JPWO2019044524A1 - グルコサミン類の生物学的利用率向上方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることを目的とする。本発明は、３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法に関する。
Description
本発明は、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させる方法に関する。
グルコサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース）は、グルコースの２位の水酸基がアミノ基に置換したアミノ糖である。グルコサミンは、変形性関節症（ＯＡ）の症状改善のために健康食品等に使用されているが、経口投与の絶対的生物学的利用率（経口投与ＡＵＣ／静脈投与ＡＵＣ）が低いことが報告されている（非特許文献１）。
Ａｇｈａｚａｄｅｈ−Ｈａｂａｓｈｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ，２００２，５（２），ｐ．１８１−１８４．
本発明は、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができる経口摂取の条件を見出した。具体的には、所定時間絶食後、かつ、特定の遺伝子発現の概日リズムを考慮してグルコサミン類を経口摂取させると、グルコサミン類の吸収率を向上させることができ、これによりその生物学的利用率を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のグルコサミン類の生物学的利用率向上方法等を包含する。
〔１〕３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
〔２〕上記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕上記絶食時間が、３〜２４時間である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を対象にグルコサミン類を経口摂取させる上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕上記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
〔７〕上記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである、上記〔６〕に記載の方法。
〔８〕上記グルコーストランスポーターが、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）、グルコーストランスポーター５（ＧＬＵＴ５）及びナトリウム−グルコース共輸送タンパク質１（ＳＧＬＴ１）からなる群より選択される１種以上である上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
〔９〕上記絶食時間が、３〜２４時間である、上記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を経口摂取させる上記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕上記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、上記〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
〔１３〕小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
〔１４〕グルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤であって、下記（ｉ）又は（ｉｉ）において対象に経口摂取させるための、関節痛の予防又は改善剤。
（ｉ）３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内
（ｉｉ）３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間
〔１５〕「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付した上記〔１４〕に記載の関節痛の予防又は改善剤。
〔１〕３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
〔２〕上記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕上記絶食時間が、３〜２４時間である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を対象にグルコサミン類を経口摂取させる上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕上記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
〔７〕上記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである、上記〔６〕に記載の方法。
〔８〕上記グルコーストランスポーターが、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）、グルコーストランスポーター５（ＧＬＵＴ５）及びナトリウム−グルコース共輸送タンパク質１（ＳＧＬＴ１）からなる群より選択される１種以上である上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
〔９〕上記絶食時間が、３〜２４時間である、上記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を経口摂取させる上記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕上記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、上記〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
〔１３〕小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
〔１４〕グルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤であって、下記（ｉ）又は（ｉｉ）において対象に経口摂取させるための、関節痛の予防又は改善剤。
（ｉ）３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内
（ｉｉ）３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間
〔１５〕「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付した上記〔１４〕に記載の関節痛の予防又は改善剤。
本発明により、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができる。
本発明の第一の態様のグルコサミン類の生物学的利用率向上方法は、３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子（以下、Ｐｅｒ遺伝子ともいう）のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む。上記グルコサミン類の生物学的利用率向上方法を、以下、本発明の第一の方法ともいう。本明細書中、Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間を、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間ともいう。Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内とは、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間〜その６時間後である。
本発明の第二の態様のグルコサミン類の生物学的利用率向上方法は、３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む。上記グルコサミン類の生物学的利用率向上方法を、以下、本発明の第二の方法ともいう。本明細書中、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間を、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間ともいう。
本明細書中、単に本発明の方法という場合は、本発明の第一の方法及び第二の方法を指す。
本発明の方法では、所定時間絶食後、かつ、上記の特定の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の吸収率を向上させることができ、その生物学的利用率を向上させることができる。生物学的利用率の向上は、関節痛の改善等のグルコサミン類の効果の増強に寄与する。また、より少ない摂取量でのグルコサミン類の効果の発現等に寄与し得る。本発明においては、上記時間に対象にグルコサミン類を１回経口摂取させることが好ましい。
本発明の方法において、上記絶食時間は、４時間以上が好ましく、５時間以上がより好ましく、６時間以上がさらに好ましく、７時間以上が特に好ましい。上記時間絶食後、かつ、上記の特定の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させると、グルコサミン類の吸収率がより向上し、その生物学的利用率がより向上する。本発明における絶食の間、水は自由に摂取させてよい。睡眠中も、絶食時間に含まれる。上記絶食時間の上限は、対象に応じて適宜設定することができるが、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましく、１５時間以下がさらに好ましく、１２時間以下が特に好ましい。一態様において、上記絶食時間は、３〜２４時間が好ましく、３〜１８時間がより好ましく、３〜１５時間がさらに好ましく、４〜１２時間がさらにより好ましく、５〜１２時間がさらにより好ましく、６〜１２時間が特に好ましく、７〜１２時間が最も好ましい。
本発明の方法では、グルコサミン類の生物学的利用率がより向上することから、グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させることが好ましく、３０分以上絶食させることがより好ましい。一態様において、グルコサミン類を経口摂取後の絶食時間の上限は、４時間以下が好ましい。
本発明の方法では、所定時間絶食後、かつ、上記の特定の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の吸収率を向上させることができ、その生物学的利用率を向上させることができる。生物学的利用率の向上は、関節痛の改善等のグルコサミン類の効果の増強に寄与する。また、より少ない摂取量でのグルコサミン類の効果の発現等に寄与し得る。本発明においては、上記時間に対象にグルコサミン類を１回経口摂取させることが好ましい。
本発明の方法において、上記絶食時間は、４時間以上が好ましく、５時間以上がより好ましく、６時間以上がさらに好ましく、７時間以上が特に好ましい。上記時間絶食後、かつ、上記の特定の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させると、グルコサミン類の吸収率がより向上し、その生物学的利用率がより向上する。本発明における絶食の間、水は自由に摂取させてよい。睡眠中も、絶食時間に含まれる。上記絶食時間の上限は、対象に応じて適宜設定することができるが、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましく、１５時間以下がさらに好ましく、１２時間以下が特に好ましい。一態様において、上記絶食時間は、３〜２４時間が好ましく、３〜１８時間がより好ましく、３〜１５時間がさらに好ましく、４〜１２時間がさらにより好ましく、５〜１２時間がさらにより好ましく、６〜１２時間が特に好ましく、７〜１２時間が最も好ましい。
本発明の方法では、グルコサミン類の生物学的利用率がより向上することから、グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させることが好ましく、３０分以上絶食させることがより好ましい。一態様において、グルコサミン類を経口摂取後の絶食時間の上限は、４時間以下が好ましい。
本明細書中、グルコサミン類の生物学的利用率（ＢＡ）は、経口摂取したグルコサミン類の生物学的利用率であり、静脈内投与時のＡＵＣ（血中薬物濃度時間曲線下面積）を摂取量とみなした生物学的利用率（絶対的生物学的利用率）で評価することができる。
後記の試験例に示されるように、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現には２４時間の周期を示すリズム（概日リズム）が存在する。そして、３時間以上絶食後、かつ、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間に、ラットにグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の吸収率が向上し、その生物学的利用率が向上した。
また、ほとんどの生物では、代謝等の様々な生理現象の概日リズムは、時計遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子によって調整されていることが報告されている。グルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現の概日リズムも、時計遺伝子のｍＲＮＡ発現の概日リズムと関連づけられる。
哺乳類においては、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子等について、時計遺伝子としての機能が知られている。例えばげっ歯類のマウスでは、１２時間周期で明期／暗期の環境で飼育した場合、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、通常、活動期である暗期開始時間周辺である（Ｙａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐ．８０１−１０．）。また、グルコーストランスポーター遺伝子については、後記の試験例に示されるように、ラットを１２時間周期で明期／暗期の環境で飼育した場合、その発現ピーク時間は、活動期である暗期開始時間の３時間前付近である。このことから、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間は、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間の約２〜３時間前と考えられる。そして、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間は、Ｐｅｒ遺伝子で考えると、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降約６時間以内の時間帯に相当すると考えられる。従って、３時間以上絶食後、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができる。
また、ほとんどの生物では、代謝等の様々な生理現象の概日リズムは、時計遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子によって調整されていることが報告されている。グルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現の概日リズムも、時計遺伝子のｍＲＮＡ発現の概日リズムと関連づけられる。
哺乳類においては、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子等について、時計遺伝子としての機能が知られている。例えばげっ歯類のマウスでは、１２時間周期で明期／暗期の環境で飼育した場合、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、通常、活動期である暗期開始時間周辺である（Ｙａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐ．８０１−１０．）。また、グルコーストランスポーター遺伝子については、後記の試験例に示されるように、ラットを１２時間周期で明期／暗期の環境で飼育した場合、その発現ピーク時間は、活動期である暗期開始時間の３時間前付近である。このことから、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間は、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間の約２〜３時間前と考えられる。そして、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間は、Ｐｅｒ遺伝子で考えると、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降約６時間以内の時間帯に相当すると考えられる。従って、３時間以上絶食後、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができる。
本発明の方法により、対象におけるグルコサミン類の生物学的利用率が向上する理由の詳細は明らかではないが、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間は、小腸（例えば十二指腸）内のグルコーストランスポーターの活性が１日の中で高い（好ましい態様では、最大となる）時間帯である可能性が考えられる。グルコサミン類は、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）等のグルコーストランスポーターの基質であることが報告されている（Ｕｌｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２００２，５２４，ｐ．１９９−２０３）。例えば、ラット、マウス等のげっ歯類及びヒトでは、３時間以上絶食すると、通常小腸上部の十二指腸内にグルコーストランスポーターの基質であるグルコース等の単糖類が実質的に存在しないか、存在しても極少量であると考えられる。本発明の方法では、小腸におけるグルコーストランスポーターの活性が高い時間帯に、小腸（例えば十二指腸）内のグルコース等の単糖類を低減させると共に、グルコサミン類を増加させることができ、グルコサミン類の吸収率が向上することが推測される。
本発明の第一の方法では、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯のいずれかの時点で、対象にグルコサミン類を経口摂取させればよい。グルコサミン類の生物学的利用率がより向上することから、対象にグルコサミン類を経口摂取させる時間帯は、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降、５時間以内が好ましく、４時間以内がより好ましく、３．５時間以内がさらに好ましい。また、一態様において、グルコサミン類を経口摂取させる時間帯は、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間の０．５時間後から５時間後の間（該発現ピーク時間の０．５〜５時間後）が好ましく、該ピーク時間の０．５時間後から４時間後の間がより好ましく、該ピーク時間の１時間後から３．５時間後の間がさらに好ましく、該ピーク時間の１．５時間後から３時間後の間が特に好ましい。
Ｐｅｒ遺伝子として、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子ファミリーであるＰｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）、Ｐｅｒｉｏｄ２（Ｐｅｒ２）、Ｐｅｒｉｏｄ３（Ｐｅｒ３）が挙げられる。Ｐｅｒ遺伝子は、これらのいずれかであればよい。
Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、例えば、対象におけるＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を解析することにより確認することができる。Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、当業者に知られた任意の方法を用いて解析することができる。例えば、Ｐｅｒ遺伝子配列中の任意の配列をプローブとして用いたノーザンブロッティング解析、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現量解析等の方法を好適に用いることができる。遺伝子発現解析に供するための試料としては、細胞が含まれていればいかなるものをも用いることができるが、例えば毛包細胞を含む毛髪、皮膚等のバイオプシー、血液、唾液等を用いることができる。毛髪等の試料は、採取が比較的簡便であり、対象の負担が少ないという利点がある。本発明の第一の方法は、対象から採取した試料を用いてＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を解析し、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間を特定することを含んでもよい。
Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、例えば、対象におけるＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を解析することにより確認することができる。Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、当業者に知られた任意の方法を用いて解析することができる。例えば、Ｐｅｒ遺伝子配列中の任意の配列をプローブとして用いたノーザンブロッティング解析、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現量解析等の方法を好適に用いることができる。遺伝子発現解析に供するための試料としては、細胞が含まれていればいかなるものをも用いることができるが、例えば毛包細胞を含む毛髪、皮膚等のバイオプシー、血液、唾液等を用いることができる。毛髪等の試料は、採取が比較的簡便であり、対象の負担が少ないという利点がある。本発明の第一の方法は、対象から採取した試料を用いてＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を解析し、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間を特定することを含んでもよい。
例えばヒトでは、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、通常、起床時間周辺であり、より具体的には、起床時間の約１〜２時間前である（Ａｋａｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ ｕｓｉｎｇ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｌｌｓ．”， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１０ Ａｕｇ ３１；１０７（３５）：１５６４３−８．）。より具体的には、ヒトにおけるＰｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、通常、午前４〜１０時頃、より具体的には、午前５〜９時頃である（上記のＡｋａｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．）。例えば、この時間以降６時間以内にグルコサミン類を経口摂取させることが好ましい。一態様において、ヒトであれば、例えば、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯として、午前５時〜午後２時の間が好ましく、午前６時〜午前１２時の間がより好ましい。
本発明の第二の方法では、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間（該発現ピーク時間の２〜８時間後）の時間帯のいずれかの時点で、対象にグルコサミン類を経口摂取させればよい。グルコサミン類の生物学的利用率がより向上することから、対象にグルコサミン類を経口摂取させる時間帯は、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の３時間後から７時間後の間が好ましく、該ピーク時間の３．５時間後から７時間後の間がより好ましく、該ピーク時間の３．５時間後から６．５時間後の間がさらに好ましく、該ピーク時間の４時間後から６．５時間後の間が特に好ましい。本発明の第二の方法において、小腸は、好ましくは十二指腸である。
上記グルコーストランスポーターとして、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）、グルコーストランスポーター５（ＧＬＵＴ５）、ナトリウム−グルコース共輸送タンパク質１（ＳＧＬＴ１）等が挙げられる。本発明におけるグルコーストランスポーター遺伝子は、これらのいずれかであればよい。一態様において、好ましくは、ＧＬＵＴ２である。本発明においては、好ましくは、ＧＬＵＴ２遺伝子、ＧＬＵＴ５遺伝子及びＳＧＬＴ１遺伝子のうちの１種以上の遺伝子の発現ピーク時間、より好ましくは、ＧＬＵＴ２遺伝子、ＧＬＵＴ５遺伝子及びＳＧＬＴ１遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間に、グルコサミン類を経口摂取させることが好ましい。本発明の一態様において、ＧＬＵＴ２遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間に、グルコサミン類を経口摂取させることも好ましい。
グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間は、例えば、対象の小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量の変化を解析することにより確認することができる。グルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、当業者に知られた任意の方法を用いて解析することができる。例えば、該遺伝子配列中の任意の配列をプローブとして用いたノーザンブロッティング解析、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現解析等の方法を好適に用いることができる。遺伝子発現解析に供する試料としては、小腸組織（好ましくは十二指腸組織）が含まれる試料であればよい。本発明の第二の方法は、対象から採取した試料を用いて小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子の発現量の変化を解析し、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間を特定することを含んでもよい。
後記の試験例に示されるように、ラットを１２時間周期で明期／暗期の環境で飼育した場合、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間は、暗期開始時間の３時間前付近である。ヒトの通常の生活では、ラットと睡眠時間及び摂食時間の昼夜が通常逆であることから、ヒトにおけるグルコーストランスポーター遺伝子（例えば、ＧＬＵＴ２遺伝子、ＧＬＵＴ５遺伝子、ＳＧＬＴ１遺伝子等）の発現ピーク時間は、通常、午前１〜７時頃、より具体的には、午前３〜６時頃、さらに具体的には午前４〜５時頃であることが推定される。例えば、その２時間後から８時間後の間にグルコサミン類を経口摂取させることが好ましい。一態様において、ヒトであれば、上述した午前５時〜午後２時の間に、グルコサミン類を経口摂取させることが好ましく、午前６時〜午前１２時の間に、グルコサミン類を経口摂取させることがより好ましい。上記時間帯は、通常、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間から２時間後から８時間後の間であり、本発明における好ましい態様の一例である。
本発明の方法においては、３時間以上絶食後の上記の特定の時間帯にグルコサミン類を経口摂取させる。グルコサミン類を経口摂取させる時間帯の好ましい態様の一例として、ヒト等の動物の１日の生活の中では、起床時から１回目の食事までが挙げられる。３時間以上絶食後、かつ、起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を経口摂取させることは、本発明における好ましい実施態様の一例である。
上述したように、ヒトにおけるＰｅｒ遺伝子の発現ピーク時間は、通常、起床時間周辺である。本発明の第一の方法の一態様においては、例えばヒトであれば、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯として、起床時以降好ましくは３．５時間以内、より好ましくは３時間以内にグルコサミン類を経口摂取させることができる。この場合、グルコサミン類を経口摂取させる時間帯として、例えば、起床時の０．５時間後から３．５時間後の間が好ましく、起床時の１時間後から３時間後の間がより好ましい。ヒトの場合、一態様として、起床時から１回目の食事（例えば朝食）前の上記時間帯（例えば起床時以降３．５時間以内）にグルコサミン類を摂取させることが好ましい。上記時間帯は、本発明の第二の方法における、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間の時間の好ましい態様の一例でもある。
また、マウス、ラット等のげっ歯類では、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯として、例えば、暗期開始時間の０．５時間後から６時間後の間が好ましく、０．５時間後から５時間後の間がより好ましく、０．５時間後から４時間後の間がさらに好ましく、１時間後から３．５時間後の間がさらにより好ましく、１．５時間後から３時間後の間が特に好ましい。上記時間帯は、本発明の第二の方法における、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間の時間の好ましい態様の一例でもある。
上記時間帯にグルコサミン類を摂取させることにより、グルコサミン類の吸収率が向上し、その生物学的利用率が向上する。
また、マウス、ラット等のげっ歯類では、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯として、例えば、暗期開始時間の０．５時間後から６時間後の間が好ましく、０．５時間後から５時間後の間がより好ましく、０．５時間後から４時間後の間がさらに好ましく、１時間後から３．５時間後の間がさらにより好ましく、１．５時間後から３時間後の間が特に好ましい。上記時間帯は、本発明の第二の方法における、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間の時間の好ましい態様の一例でもある。
上記時間帯にグルコサミン類を摂取させることにより、グルコサミン類の吸収率が向上し、その生物学的利用率が向上する。
本発明の第一の方法及び第二の方法について、以下にさらに説明する。
本発明におけるグルコサミン類は、グルコサミン若しくはその誘導体又はこれらの塩であり、１種使用してもよく、２種以上を組合わせて使用してもよい。グルコサミンの誘導体として、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−メチル−Ｌ−グルコサミン等が挙げられる。グルコサミン又はその誘導体の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、乳酸塩等が挙げられ、好ましくは塩酸塩である。中でも、グルコサミン類として、グルコサミン、グルコサミンの塩、Ｎ−アセチルグルコサミンの１種又は２種以上が好適に用いられる。グルコサミン類は、より好ましくは、グルコサミン、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、アセチルグルコサミンであり、グルコサミン、グルコサミン塩酸塩がさらに好ましい。
本発明におけるグルコサミン類は、グルコサミン若しくはその誘導体又はこれらの塩であり、１種使用してもよく、２種以上を組合わせて使用してもよい。グルコサミンの誘導体として、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−メチル−Ｌ−グルコサミン等が挙げられる。グルコサミン又はその誘導体の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、乳酸塩等が挙げられ、好ましくは塩酸塩である。中でも、グルコサミン類として、グルコサミン、グルコサミンの塩、Ｎ−アセチルグルコサミンの１種又は２種以上が好適に用いられる。グルコサミン類は、より好ましくは、グルコサミン、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、アセチルグルコサミンであり、グルコサミン、グルコサミン塩酸塩がさらに好ましい。
本発明に使用できるグルコサミン類は、その由来、製法等について特に制限はない。グルコサミン類は、例えば、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類やイカの軟骨などに含まれるキチンを酸又は酵素により加水分解し、分離及び精製することによって得ることができる。また、グルコサミン類は、市販品を利用することもできる。
グルコサミン類を経口摂取させる量（摂取量）は、例えば、成人のヒトであれば、一個体あたり、１日あたり５０〜５０００ｍｇが好ましく、５００〜３０００ｍｇがより好ましい。また、１日あたり、体重１ｋｇあたりの摂取量は、例えば１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜６０ｍｇ／ｋｇとすることができる。本発明の方法においては、上記量のグルコサミン類を、１回で経口摂取させることが好ましい。また、本発明の一実施態様において、グルコサミン類の経口摂取は、１日に１回が好ましい。
本発明の方法においては、グルコサミン類をそのまま経口摂取させることができる。また、グルコサミン類に、所望により他の成分を配合して組成物として経口摂取させることもできる。一態様において、好ましくは、グルコサミン類を含む組成物を経口摂取させる。グルコサミン類を含む組成物は、好ましくはグルコサミン類を有効成分として含む組成物である。グルコサミン類を含む組成物は、好ましくは、飲食品（飲食品組成物）、経口用医薬（経口用医薬組成物）、経口用医薬部外品（経口用医薬部外品組成物）、動物用飼料等の経口で摂取される形態の組成物であり、より好ましくは、飲食品、動物用飼料である。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、食品添加剤等が挙げられる。
本発明の方法は、上記時間帯に、「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付したグルコサミン類を含む飲食品を対象に摂取させることを含む。本発明において、「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示には、一例として、「目覚めと共に摂取する」、「朝起きて一番に摂取する」、「寝起きと共に摂取する」、「目覚めて一番に摂取する」、「１日のスタートに摂取する」、「朝食前に摂取する」、「朝一番のエネルギー補給として摂取する」、「起床時に摂取する」、「１日の活動前に摂取する」、「１日の食事の前に摂取する」等の表示が含まれる。表示の方法として、グルコサミン類を含む飲食品の包装、容器、説明書、広告等への表示が挙げられる。
グルコサミン類を含む組成物は、本発明の効果を損なわない限り、所望により、任意の添加剤、任意の成分を含むことができる。これらの添加剤及び成分としては、飲食品、経口用医薬、経口用医薬部外品、飼料等の経口用組成物一般的に使用可能なものを使用することができる。例えば甘味料、酸味料等を含んでもよい。また、製剤化において配合される賦形剤、結合剤、乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、着色剤、凝固剤、コーティング剤、香料等を含んでもよい。組成物は、グルコサミン類以外の有効成分、例えば、コンドロイチン、酵素処理ルチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ビタミン等を含んでもよい。これらの任意の成分は１種用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一態様において、グルコサミン類を含む組成物は、グルコーストランスポーター（好ましくはＧＬＵＴ２）の基質、例えばグルコース等の単糖類を含まないか、含んでいても少量であることも好ましい。
グルコサミン類を含む組成物の形態は、特に限定されない。例えば、飲食品の場合、飲料等の液状食品、半固形状食品、固形状食品等のどのような形態でもよい。また、錠剤、カプセル、粉末、チュアブル錠等の経口用固形製剤；内服液剤、シロップ等の経口用液体製剤等の各種製剤形態とすることもできる。経口用医薬品、経口用医薬部外品は経口投与に適したものであればよい。
飲食品、医薬、医薬部外品、飼料等のグルコサミン類を含む組成物の製造方法は特に限定されず、グルコサミン類を用いて、一般的な方法により製造することができる。
グルコサミン類を含む組成物中のグルコサミン類の配合割合は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、組成物中に、グルコサミン類が、合計で０．１〜９５重量％が好ましく、１０〜８０重量％がより好ましい。
飲食品、医薬、医薬部外品、飼料等のグルコサミン類を含む組成物の製造方法は特に限定されず、グルコサミン類を用いて、一般的な方法により製造することができる。
グルコサミン類を含む組成物中のグルコサミン類の配合割合は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、組成物中に、グルコサミン類が、合計で０．１〜９５重量％が好ましく、１０〜８０重量％がより好ましい。
本発明の方法において、グルコサミン類を経口摂取させる対象は、哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）が好ましく、ヒトがより好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、サル等が挙げられる。本発明の方法における対象として、グルコサミン類の生物学的利用率向上を希望する又は必要とする対象が好ましい。また、グルコサミン類は、変形性関節症の症状を改善する作用等を有することから、例えば、関節痛の予防又は改善のために使用される。本発明における対象として、膝関節に不具合を感じる対象、変形性関節症の予防又は改善を希望する又は必要とする対象等が好ましい。予防は、発症の防止、遅延、発症率の低下を包含する。改善は、症状の軽快、症状の進行抑制、症状の治癒を包含する。グルコサミン類の生物学的利用率の向上は、例えば、膝関節の痛み等の予防又は改善、変形性関節症の予防又は改善に寄与し得る。
本発明の方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。「非治療的」とは、医療行為、すなわち手術、治療又は診断を含まない概念である。
本発明の方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。「非治療的」とは、医療行為、すなわち手術、治療又は診断を含まない概念である。
上述したように、対象におけるＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量、又は、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間（グルコサミン類を摂取する時間）を知る指標として使用できる。グルコサミン類の生物学的利用率が向上する摂取時間を知ることは、上述した関節痛の予防又は改善等のグルコサミン類による効果をより充分に得ることを希望する又は必要とする対象にとって有用である。
本発明は、Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法も包含する。当該方法においては、Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標として、該発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内を、グルコサミン類の生物学的利用率が向上する摂取時間として提示すればよい。また、一態様において、当該方法おいては、上記Ｐｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量及び絶食時間を指標とし、３時間以上絶食後、かつ、該発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内を、グルコサミン類の生物学的利用率が向上する摂取時間として提示することが好ましい。Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間以降６時間以内の時間帯の好ましい態様は、上述した通りである。対象におけるＰｅｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の解析等は上述した方法で行うことができる。本発明の方法は、対象から採取した試料を用いてＰｅｒ遺伝子の発現量の変化を解析し、Ｐｅｒ遺伝子の発現ピーク時間を特定することを含んでもよい。
本発明は、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法も包含する。当該方法においては、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とし、上記発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間を、グルコサミン類の生物学的利用率が向上する摂取時間として提示すればよい。また、一態様において、当該方法おいては、上記グルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量及び絶食時間を指標とし、３時間以上絶食後、かつ、該発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間を、グルコサミン類の生物学的利用率が向上する摂取時間として提示することが好ましい。グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間の２時間後から８時間後の間の時間帯の好ましい態様は、上述した通りである。対象の小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量の解析等は上述した方法で行うことができる。本発明の方法においては、対象から採取した試料を用いて小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子の発現量の変化を解析し、グルコーストランスポーター遺伝子の発現ピーク時間を特定することを含んでもよい。
本発明は、以下のグルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤も包含する。
グルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤であって、下記（ｉ）又は（ｉｉ）において、対象に経口摂取させるための、関節痛の予防又は改善剤。
（ｉ）３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内
（ｉｉ）３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間から２時間後から８時間後の間
グルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤であって、下記（ｉ）又は（ｉｉ）において、対象に経口摂取させるための、関節痛の予防又は改善剤。
（ｉ）３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内
（ｉｉ）３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間から２時間後から８時間後の間
本発明の関節痛の予防又は改善剤は、グルコサミン類を有効成分として含む。
上記の（ｉ）又は（ｉｉ）の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の生物学的利用率が向上し、グルコサミン類による関節痛の予防又は改善効果が増強される。グルコサミン類を摂取させる時間の好ましい態様は、上述した通りである。本発明の関節痛の予防又は改善剤は、１日１回経口摂取させることが好ましい。
上記の（ｉ）又は（ｉｉ）の時間帯に対象にグルコサミン類を経口摂取させることにより、グルコサミン類の生物学的利用率が向上し、グルコサミン類による関節痛の予防又は改善効果が増強される。グルコサミン類を摂取させる時間の好ましい態様は、上述した通りである。本発明の関節痛の予防又は改善剤は、１日１回経口摂取させることが好ましい。
本発明の関節痛の予防又は改善剤は、上述した任意の添加剤、任意の成分を含む組成物であってよい。グルコサミン類を含む組成物及びその好ましい態様は、上述した組成物及びその好ましい態様と同じである。グルコサミン類の摂取量等も上述した通りである。
本発明の関節痛の予防又は改善剤は、上述した経口用医薬品、経口用医薬部外品、飲食品、飼料等とすることができる。本発明の関節痛の予防又は改善剤は、包装、容器、説明書、添付文書、広告等に用途、有効成分の種類、使用方法等の１又は２以上を表示してもよい。一態様において、本発明の関節痛の予防又は改善剤には、上記の「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付してよい。
本発明の関節痛の予防又は改善剤は、上述した経口用医薬品、経口用医薬部外品、飲食品、飼料等とすることができる。本発明の関節痛の予防又は改善剤は、包装、容器、説明書、添付文書、広告等に用途、有効成分の種類、使用方法等の１又は２以上を表示してもよい。一態様において、本発明の関節痛の予防又は改善剤には、上記の「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付してよい。
以下、本発明を試験例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。時刻は２４時間表記（０：００−２４：００）で示した。なお、一連の動物実験は、動物愛護管理法他関連法令を遵守し、社内動物実験委員会の審査を経て機関の長が承認した計画に基づき実施した。
＜実験動物＞
７週齢Ｌｅｗｉｓ系雄性ラットを日本エスエルシー株式会社より購入した。ラットは、プラスチックケージの中で２−３匹の群飼育とし、自由摂食飲水、１２時間明暗周期（明期：時刻７：００−１９：００）、恒温（２４±１℃）条件下の室内で１週間以上飼育した後、実験に使用した。
７週齢Ｌｅｗｉｓ系雄性ラットを日本エスエルシー株式会社より購入した。ラットは、プラスチックケージの中で２−３匹の群飼育とし、自由摂食飲水、１２時間明暗周期（明期：時刻７：００−１９：００）、恒温（２４±１℃）条件下の室内で１週間以上飼育した後、実験に使用した。
＜グルコサミン＞
Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（以下、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ）（プロテインケミカル（株）製）を、大塚蒸留水（（株）大塚製薬工場）に用時に溶解させて使用した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ水溶液は、投与容量を２ｍＬ／ｋｇとして、ラットに経口投与した。
Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（以下、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ）（プロテインケミカル（株）製）を、大塚蒸留水（（株）大塚製薬工場）に用時に溶解させて使用した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ水溶液は、投与容量を２ｍＬ／ｋｇとして、ラットに経口投与した。
以下の試験において、血漿中のグルコサミン（ＧｌｃＮ）濃度は、以下の方法により測定した。
＜血漿中ＧｌｃＮ濃度測定＞
尾静脈より血液を採取した。採取した血液は、直ちにＥＤＴＡ処理を行った後、３，０００×ｇ、１５℃で１０分間遠心分離し、血漿を得た。血漿は測定まで−８０℃で凍結保存した。
血漿中ＧｌｃＮ濃度の測定には、内部標準法を用いた。内部標準物質として１３Ｃ−グルコサミンを使用し、血漿４０μＬに内部標準溶液５μＬ、アセトニトリル２００μＬを加え撹拌し、氷上静置１０分間した後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行った。得られた上清２００μＬについて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて後述の分析条件でＧｌｃＮ濃度を測定した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前の血漿中ＧｌｃＮ濃度を、投与時間０時間の血漿中ＧｌｃＮ濃度とした。
＜血漿中ＧｌｃＮ濃度測定＞
尾静脈より血液を採取した。採取した血液は、直ちにＥＤＴＡ処理を行った後、３，０００×ｇ、１５℃で１０分間遠心分離し、血漿を得た。血漿は測定まで−８０℃で凍結保存した。
血漿中ＧｌｃＮ濃度の測定には、内部標準法を用いた。内部標準物質として１３Ｃ−グルコサミンを使用し、血漿４０μＬに内部標準溶液５μＬ、アセトニトリル２００μＬを加え撹拌し、氷上静置１０分間した後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行った。得られた上清２００μＬについて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて後述の分析条件でＧｌｃＮ濃度を測定した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前の血漿中ＧｌｃＮ濃度を、投与時間０時間の血漿中ＧｌｃＮ濃度とした。
血漿中ＧｌｃＮ濃度のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ２Ｄ ５．０μｍ，２．０×１５０ｍｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）（昭和電工（株））
ガードカラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０Ｇ ２Ａ ５．０μｍ，２．０×３０ｍｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）（昭和電工（株））
移動相：１０ｍＭ酢酸水溶液（アンモニアでｐＨ７．５に調整）：アセトニトリル＝２０：８０（ｖ／ｖ）
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０．００μＬ
カラムオーブン：２８±５℃
サンプルクーラー：１０±５℃
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ２Ｄ ５．０μｍ，２．０×１５０ｍｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）（昭和電工（株））
ガードカラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０Ｇ ２Ａ ５．０μｍ，２．０×３０ｍｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）（昭和電工（株））
移動相：１０ｍＭ酢酸水溶液（アンモニアでｐＨ７．５に調整）：アセトニトリル＝２０：８０（ｖ／ｖ）
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０．００μＬ
カラムオーブン：２８±５℃
サンプルクーラー：１０±５℃
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
ＭＳ検出器：Ｑｕａｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社）
モニターイオン：１８０．１→１６２．１
Ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ：３，５００Ｖ
温度：３５０℃
ＭＳ検出器：Ｑｕａｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社）
モニターイオン：１８０．１→１６２．１
Ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ：３，５００Ｖ
温度：３５０℃
＜統計解析＞
多群間の比較には一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を、特定の２群間の比較にはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔを用いた。独立した２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。２４時間の周期性の有無の評価にはＣｏｓｉｎｅｒ法を用いた。有意水準は５％とした。
多群間の比較には一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を、特定の２群間の比較にはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔを用いた。独立した２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。２４時間の周期性の有無の評価にはＣｏｓｉｎｅｒ法を用いた。有意水準は５％とした。
＜試験例１＞
（ＧｌｃＮの体内動態に及ぼす絶食飼育環境の影響）
血漿中ＧｌｃＮ濃度に及ぼす摂食の影響を調べた。自由摂食又は投与１２時間前絶食環境下（時刻２２：００−１０：００）で飼育したラットにＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻１０：００に単回経口投与した。自由摂食群（ｎ＝３）は、試験開始前から試験終了まで継続して自由摂食環境下で飼育した。投与１２時間前絶食群（ｎ＝３）は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与１２時間前から試験終了まで絶食環境下で飼育した。両群ともに常に自由飲水環境下で飼育した。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図１に示す。
（ＧｌｃＮの体内動態に及ぼす絶食飼育環境の影響）
血漿中ＧｌｃＮ濃度に及ぼす摂食の影響を調べた。自由摂食又は投与１２時間前絶食環境下（時刻２２：００−１０：００）で飼育したラットにＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻１０：００に単回経口投与した。自由摂食群（ｎ＝３）は、試験開始前から試験終了まで継続して自由摂食環境下で飼育した。投与１２時間前絶食群（ｎ＝３）は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与１２時間前から試験終了まで絶食環境下で飼育した。両群ともに常に自由飲水環境下で飼育した。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図１に示す。
図１は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌを単回投与後の、ラットの血漿中ＧｌｃＮ濃度の経時変化を示すグラフである。図１に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。図１中、○は自由摂食群、●は投与１２時間前絶食群である。横軸は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与後の経過時間である。
各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度に両投与群間で有意な差異はみられなかった。
また、各測定時点の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。各群におけるＡＵＣ０−４ｈｒの平均値は、自由摂食群で１２．２（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、投与１２時間前絶食群で１４．１（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、両群間でＡＵＣ０−４ｈｒに有意な差異はみられなかった。これらの結果から、ＧｌｃＮ−ＨＣｌの空腹時投与では、ＧｌｃＮの吸収率を向上させることはできなかった。
各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度に両投与群間で有意な差異はみられなかった。
また、各測定時点の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。各群におけるＡＵＣ０−４ｈｒの平均値は、自由摂食群で１２．２（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、投与１２時間前絶食群で１４．１（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、両群間でＡＵＣ０−４ｈｒに有意な差異はみられなかった。これらの結果から、ＧｌｃＮ−ＨＣｌの空腹時投与では、ＧｌｃＮの吸収率を向上させることはできなかった。
＜試験例２＞
（血漿中ＧｌｃＮ濃度に及ぼす投与時刻の影響）
自由摂食環境下のラットにＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻４：００、１０：００、１６：００又は２２：００に単回経口投与した（各群ｎ＝６）。ラットは、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与後に絶食環境下とした。また試験開始前から試験終了まで自由飲水環境下で飼育した。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図２に示す。
（血漿中ＧｌｃＮ濃度に及ぼす投与時刻の影響）
自由摂食環境下のラットにＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻４：００、１０：００、１６：００又は２２：００に単回経口投与した（各群ｎ＝６）。ラットは、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与後に絶食環境下とした。また試験開始前から試験終了まで自由飲水環境下で飼育した。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図２に示す。
図２は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌを単回投与後の、ラットの血漿中ＧｌｃＮ濃度の経時変化を示すグラフである。図２に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である。図２中、▲は４：００投与群、○は１０：００投与群、△は１６：００投与群、●は２２：００投与群である。図２の横軸は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与後の経過時間である。
各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度は、すべての投与群間で有意な差異はみられなかった。
また、各測定時点の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。各群におけるＡＵＣ０−４ｈｒの平均値は、４：００投与群で１９．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１０：００投与群で１５．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１６：００投与群で１６．８（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、２２：００投与群で１６．４（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、すべての群間でＡＵＣ０−４ｈｒに有意な差異はみられなかった。これらの結果から、自由摂取環境下において、投与時刻の違いによりＧｌｃＮの吸収率を向上させることはできなかった。
各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度は、すべての投与群間で有意な差異はみられなかった。
また、各測定時点の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。各群におけるＡＵＣ０−４ｈｒの平均値は、４：００投与群で１９．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１０：００投与群で１５．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１６：００投与群で１６．８（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、２２：００投与群で１６．４（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、すべての群間でＡＵＣ０−４ｈｒに有意な差異はみられなかった。これらの結果から、自由摂取環境下において、投与時刻の違いによりＧｌｃＮの吸収率を向上させることはできなかった。
＜試験例３＞
（ラットの自発運動及び摂食行動の日内変動）
ラットの摂食行動及び活動リズムを以下の方法で測定した。
自由摂食飲水、１２時間明暗周期（明期：時刻７：００−１９：００）条件下のラットを対象に、１５分毎にラットの自発運動量及び摂食量を測定した。測定には、ｃＦＤＭ−７００ＡＳ（ラット用摂餌制限機能付摂餌量測定装置、ＭＥＬＱＵＥＳＴ社）を用いて、ラットはプラスチック測定ケージの中で個別飼育とした。
（ラットの自発運動及び摂食行動の日内変動）
ラットの摂食行動及び活動リズムを以下の方法で測定した。
自由摂食飲水、１２時間明暗周期（明期：時刻７：００−１９：００）条件下のラットを対象に、１５分毎にラットの自発運動量及び摂食量を測定した。測定には、ｃＦＤＭ−７００ＡＳ（ラット用摂餌制限機能付摂餌量測定装置、ＭＥＬＱＵＥＳＴ社）を用いて、ラットはプラスチック測定ケージの中で個別飼育とした。
ラットは、暗期の始まりである１９：００頃に活動を開始し、暗期の間、断続的に活発な活動がみられた。各測定日における暗期及び明期での活動量の平均値は、暗期が８０９５．３（ｃｏｕｎｔｓ／１２ｈｒ）及び明期が２０９０．１（ｃｏｕｎｔｓ／１２ｈｒ）であり、摂食量の平均値は、暗期が１２．８（ｇ／１２ｈｒ）及び明期が５．４（ｇ／１２ｈｒ）であった。総活動量中の暗期の活動量の占める割合は約８０％、総摂食量中の暗期の摂食量の占める割合は約７０％であり、自発運動及び摂食行動が暗期の間で活発に行われていることが確認された。
表１に、各測定日における３時間毎の自発運動量及び摂食量の平均値を示した。その結果、自発運動量及び摂食量のピークは、暗期の初期である１９：００から２２：００までの時間帯であった。また、１９：００から２２：００の時間帯をピークとした自発運動量及び摂食量の日内変動は、測定期間中、各測定日において継続して確認された。
表１に、各測定日における３時間毎の自発運動量及び摂食量の平均値を示した。その結果、自発運動量及び摂食量のピークは、暗期の初期である１９：００から２２：００までの時間帯であった。また、１９：００から２２：００の時間帯をピークとした自発運動量及び摂食量の日内変動は、測定期間中、各測定日において継続して確認された。
＜試験例４＞
（投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にした投与時刻の違いによる血漿中ＧｌｃＮ濃度への影響）
投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻４：００、１０：００、１６：００又は２２：００に単回経口投与した。ラットは、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与３時間前から試験終了まで絶食環境下で飼育したが、水は自由に摂取させた。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図３に示す。
（投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にした投与時刻の違いによる血漿中ＧｌｃＮ濃度への影響）
投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５００ｍｇ／ｋｇを時刻４：００、１０：００、１６：００又は２２：００に単回経口投与した。ラットは、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与３時間前から試験終了まで絶食環境下で飼育したが、水は自由に摂取させた。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与前、及び、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間にラット尾静脈より採血を行い、上記方法で、血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。結果を図３に示す。
図３は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌを単回投与後の、ラットの血漿中ＧｌｃＮ濃度の経時変化を示すグラフである。図３に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である（＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ．４：００投与群；＃：Ｐ＜０．０５、＃＃：Ｐ＜０．０１ ｖｓ．１０：００投与群；†：Ｐ＜０．０５、††：Ｐ＜０．０１ ｖｓ．１６：００投与群（Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔ））。図３中、▲は４：００投与群、○は１０：００投与群、△は１６：００投与群、●は２２：００投与群である。図３の横軸は、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与後の経過時間である。
ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与０．２５時間後の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、２２：００投与群が、１６：００投与群と比較して有意に高値を示した（Ｐ＜０．０５）。また、ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与０．５時間後及び１時間後の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、２２：００投与群が、他の投与群と比較して有意に高値を示した（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。さらにＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与２時間後の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、４：００投与群及び２２：００投与群が、１６：００投与群と比較して有意に高値を示した（それぞれＰ＜０．０５）。
また、各測定時点の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。各群におけるＡＵＣ０−４ｈｒの平均値は、４：００投与群で１９．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１０：００投与群で１６．１（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、１６：００投与群で１２．５（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）、２２：００投与群で２７．８（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であった。２２：００投与群のＡＵＣ０−４ｈｒは、１０：００投与群及び１６：００投与群のＡＵＣ０−４ｈｒと比較してそれぞれ１．７３倍及び２．２２倍であった（ｖｓ．１０：００投与群：Ｐ＜０．０５、ｖｓ．１６：００投与群：Ｐ＜０．０１）。
（各投与時刻での摂食条件の違いによる血漿中ＧｌｃＮ濃度への影響）
図４に、図２及び図３に示したデータを用いて、各投与時刻における自由摂食群及び投与３時間前絶食群の血漿中ＧｌｃＮ濃度の経時変化を示した（（ａ）は、４：００投与群、（ｂ）は、１０：００投与群、（ｃ）は、１６：００投与群、（ｄ）は、２２：００投与群）。図４（ａ）〜（ｄ）に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である（＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ．各自由摂食群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ））。図４（ａ）〜（ｄ）中、□は、自由摂食群、■は、投与３時間前絶食群である。
図４に、図２及び図３に示したデータを用いて、各投与時刻における自由摂食群及び投与３時間前絶食群の血漿中ＧｌｃＮ濃度の経時変化を示した（（ａ）は、４：００投与群、（ｂ）は、１０：００投与群、（ｃ）は、１６：００投与群、（ｄ）は、２２：００投与群）。図４（ａ）〜（ｄ）に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である（＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ．各自由摂食群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ））。図４（ａ）〜（ｄ）中、□は、自由摂食群、■は、投与３時間前絶食群である。
２２：００投与（図４（ｄ））における投与３時間前絶食群の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、自由摂食群と比較して、投与後０．０８３時間目から１時間目までのすべての測定時点で有意に高値を示し（それぞれＰ＜０．０５）、投与３時間前絶食群のＡＵＣ０−４ｈｒは、自由摂食群と比較し１．７０倍であった（Ｐ＜０．０５）。
４：００投与（図４（ａ））及び１０：００投与（図４（ｂ））においては、各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度及びＡＵＣ０−４ｈｒに両投与群間で有意な差異はみられなかった。１６：００投与（図４（ｃ））における投与３時間前絶食群の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、自由摂食群と比較して、投与後０．５時間目及び１時間目で有意に低値を示し（それぞれＰ＜０．０５）、投与３時間前絶食群のＡＵＣ０−４ｈｒは、自由摂食群と比較し０．７４倍であった（Ｐ＜０．０５）。
このように２２：００投与３時間前絶食群においてのみ、血漿中ＧｌｃＮ濃度が上昇した。以上より、特定の投与時刻で数時間摂食しないときにグルコサミン類を摂取すると、ＧｌｃＮの血中濃度が顕著に増加することが明らかとなった。
４：００投与（図４（ａ））及び１０：００投与（図４（ｂ））においては、各測定時点での血漿中ＧｌｃＮ濃度及びＡＵＣ０−４ｈｒに両投与群間で有意な差異はみられなかった。１６：００投与（図４（ｃ））における投与３時間前絶食群の血漿中ＧｌｃＮ濃度は、自由摂食群と比較して、投与後０．５時間目及び１時間目で有意に低値を示し（それぞれＰ＜０．０５）、投与３時間前絶食群のＡＵＣ０−４ｈｒは、自由摂食群と比較し０．７４倍であった（Ｐ＜０．０５）。
このように２２：００投与３時間前絶食群においてのみ、血漿中ＧｌｃＮ濃度が上昇した。以上より、特定の投与時刻で数時間摂食しないときにグルコサミン類を摂取すると、ＧｌｃＮの血中濃度が顕著に増加することが明らかとなった。
＜試験例５＞
（小腸組織中トランスポーターｍＲＮＡ発現の概日リズムの評価）
ラットの小腸におけるグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５及びＳＧＬＴ１）のｍＲＮＡ発現量の変化を調べた。
（小腸組織中トランスポーターｍＲＮＡ発現の概日リズムの評価）
ラットの小腸におけるグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５及びＳＧＬＴ１）のｍＲＮＡ発現量の変化を調べた。
（小腸組織の採取）
組織採取３時間前より絶食環境下（水は自由に摂取）で飼育したラットを対象に、時刻４：００、１０：００、１６：００、２２：００に全身麻酔下で下大動脈よりＰＢＳ（−）を潅流させ、脱血致死後に十二指腸を採取した。組織サンプルは、−８０℃にて凍結保存した。
組織採取３時間前より絶食環境下（水は自由に摂取）で飼育したラットを対象に、時刻４：００、１０：００、１６：００、２２：００に全身麻酔下で下大動脈よりＰＢＳ（−）を潅流させ、脱血致死後に十二指腸を採取した。組織サンプルは、−８０℃にて凍結保存した。
（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出）
採取した組織にＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）５００μＬを加え、氷冷却条件下でホモジナイズした。ホモジネートにクロロホルム１００μＬを加えてボルテックスし、室温で５分間静置後、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。その上清を採取し、イソプロパノール３００μＬを加え、転倒混和後、室温で１０分間静置した。１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を取り除いた。残渣に７５％エタノールを加え、７，５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上清を取り除き風乾させ、残渣をＴＥ ｂｕｆｆｅｒ ２２μＬに溶解した。極微量分光光度計（ＬＭＳ Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＲＮＡ濃度を測定した後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを加え５００ｎｇ／μＬに調整し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルとした。
採取した組織にＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）５００μＬを加え、氷冷却条件下でホモジナイズした。ホモジネートにクロロホルム１００μＬを加えてボルテックスし、室温で５分間静置後、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。その上清を採取し、イソプロパノール３００μＬを加え、転倒混和後、室温で１０分間静置した。１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を取り除いた。残渣に７５％エタノールを加え、７，５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上清を取り除き風乾させ、残渣をＴＥ ｂｕｆｆｅｒ ２２μＬに溶解した。極微量分光光度計（ＬＭＳ Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＲＮＡ濃度を測定した後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを加え５００ｎｇ／μＬに調整し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルとした。
（ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）除去及びｃＤＮＡ合成）
以下の実験はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）のプロトコールに準じて行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル １μＬ、５×ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ １μＬ、ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２．５μＬを混合した。ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４２℃、２分でｇＤＮＡａｓｅ処理を行った。その後、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２（ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）２．５μＬ、ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ０．５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉ ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２．５μＬを混合し、ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて３７℃、１５分、８５℃、５秒で反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
以下の実験はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）のプロトコールに準じて行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル １μＬ、５×ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ １μＬ、ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２．５μＬを混合した。ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４２℃、２分でｇＤＮＡａｓｅ処理を行った。その後、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２（ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）２．５μＬ、ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ０．５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉ ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２．５μＬを混合し、ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて３７℃、１５分、８５℃、５秒で反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法）
各ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。リアルタイムＰＣＲ反応はＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，ＬＴＤ）を用い、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５、ＳＧＬＴ１プライマーは以下に示す配列のものを用いた。
Rat GAPDH (GenBank accession number : NM_017008.4)
Forward: 5’- AAAGCTGTGGCGTGATGG-3’（配列番号１）
Reverse: 5’- TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’（配列番号２）
各ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。リアルタイムＰＣＲ反応はＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，ＬＴＤ）を用い、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５、ＳＧＬＴ１プライマーは以下に示す配列のものを用いた。
Rat GAPDH (GenBank accession number : NM_017008.4)
Forward: 5’- AAAGCTGTGGCGTGATGG-3’（配列番号１）
Reverse: 5’- TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’（配列番号２）
Rat GLUT2 (GenBank accession number : NM_012879.2)
Forward: 5’- TGTGGGCTAATTTCAGGACTGG -3’（配列番号３）
Reverse: 5’- AAGAGCCAGTTGGTGAAGAGTG -3’（配列番号４）
Forward: 5’- TGTGGGCTAATTTCAGGACTGG -3’（配列番号３）
Reverse: 5’- AAGAGCCAGTTGGTGAAGAGTG -3’（配列番号４）
Rat GLUT5 (GenBank accession number : NM_031741.1)
Forward: 5’- ATCTTCTCCTCATCGGCTTCTC -3’（配列番号５）
Reverse: 5’- CAATGACACAGACGATGCTGAC -3’（配列番号６）
Forward: 5’- ATCTTCTCCTCATCGGCTTCTC -3’（配列番号５）
Reverse: 5’- CAATGACACAGACGATGCTGAC -3’（配列番号６）
Rat SGLT1 (GenBank accession number : NM_013033.2)
Forward: 5’- TGGAGTCTACGTAACAGCACAG -3’（配列番号７）
Reverse: 5’- GTCATATGCCTTCCTGAAGCAC -3’（配列番号８）
Forward: 5’- TGGAGTCTACGTAACAGCACAG -3’（配列番号７）
Reverse: 5’- GTCATATGCCTTCCTGAAGCAC -3’（配列番号８）
ｃＤＮＡサンプル２μＬ、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２μＬ（最終濃度０．２μＭ）、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２μＬ（最終濃度０．２μＭ）、ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ０．４μＬ、ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １０μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ７．２μＬを混合した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて初期変性を９８℃、２分の条件で行った後に、解離反応を９８℃、１０秒、アニーリングを６０℃、１０秒、伸長反応を６８℃、３０秒の条件でＰＣＲ反応を４０サイクル行った。さらに、ＰＣＲ反応後に融解温度の測定を行った。
内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する各遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量を算出した。
内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する各遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量を算出した。
図５は、ラット十二指腸組織中のＧＬＵＴ２遺伝子、ＧＬＵＴ５遺伝子及びＳＧＬＴ１遺伝子の各ｍＲＮＡ発現量の２４時間のリズムを示すグラフである（（ａ）：ＧＬＵＴ２、（ｂ）：ＳＧＬＴ１、（ｃ）：ＧＬＵＴ５）。図５（ａ）〜（ｃ）に示す値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）である。図５（ａ）〜（ｃ）に示す結果は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量に対する相対ｍＲＮＡ量である。
ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５及びＳＧＬＴ１のｍＲＮＡ発現量には、概日リズムが観察された（ＧＬＵＴ２：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝１０．１４９、Ｐ＜０．０１，Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１；ＧＬＵＴ５：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝２３．１４３、Ｐ＜０．０１、Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１；ＳＧＬＴ１：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝３３．９２８、Ｐ＜０．０１、Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１）。
ＧＬＵＴ２及びＧＬＵＴ５のｍＲＮＡ発現量には、時刻１６：００に最高値を、４：００に最低値を示す有意な概日リズムが観察された（それぞれＰ＜０．０１）。また、ＳＧＬＴ１のｍＲＮＡ発現量には、１６：００に最高値を、１０：００に最低値を示す有意な概日リズムが観察された（Ｐ＜０．０１）。
ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５及びＳＧＬＴ１のｍＲＮＡ発現量には、概日リズムが観察された（ＧＬＵＴ２：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝１０．１４９、Ｐ＜０．０１，Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１；ＧＬＵＴ５：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝２３．１４３、Ｐ＜０．０１、Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１；ＳＧＬＴ１：Ｆ ｆｒｏｍ ＡＮＯＶＡ＝３３．９２８、Ｐ＜０．０１、Ｐ ｆｒｏｍ Ｃｏｓｉｎｏｒ＜０．０１）。
ＧＬＵＴ２及びＧＬＵＴ５のｍＲＮＡ発現量には、時刻１６：００に最高値を、４：００に最低値を示す有意な概日リズムが観察された（それぞれＰ＜０．０１）。また、ＳＧＬＴ１のｍＲＮＡ発現量には、１６：００に最高値を、１０：００に最低値を示す有意な概日リズムが観察された（Ｐ＜０．０１）。
＜試験例６＞
グルコサミンの生物学的利用率の評価
自由摂食又は投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）を時刻２２：００に尾静脈内投与した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間に尾静脈より血液を採取し、上記の方法で血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。
グルコサミンの生物学的利用率の評価
自由摂食又は投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）を時刻２２：００に尾静脈内投与した。ＧｌｃＮ−ＨＣｌ投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、３、４時間後の各時間に尾静脈より血液を採取し、上記の方法で血漿中のＧｌｃＮ濃度を測定した。
投与３時間絶食後の静脈注射時の血漿中ＧｌｃＮ濃度からＡＵＣ０−４ｈｒを算出した。静脈投与（ＧｌｃＮ−ＨＣｌ ５０ｍｇ投与）のＡＵＣ０−４ｈｒ（静脈投与ＡＵＣ）の平均値±ＳＤは、２９．２±１．６（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であった（ｎ＝３）。
試験例４の結果から、自由摂食又は投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ（５００ｍｇ／ｋｇ）を２２：００に経口投与した場合のＡＵＣ０−４ｈｒ（経口投与ＡＵＣ）は、自由摂食群の経口投与群のＡＵＣ０−４ｈｒの平均値±ＳＤは、１６．４±３．６（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、投与３時間前絶食群が２７．８±８．０（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であった（いずれも、ｎ＝６）。
経口投与ＡＵＣ及び絶食群の静脈投与ＡＵＣから、以下の式により、２２：００投与の際の自由摂食群及び投与３時間前絶食群のＧｌｃＮの生物学的利用率（ＢＡ）を算出した。
生物学的利用率（％）＝１００×経口投与ＡＵＣ／絶食群の静脈投与ＡＵＣ
試験例４の結果から、自由摂食又は投与３時間前より絶食環境下で飼育したラットを対象にＧｌｃＮ−ＨＣｌ（５００ｍｇ／ｋｇ）を２２：００に経口投与した場合のＡＵＣ０−４ｈｒ（経口投与ＡＵＣ）は、自由摂食群の経口投与群のＡＵＣ０−４ｈｒの平均値±ＳＤは、１６．４±３．６（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であり、投与３時間前絶食群が２７．８±８．０（μｇ／ｍＬ・ｈｒ）であった（いずれも、ｎ＝６）。
経口投与ＡＵＣ及び絶食群の静脈投与ＡＵＣから、以下の式により、２２：００投与の際の自由摂食群及び投与３時間前絶食群のＧｌｃＮの生物学的利用率（ＢＡ）を算出した。
生物学的利用率（％）＝１００×経口投与ＡＵＣ／絶食群の静脈投与ＡＵＣ
自由摂食群においては、ＧｌｃＮの生物学的利用率が６％であった。投与３時間前絶食群の生物学的利用率は１０％であり、自由摂食群の１．７０倍であった。
上記の試験例から、所定時間絶食後の空腹時、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で高値を示す時刻から所定時間後にグルコサミン類を経口摂取させることによって、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができることが明らかとなった。
上記の試験例から、所定時間絶食後の空腹時、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で高値を示す時刻から所定時間後にグルコサミン類を経口摂取させることによって、グルコサミン類の生物学的利用率を向上させることができることが明らかとなった。
上記の試験においては、ラットでは、明期である昼間が睡眠時間にあたり、暗期である夜間が摂食時間にあたる。上記試験では、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現は、暗期開始前の１６時（１６：００）に最高値を示した。ヒトの場合は、ラットと睡眠時間及び摂食時間の昼夜が通常逆であり、通常は夕食後から起床時間までは絶食時間である。このため、上記のラットの結果をヒトに当てはめると、ヒトの通常の生活では、起床時から朝食までにグルコサミン類を経口摂取させることによって、グルコサミン類の吸収率を向上させることができると考えられる。
Claims (15)
- ３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
- 前記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである請求項１に記載の方法。
- 前記絶食時間が、３〜２４時間である、請求項１又は２に記載の方法。
- 起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を経口摂取させる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- ３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間に、対象にグルコサミン類を経口摂取させることを含む、グルコサミン類の生物学的利用率向上方法。
- 前記グルコサミン類の生物学的利用率向上が、グルコサミン類の吸収率向上によるものである、請求項６に記載の方法。
- 前記グルコーストランスポーターが、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）、グルコーストランスポーター５（ＧＬＵＴ５）及びナトリウム−グルコース共輸送タンパク質１（ＳＧＬＴ１）からなる群より選択される１種以上である請求項６又は７に記載の方法。
- 前記絶食時間が、３〜２４時間である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
- 起床時から１回目の食事までに対象にグルコサミン類を経口摂取させる請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
- 前記グルコサミン類を経口摂取させた後、１５分以上絶食させる、請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
- Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
- 小腸におけるグルコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、生物学的利用率が向上するグルコサミン類の摂取時間を提示する方法。
- グルコサミン類を含む関節痛の予防又は改善剤であって、下記（ｉ）又は（ｉｉ）において対象に経口摂取させるための、関節痛の予防又は改善剤。
（ｉ）３時間以上絶食後、かつ、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間以降６時間以内
（ｉｉ）３時間以上絶食後、かつ、小腸におけるグルコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量が１日の中で最大となる時間の２時間後から８時間後の間 - 「起床時から１回目の食事までの間に摂取する」旨の表示を付した請求項１４に記載の関節痛の予防又は改善剤。
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| JP2017165804 | 2017-08-30 | ||
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-
2018
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 合田敏尚: "消化管における遺伝子発現リズム発振の分子基盤に関する研究", 科学研究費補助金研究成果報告書, JPN6021043281, 30 May 2011 (2011-05-30), ISSN: 0004631501 * |
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