JPWO2018203576A1 - 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、現在、イメージング技術により撮影された細胞形態情報は、目視により評価されている。今後、機械学習技術により判別が進むとしても、その判別の妥当性を評価する必要がある。現状では、目視等により観察した一細胞は物理的に分取して遺伝子や他の診断技術との比較を行うしか無い。
(1) 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法であって、
1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており;
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし;
該関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得;
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し;
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなる、方法。
(2) 前記複数のコンパートメントが、細胞群またはその由来物、複数の第一ビーズ、および複数の第二ビーズを分配処理することにより得られたものである、(1)に記載の方法。
(3) 第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出する、(1)または(2)に記載の方法。
(4) 1コンパートメント当たりの第一ビーズの数が複数である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) 1コンパートメント当たりの第二ビーズの数が1つである、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記コンパートメントが、ウェル、液滴またはゲル粒子の形態である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記ゲノム関連核酸が、前記一細胞ゲノムDNA、前記一細胞ゲノムに由来するRNAもしくはそのcDNA、または前記一細胞で発現する蛋白質に特異的な核酸プローブである、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも1つの測定情報に基づくものである、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 第一ビーズにおける第一バーコード核酸が各々、同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10) 第一共通バーコード領域の配列情報が、一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標となる、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11) 前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12) 前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する一細胞またはその由来物を特定する指標となる、(11)に記載の方法。
(13) 前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、(11)または(12)に記載の方法。
(14) 第二バーコード核酸が、PCRプライマー領域をさらに含んでなる、(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(15) 第二バーコード核酸が、第二ビーズ側から順に、PCRプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域および第二ハイブリダイズ領域を含んでなる、(14)に記載の方法。
(16) 第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、(11)〜(15)のいずれかに記載の方法。
(17) 第一バーコード核酸および第二バーコード核酸が、RNA、DNAまたはそれらの組み合わせである、(1)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18) 非破壊的計測情報の測定がフローサイトメトリーまたは顕微鏡により行われる、(1)〜(17)のいずれかに記載の方法。
(19) 前記非破壊的計測情報が、イメージング情報である、(1)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(20) 前記非破壊的計測情報が、細胞の形態情報である、(1)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(21) 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムであって、
1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、
第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする非破壊的計測情報測定部と、
前記関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、 前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、
前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部と
を含んでなる、システム。
(22) 前記非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部が顕微鏡、フローサイトメトリー装置から選択される少なくとも一つを含んでなる、(21)に記載のシステム。
(23) 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。
(24) 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するため、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
(25) 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するため、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
(26) (1)〜(20)のいずれかに記載の方法により一体的に検出された、非破壊的計測情報とゲノム関連情報に基づいて取得された分類モデルを用い、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を分類する方法。
(27) (1)〜(20)のいずれかに記載の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法であって、
前記被検物質を、一細胞またはその由来物、前記第一ビーズ、および前記第二ビーズと共存させることを含むこと
を含んでなる、方法。
(28) (27)に記載の方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質をスクリーニングする方法。
本明細書において「ゲノム関連情報」とは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸に由来する核酸配列情報をいう。ここで、「ゲノム関連核酸」とは、好ましくは一細胞のゲノムDNA、一細胞ゲノムに由来するmRNA等のRNAもしくはそのcDNA、または一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブをいう。前記核酸プローブは、標的とする蛋白質等の分子に特異的に結合する分子(以下、結合分子ともいう)に切断可能に連結された互いに峻別しうるバーコード核酸を含むことが好ましい。また、核酸がゲノムDNAである場合には、当該DNAは制限酵素等で切断された断片でも良いし、DNAタグが導入されていても良い。
バーコード領域としては、共通バーコード領域、固有バーコード領域の二つが存在する。
共通バーコード領域とは、同一の識別の対象において共通するバーコード領域である。識別の対象が細胞のゲノム関連情報である場合には、細胞毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの細胞において共通するバーコード領域である。共通バーコード領域で標識することにより、同一細胞由来のゲノム関連情報が識別可能とされる。また、識別の対象がビーズのイメージング情報の場合には、同一のイメージング情報を有するビーズ毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一のイメージング情報を有するビーズにおいて共通するバーコード領域である。共通バーコード領域で標識することにより、同一のイメージング情報を有するビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
さらに、一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブにおいて、該核酸プローブは該蛋白質等の分子に特異的に結合する分子(結合分子)を含むものである。ここで、前記核酸プローブにおける、前記結合分子毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一の結合分子において共通するバーコード領域も共通バーコード領域とされる。
また、固有バーコード領域とは、バーコード核酸毎に異なるバーコード領域で標識することにより、各バーコード核酸を各々峻別可能とするものであり、各バーコード核酸に連結したビーズ、各バーコード核酸とハイブリダイズしたゲノム関連核酸を識別できる。バーコード領域の長さは、特に限定されるものでないが、好ましくは10〜40塩基長の配列であり、例えばバーコード領域が12塩基長である場合は、412種類の多様性のあるバーコード配列を一度に核酸増幅することができ、412種類のビーズを作製することができる。
したがって、「ハイブリダイズ領域」とは、細胞ゲノムもしくはその発現物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸に結合し得る(ハイブリダイズし得る)領域である。
例えば、ゲノム関連核酸がmRNAである場合は、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域はTにより構成されるポリチミンであることが好ましい。ポリチミンの長さはmRNAのポリアデニン(A)テールとアニーリングし得る(ハイブリダイズし得る)長さであればよい。上記の場合、第一ハイブリダイズ領域はポリチミンに相補的な配列、例えば、ポリアデニン(ポリA)であることが好ましい。
ゲノム関連核酸がゲノムDNA等のDNAである場合、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該DNAの特定の配列または当該DNAに導入されたDNAタグの配列と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、第一ハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
また、一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブがバーコード核酸を含み、当該バーコード核酸がハイブリダイズ領域を含む場合には、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該ハイブリダイズ領域と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、上記核酸プローブに連結したバーコード核酸におけるハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法は、
1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており;
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし;
前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得;
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し;
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなることを特徴としている。
本発明のコンパートメント準備工程は、1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程である。ここで、第一ビーズは各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能である。前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している。
まず、組織または複数の細胞等検出対象となる細胞群101、複数の第一ビーズ102、複数の第二ビーズ103をそれぞれ準備する。なお、図1aでは、第一バーコード核酸はRNAであり、第一共通バーコード領域およびポリアデニンを含み、UV切断可能なリンカーを介して第一ビーズに連結している。また、第二バーコード核酸はDNAであり、PCRプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域およびポリチミンを含む。
分配処理の方法は後述する。
例えば、第一ビーズのイメージング情報として、ビーズのサイズ、蛍光の色、蛍光の濃度を選択した例を以下に示す。ビーズのサイズが3種類(3、7、11μm)、蛍光色素の色が3色(青、緑、赤)、蛍光色素の濃度による強度レベルが6種類(0、1、2、3、4、5)とする。その場合、ビーズの種類としては、(強度レベルサイズ種類−1)×サイズ種類=(63−1)×3=645となる。
ここで、コンパートメント中に、第一ビーズが3個存在する場合、第一ビーズの各組み合わせの種類としては645C3>107通りと非常に多くの種類の組み合わせを得ることができる。
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程は、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする工程を含む。
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の非破壊的計測情報の関連付け工程の一態様を図1bに従って説明する。
上記一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出または測定する方法としては、フローサイトメトリー(例えば、流路を流れるコンパートメントを観察するイメージングフローサイトメトリー法等)、顕微鏡測定(一般的な光学顕微鏡を用いたマイクロウェル内のコンパートメント観察法等)等が挙げられる。
また、本発明の別の態様によれば、コンパートメント104は、ビーズのイメージング情報により特定することができることから、例えば、インキュベーション、化学アッセイ、イメージング情報、または細胞の非破壊的計測情報の取得後の所定の時間の経過後、例えば、10分後に、細胞の非破壊的計測情報等を再度測定することも可能である。
蛍光としては、有機系蛍光分子、生体由来蛍光分子、量子ドット、重金属等の無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。
透過、位相、散乱、反射等の測定情報は、濃度によって屈折率や色の異なる有機物質、無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
吸収スペクトル、ラマンは、吸収、ラマン散乱スペクトルを有する吸収波長帯(分子フットプリント)の異なる有機分子、無機物質、それら組み合わせにより得ることができ、例えば、細胞信号と重ならない波長帯を有するアルキン系化合物が挙げられる。
また、コヒーレントラマンに関しては、例えば、コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)法、誘導ラマン散乱(SRS)法により測定することができる。
ビーズのサイズ、色、形状に関しても、第一ビーズのイメージング情報となり、これらサイズ、色、形状はビーズを例えばフローリソグラフィにより形成することにより、多種多様なものとなりうる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
また、ビーズのイメージング情報は、細胞と空間的に分離されるため、細胞の非破壊的計測情報と干渉する事なく、分離することができる。
図1fは、サイズ、RGB、蛍光輝度やその他の光学特性をコントロールして作製されたn種類(ID)のビーズのイメージング情報を指標とする場合の第一ビーズのデータベースの模式図である。図1fでは、第一ビーズのイメージング情報を計測し、得られた第一ビーズのイメージング情報に光学的ビーズIDを紐付けしている。
さらに、図1gでは、細胞および第一ビーズの組合せの測定を行い、細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報を関連付けしている。まず、各第一ビーズの光学バーコードIDが読み出される(ここで、光学的なキャリブレーションが行われる)。また、各第一ビーズには、第一ビーズに連結する第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域に基づいて核酸バーコードIDが付与されている。したがって、上記第一ビーズの核酸バーコードIDの組合せと上記光学的ビーズIDの組合せとを照合し、細胞が特定される。この後、細胞の非破壊的計測情報と細胞のゲノム関連情報とを紐付けることができる。
ハイブリダイズ複合体取得工程は、前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断した後、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体取得工程の一態様を図1cに従って説明する。
上述の一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程に続き、切断可能なリンカーを切断(例えば、UV照射によりUV切断可能なリンカーを切断)し、第一バーコード核酸106を切り離し、その後、細胞を溶解する。その後、コンパートメント内で、細胞由来mRNA107および第一ビーズ由来の第一バーコード核酸106をそれぞれ、第二バーコード核酸108にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ複合体120を得る。その後に、液滴を破壊する。
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程は、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程の一態様を図1dに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に対して、逆転写反応を行う。この逆転写反応により、細胞由来mRNA107に対するcDNA110が合成され、第一バーコード核酸106に対するcDNA109が合成される。その後、鋳型切り替え(テンプレートスイッチング)を行ってもよい。
その後、PCR反応を行う。このPCR反応により、第一バーコード核酸106と第二バーコード核酸108とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物112、および、細胞由来mRNA107と第二バーコード核酸108とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物113の2種類の増幅物111が生じる。なお、ゲノム関連核酸がDNAである場合には、上記PCR反応としてエクステンションPCR法を行うことができる。
その後、得られた増幅物に基づいて、1〜nの各コンパートメントに由来する、第一増幅物および第二増幅物を含む増幅物のライブラリーを調製する。
一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程は、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程を含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、または、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報、第一共通バーコード領域の配列情報、第一固有バーコード領域の配列情報、第二バーコード核酸の配列情報、第二共通バーコード領域の配列情報、もしくは第二固有バーコード領域の配列情報等が挙げられる。
以下、特に限定するものではないが、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程の一態様を図1eに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物(第一増幅物、第二増幅物)の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各mRNA分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のmRNAの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報115を得ることができる。
次に、細胞の非破壊的計測情報114の解析を行う。ここで、上述のように、一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とが関連付けられており、該第一ビーズには、各イメージング情報に対応している第一バーコード核酸が連結している。したがって、上記解析では、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第一増幅物に対し、由来する細胞の非破壊的計測情報114を割り当てることができる。
次に、細胞の非破壊的計測情報114と、トランスクリプトーム情報115のマッチングを行う。したがって、各コンパートメント中の一細胞のゲノム関連情報と非破壊的計測情報を、1対1で結びつけることができる。
上記方法において、まず、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報のデータベースを作成することができる。さらに、上記データベースを用いて、上記の一細胞の非破壊的計測情報と該細胞のトランスクリプトーム等のゲノム関連情報のマッチングの結果に基づき、ゲノム関連情報をクラスタリング116することにより、各細胞をいくつかのタイプ117(細胞タイプA、B、C、・・・N)にラベル付けし、分類することができる。また、得られた上記の一細胞の非破壊的計測情報と細胞分類結果とを教師データとして用い、一細胞における非破壊的計測情報に関して機械学習して分類モデルを取得することができる(教師あり機械学習)。
さらに、上記で取得された分類モデルを用いて、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を解析、判別または分類することができる。例えば、上記被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該細胞に関し、ゲノム関連情報によりクラスタリングされた細胞タイプを同定することができる。
また、上記被検細胞を解析、判別または分類する方法の別の態様として、以下の方法も挙げられる。
まず、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報のデータベースを作成することができる。上記データベースを用いて、上記の一細胞の非破壊的計測情報と該細胞のトランスクリプトーム等のゲノム関連情報のマッチングの結果に基づき、非破壊的計測情報をクラスタリングすることにより、各細胞をいくつかのタイプ(細胞タイプA、B、C、・・・N)にラベル付けし、分類することができる。また、得られた上記の一細胞の非破壊的計測情報と細胞分類結果とを教師データとして用い、一細胞におけるゲノム関連情報に関して機械学習して分類モデルを取得することができる(教師あり機械学習)。
さらに、上記で取得された分類モデルを用いて、被検細胞におけるゲノム関連情報に基づいて、該被検細胞を解析、判別または分類することができる。
図2では、第一バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ(以下、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ、ともいう)の一態様として、第一バーコード核酸がRNAである態様を示す。
第一バーコード核酸202が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ201に連結している。第一バーコード核酸202は第一共通バーコード領域203および第一ハイブリダイズ領域204を含む。第一バーコード核酸202は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域203および第一ハイブリダイズ領域204を含む。ここで、第一ハイブリダイズ領域204としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第一バーコード核酸202は、切断可能なリンカー205を介して切断可能に、第一ビーズ201に連結している。
本発明の第一ビーズは、第一バーコード核酸を含みかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する生物(以下、第一バーコード核酸を含む生物、ともいう)であってもよい。
かかる生物は、第一バーコード核酸を有するプラスミドを含むことが好ましい。また、かかる生物におけるイメージング情報は、本発明のイメージング情報であれば特に限定されないが、好ましくは、生物の個数、蛍光であり、蛍光としては各色のスペクトルのみならずその輝度情報も含む。さらに、蛍光はプラスミド中に存在する蛍光タンパク質遺伝子から発現する蛍光タンパク質により得られることが好ましい。したがって、本発明の生物は、例えば、第一バーコード核酸と蛍光タンパク質遺伝子とを有するプラスミドを含むことが好ましい。ここで、第一バーコード核酸は第一共通バーコード領域(例えば、蛍光タンパク質毎に共通した共通バーコード領域)および第一ハイブリダイズ領域を含み、第一ハイブリダイズ領域としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第一バーコード核酸は第三固有バーコード領域を含んでいてもよい。かかる第三固有バーコード領域は生物の各クローンを峻別可能とするものである。したがって、本発明の生物におけるプラスミドの構成は、例えば、順に、蛍光タンパク質遺伝子領域、第三固有バーコード領域、第一共通バーコード領域、および第一ハイブリダイズ領域とされる。
本発明の第一ビーズは、イメージング情報により互いに峻別しうるビーズである。
本明細書において、ビーズとは、バーコード核酸が連結できる粒子またはバーコード核酸を含むことができる生物であれば特に限定されず、形状も限定されない。
第一ビーズが粒子である場合、その材質は、特に限定されないが、セレン化カドミウム(CdSe)、硫化亜鉛(ZnS)、硫化カドミウム(CdS)、セレン化亜鉛(ZnSe)、酸化亜鉛(ZnO)等の半導体材料でできた量子ドット(半導体ナノ粒子)等の半導体、金等の重金属等の無機物質、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、PEG系等のハイドロゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、親水性ビニルポリマー(例えば、Toyopearl HW-65S(東ソー株式会社))等の樹脂、または、PEGまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマー等が挙げられ、好ましくは、ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルアミド、アルギン酸である。
第一ビーズが生物である場合、生物の種類、形態は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて生物を選択することができる。かかる生物としては、真核生物もしくは原核生物またはその細胞が挙げられ、例えば微生物等であり、具体的には、大腸菌等のバクテリア、酵母等の真菌が挙げられる。かかる生物は第一バーコード核酸を有するプラスミドを増幅できることが好ましい。
本発明の第一バーコード核酸は、各イメージング情報に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はRNA、DNAまたはそれら組み合わせである。
本発明の第一バーコード核酸は、各々同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域を含んでなることが好ましい。ここで、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、各コンパートメントにおける同一のイメージング情報を有する第一ビーズのイメージング情報に一対一に対応できる。したがって、関連付けにより、同一コンパートメント中に存在する一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標とすることができる。
上記第一バーコード核酸は第一ビーズ一つあたり複数連結していることが好ましい。
また、本発明の第一ビーズは一種類の第一バーコード核酸を連結していることが好ましい。
第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの製造方法は、公知の手法に準じて製造することができる。例えば、A. M. Klein et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell. 161, 1187-1201 (2015) に記載の方法に準じて製造することができる。
上記方法の一例としては、マイクロ流体エマルジョン技術により、第一バーコード核酸含有アクリルアミド:ビスアクリルアミド水溶液を有機溶媒層中でアクリルアミド重合体とし、第一ビーズとして用いる。ここで、第一バーコード核酸に結合した切断可能なリンカーのビーズ連結側はアクリルホスホロアミダイド部分(Acrydite(商標))等のアクリルアミド部分で修飾することができる。上記修飾によりアクリルアミドの重合時に、第一バーコード核酸もアクリルアミド重合体に共に重合される。このエマルション化の前に、例えば、上記水溶液に、蛍光標識されたアクリルアミドモノマーを溶解させておくことにより、各色での種々の蛍光強度を有する第一ビーズを作成することができる。具体的には、第一ビーズはフローフォーカシング・デバイス(flow focusing device)、またはマイクロウェル等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法を用いて製造することができる。ビーズのサイズは、フローフォーカシング・デバイスでは流体条件を変えることにより、マイクロウェルではそれぞれのチャンバーのサイズを変更することにより制御することができる。重合化した後、得られた第一ビーズを液滴から取り出し、何回か洗浄し、第一ビーズとして用いる。
第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの製造方法は、公知の手法でも製造することができる。例えば、特表2009−513948号公報、特表2017−506877号公報に記載の方法により製造することができる。
上記方法の一例を述べる。まず、第一バーコード核酸は特定の核酸配列を固相合成法または酵素合成法により調製される。その後、切断可能なリンカーを介して第一ビーズに結合する。バーコード核酸がRNAである場合は、一本鎖バーコード核酸の相補鎖となるDNA鋳型を合成した後、線形増幅反応にて、DNA鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコード領域を含むRNAを合成する、T7等のRNAポリメラーゼにより合成してもよい。
図3では、ゲノム関連核酸、および第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、第二ビーズ(以下、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ、ともいう)の一態様を示す。
図3では、第二バーコード核酸302が第二ビーズ301に連結している。第二バーコード核酸302は、第二共通バーコード領域303、第二固有バーコード領域304および第二ハイブリダイズ領域305を含む。第二バーコード核酸302は、第二ビーズ側から順に、PCRプライマー領域306、第二共通バーコード領域303、第二固有バーコード領域304および第二ハイブリダイズ領域305を含む。上記第二ハイブリダイズ領域305はポリチミンである。
第二ビーズは、多数のゲノム関連核酸とハイブリダイズできる観点から、1,000〜100,000の第二バーコード核酸と連結していることが好ましい。
本発明の第二ビーズの材質は、第一ビーズ粒子と同様の材質を用いることができる。
本発明の第二ビーズの材質は、好ましくは、ハイドロゲル、樹脂であり、より好ましくは、アクリルアミド、ポリスチレン、親水性ビニルポリマー、PEGまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマーである。
本発明の第二バーコード核酸は、バーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸は、RNA、DNAまたはそれら組み合わせである。第二バーコード核酸は第二ビーズに直接的または間接的に連結することができる。
本発明の第二バーコード核酸は、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、第二ハイブリダイズ領域とを含むことが好ましい。ここで、上記第二共通バーコード領域の配列情報は、コンパートメント中に第二バーコード核酸と共に存在する細胞を特定する指標として用いることができる。さらに、上記第二固有バーコード領域の配列情報は、ゲノム関連核酸を特定する指標として用いることができる。また、上記第二ハイブリダイズ領域は、ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸のそれぞれとハイブリダイズすることができる。したがって、第二ハイブリダイズ領域がポリチミン、またはゲノム関連核酸と相補的な核酸を含むことが好ましい。
上述のように、ゲノム関連核酸は上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられるため、該ゲノム関連核酸が由来する細胞を特定することができる。さらに、上記第二バーコード核酸は第一バーコード核酸とハイブリダイズするため、第一ビーズの第一共通バーコード領域等の配列情報も上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられることとなる。なお、第一共通バーコード領域の配列情報は各第一ビーズのイメージング情報に関連づけられている。また、細胞の非破壊的計測情報も各第一ビーズのイメージング情報に関連づけられている。したがって、ゲノム関連核酸情報と細胞の非破壊的計測情報に一対一に対応できる。
図4Aの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ400では、第一バーコード核酸402が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ401に連結している。第一バーコード核酸402は第一共通バーコード領域403および第一ハイブリダイズ領域404を含む。第一バーコード核酸402は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域403および第一ハイブリダイズ領域404を含む。さらに、第一バーコード核酸402は、切断可能なリンカー405を介して切断可能に、第一ビーズ401に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域404は下記第二ハイブリダイズ領域415に相補的な配列である。
また、図4Aの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ410では、第二バーコード核酸412が第二ビーズ411に連結している。第二バーコード核酸412は、第二共通バーコード領域413、第二固有バーコード領域414および第二ハイブリダイズ領域415を含む。第二バーコード核酸412は、第二ビーズ側から順に、PCRプライマー領域416、第二共通バーコード領域413、第二固有バーコード領域414および第二ハイブリダイズ領域415を含む。上記第二ハイブリダイズ領域415はゲノム関連核酸422の特定の配列とハイブリダイズする、当該配列に相補的な配列である。
さらに、図4Aには、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ400および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ410とともに、細胞420を含むコンパートメント430を示す。
また、図4Bでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸412は第二ハイブリダイズ領域415にて、第一バーコード核酸402の第一ハイブリダイズ領域404とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸412は第二ハイブリダイズ領域415にて、ゲノム関連核酸422の特定の配列421とハイブリダイズしている。
図5Aの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ500では、第一バーコード核酸502が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ501に連結している。第一バーコード核酸502は第一共通バーコード領域503および第一ハイブリダイズ領域504を含む。第一バーコード核酸502は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域503および第一ハイブリダイズ領域504を含む。さらに、第一バーコード核酸502は、切断可能なリンカー505を介して切断可能に第一ビーズ501に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域504は下記第二ハイブリダイズ領域515に相補的な配列である。
また、図5Aの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ510では、第二バーコード核酸512が第二ビーズ511に連結している。第二バーコード核酸512は、第二共通バーコード領域513、第二固有バーコード領域514および第二ハイブリダイズ領域515を含む。第二バーコード核酸512は、第二ビーズ側から順に、PCRプライマー領域516、第二共通バーコード領域513、第二固有バーコード領域514および第二ハイブリダイズ領域515を含む。上記第二ハイブリダイズ領域515は核酸プローブ520のハイブリダイズ領域524に相補的な配列である。
図5B(1)では、核酸プローブ520を示す。図5B(2)では、上記核酸プローブ520を細胞530と混合し洗浄することにより得られた、上記核酸プローブ520が細胞530で発現する蛋白質に結合する態様を示す。さらに、図5B(3)では、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ500および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ510とともに、上記核酸プローブ520が結合した細胞530を含むコンパートメント540を示す。
図5B(1)の核酸プローブ520では、第三バーコード核酸522が、一細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子521(以下、結合分子521ともいう)に連結している。第三バーコード核酸522は第三共通バーコード領域523および第三ハイブリダイズ領域524を含む。第三バーコード核酸522は、結合分子521から順に、第三共通バーコード領域523および第三ハイブリダイズ領域524を含む。さらに、第三バーコード核酸522は、切断可能なリンカー525を介して切断可能に、結合分子521に連結している。さらに、第三ハイブリダイズ領域524は第二ハイブリダイズ領域515に相補的な配列である。上記核酸プローブ520は、結合分子521毎に異なる第三バーコード核酸522を含む複数種類のプローブであって良い。
また、図5Cはハイブリダイズ複合体を示す。第二バーコード核酸512は第二ハイブリダイズ領域515にて、第一バーコード核酸502の第一ハイブリダイズ領域504とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸512は第二ハイブリダイズ領域515にて、第三バーコード核酸522の第三ハイブリダイズ領域524とハイブリダイズしている。
上記核酸プローブ520の第三共通バーコード領域523の配列に由来する増幅物の配列情報の解析を行うことにより、目的とする分子の細胞での発現の有無や量を確認することができる。
したがって、一細胞で発現する分子に特異的な核酸プローブを用いることにより、大量プロテオミクスと細胞の非破壊的計測情報とが一対一に対応できる。
図6Aの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ600では、第一バーコード核酸602が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ601に連結している。第一バーコード核酸602は第一共通バーコード領域603および第一ハイブリダイズ領域604を含む。第一バーコード核酸602は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域603および第一ハイブリダイズ領域604を含む。さらに、第一バーコード核酸602は、切断可能なリンカー605を介して切断可能に、第一ビーズ601に連結している。さらに、第一バーコード核酸603と切断可能なリンカー605の間に、特定の配列606を含む。さらに、第一ハイブリダイズ領域604は第二ハイブリダイズ領域615に相補的な配列である。
また、図6B(1)では、ハイブリダイズ複合体を示す。610は第二バーコード核酸と連結している第二ビーズを示す。ここで、第二バーコード核酸612は第二ハイブリダイズ領域615にて、第一バーコード核酸602の第一ハイブリダイズ領域604とハイブリダイズしている。さらに、図6B(2)に示すように、特定の配列606に相補的な配列のプライマー607を用いることにより、第一バーコード核酸602および第二バーコード核酸612と相補的なDNAが合成され、さらに、第二バーコード核酸612の相補的なDNAの合成はテンプレートスイッチングにより行われる。
図7Aはコンパートメントの準備工程を示す。図7Aの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ700では、第一バーコード核酸702が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ701に連結している。第一バーコード核酸702は第一共通バーコード領域703および第一ハイブリダイズ領域705を含む。第一バーコード核酸702は、第一ビーズ側から順に、PCRプライマー領域708、第一共通バーコード領域703、第一固有バーコード領域704および第一ハイブリダイズ領域705を含む。さらに、第一バーコード核酸702は、切断可能なリンカー706を介して切断可能に、第一ビーズ701に結合したアクリルホスホロアミダイド部分(Acrydite(商標))等のアクリルアミド部分707に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域705はポリアデニンである。
また、図7Aの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ710では、第二バーコード核酸712が第二ビーズ711に連結している。第二バーコード核酸712は、第二共通バーコード領域713、第二固有バーコード領域714および第二ハイブリダイズ領域715を含む。第二バーコード核酸712は、第二ビーズ側から順に、PCRプライマー領域416、第二共通バーコード領域713、第二固有バーコード領域714および第二ハイブリダイズ領域715を含む。上記第二ハイブリダイズ領域715はポリチミンである。720は細胞を示す。
図7B〜Eは、一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報との関連づけ工程を経た後の、ハイブリダイズ複合体取得工程を示す。
図7Bでは、光切断可能なリンカーを切断し、細胞を溶解している。図7Bでは、第一バーコード核酸702が切断された第一ビーズ701、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ710、および細胞由来mRNA721を示す。
また、図7Cでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸712は第二ハイブリダイズ領域715にて、第一バーコード核酸702の第一ハイブリダイズ領域705とハイブリダイズしている。さらに、DNAポリメラーゼ722により相補鎖DNA723が合成される。さらに、第二バーコード核酸712は第二ハイブリダイズ領域715にて、細胞由来mRNA721のポリアデニンとハイブリダイズしている。
図7Dでは、ハイブリダイズ複合体において、逆転写反応が行われ、細胞由来mRNA721に対するcDNA724が合成される。
図7Eでは、合成されたcDNAの3’末端がDNAタグ725によりタグ化されている。上記DNAタグは、PCRのプライマーサイトとして用いることができ、例えば、トランスポゾンMosaic End(ME)配列が挙げられる。
複数の第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの製造方法は、公知の手法により製造することができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により製造することができる。
上記方法を簡単に述べると、第二バーコード核酸における第二共通バーコード領域は分割プール合成 (split-and-pool synthesis) により製造することができる。例えば、分割プール合成工程をnラウンド行うことにより製造できる。各ラウンドは、i)ビーズの集団を4個に分割する工程、ii)各ビーズ集団毎にA、G、C、Tのいずれかを合成する工程、iii)4つのビーズ集団を合わせてプールする工程からなる。ラウンド数nは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、n=6〜40が挙げられる。
上記第二共通バーコードを製造した後に、第二固有バーコード領域を合成する。第二共通バーコード領域に連結した全てのビーズに対してA、T、G、Cの全ての塩基の存在下での合成をmラウンド行う。ラウンド数mは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、m=3〜15が挙げられる。
分配処理、すなわち、コンパートメントの製造方法の一態様を図8、9に基づき、具体的に説明する。
図8a、bは、シングルステップでコンパートメントを製造し、一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とを共に検出および/または測定する方法を示す。具体的には、細胞801、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ802、および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ803を含む溶液を油806中に入れ、コンパートメント807としての液滴を作成し、出口808で放出する。非破壊的計測情報の測定は、図8aではコンパートメントの形成の前および後に行われ、図8bではコンパートメントの形成の後に行われる。図8aでは、コンパートメントの形成の前と後に各1種類の測定、例えば蛍光イメージング測定804、明視野イメージング805を行うことができる。ここで、コンパートメントの作成前の測定では、細胞および第一ビーズの正確なイメージング情報を得ることができ、コンパートメントの作成後の測定では、コンパートメント中の細胞および第一ビーズの組み合わせを確認することができる。また、図8a、bの方法によれば、細胞および第一ビーズの自然な状態が撮影可能になる。上記方法において、具体的に使用する機器としては、コンパートメントの製造にはフローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器、非破壊的計測情報の測定には、イメージングフローサイトメトリー等が挙げられる。上記機器としては、本発明を妨げない限り、公知の機器を用いることができる。フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器として、例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)、Microfluid Nanofluid(2008)5:585-594, Applied Physics Letters、Vol.85, No.13, 27, September 2004, p2649-2651、T. M. Gierahn et al., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput, Nature Methods, 14, 395-398 (2017)、特表2013−508156等に記載の機器が挙げられる。上記フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器によれば、色、形、サイズをはじめとするイメージング情報を有するビーズを効率よく大量に製造することができる。
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムは、1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、第一ビーズは、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする、非破壊的計測情報の測定部と、前記関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部とを含んでなることを特徴としている。
(A)コンパートメント準備部において、1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントが準備される。上記複数のコンパートメントは、細胞群、複数の第一ビーズ、および複数の第二ビーズを分配処理することにより得ることが好ましい。ここで、上記第一ビーズは各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能である。さらに、上記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している。上記コンパートメント準備部として使用する機器としては、フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法で用いる装置が挙げられる。
(B)非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部において、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とが共に測定され、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とが関連付けされる。非破壊的計測情報の測定に用いる機器としては、フローサイトメトリー装置または顕微鏡が挙げられる。なお、コンパートメントが、液滴またはゲル粒子等の非破壊的計測情報、イメージング情報測定により破壊されない形態である場合には、細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報は、一度測定した後に、再度測定することができる。再度測定することは、細胞の非破壊的計測情報の変化を時系列で取得できる点で有利である。
また、コンパートメントに細胞の由来物が含まれる場合、一細胞の非破壊的計測情報および第一ビーズのイメージング情報の測定および関連付けはコンパートメントの準備前に行われることが好ましい。したがって、(A)コンパートメント準備部においてコンパートメントが準備される前に、(B)非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部において、一細胞の非破壊的計測情報および第一ビーズのイメージング情報との測定および関連付けが行われてもよい。
(C)ハイブリダイズ複合体形成部において、上記関連付けした第一ビーズから固有の第一バーコード核酸が切断され、上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体が得られる。ハイブリダイズ複合体の形成に用いる機器や試薬としては、第一バーコード核酸に連結している切断可能リンカーの切断装置およびハイブリダイズ複合体形成のための試薬や装置が挙げられる。上記切断可能リンカーの切断装置は、切断可能リンカーの種類により適宜選択することができ、例えば、該切断可能リンカーがUV切断可能リンカー(例えば、iSpPC(Integrated DNA Technologies社))である場合には、UV照射装置(例えば、BlackRayキセノンランプ装着装置)が挙げられる。また、ハイブリダイズ複合体形成の試薬としては、通常の核酸のハイブリダイズに用いられる試薬、装置としては、ウォーターバス等が挙げられる。
(D)増幅物製造部において、上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物が製造される。増幅物の製造としては、例えば、ゲノム関連核酸がRNAの場合には、逆転写およびPCRが挙げられ、ゲノム関連核酸がDNAの場合には、エクステンションPCRが挙げられる。増幅物製造に用いる試薬としては、通常の逆転写またはPCR反応に用いられる試薬、機器としては、PCR装置が挙げられる。
(E)非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部において、上記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とが一体的に検出される。ゲノム関連情報は、ゲノム関連核酸の配列情報をシークエンサーに決定することにより得られる。得られたゲノム関連情報と一細胞における非破壊的計測情報を、コンピューターにより関連づけることができる。
なお、上記システムの態様は、本発明の検出方法に関する記載に準じて実施することができる。
本発明の別の実施態様としては、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。また、本発明の組み合わせ物は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するために用いる限り、特に制限されず、1つの組成物または試薬等の剤の形態であってもよく、複数の組成物または試薬等の剤の組み合わせから構成されていてもよい。また、上記組み合わせ物は一体的にまたは別体として構成されていてもよい。上記複数または別体としての組成物の組み合わせとしては、例えば、第一ビーズを含んでなる組成物と、第二ビーズを含んでなる組成物との組み合わせが挙げられる。ここで、上記組み合わせ物は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法に用いるための試薬キットであってもよい。かかる試薬キットは、緩衝液、逆転写反応またはPCR反応に必要な試薬、細胞溶解バッファー等の必要な試薬、使用説明書等を備えていてもよい。
本発明の別の実施態様としては、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出できることを特徴としている。
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出できることを特徴としている。
また、本発明の別の態様として、本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法を提供できる。上述の、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法は、コンパートメント中に、一細胞またはその由来物、上記第一ビーズ、および上記第二ビーズとともに、上記被検物質を共存させることを特徴とする。被検物質を共存させるタイミング(例えば、添加のタイミング)は、コンパートメントの形成前、形成時、または形成後が挙げられる。また、被検物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス等の薬剤等が挙げられる。各コンパートメント中の被検物質は、同一であっても異なっていてもよい。また、被検物質の濃度も、各コンパートメントにおいて同一であっても異なっていてもよい。
さらに、上記方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質のスクリーニング等のアッセイを行うことができる。得られた細胞のゲノム関連情報および/または非破壊的計測情報から、被検物質に対する該細胞の応答(例えば、分子発現・局在、形態、分化の変化等)を計測し、その応答の計測結果に基づいて被検物質のスクリーニング等のアッセイを行うことができる。
第一ビーズの作成
まず、蛍光標識アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。具体的には、2質量%アルギン酸ナトリウム溶液に所望の濃度で蛍光色素を添加し、緑色、赤色または青色の蛍光アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。なお、緑色の蛍光色素としては5FTSC(フルオレセイン−5−チオセミカルバジド)、赤色の蛍光色素としてはAF555 Hydrazide、青色の蛍光色素としてはCascade Blue Hydrazideを用いた。
5mLのTEBSTバッファー(10mM Tris−HCl[pH8.0]、137mM NaCl、2.7mM KCl、および0.1%(v/v)Triton X−100)に約 10,000,000個の第一ビーズ(緑色、赤色または青色蛍光第一ビーズ)を加えて懸濁した。バッファー添加から0時間および72時間の時点でフローサイトメトリーにより第一ビーズの輝度を確認した。その結果、0時間および72時間の時点で蛍光スペクトルの変化は確認されなかった。
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、例1で得られた第一ビーズ、第二ビーズ(Chemgenes)およびNIH3T3細胞を含む油中水型コンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。ここで、第二ビーズにおける第二バーコード核酸は、リンカーを介して第二ビーズに連結していた。かかる第二バーコード核酸は、第二ビーズ側から順に、7塩基のポリチミン、25塩基のPCRプライマー領域、12塩基の第二共通バーコード領域、8塩基の第二固有バーコード領域、および30塩基のポリチミン(第二ハイブリダイズ領域)であった。得られたコンパートメントの写真を図13に示す。
(a)緑色蛍光第一ビーズ担持NIH3T3細胞
培養プレートから剥がし、CellCover固定したNIH3T3細胞5x105個と例1で得られた緑色蛍光第一ビーズ5x105とを4℃、40時間インキュベート後、さらに4℃、150G、1時間遠心し接着を促し、緑色蛍光第一ビーズ担持NIH3T3細胞を得た。緑色蛍光第一ビーズを構成するアルギン酸はBAM試薬(細胞膜修飾剤)で修飾したアルギン酸を50%含んだ。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図14Aに示す。
(b)赤色蛍光第一ビーズ担持K562細胞
細胞をK562細胞とし、第一ビーズを赤色蛍光第一ビーズとする以外は、(a)と同様の方法により、赤色蛍光第一ビーズ担持K562細胞を得た。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図14Bに示す。
(c)緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズを担持するMIA−PaCa2細胞
細胞をMIA−PaCa2細胞とし、第一ビーズを緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズとする以外は、(a)と同様の方法により、緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズを担持するMIA−PaCa2細胞を得た。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図14Cに示す。
コンパートメント(細胞を含む第一ビーズ、および第二ビーズを含むコンパートメント)の作成
分散相溶液に細胞(NIH3T3細胞、K562細胞またはMIA−PaCa2細胞)を添加する以外は例1と同様の方法で、緑色、赤色または青色蛍光第一ビーズを作成した。したがって、上記第一ビーズは細胞を含むものであった。なお、同色の第一ビーズにはそれぞれ同じ種類の細胞を含ませた。結果を図15に示す。図15Aは位相差顕微鏡での観察結果、図15Bは蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真 を示す。
次に、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、上記細胞含有第一ビーズ、および例2に記載の第二ビーズ(Chemgenes)を含むコンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。また、第一ビーズを含まない以外は上記と同様のコンパートメントも作成した。ここで、第一ビーズを含まないコンパートメントは、上記第一ビーズを含むコンパートメントと同様に細胞を含む。
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) またはT. M. Gierahn et al., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput, Nature Methods, 14, 395-398 (2017)に記載の方法に準じて、例3で得られた第一ビーズを担持した細胞および例2に記載の第二ビーズを含むコンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。ここで、第一ビーズを担持した細胞としては、緑色蛍光第一ビーズ担持NIH3T3細胞(マウス由来細胞)および赤色蛍光第一ビーズ担持K562細胞(ヒト由来細胞)の混合物を用いた。コンパートメントの作成において、各コンパートメントに、緑色蛍光第一ビーズ担持NIH3T3細胞、および赤色蛍光第一ビーズ担持K562細胞のいずれか一つが含まれるように調整した。
その後、得られたコンパートメントにおいてハイブリダイズ複合体に由来する増幅物の塩基配列解析を行った。具体的には、赤色蛍光第一ビーズが帰属したコンパートメントにおいて、赤色蛍光第一ビーズ(ここで、ビーズには複数の第一バーコード核酸が連結している)の第一共通バーコード領域10塩基にマッチするリードの数で順位をつけ、順位の高い順に100個を選別した。さらに、それらリードが帰属するコンパートメント内の遺伝子転写産物の個数を測定した。結果を図16に示す。図中のプロットは縦軸がマウス遺伝子転写産物の数、横軸がヒト遺伝子転写産物の数を示す。図16より第一ビーズのイメージング情報と細胞のゲノム関連情報が関連付けられることがわかった。
蛍光タンパク質遺伝子領域および第一共通バーコード領域を有するプラスミドを含むバクテリアを作成した。具体的には、EGFPタンパク質遺伝子領域およびEGFPに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミド、Venusタンパク質遺伝子領域およびVenusに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミド、または、EBFPタンパク質遺伝子領域およびEBFPに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミドを含むバクテリアを作成した。得られたバクテリアの混合物の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図17Aに示す。
図17Bには、EGFPタンパク質遺伝子領域およびEGFPに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミドの配列のシーケンシングの結果を示す。EGFPタンパク質遺伝子領域に続いてバクテリアのコロニー毎に特有の配列領域(第三固有バーコード領域)、EGFPに対応した第一共通バーコード領域、およびポリA配列領域が確認された。
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、第一バーコード核酸を含むバクテリアおよび細胞を含む油中水型コンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。得られたコンパートメントの写真を図17Cに示す。その後、得られたコンパートメントにおいてハイブリダイズ複合体に由来する増幅物のサイズを測定した。その結果、第三固有バーコード領域の配列とEGFPに対応した第一共通バーコード領域を含む288塩基を検出できた。結果を図17Dに示す。
102 第一ビーズ
103 第二ビーズ
104 コンパートメント
105 一細胞
106 第一バーコード核酸
107 細胞由来mRNA
108 第二バーコード核酸
109 第一バーコード核酸に対するcDNA
110 細胞由来mRNAに対するcDNA
111 増幅物
112 第一増幅物
113 第二増幅物
114 細胞の非破壊的計測情報
115 細胞のトランスクリプトーム情報
116 クラスタリング
117 細胞タイプ
120 ハイブリダイズ複合体
201 第一ビーズ
202 第一バーコード核酸
203 第一共通バーコード領域
204 第一ハイブリダイズ領域
205 切断可能なリンカー
301 第二ビーズ
302 第二バーコード核酸
303 第二共通バーコード領域
304 第二固有バーコード領域
305 第二ハイブリダイズ領域
306 PCRプライマー領域
400 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
401 第一ビーズ
402 第一バーコード核酸
403 第一共通バーコード領域
404 第一ハイブリダイズ領域
405 切断可能なリンカー
410 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
411 第二ビーズ
412 第二バーコード核酸
413 第二共通バーコード領域
414 第二固有バーコード領域
415 第二ハイブリダイズ領域
416 PCRプライマー領域
420 細胞
421 ゲノム関連核酸の特定の配列
422 ゲノム関連核酸
430 コンパートメント
500 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
501 第一ビーズ
502 第一バーコード核酸
503 第一共通バーコード領域
504 第一ハイブリダイズ領域
505 切断可能なリンカー
510 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
511 第二ビーズ
512 第二バーコード核酸
513 第二共通バーコード領域
514 第二固有バーコード領域
515 第二ハイブリダイズ領域
516 PCRプライマー領域
520 核酸プローブ
521 一細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子
522 第三バーコード核酸
523 第三共通バーコード領域
524 第三ハイブリダイズ領域
525 切断可能なリンカー
530 細胞
540 コンパートメント
600 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
601 第一ビーズ
602 第一バーコード核酸
603 第一共通バーコード領域
604 第一ハイブリダイズ領域
605 切断可能なリンカー
606 特定の配列
607 特定の配列に相補的な配列のプライマー
610 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
612 第二バーコード核酸
615 第二ハイブリダイズ領域
700 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
701 第一ビーズ
702 第一バーコード核酸
703 第一共通バーコード領域
704 第一固有バーコード領域
705 第一ハイブリダイズ領域
706 切断可能なリンカー
707 アクリルアミド部分
708 PCRプライマー領域
710 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
711 第二ビーズ
712 第二バーコード核酸
713 第二共通バーコード領域
714 第二固有バーコード領域
715 第二ハイブリダイズ領域
716 PCRプライマー領域
720 細胞
721 細胞由来mRNA
722 DNAポリメラーゼ
723 相補鎖DNA
724 細胞由来mRNAに対するcDNA
801 細胞
802 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
803 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
804 蛍光イメージング測定
805 明視野イメージング
806 油
807 コンパートメント
808 出口
901 細胞
902 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
903 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
904 油
905 コンパートメント
906 出口
907 ゲル化した粒子
908 細胞溶解バッファー
909 蛍光イメージング測定
910 油
911 コンパートメント
1001 細胞
1002 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
1003 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
1004 油
1005 コンパートメント
1006 出口
1007 ゲル化した粒子
1008 細胞溶解バッファー
1009 蛍光イメージング測定
1010 コンパートメント
1101 細胞
1102 第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
1103 蛍光イメージング測定
1104 第一ビーズを担持した細胞
1105 第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
1106 細胞溶解バッファー
1107 コンパートメント
1108 油
1109 出口
Claims (20)
- 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法であって、
1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており;
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし、;
前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得;
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し;
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなる、方法。 - 第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出する、請求項1に記載の方法。 - (a)〜(c)の少なくともいずれか1つの特徴を有する、請求項1また2に記載の方法:
(a)1コンパートメント当たりの第一ビーズの数が複数である、
(b)1コンパートメント当たりの第二ビーズの数が1つである、
(c)前記コンパートメントが、ウェル、液滴またはゲル粒子の形態である。 - 前記ゲノム関連核酸が、前記一細胞ゲノムDNA、前記一細胞ゲノムに由来するRNAもしくはそのcDNA、または前記一細胞で発現する蛋白質に特異的な核酸プローブである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも1つの測定情報に基づくものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第一ビーズにおける第一バーコード核酸が各々、同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第一共通バーコード領域の配列情報が、一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標となる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する一細胞またはその由来物を特定する指標となる、請求項8に記載の方法。
- 前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、請求項8または9に記載の方法。
- 第二バーコード核酸が、PCRプライマー領域をさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムであって、 1コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、
第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする、非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部と、
該関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、
前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部と
を含んでなる、システム。 - 前記非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部が顕微鏡、フローサイトメトリー装置から選択される少なくとも一つを含んでなる、請求項13に記載のシステム。
- 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。 - 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。 - 一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により一体的に検出された、非破壊的計測情報とゲノム関連情報に基づいて取得された分類モデルを用い、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を分類する方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法であって、
一細胞またはその由来物、前記第一ビーズ、および前記第二ビーズと共存させることを含むこと
を含んでなる、方法。 - 請求項19に記載の方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質をスクリーニングする方法。
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