JPWO2018182014A1 - 腫瘍溶解性ウイルスの増殖方法及び抗腫瘍剤 - Google Patents
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Abstract
Description
1)腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
2)腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである1)記載の抗腫瘍剤。
3)コクサッキーウイルスが、A11型又はB3型である2)記載の抗腫瘍剤。
4)植物アルカロイド系抗がん剤が、SN−38、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる1以上からなる1)〜3)のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
5)代謝拮抗剤が、5−FU又はその塩である1)〜3)のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
6)腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
7)腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである6)記載の抗腫瘍剤。
8)コクサッキーウイルスが、A11型又はB3型である7)記載の抗腫瘍剤。
9)植物アルカロイド系抗がん剤が、SN−38、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる1以上からなる6)〜8)のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
10)代謝拮抗剤が、5−FU又はその塩である6)〜8)のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
11)腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン及び植物アルカロイド系抗がん剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである1)〜5)のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
12)オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
13)腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである12)記載の抗腫瘍効果増強剤。
14)オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
15)オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
16)ウイルス受容体が、DAF及び/又はICAM−1である15)記載のウイルス受容体発現増強剤。
17)抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
18)抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
19)腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
腫瘍溶解性ウイルスは、細胞表面のウイルス受容体に結合することによって、当該細胞に感染することができる。ウイルス受容体としては、例えば、崩壊促進因子(DAF又はCD55)、細胞間接着分子‐1(ICAM‐1又はCD54)、インテグリンα2β1(CD49b)等が挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスがウイルス受容体と相互作用することでカプシドが脱安定化され、これにより腫瘍溶解性ウイルスの脱外皮が誘導される。
ウイルスRNAを単離するには、フェノール/クロロホルム抽出法や磁気ビーズによる単離等の任意の方法を使用することができる。
また、上記核酸は、ウイルスを生じさせるための核酸を組み込んだウイルスプラスミドや発現ベクターであってもよい。発現ベクターには、例えば、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするDNAを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターには、挿入された核酸が機能的に連結された転写調節制御配列が含まれてもよい。ここでの転写調節制御配列は、例えば、転写を開始させるためのプロモーター、転写されたmRNAに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント等である。
オキサリプラチンは、L−OHPとしても知られる第三世代の白金錯体系抗がん剤である。本発明において、「オキサリプラチン」は、cis−オキサロト(trans−l−1,2−ジアミノシクロヘキサン)白金(II)、その光学エナンチオマーであるcis−オキサロト(trans−d−1,2−ジアミノシクロヘキサン)白金(II)及びこれらの混合物が包含される。
イリノテカンは、カンレンボク由来の抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンの誘導体で、トポイソメラーゼI阻害作用を有する。SN−38(7−ethyl−10−hydroxycamptothecin)は、イリノテカンの活性代謝物であり、イリノテカンに比べ強い抗腫瘍活性を有する。
イリノテカン及びSN−38の塩としては、無機酸又は有機酸との塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。
5−FUは、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤で、核酸の合成を阻害することにより抗腫瘍効果を発揮する抗がん剤である。
すなわち、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤又は代謝拮抗剤と、腫瘍溶解性ウイルスの併用において、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進剤、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤となり得、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせは抗腫瘍剤となり得る(以下、これらを纏めて本発明の「抗腫瘍療法」とも称する)。また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は癌細胞のウイルス受容体の発現増強剤となり得る。
固形癌において特に強い細胞傷害性が誘導される癌細胞としては、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、下咽頭癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌等の癌細胞が挙げられる。したがって、本発明の抗腫瘍療法では、前記固形癌に加え、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病、ヒトBリンパ腫等の癌細胞を対象に用いられるのが好ましく、大腸癌、結腸直腸癌の癌細胞が特に好ましい。
また、キットは、腫瘍溶解性ウイルスを含有する薬剤とオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有する薬剤以外に、さらに他の薬剤を組み合わせて投与することができる。
希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。
投与方法は、単回投与でも複数回投与でもよく、徐放製剤として持続的に投与してもよい。また、投与順序や投与間隔は、腫瘍溶解性ウイルスと、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせの効果が得られる範囲であれば特に制限されないが、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の投与後に腫瘍溶解性ウイルスを投与することがより好ましい。また、キットとする場合は、それぞれ単独の製剤を、同時に或いは間隔を空けて投与してもよい。
実施例1 オキサリプラチンとCVA11型の併用による抗腫瘍効果
(1)方法
(a)CVA11型の調製
CVA11型は、国立感染症研究所から入手した。CVA11型は、HELA細胞(ATCCから購入)を用いて増殖した。Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)(Sigma−Aldrich製)を10mL用いて継代培養したHELA細胞(約2x106cells/mL)にCVA11型(播種量:MOI=0.1〜1.0)を1時間孵置した後、培地をDMEMに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにOPTI−MEM I 1mLを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、CVA11型及びHELA細胞は、インキュベーター内で37℃、5%CO2下で培養した。液体窒素を用いて、回収したHELA細胞の凍結、融解を3回繰り返した後、4℃、3000rpmで15分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清(ウイルス溶液)は、−80℃で保存した。
MOIは、特許文献3に記載の以下の方法で算出した。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)(ATCCから入手)を96穴のプレートに5×103cells/100μL/ウェルで播種し、37℃、5%CO2下で5時間維持した。ウイルスは、OPTI−MEM Iで100倍又は1000倍希釈して、これをMOI測定用のウイルス原液とした(ここでの希釈倍率の常用対数をLとする)。ウイルス原液を10倍ずつ段階希釈し(ここでの希釈倍率の常用対数をdとする)、希釈系列液を調製した。次に、各ウェルに希釈系列液を0.05mLずつ添加した(添加した希釈系列液の体積をvとする)。120時間後に50%以上の細胞変性効果が認められたウェル数の合計を8で除算した値Sを算出し、MOIを以下の式で算出した。
(数1)
log10(MOI)=L+d(S−0.5)+log10(1/v)
クリスタルバイオレット法により、CVA11型による抗腫瘍効果(細胞傷害性)を評価した。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を72時間後にコンフルエントになる密度(3×104cells/ウェル)で24穴のプレートに播種した。適切な感染力価(MOI=0.001、0.01、0.1)になるように、OPTI-MEM IでCVA11型を希釈し、CVA11型の希釈液を調製した。約6時間後、プレートから培地を除去し、CVA11型の希釈液を各ウェルに200μL添加し、37℃、5%CO2下にプレートを1時間維持した。次に、CVA11型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに1mL加え、72時間培養した。72時間後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で緩やかに洗浄し、0.5%グルタルアルデヒド含有PBSを各ウェルに300μL添加した後、15分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有PBSを除去し、PBSで洗浄後、2%エタノール及び0.1%クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに300μL添加し、室温で10分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水500μLで2回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。
図1にクリスタルバイオレット法の結果を示す。B:オキサリプラチンのみを添加したもの、D:CVA11型のみを添加したWiDrでは抗腫瘍効果は認められなかった。一方、C:オキサリプラチン添加後CVA11型を添加(MOI=0.01)した群で強い抗腫瘍効果が認められた。
(1)方法
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度50μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約12時間静置した後、CVA11型をMOI=0.01となるように添加した。37℃、5%CO2下にプレートを約30時間静置した後、実施例1(1)(b)に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。A:オキサリプラチン、CVA11型ともに不添加、B:オキサリプラチンを添加せず、CVA11型のみを添加、C:オキサリプラチン添加(50μM)後、CVA11型添加(MOI=0.01)の3群に分けて比較をした。検定はt検定を用いた。
図2にCVA11型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なCVA11型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンがCVA11型の増殖を促進することが確認された。
(1)方法
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度50μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約42時間静置した後、mRNAを採取しcDNAを作成した。細胞播種後、約20時間後にCVA11型を添加したものと比較した。DAF(decay accelerating factor)、ICAM−1(intercellular adhesion molecule 1)の発現をreal−time PCRにより比較した。検定はt検定を用いた。
図3にreal−time PCRの結果を示す。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)において、オキサリプラチン添加により、ウイルス受容体あるDAFとICAM−1の発現が有意に増加した。一方、CVA11型ウイルスを添加したものは、DAFとICAM−1の発現は増加しなかった。受容体の中にはウイルスの増殖に影響するものも知られており、この結果より、CVA11型によるWiDrに対する抗腫瘍効果がオキサリプラチンによる前処理によって増加したのは、DAFやICAM−1がウイルスの増殖に関与し、CVA11型ウイルスが増殖したためと考えられた。
(1)方法
実施例1で確認したCVA11型の癌細胞に対する抗腫瘍効果を、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株WiDrによる担癌ヌードマウスを用いて検討した。WiDrをPBS で洗浄し、5.0×107cells/mLになるようにOPTI−MEM Iに懸濁した。 6−8週齢のBALB/cヌードマウスの右側腹部にWiDrを含む懸濁液を、100μLずつ27G針を用いて皮下注射した。マウスは、1)非投与群、2)オキサリプラチン単独投与群、3)CVA11型単独投与群、4)オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与した群の4つに分けた。オキサリプラチン100μgは、day1に腹腔内投与された。CVA11型は5×107プラーク形成ユニット(PFU)をday2,4,6,8,10に皮下腫瘍内に局所注射された。非投与群に対しては、右側腹部にCVA11型を含まないOPTI−MEM Iを、CVA11型投与群と同量投与した。CVA11型投与後、各群の腫瘍体積及び体重を測定した。なお、腫瘍体積は、長径×短径×短径×0.5で算出した。また、試験は各群5匹のマウスを用いて行い、検定はt検定を用いた。
図4は、非投与群の腫瘍体積およびオキサリプラチン単独投与群、CVA11型単独投与群、オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与した群(併用群)の腫瘍体積を示す。オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与したマウスでは、非投与群と比較して、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。また、併用群は、オキサリプラチン単独投与群、CVA11型単独投与群と比較しても腫瘍体積の増加が抑制されており、高い抗腫瘍効果を有していることが確認された。
また、図5は、これら4群の体重の変化を示す。この結果、非投与群と比べて、オキサリプラチン単独投与したマウス、CVA11型を単独投与したマウス、オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与したマウスにおいて有意な体重減少を認めなかった。この時点での体重減少は、有害事象を示唆するため、体重減少を認めないことは、オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与したマウスにおいても有害事象を認めなかったといえ、本発明の抗腫瘍療法は安全性が高いといえる。
(1)方法
実施例4におけるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株WiDrを皮下移植された担癌ヌードマウスにおける生存率を比較し、皮下移植後day 40の腫瘍の病理組織をH.E.(hematoxylin eosin)染色にて評価した。
図6に担癌ヌードマウスにおける生存率を比較したデータを示す。オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与したマウスの生存率は、未治療群のマウス、オキサリプラチン単独投与群のマウス、CVA11型単独投与群のマウスと比べて改善が見られた。また、図7に腫瘍組織の病理組織(H.E.染色)を示す。H.E.染色された腫瘍の病理組織においては、オキサリプラチン投与後にCVA11型を投与したマウスの腫瘍の病理組織において、より広範囲に細胞死をみとめた。これにより、生存率や病理組織の観察からも本発明が高い抗腫瘍効果を有することが確認された。
(1)方法
(a)CVB3型の調製
CVB3型は、国立感染症研究所から入手した。CVB3型は、HELA細胞(ATCCから購入)を用いて増殖した。Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)(Sigma−Aldrich製)を10mL用いて継代培養したHELA細胞(約2x106cells/mL)にCVA11型(播種量:MOI=0.1〜1.0)を1時間孵置した後、培地をDMEMに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにOPTI−MEM I 1mLを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、CVB3型及びHELA細胞は、インキュベーター内で37℃、5%CO2下で培養した。液体窒素を用いて、回収したHELA細胞の凍結、融解を3回繰り返した後、4℃、3000rpmで15分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清(ウイルス溶液)は、−80℃で保存した。
MOIの算出は、実施例1(1)(b)と同様の方法で行った。
ウイルスとしてCVB3型を使用した。また、CVB3型の感染力価(MOI)を0(不添加)、0.001、0.01、0.1とし、オキサリプラチンの添加量を0μM(不添加)、0.5μM、1μM、5μMとした以外は、実施例1(1)(c)と同様の方法で行った。
図8にクリスタルバイオレット法の結果を示す。オキサリプラチンのみを添加したもの(図8のCVB3型のMOIが0の横一列)、CVB3型のみを添加したもの(図8のOXAが0の縦一列)では抗腫瘍効果は認められなかった。一方、オキサリプラチン添加後CVA11型を添加した群(枠内の群)では、MOI及びオキサリプラチン添加量の量に依存して強い抗腫瘍効果が認められた。
(1)方法
CVB3型の調製は、実施例6(1)(a)と同様の方法で行った。また、MOIの算出は、実施例1(1)(b)と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が0(不添加)、0.5、1.0μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約12時間静置した後、CVB3型をMOI=0.01となるように添加した。37℃、5%CO2下にプレートを約30時間静置した後、実施例1(1)(b)に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。1:オキサリプラチン不添加、2:オキサリプラチン 0.5μM添加、3:オキサリプラチン 1.0μM添加の3群に分けて比較した。試験は6回試験とし、検定はt検定を用いた。
図9にCVB3型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、CVB3型ウイルス量の増加がみとめられた。特にオキサリプラチン1μM添加時には有意な増加がみとめられた。これにより、オキサリプラチンがCVA11型だけでなく、CVB3型の増殖も促進することが確認された。
(1)方法
(a)AAVの調製
AAVとしてpAAV−CMV Vector(タカラバイオ(株)製)を使用した。pAAV−CMV Vectorは、AAVpro(R) Helper Free System(タカラバイオ(株)製)を用いて調製を行った。回収した上清(ウイルス溶液)は、−80℃で保存した。
MOIの算出は、実施例1(1)(b)と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が0(無添加)、0.25、0.5、1.0、2.5μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約24時間静置した後、AAVをMOI=0.01となるように添加した。37℃、5%CO2下にプレートを約30時間静置した後、AAVpro(R) Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2(タカラバイオ(株)製)を用いてウイルスのコピー数を測定した。検定はt検定を用いた。
図10にAAVのコピー数の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なAAVのコピー数の増加がみとめられた。特に、オキサリプラチンの添加量が0.25〜1.0μMの間で顕著な増加が見られた。これにより、オキサリプラチンがAAVの増殖を促進することが確認された。
(1)方法
CVA11型の調製及びMOIの算出は、実施例1(1)(a)及び(b)と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、SN−38を最終濃度が0(不添加)、1.0、5.0、50μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約12時間静置した後、CVA11型をMOI=0.01となるように添加した。37℃、5%CO2下にプレートを約30時間静置した後、実施例1(1)(b)に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。1:SN−38不添加、2:SN−38 1.0μM添加、3:SN−38 5.0μM添加、4:SN−38 50μM添加の4群に分けて比較をした。試験は6回試験とし、検定はt検定を用いた。
図11にSN−38添加時のCVA11型のウイルス力価の結果を示す。SN−38添加を行ったもので、有意なCVA11型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンだけでなく、SN−38においてもCVA11型の増殖を促進することが確認された。
(1)方法
CVA11型の調製及びMOIの算出は、実施例1(1)(a)及び(b)と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)を3×106cells/mLになるようにDMEM培地に懸濁した。96穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を100μLずつ分注し、3×105cells/ウェルとなるように播種した。37℃、5%CO2下にプレートを約8時間静置した後、5−FUを最終濃度が0(不添加)、50μMとなるように添加した。その後、37℃、5%CO2下にプレートを約12時間静置した後、CVA11型をMOI=0.01となるように添加した。37℃、5%CO2下にプレートを約30時間静置した後、実施例1(1)(b)に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。1:5−FU不添加、2:5−FU 50μM添加の2群に分けて比較をした。試験は6回試験とし、検定はt検定を用いた。
図12に5−FU添加時のCVA11型のウイルス力価の結果を示す。5−FU添加を行ったもので、有意なCVA11型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチン、SN−38だけでなく、5−FUにおいてもCVA11型の増殖を促進することが確認された。
(1)方法
(a)CVA11型の調製
CVA11型の調製は、実施例1(1)(a)と同様の方法で行った。
(b)MOIの算出
MOIの算出は、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株(WiDr)の代わりに脳腫瘍細胞株U−87を使用したこと以外は実施例1(1)(b)と同様の方法で行った。
(c)CVA11型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
クリスタルバイオレット法により、脳腫瘍細胞株U−87を使用した際のCVA11型及びオキサリプラチンの併用による抗腫瘍効果(細胞傷害性)を評価した。
脳腫瘍細胞株U−87を72時間後にコンフルエントになる密度(3×104 cells/ウェル)で24穴のプレートに播種した。その後、オキサリプラチンを0(不添加)又は50μM添加した。感染力価がMOI=0.001になるように、OPTI-MEM IでCVA11型を希釈し、CVA11型の希釈液を調製した。約6時間後、プレートから培地を除去し、CVA11型の希釈液を各ウェルに200μL添加し、37℃、5%CO2下にプレートを1時間維持した。次に、CVA11型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに1mL加え、72時間培養した。72時間後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で緩やかに洗浄し、0.5%グルタルアルデヒド含有PBSを各ウェルに300μL添加した後、15分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有PBSを除去し、PBSで洗浄後、2%エタノール及び0.1%クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに300μL添加し、室温で10分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水500μLで2回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。
図13にクリスタルバイオレット法の結果を示す。CVA11型のみにおいても抗腫瘍効果が確認されたが、オキサリプラチン50μMとの併用で抗腫瘍効果の増強が確認された。これにより大腸癌以外の癌種である脳腫瘍に対しても当該抗腫瘍療法が効果的であることが示された。
(1)方法
(a)CVA11型の調製及びMOIの算出
CVA11型の調製及びMOIの算出は、実施例1(1)(a)及び(b)と同様の方法で行った。
CVA11型の感染力価(MOI)を0(不添加)、0.001、0.01、0.1とし、オキサリプラチン又はシスプラチンの添加量を0μM(不添加)、0.5μM、1μM、5μMとした。それ以外は、実施例1(1)(c)と同様の方法で行った。
図14(a)にオキサリプラチン添加時、図14(b)にシスプラチン添加時のクリスタルバイオレット法の結果を示す。CVA11型とオキサリプラチンの併用は、CVA11型とシスプラチンの併用と比較して、強い抗腫瘍効果を示した。この結果より、腫瘍溶解性ウイルスであるCVA11型とオキサリプラチンの組み合わせは、既報(国際公開第2013−157648号)のCVA11型とシスプラチンとの組み合わせと比較して特に有用であることが示された。
(1)方法
オキサリプラチンの代わりにシスプラチンを使用した以外は、実施例7と同様の方法で行った。1:シスプラチン不添加、2:シスプラチン 0.5μM添加、3:シスプラチン 1.0μM添加の3群に分けて比較をした。
図15にCVB3型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチンを添加した場合(図9)と異なり、シスプラチンを添加してもCVB3型ウイルス量の増加はみとめられなかった。この結果より、オキサリプラチンはシスプラチンと比較して、腫瘍溶解性ウイルスとの併用において有用であることが示された。
Claims (19)
- 腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
- 腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項1記載の抗腫瘍剤。
- コクサッキーウイルスが、A11型又はB3型である請求項2記載の抗腫瘍剤。
- 植物アルカロイド系抗がん剤が、SN−38、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる1以上からなる請求項1〜3のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 代謝拮抗剤が、5−FU又はその塩である請求項1〜3のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
- 腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項6記載の抗腫瘍剤。
- コクサッキーウイルスが、A11型又はB3型である請求項7記載の抗腫瘍剤。
- 植物アルカロイド系抗がん剤が、SN−38、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる1以上からなる請求項6〜8のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 代謝拮抗剤が、5−FU又はその塩である請求項6〜8のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである請求項1〜5のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
- 腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項12記載の抗腫瘍効果増強剤。
- オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
- オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
- ウイルス受容体が、DAF及び/又はICAM−1である請求項15記載のウイルス受容体発現増強剤。
- 抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
- 抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
- 腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
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