG1655/pACG-EGT）を得た。
大腸菌でのEGT生産試験
実施例１で構築したEGT生産株MG1655/pACG-EGTを用いて、EGTの発酵生産試験を行った。MG1655株に空ベクターpACGを導入したMG1655/pACGをコントロール株とした。MG1655/pACG 、MG1655/pACG-EGT、それぞれのグリセロールストックを3ｍＬのLB培地（polypeptone 10g、yeast extract 5g、 NaCl 10g/培地１L）にテトラサイクリン（終濃度10μg/mL）を含む試験管に添加し、37℃、200rpmで15-18時間、定常期に達するまで振盪培養し前培養液を得た。さらに、500ｍＬ容バッフル付フラスコ中の50ｍＬの2×TY培地（polypeptone 16g、yeast extract 10g、NaCl 5g、Glucose 5%、L-Histidine 5mM、L-Cystine 2.5mM、L-Methionine 5mM、tetracycline 10μg/mL/培地1L）に、OD=0.4となるよう前培養液を添加し、37℃160rpmで96時間振盪することで本培養を行った。
実施例１で構築したEGT生産株MG1655/pACG-EGTを用いて、EGTの発酵生産試験を行った。MG1655株に空ベクターpACGを導入したMG1655/pACGをコントロール株とした。MG1655/pACG 、MG1655/pACG-EGT、それぞれのグリセロールストックを3ｍＬのLB培地（polypeptone 10g、yeast extract 5g、 NaCl 10g/培地１L）にテトラサイクリン（終濃度10μg/mL）を含む試験管に添加し、37℃、200rpmで15-18時間、定常期に達するまで振盪培養し前培養液を得た。さらに、500ｍＬ容バッフル付フラスコ中の50ｍＬの2×TY培地（polypeptone 16g、yeast extract 10g、NaCl 5g、Glucose 5%、L-Histidine 5mM、L-Cystine 2.5mM、L-Methionine 5mM、tetracycline 10μg/mL/培地1L）に、OD=0.4となるよう前培養液を添加し、37℃160rpmで96時間振盪することで本培養を行った。
EGTの定量は下記の通り行った。本培養の間、培養開始後24、48、72、96時間に培養液1mLを採取し培養サンプルを評価した。採取した培養液の菌体濁度（OD600）を測定後、14000rpmで10分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。沈殿物は熱水抽出（60℃、10分）により、細胞内成分を抽出し、菌体内サンプルとした。菌体内サンプル及び、分離した菌体外培養液（菌体外サンプル）中のEGT含量を、HPLCにより測定した。HPLC測定条件は以下の表２の通りで、保持時間10分付近に生じるEGTのピークをもとに、定量を行った。
培養試験の結果、培養72時間後において、コントロール株MG1655/pACGからはEGTの生産は確認されなかったが、MG1655/pACG-EGTの培養液及び、菌体内抽出物中にEGTのピークを確認でき、EGT合成遺伝子依存的なEGTの生産が確認できた（図１）。
ΔbetT, ΔcaiTにおけるEGT生産試験
次に、betT、caiTそれぞれの遺伝子破壊株を用いたEGTの発酵生産試験を行った。betT遺伝子破壊株（ΔbetT）、caiT遺伝子破壊株（ΔcaiT）は、betT遺伝子、caiT遺伝子それぞれの上流配列と下流配列を含むカウンターセレクションベクター（sacB遺伝子、薬剤耐性遺伝子を含む）を用いた相同組み換え法により、大腸菌MG1655株の各遺伝子領域を欠失させる従来公知の方法で構築した。上記の破壊株構築は、M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun., 1991, 4310-4317や、H. Mizoguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71 (12), 2905-2911などを参照できる。構築したΔbetT、ΔcaiTをpACG-EGTで形質転換し、ΔbetT/pACG-EGT、ΔcaiT/pACG-EGTを得た。コントロール株として、実施例２で構築したMG1655/pACG-EGTを下記培養試験に用いた。
次に、betT、caiTそれぞれの遺伝子破壊株を用いたEGTの発酵生産試験を行った。betT遺伝子破壊株（ΔbetT）、caiT遺伝子破壊株（ΔcaiT）は、betT遺伝子、caiT遺伝子それぞれの上流配列と下流配列を含むカウンターセレクションベクター（sacB遺伝子、薬剤耐性遺伝子を含む）を用いた相同組み換え法により、大腸菌MG1655株の各遺伝子領域を欠失させる従来公知の方法で構築した。上記の破壊株構築は、M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun., 1991, 4310-4317や、H. Mizoguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71 (12), 2905-2911などを参照できる。構築したΔbetT、ΔcaiTをpACG-EGTで形質転換し、ΔbetT/pACG-EGT、ΔcaiT/pACG-EGTを得た。コントロール株として、実施例２で構築したMG1655/pACG-EGTを下記培養試験に用いた。
培養方法及びEGTの分析方法は、実施例２記載の通りに行った。培養試験の結果、培養開始96時間後の培養液中のEGT生産量が、野生株に対してΔbetT/pACG-EGTでは約８．６倍向上（菌体内では１２．３倍向上）、ΔcaiT/pACG-EGTでは約４．６倍向上（菌体内では３．７５倍向上）と両遺伝子破壊株で驚くほど顕著に細胞内外のEGT生産量が向上した（図２、図３）。
EGT生産用ベクター（egtD-eanB）構築
嫌気性細菌由来のEGT合成遺伝子を用いた生産用ベクターを構築した。egtD遺伝子がコードする酵素に加え、嫌気性細菌で発見されたeanB遺伝子がコードする酵素を大腸菌で発現させることで、チオ硫酸イオン由来の硫黄を利用してEGTの生合成が可能となる。egtD遺伝子はマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)と同じ放線菌目に分類されるストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のアミノ酸配列をコドン最適化した遺伝子配列（配列番号12）、eanB遺伝子は嫌気性細菌クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）由来のアミノ酸配列をコドン最適化した遺伝子配列（配列番号13）を用いることとした。上記２遺伝子を人工合成した。ベクターは、実施例１で構築したpACG−EGTを利用した。pACG−EGTを制限酵素HindIII-BamHIで処理しegt1遺伝子を切り出し、HindIII-BamHIサイトに人工合成したegtD遺伝子をライゲーションで連結した。egtD遺伝子をクローニングしたベクターを、さらにNheI-XbaIで処理することでegt2を切り出し、NheI-XbaIサイトにeanB遺伝子をライゲーションで連結することで、gapAプロモーターの下流にegtD-eanBがクローニングされたpACG_egtD-eanBを構築した。
嫌気性細菌由来のEGT合成遺伝子を用いた生産用ベクターを構築した。egtD遺伝子がコードする酵素に加え、嫌気性細菌で発見されたeanB遺伝子がコードする酵素を大腸菌で発現させることで、チオ硫酸イオン由来の硫黄を利用してEGTの生合成が可能となる。egtD遺伝子はマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)と同じ放線菌目に分類されるストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のアミノ酸配列をコドン最適化した遺伝子配列（配列番号12）、eanB遺伝子は嫌気性細菌クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）由来のアミノ酸配列をコドン最適化した遺伝子配列（配列番号13）を用いることとした。上記２遺伝子を人工合成した。ベクターは、実施例１で構築したpACG−EGTを利用した。pACG−EGTを制限酵素HindIII-BamHIで処理しegt1遺伝子を切り出し、HindIII-BamHIサイトに人工合成したegtD遺伝子をライゲーションで連結した。egtD遺伝子をクローニングしたベクターを、さらにNheI-XbaIで処理することでegt2を切り出し、NheI-XbaIサイトにeanB遺伝子をライゲーションで連結することで、gapAプロモーターの下流にegtD-eanBがクローニングされたpACG_egtD-eanBを構築した。
EGT生産用ベクター（egtD-eanB）を用いたEGT生産試験
MG1655、さらに実施例３で作成したΔbetT、ΔcaiTの大腸菌3株を、実施例４で構築したpACG_egtD-eanBで形質転換し、得られた菌株を以下のEGT生産試験に用いた。
作成した3菌株を用いた生産試験は、実施例２記載の本培養条件の2.5mM Cystineの代わりに、10mMチオ硫酸ナトリウムを使用し、実施した。その結果、egtD-enaB遺伝子をEGT生産ベクターに使用した場合にも、培養開始48時間後の時点で、ΔbetT、ΔcaiT株において野生株よりもEGT生産性が有意に向上した（図４）。
MG1655、さらに実施例３で作成したΔbetT、ΔcaiTの大腸菌3株を、実施例４で構築したpACG_egtD-eanBで形質転換し、得られた菌株を以下のEGT生産試験に用いた。
作成した3菌株を用いた生産試験は、実施例２記載の本培養条件の2.5mM Cystineの代わりに、10mMチオ硫酸ナトリウムを使用し、実施した。その結果、egtD-enaB遺伝子をEGT生産ベクターに使用した場合にも、培養開始48時間後の時点で、ΔbetT、ΔcaiT株において野生株よりもEGT生産性が有意に向上した（図４）。
配列番号：１は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt1遺伝子（SPBC1604.01）の塩基配列である。
配列番号：２は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）の塩基配列である。
配列番号：３は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt1遺伝子（SPBC1604.01）を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt1遺伝子（SPBC1604.01）を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：５は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、コア配列領域に共通するアミノ酸配列である。
配列番号：８は、コア配列領域のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、コア配列領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、BetTタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、CaiTタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、ストレプトマイセス・セリカラー由来のEgtDタンパク質のアミノ酸配列を大腸菌用にコドン最適化した塩基配列である。
配列番号：１３は、クロロビウム・リミコラ由来のEanBタンパク質のアミノ酸配列を大腸菌用にコドン最適化した塩基配列である。
配列番号：２は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）の塩基配列である。
配列番号：３は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt1遺伝子（SPBC1604.01）を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt1遺伝子（SPBC1604.01）を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：５は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、シゾサッカロマイセス・ポムベ由来のegt2遺伝子（SPBC660.12c）を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、コア配列領域に共通するアミノ酸配列である。
配列番号：８は、コア配列領域のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、コア配列領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、BetTタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、CaiTタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、ストレプトマイセス・セリカラー由来のEgtDタンパク質のアミノ酸配列を大腸菌用にコドン最適化した塩基配列である。
配列番号：１３は、クロロビウム・リミコラ由来のEanBタンパク質のアミノ酸配列を大腸菌用にコドン最適化した塩基配列である。
本発明によるエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法は、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を持つエルゴチオネインを安価かつ大量に製造するために用いることができる。
Claims (16)
- エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地、または該培養により得られた菌体よりエルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含み、前記細菌が、Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を一部に含むコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている菌株であることを特徴とする方法。
- 前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、請求項１に記載の方法。 - 前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、請求項２に記載の方法：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。 - 前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。 - 前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- 前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、請求項５に記載の方法。
- 前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属の細菌である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 前記エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌が大腸菌である、請求項７に記載の方法。
- Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（配列番号７）なる５アミノ酸を有するコア配列領域を含むタンパク質の活性が低下するように改変されている、エルゴチオネイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌。
- 前記コア配列領域が、
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
（X15aa、X16aaおよびX17aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号８）で示される配列である、請求項９に記載の細菌。 - 前記コア配列領域が、下記（１）〜（３）から選択されるアミノ酸を有する配列である、請求項１０に記載の細菌：
（１）X15aaが、LeuまたはIleである
（２）X16aaが、IleまたはValである
（３）X17aaが、IleまたはValである。 - 前記コア配列領域を含むタンパク質が、BetTタンパク質、またはCaiTタンパク質のどちらか、またはその両方であり、前記BetTタンパク質が下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質であり、前記CaiTタンパク質が下記（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のタンパク質である、請求項９に記載の細菌：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。 - エルゴチオネイン合成遺伝子の発現を増強するように改変された細菌である請求項９から１２のいずれかに記載の細菌。
- 前記エルゴチオネイン合成遺伝子が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のegtA、egtB、egtC、egtDまたはegtEに相当する遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のEgt1またはEgt2に相当する遺伝子、クロロビウム・リミコラ（Chlorobium limicola）のeanAまたはeanBに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上を含む、請求項１３に記載の細菌。
- エシェリヒア（Escherichia）属、の細菌である、請求項９から１４のいずれかに記載の細菌。
- 大腸菌である、請求項１５に記載の細菌。
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