JPWO2018179172A1 - 免疫賦活活性を有する核酸誘導体 - Google Patents

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Abstract

本発明の目的は、免疫賦活活性を有する核酸誘導体として、以下のＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを提供することにある。第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチドであり、第２の鎖に脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチドからなるアジュバント。

Description

本発明は、免疫賦活活性を有する核酸誘導体に関する。より詳細には、第１の鎖がＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、第２の鎖に脂質が結合している二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。
感染症や癌領域で利用される医薬品であるワクチンは、抗原に対する特異的な免疫応答を利用している。アジュバントとは、ワクチンの免疫応答の有効性や持続性を高めるために利用される、免疫賦活活性を有する化合物であり、アルミニウム塩、乳化剤、リポソーム等これまで様々な種類のアジュバントが研究開発されている（非特許文献１等）。
アジュバントの一つとして、非メチル化シトシン-グアニンのジヌクレオチド（５’‐ＣｐＧ−３’）モチーフを含有する一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ）が知られている。ｓｓＣｐＧ ＯＤＮは、ＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９）のリガンドであり、ＴＬＲ９を介して非常に効率的にＴｈ１免疫や細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を誘導し、免疫を賦活化する（非特許文献１）。但し、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮを単独で用いるには、生体内での安定性、毒性、体内動態等に課題がある。その課題を解決する手段として、脂質の二重膜で形成されたナノ粒子内にｓｓＣｐＧ ＯＤＮを封入する方法（非特許文献２）、脂質をｓｓＣｐＧ ＯＤＮの５’末端に結合する方法（非特許文献３、特許文献１）等が知られている。
また、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮを第１の鎖と第２の鎖としてアニーリングすることにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＣｐＧ ＯＤＮ）として投与するとアジュバントとしての特性が失われることが知られている（非特許文献４）。非特許文献５には、ｄｓＣｐＧ ＯＤＮのみでは免疫賦活作用を示さないが、リポフェクチン粒子にｄｓＣｐＧ ＯＤＮを封入するとＣｐＧモチーフ、ＧｐＣモチーフに関わらず、免疫賦活活性を示すことが記載されている。
国際公開第２０１３／１５１７７１号
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００９， ３０（１）， ２３−３２ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ， ２００９， ６１（３）， ２３３−２４２ Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， ５０７， ５１９−５２２ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２００３， ３３， １３８２−１３９２ ＢＭＢ ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１０， ４３（３）， １６４−１６９
本発明の目的は、ワクチンのアジュバント及び／又はワクチンそのものとして利用可能な新規の免疫賦活活性を有する核酸誘導体を提供することにある。
非特許文献４及び５には、ｄｓＣｐＧ ＯＤＮを投与しても免疫賦活活性を示さないことが記載されている。さらに、非特許文献５にはリポフェクチン粒子にｄｓＣｐＧ ＯＤＮを封入するとＣｐＧモチーフ（ＯＤＮ４５３１）、ＧｐＣモチーフ（ＯＤＮ４５３１ＧＣ）に関わらず、つまり、ＣＧ配列とは独立した方法で、ＩＬ−８及びＨＬＲ−ＤＲＡ発現を誘導したことが記載されている。ｄｓＣｐＧ ＯＤＮはｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して細胞内でより早く分解されることから、リポフェクチン粒子に封入されたｄｓＣｐＧ ＯＤＮが免疫賦活活性を示した理由は、リポフェクチン粒子に封入されることにより、ｄｓＣｐＧ ＯＤＮが早期の分解から保護されていることかもしれないと記載されている（１６５頁、右欄、１４〜１６行目）。
本発明者らは、鋭意研究の結果、第１の鎖がＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、第２の鎖が該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、該第２の鎖に脂質が結合している二本鎖オリゴヌクレオチド（本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド）を合成した。該本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドをアジュバントとして癌抗原ペプチドと共に投与することにより、該ワクチンによる抗原特異的ＣＴＬの誘導率が向上し、抗腫瘍効果を示すことを見出した（本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドをアジュバントとして利用する場合、「本発明のアジュバント」とも称する）。また、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの中には、単独で強力な抗腫瘍効果を示すもの、つまり癌ワクチンとして利用可能なものが存在することを見出した（本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドをワクチンとして利用する場合、「本発明のワクチン」とも称する）。つまり、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、免疫賦活活性を有する。また、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは代謝安定性及び水溶性がよく、毒性が低く、医薬として使用するために十分安全である。
例えば、第２の鎖がＤＮＡヌクレオチドである本発明のアジュバント、糖の２’位にＯＭｅを有するヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである本発明のアジュバント、又は、糖の２’位にＦを有するヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである本発明のアジュバントを癌抗原ペプチドと共に投与すると、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して、ＣＴＬ誘導率の上昇や強い抗腫瘍効果を示した（実施例３、結果１−Ａ，Ｂ、結果７−Ａ，Ｂ、結果９−Ａ，Ｂ等）。一方、第２の鎖がＲＮＡオリゴヌクレオチドである脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ−４０）は抗腫瘍効果を示さなかった（結果７−Ｂ）。
１４個〜２４個の炭素原子を含むアシル鎖を２本含む脂質を第２の鎖の３’末端又は５’末端に結合した本発明のアジュバントを癌抗原ペプチドと共に投与すると、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して強い抗腫瘍効果を示した（実施例３、結果２−Ａ，Ｂ等）。一方、１０個の炭素原子を含むアシル鎖を２本含む脂質が第２の鎖の５’末端に結合した二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ−１２）を癌抗原ペプチドと共に投与しても、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して抗腫瘍効果の向上は見られなかった。また、１２個〜２０個の炭素原子を含むアシル鎖を２本含む脂質を第２の鎖の３’末端又は５’末端に結合し、さらに、もう一方の末端に脂質が結合した本発明のアジュバントを癌抗原ペプチドと共に投与すると、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較してＣＴＬ誘導率の上昇や強い抗腫瘍効果を示した（実施例３、結果３−Ａ，Ｂ等）。
第２の鎖の長さが第１の鎖（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に対して５０％〜１００％である本発明のアジュバントを癌抗原ペプチドと共に投与すると、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較してＣＴＬ誘導率の上昇や強い抗腫瘍効果を示した（実施例３、結果４−Ａ，Ｂ、結果５−Ａ、結果８−Ａ，Ｂ、結果９−Ａ，Ｂ等）。
第２の鎖にオリゴヌクレオチドリンカー（例えば、ｄＧｄＧ、ｄＴｄＴ、ｄＡｄＡ等）を介して脂質が結合している本発明のアジュバントを癌抗原ペプチドと共に投与すると、オリゴヌクレオチドリンカーを介さない本発明のアジュバントと比較して、さらにＣＴＬ誘導率の上昇や強い抗腫瘍効果を示した（実施例３、結果８−Ａ，Ｂ等）。
また、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、全身毒性がなく、安全性が高いことが示唆された（実施例５）。
さらに、感染症疾患の原因となる緑膿菌由来のＰＣＲＶタンパク質と共に免疫した結果、本発明のアジュバントは、感染症ワクチンのアジュバントとしても免疫賦活活性を示した（実施例６）。
また、第２の鎖にオリゴヌクレオチドリンカー（ｄＧｄＧｄＧｄＧｄＧ）を介して脂質が結合している本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１２１）を単独で投与すると、ｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して、強い抗腫瘍効果を示した（実施例４）。
すなわち、本発明は、以下に関する。
（Ａ１）第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチド（但し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを除く）であり、
第２の鎖の長さが、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さであり、
第２の鎖に炭素数１２〜３０の炭化水素鎖を含む脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ２）第２の鎖のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである、（Ａ１）に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ３）ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、（Ａ２）に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ４）糖の４’位と２’位との間に架橋構造が、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）である、（Ａ３）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ５）脂質が、ジアシル脂質である、（Ａ１）〜（Ａ４）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ６）脂質が、第２の鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合している、（Ａ１）〜（Ａ５）に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ７）リンカーが、オリゴヌクレオチドリンカーである、（Ａ１）〜（Ａ６）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ８）該リンカーが、−（ｄＸ１）ｕ−（ここで、Ｘ１はそれぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴであり、ｕは１〜８の整数である）である、（Ａ７）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ９）ＳＥＱ−６１、ＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０及びＳＥＱ−１９２からなる群から選択される、（Ａ１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ１０）ＳＥＱ−５９、ＳＥＱ−１６６、ＳＥＱ−１６８、ＳＥＱ−２１６、ＳＥＱ−２７２、ＳＥＱ−２８０、ＳＥＱ−２９０、ＳＥＱ−２９４、ＳＥＱ−３１０、ＳＥＱ−３７３、及びＳＥＱ−３８４ からなる群から選択される、（Ａ１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ１１）（Ａ１）〜（Ａ１０）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
（Ａ１２）抗原をさらに含む、（Ａ１１）記載の医薬組成物。
（Ａ１３）（Ａ１）〜（Ａ１０）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする、癌又は感染性疾患の治療又は予防方法。
（Ａ１４）癌又は感染性疾患の治療又は予防剤を製造するための、（Ａ１）〜（Ａ１０）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの利用。
（Ａ１５）癌又は感染性疾患を治療又は予防するための、（Ａ１）〜（Ａ１０）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ１６）抗原が、微生物抗原、自己抗原又は習慣性物質である、（Ａ１２）記載の医薬組成物。
（Ａ１８）微生物抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原又は寄生生物抗原である、（Ａ１６）記載の医薬組成物。
（Ａ１８）自己抗原が、癌抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原又はヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原である、（Ａ１６）記載の医薬組成物。
（Ａ１９）習慣性物質が、ニコチン又はコカインである、（Ａ１６）記載の医薬組成物。
（Ａ２０）被験体における免疫応答を増大させるための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の（Ａ１２）、（Ａ１６）〜（Ａ１９）いずれかに記載の医薬組成物を投与して、該被験体における免疫応答を増大させる工程を含む、方法。
（Ａ２１）該免疫応答が、コントロールと比較して、誘導される特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導率の上昇である、（Ａ２０）に記載の方法。
（Ａ２２）該被験体が、癌又は感染性疾患を有する、（Ａ２０）又は（Ａ２１）に記載の方法。
また、本発明は、以下も包含する。
（Ｂ１）第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖に脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチドからなるアジュバント。
（Ｂ２）第２の鎖のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである、（Ｂ１）に記載のアジュバント。
（Ｂ３）ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、（Ｂ２）に記載のアジュバント。
（Ｂ４）該置換基が、ＯＣＨ３である、（Ｂ３）記載のアジュバント。
（Ｂ５）脂質が、ジアシル脂質である、（Ｂ１）〜（Ｂ４）いずれかに記載のアジュバント。
（Ｂ６）該ジアシル脂質のアシル鎖が、１４〜３０個の炭素原子を含む、（Ｂ５）記載のアジュバント。
（Ｂ７）脂質が、第２の鎖の５’末端に結合している、（Ｂ５）又は（Ｂ６）記載のアジュバント。
（Ｂ８）第２の鎖の長さが、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さである、（Ｂ１）〜（Ｂ７）いずれかに記載のアジュバント。
（Ｂ９）リンカーが、オリゴヌクレオチドリンカーである、（Ｂ１）〜（Ｂ９）いずれかに記載のアジュバント。
（Ｂ１０）該リンカーが、ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）である、（Ｂ９）記載のアジュバント。
（Ｂ１１）抗原及び（Ｂ１）〜（Ｂ１０）いずれかに記載のアジュバントを含む、ワクチン組成物。
（Ｂ１２）抗原が、微生物抗原、自己抗原又は習慣性物質である、（Ｂ１１）記載のワクチン組成物。
（Ｂ１３）微生物抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原又は寄生生物抗原である、（Ｂ１２）記載のワクチン組成物。
（Ｂ１４）自己抗原が、癌抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原又はヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原である、（Ｂ１２）記載のワクチン組成物。
（Ｂ１５）習慣性物質が、ニコチン又はコカインである、（Ｂ１２）記載のワクチン組成物。
（Ｂ１６）被験体における免疫応答を増大させるための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の（Ｂ１１）〜（Ｂ１５）いずれかに記載のワクチン組成物を投与して、該被験体における免疫応答を増大させる工程を含む、方法。
（Ｂ１７）該免疫応答が、コントロールと比較して、誘導される特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導率の上昇である、（Ｂ１６）に記載の方法。
（Ｂ１８）該被験体が、癌又は感染性疾患を有する、（Ｂ１６）又は（Ｂ１７）に記載の方法。
（Ｂ１９）癌又は感染性疾患を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の（Ｂ１１）〜（Ｂ１４）いずれかに記載のワクチン組成物を投与して、コントロールと比較して、該癌又は感染性疾患の１以上の症状を低減する工程を含む、方法。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的抗原に対してより優れた免疫賦活活性を示す。全身毒性も見られなかったことから、ワクチンのアジュバント及び／又はワクチンそのものとして医薬品への応用が期待される。
ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ１８２６、ＳＥＱ−１）、ｄｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ−４）又は本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１６）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ１８２６、ＳＥＱ−１）又は両末端に脂質を有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−４６及びＳＥＱ−４８）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ１８２６、ＳＥＱ−１）、脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ−２）又は相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバント（ＳＥＱ−８及びＳＥＱ−１０）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ１８２６、ＳＥＱ−１）、脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ−２）、本発明のアジュバント（ＳＥＱ−２６）又はモンタナイドを癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ１８２６、ＳＥＱ−１）、脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ−２）又は本発明のアジュバント（ＳＥＱ−３８）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）、相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバント（ＳＥＱ−５１及びＳＥＱ−６１）又はリンカーを有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−６３及びＳＥＱ−６５）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又は相補鎖の核酸モノマーが２’−ＯＭｅ―ＲＮＡである本発明のアジュバント（ＳＥＱ−６７及びＳＥＱ−６９）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又はオリゴヌクレオチドリンカーを有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１１９及びＳＥＱ−１９２）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又はオリゴヌクレオチドリンカーを有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１２１）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又はオリゴヌクレオチドリンカーを有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１５２及びＳＥＱ−１５８）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又は３’末端及び/又は５’末端に脂質が結合している本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１８８、ＳＥＱ−１９２及びＳＥＱ−１９４）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又はオリゴヌクレオチドリンカーを有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１６４）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又は３’末端のみに脂質を有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ−１７０）を癌抗原ペプチド（ＴＲＰ２ペプチド）と共に投与した際の抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）又は本発明のワクチン（ＳＥＱ−１２１）の癌抗原ペプチド非存在下における抗腫瘍効果 ｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）、本発明のアジュバント（ＳＥＱ−６１及びＳＥＱ−１２１）又はＦｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント使用時のＰＣＲＶ抗原ワクチンの皮下投与による抗体価
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２）に記載された方法等が挙げられる。
以下に本明細書中で使用する各用語を説明する。なお、本明細書中、各用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、特に記載の無い限り、同一の意義を有する。
本明細書において「アジュバント」とは、ワクチン抗原の免疫応答の有効性や持続性を高めるために利用される、免疫賦活活性を有する化合物を意味する。
「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物を意味する。 「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドがリン酸ジエステル結合などのヌクレオシド間結合で複数個結合したヌクレオチドを意味する。
オリゴヌクレオチドにおける糖と糖の間の結合（ヌクレオシド間結合）は、天然の核酸が有する結合、ホスホジエステル（Ｄ−オリゴ）でもよいし、人工的に修飾がなされた結合又はリン原子を有していない結合であってもよい。当該分野で公知の結合であれば、いずれも利用可能である。人工的に修飾がなされた結合としては、ホスホロチオエート（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート（Ｍ−オリゴ）、ボラノホスホネート等が挙げられる。また、国際公開第２０１３／０２２９６６号、国際公開第２０１１／００５７６１号、国際公開第２０１４／０１２０８１号、国際公開第２０１５／１２５８４５号等に記載の結合も利用可能である。リン原子を有していない結合としては、アルキル、非芳香族炭素環式基、ハロアルキル、ハロゲンで置換された非芳香族炭素環式基等から誘導される二価の置換基が挙げられる。例えば、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、メチレンギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、アルケニル、スルファマート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホナート、スルホンアミド、アミド等から誘導される二価の置換基である。オリゴヌクレオチド中、全て同じ結合でもよいし、異なる結合を含んでいてもよい。
本明細書において、「ＤＮＡヌクレオシド」又は「ＲＮＡヌクレオシド」とは、天然のＤＮＡヌクレオシド又は天然のＲＮＡヌクレオシドであり、オリゴヌクレオチドを構成する１単位であるヌクレオチドの一部を意味する。「天然のＤＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
Figure 2018179172
(式中、ＢＸ１は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のＲＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
Figure 2018179172
（式中、ＢＸ２は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。）
「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドであり、「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドである。
本明細書において、「ヌクレオシド誘導体」とは、ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの核酸塩基及び／又は糖部位に人工的な修飾がなされたヌクレオシドを意味する。当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
核酸塩基の修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。
糖部位の修飾としては、例えば、糖の２’位の置換が挙げられる。具体的には、２’-Ｆ、２’-ＯＣＨ３（２’-ＯＭｅ）、２’-ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’-ＭＯＥ）等である。
また、例えば、以下の糖の４’位と２’位との間の架橋構造が挙げられる。
４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｓ−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−ＮＲ３−Ｏ−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’又は４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ２-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−Ｙ４−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１−ＳＯ２−ＮＲ３−２’、又は
Figure 2018179172
であり、
ここで、
Ｙ４は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ２であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ３は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Ｙ１はＣＲ４又はＮであり、
Ｙ２はＣＲ５又はＮであり、
Ｙ３はＣＲ６又はＮであり、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルキルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
ｍは、１〜４の整数であり、
ｍ１は、０〜３の整数であり、
ｍ２は、０又は１である。
Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、水素原子である。
Ｒ３は、好ましくは、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル又は非芳香族複素環アルキルであり、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、水酸基、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
該架橋構造として、好ましくは、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−２’又は４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（ＡｍＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であり、
ここで、
Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ３は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍは、１〜４の整数であり、
ｍ１は、０〜２の整数である。
該架橋構造として、特に好ましくは、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）又は、４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）である。
４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）の中で、特に好ましくは４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（ＬＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）である。具体例及びその調製方法は、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２００５／０２１５７０号等に記載されている。
４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）の中で、特に好ましくは４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−２’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載されている。
当該分野で公知のヌクレオチドの修飾及び修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。
国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開２０００／０５６７４８、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開２０１４／１１２４６３号、国際公開２０１４／１２６２２９号等。
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を包含する。特にフッ素原子、及び塩素原子が好ましい。
「アルキル」とは、炭素数１〜１５、好ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−へプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられる。
「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルが挙げられる。さらに好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
「アルケニル」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２〜１５、好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル等が挙げられる。
「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルが挙げられる。
「アルキニル」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜８、さらに好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等を包含する。これらはさらに任意の位置に二重結合を有していてもよい。
「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルが挙げられる。
「芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。
「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
「非芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状飽和炭化水素基又は環状非芳香族不飽和炭化水素基を意味する。２環以上の非芳香族炭素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族炭素環式基に、「芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
Figure 2018179172
単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数３〜１６が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１２、さらに好ましくは炭素数４〜８である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
「芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、芳香族環式基を意味する。
２環以上の芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
単環の芳香族複素環式基としては、５〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
２環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
３環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
「非芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、環状非芳香族環式基を意味する。
２環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
Figure 2018179172
単環の非芳香族複素環式基としては、３〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
「アルキルオキシ」とは、「アルキル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、へキシルオキシ等が挙げられる。
「アルキルオキシ」の好ましい態様として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシが挙げられる。
「ハロアルキル」とは、１以上の「ハロゲン」が「アルキル」に結合した基を意味する。例えば、モノフルオロメチル、モノフルオロエチル、モノフルオロプロピル、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル、モノクロロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、１，２−ジブロモエチル、１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イル等が挙げられる。
「ハロアルキル」の好ましい態様として、トリフルオロメチル、トリクロロメチルが挙げられる。
「アルキルチオ」とは、「アルキル」が硫黄原子に結合した基を意味する。
「アルキルアミノ」には、モノアルキルアミノとジアルキルアミノが含まれる。
「モノアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ等が挙げられる。好ましくは、メチルアミノ、エチルアミノが挙げられる。
「ジアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキルは、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノ、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−エチルアミノ等が挙げられる。好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノが挙げられる。
「アルキルカルボニルアミノ」とは、アルキルカルボニルがアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルキルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ、プロピルカルボニルアミノ、イソプロピルカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノ、イソブチルカルボニルアミノ、ｓｅｃ−ブチルカルボニルアミノ、ジメチルカルボニルアミノ、ジエチルカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボニルアミノ等が挙げられる。
「アルキルカルボニルアミノ」の好ましい態様としては、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノが挙げられる。
「アルケニルカルボニルアミノ」とは、アルケニルカルボニルがアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルケニルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ビニルカルボニルアミノ、プロペニルカルボニルアミノ等が挙げられる。
「アルキニルカルボニルアミノ」とは、アルキニルカルボニルがアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルキニルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、エチニルカルボニルアミノ、プロピニルカルボニルアミノ等が挙げられる。
「アルキルカルバモイル」とは、「アルキル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルキル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル等が挙げられる。
「アルケニルカルバモイル」とは、「アルケニル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルケニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ビニルカルバモイル、プロペニルカルバモイル等が挙げられる。
「アルキニルカルバモイル」とは、「アルキニル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれのアルキニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、エチニルカルバモイル、プロピニルカルバモイル等が挙げられる。
「芳香族炭素環アルキル」、「非芳香族炭素環アルキル」、「芳香族複素環アルキル」、及び「非芳香族複素環アルキル」のアルキル部分も、「アルキル」と同様である。
「芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、以下に示される基
Figure 2018179172
等が挙げられる。
「芳香族炭素環アルキル」の好ましい態様としては、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルが挙げられる。
「非芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキル」も包含する。例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロへキシルメチル、以下に示される基
Figure 2018179172
等が挙げられる。
「芳香族複素環アルキル」とは、１以上の「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、ピリジルメチル、フラニルメチル、イミダゾリルメチル、インドリルメチル、ベンゾチオフェニルメチル、オキサゾリルメチル、イソキサゾリルメチル、チアゾリルメチル、イソチアゾリルメチル、ピラゾリルメチル、イソピラゾリルメチル、ピロリジニルメチル、ベンズオキサゾリルメチル、以下に示される基
Figure 2018179172
等が挙げられる。
「非芳香族複素環アルキル」とは、１以上の「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチル、モルホリニルエチル、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル、以下に示される基
Figure 2018179172
等が挙げられる。
「置換若しくは非置換のアルキル」、「置換若しくは非置換のアルケニル」、「置換若しくは非置換のアルキニル」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル」又は「置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイル」の置換基としては、次の置換基が挙げられる。任意の位置の炭素原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環式基」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」の「芳香族炭素環」、「非芳香族炭素環」、「芳香族複素環」及び
「非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
また、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」は「オキソ」で置換されていてもよい。この場合、以下のように炭素原子上の２個の水素原子が置換されている基を意味する。
Figure 2018179172
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは
第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖に脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチド
からなる。
より、好ましくは、
第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチド（但し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを除く）であり、
第２の鎖の長さが、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さであり、
第２の鎖に炭素数１２〜３０の炭化水素鎖を含む脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチド
である。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第１の鎖は、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）」とは、非メチル化シトシン-グアニンのジヌクレオチド（５’‐ＣｐＧ−３’）モチーフ（ＣｐＧモチーフ）を含有する一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、ＴＬＲ９を介して獲得免疫反応を誘導することから、ワクチンアジュバントとして使用可能であることが知られている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２００６，５，４７１−４８４、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．，２０１１，１０（４），４９９-５１１）。本発明に使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み、複数のＣｐＧモチーフを含んでいてもよい。
本発明に使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドの長さは、８〜５０塩基である。例えば、８〜５０塩基、８〜４０塩基、８〜３０塩基、１０〜２５塩基、１５〜２５塩基、１８塩基〜２５塩基等である。
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」としては、当該分野で免疫賦活活性が知られている公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されない。例えば、国際公開第２００６／０６５７５１号、国際公開第２００７／０９２３１５号、国際公開第２００８／０６８６３８号、国際公開２０１０／０６７２６２号、国際公開第２０１０／１２５４８０号、国際公開第２０１４／０４７５８８号、国際公開第２０１４／１３４６９８号、国際公開第２０１５／０４１３１８号、米国特許出願公開第２０１１／０３００１６３号明細書等に合成法とＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのＣｐＧオリゴヌクレオチドは上記文献に記載の方法を参照して合成可能である。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列、二次構造及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する影響に基づいて、クラスＡ、クラスＢ、クラスＣ、クラスＰ、クラスＳに分類される（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ， ２００９， ６１（３），１９５−２０４）。
クラスＡ：ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ２３３６等；
クラスＢ：ＯＤＮＢＷ００６、ＯＤＮ Ｄ−ＳＬ０１、ＯＤＮ１６６８（国際公開第２００５／０６３２６４号）、ＯＮＤ１８２６（国際公開第２００７／０３０５８０号）、ＯＮＤ２００６（ＣｐＧ７９０９、ＰF−３５１２６７６）（国際公開第９８／１８８１０号）、ＯＤＮ２００７、ＯＤＮ６８４等；
クラスＣ：ＯＤＮ Ｄ−ＳＬ０３、ＯＤＮ ２３９５、ＯＤＮ Ｍ３６２等が挙げられる。これらは、研究用試薬としてＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入することもできる。また、その他、
ＣｐＧ−２８（国際公開第２０００／０５６３４２号）、
ＣｐＧ−６８５（ＧＮＫＧ−１６８）（Ｂｌｏｏｄ， ２０１０， １１５（２４）， ５０４１）
ＣｐＧ−ＯＤＮ Ｃ２７４（ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８（４）， ｅ６２３７３）
ＫＳＫ−１３（ＫＳＫ−ＣｐＧ）（米国特許第７４０８０５０号明細書）
ＣｐＧ ＯＤＮ １０１０４（ＣｐＧ−１０１０４）（Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐ， ２００６， ２８（３）， ２５８）
ＣｐＧ ＯＤＮ−１５８５（国際公開第２００１／０２２９９０号）
ＯＤＮ−５８９０（国際公開第２００６／０８０９４６号）
１０１８−ＩＳＳ（国際公開第２００８／０７３６６１号）
ＥＭＤ−１２０１０８１（ＨＹＢ−２０５５、ＩＭＯ−２０５５）（国際公開第２００５／００９３５５号）
Ｄ３５−ＣｐＧ、Ｋ３−ＣｐＧ（ジーンデザイン社）
等が挙げられる。本発明にはいずれのクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであっても利用可能であるが、好ましくは、クラスＡのＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ２３３６、Ｄ３５−ＣｐＧ等）又はクラスＢのＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６、ＣｐＧ−２８、１０１８−ＩＳＳ、ＩＭＯ２０５５、Ｋ３−ＣｐＧ、ＯＤＮ６８４、Ｄ−ＬＳ０１等）又はクラスＣのＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Ｄ−ＬＳ０３、ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ Ｍ３６２）である。特に好ましくは、ＯＤＮ１８２６、ＯＤＮ２００６である。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第２の鎖は、第１の鎖であるＣｐＧオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチド（但し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを除く）である。
好ましくは、第２の鎖は、ストリンジェントな条件で第１の鎖であるＣｐＧオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチドである。
第２の鎖のオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
例えば、ハイブリダイズする部位が、第１の鎖のＣｐＧオリゴヌクレオチドの相補配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列が特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応及び洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液及び洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
「１又は数個のミスマッチ」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のミスマッチを意味している。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第２の鎖の長さは、８〜６０塩基である。例えば、８〜６０塩基、８〜５０塩基、８〜４０塩基、８〜３０塩基、１０〜２５塩基、１５〜２５塩基である。第２の鎖の長さは、第１の鎖であるＣｐＧオリゴヌクレオチドと同じ長さであってもよいし、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする限りにおいて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの長さより１又は数個の塩基の分短くてもよい。また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部位の片側又は両側に１又は数個の塩基が付加することにより、第２の鎖の長さはＣｐＧオリゴヌクレオチドの長さより長くてもよい。
「１又は数個の塩基」とは、１〜１０個、１〜５個、１〜３個又は１若しくは２個の塩基を意味している。
第２の鎖の好ましい長さは第１の鎖のＣｐＧオリゴヌクレオチドの長さに依存する。例えば、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さ、６０％以上の長さ、７０％以上の長さ、５０〜１００％の長さ、６０〜１００％の長さ、７０〜１００％の長さである。特に好ましくは第１の鎖の長さに対して５０〜１００％の長さである。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第２の鎖のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド及びヌクレオシド誘導体からなる群から選ばれるヌクレオシドが結合したオリゴヌクレオチドである。全てのヌクレオシドが同じ種類でもよいし、２種以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。但し、全てのヌクレオシドがＲＮＡヌクレオシドであるＲＮＡオリゴヌクレオチドを除く。第２の鎖に含まれるヌクレオシドとして、好ましくは、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである。全てのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであってもよいし、全てのヌクレオシドがヌクレオシド誘導体であってもよいし、両方を含んでいてもよい。
ＤＮＡヌクレオシド及びヌクレオシド誘導体を含む場合、例えば、中心領域と該中心領域の両側の末端領域を含み、両側の末端領域に少なくとも１つのヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。具体的には、５’末端領域及び／又は３’末端領域に、ヌクレオシド誘導体を１以上、好ましくは、１〜５、さらに好ましくは、２〜３含有する。一方の末端領域内の修飾の種類、数、位置は他方の末端領域における修飾の種類、数、位置と同じであっても異なっていてもよい。他の態様として、ランダムにヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドも挙げられる。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第２の鎖中のヌクレオシド誘導体としては、上記に例示した通り、当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
好ましくは、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである。
糖の２’位の置換基として好ましくは、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。特に、ＯＣＨ３が好ましい。
糖の４’位と２’位との間の架橋構造として好ましくは、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）、４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）である。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの第２の鎖のオリゴヌクレオチドにおいてヌクレオシド間結合としては、上記に例示した通り、当該分野で公知のヌクレオシド間結合であればいずれも利用可能である。全てのヌクレオシド間結合が同じ種類でもよいし、２種以上の結合を含んでいてもよい。好ましくは、Ｄ−オリゴ及び／又はＳ−オリゴである。
Ｄ−オリゴ及びＳ−オリゴのように、２種以上のヌクレオシド間結合を含む場合、例えば、中心領域と該中心領域の両側の末端領域を含み、両側の末端領域に少なくとも１つの非天然のヌクレオシド間結合（例えば、Ｓ−オリゴ）を含み、中心領域に天然のヌクレオシド間結合（つまり、Ｄ−オリゴ）を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。例えば、５’末端領域及び／又は３’末端領域に、非天然のヌクレオシド間結合を１以上、好ましくは、１〜５、さらに好ましくは、２〜３含有する。一方の末端領域内の修飾の種類、数、位置は他方の末端領域における修飾の種類、数、位置と同じであっても異なっていてもよい。他の態様として、ランダムに非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドも挙げられる。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド中の第１の鎖のＣｐＧオリゴヌクレオチド及び第２の鎖のオリゴヌクレオチドは、当該分野の常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、下記実施例１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２， １８５９−１８６２ （１９８１）等に開示されている。
合成された第１の鎖及び第２の鎖は公知の方法でハイブリダイズさせることにより二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。例えば、下記実施例１、国際公開第２０１３／０８９２８３号の実施例１等に開示されている。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、第２の鎖に脂質がリンカーを介して結合している。
「脂質」とは、疎水性の化合物であり、公知の脂質であれば特に限定されず、直鎖状、分枝状又は環式であってもよい。例えば、８〜３０個の炭素の脂肪族鎖を有する脂肪酸（例えば、ファルネソール）、ジアシル脂質、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイド酸（例えば、胆汁酸）、リピドＡ、トコフェロール又はこれらの組み合わせが挙げられる。脂肪族鎖を有する脂肪酸としては、直鎖状の不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸、分枝状の飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸並びに脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、脂肪酸チオエステル等）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に利用される脂質として好ましくは、炭化水素鎖を含む脂質である。好ましくは、炭化水素鎖を１本又は２本含む脂質等が挙げられる。本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、特に好ましくは、ジアシル脂質を有する。脂質が２カ所以上に結合している場合、１つの脂質がジアシル脂質であれば、他方の脂質はジアシル脂質以外の脂質であってもよい。
「ジアシル脂質」は、リン酸脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質又はこれらの組み合わせであり、炭化水素鎖を２本含む。好ましくは、下記（ａ）又は（ｆ）で表される基である。
脂質中の炭化水素鎖は、それぞれ、約８〜３０個の炭素原子を含み、飽和、不飽和、又はこれらの組み合わせであり、分岐していてもよい。１本鎖の脂質の場合、好ましい鎖長は、炭素原子数が８〜３０個、より好ましくは８〜２０個である。２本鎖の脂質の場合、好ましい鎖長は炭素原子数が１０〜３０個、より好ましくは１２〜３０個、さらに好ましくは１４〜２４個である。２本鎖の脂質の場合、２本の鎖は長さが同じであっても異なっていてもよい。脂質中の鎖は、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合又はこれらの組み合わせ等を介して、リン酸、糖等を含む部位（オリゴヌクレオチドと結合する部位）に結合する。
なお、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは第２の鎖に炭素数１２〜３０の炭化水素鎖を含む脂質を有する。脂質が２カ所以上に結合している場合、１つの脂質が炭素数１２〜３０の炭化水素鎖を含む脂質であれば、他方の脂質に含まれる炭化水素鎖の炭素数は、１２より少なくてもよい。
「脂質」として、具体的には、例えば、以下が挙げられる。
Figure 2018179172
（式中、ｐ及びｑはそれぞれ独立して６〜２８の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して８〜２８であり、より好ましくはそれぞれ独立して１０〜２８であり、さらに好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、脂質は第２の鎖のいずれに結合していてもよい。３’末端、５’末端又は第２の鎖中に結合し得る。
脂質が第２の鎖の５’末端に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
Figure 2018179172
（式中、Ｂ１は、第２の３’末端の塩基であり、Ｙａは、Ｏ又はＳであり、ｐ又はｑは、それぞれ独立して６〜２８の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
脂質が第２の鎖の３’末端に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
Figure 2018179172
（式中、Ｂ１は、第２の５’末端の塩基であり、Ｙａは、Ｏ又はＳであり、ｐ又はｑは、それぞれ独立して６〜２８の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
脂質が第２の鎖中に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
Figure 2018179172
あるいは、
Figure 2018179172
（式中、Ｂ１及びＢ２は第２の鎖中隣接する塩基であり、Ｙａ又はＹｂは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、ｐ又はｑは、それぞれ独立して６〜２８の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
また、脂質は第２の鎖の１又は２か所に結合していることが好ましい。好ましくは、３’末端及び／又は５’末端に脂質が結合する。より好ましくは、５’末端に脂質が結合する。
脂質の具体例と調製方法は、当該分野において公知の手法を参考にしながら合成することができる。例えば、下記実施例１、特許文献１等にも開示されている。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて脂質はリンカーを介して第２の鎖に結合している。「リンカー」としては、当該分野で用いられるリンカーであれば、いずれでも利用可能である。例えば、極性型リンカー、アルキレンリンカー、エチレングリコールリンカー、エチレンジアミンリンカー等が挙げられる。脂質がリン酸脂質である場合、第２の鎖の酸素原子と脂質のリン原子との間が４〜２６原子であるリンカーである。具体例として、オリゴヌクレオチドリンカー又は以下に記載のリンカーが挙げられる。
Figure 2018179172
 （式中、Ｙ’はＯ又はＳであり、ｒ又はｓは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１〜５であり、より好ましくはそれぞれ独立して１〜３である。ｔは１〜４の整数であり、好ましくは１〜３、より好ましくは２又は３である。）
リンカーは、当該分野において公知の手法を参考にしながら合成することができる。オリゴヌクレオチドリンカーに関しては、上記に例示したオリゴヌクレオチドの合成方法と同様の方法で合成することができる。
リンカーとして好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーである。オリゴヌクレオチドリンカーの長さは、２〜１０塩基、２〜５塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基である。例えば、以下に記載のリンカーが挙げられる。
Figure 2018179172

（式中、Ｂ１及びＢ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）である。Ｙ’はそれぞれ独立してＯ又はＳである。Ｚ１又はＺ２は、それぞれ独立してＨ又はＯＨであり、好ましくはＨである。）
オリゴヌクレオチドリンカーとして、例えば、ＤＮＡリンカー、つまり、−（ｄＸ１）ｕ−（ここで、Ｘ１はそれぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴであり、ｕは１〜８の整数である）が挙げられる。具体的には、ｄＧ、ｄＧｄＧ、ｄＧｄＧｄＧｄＧ、ｄＧｄＧｄＧｄＧｄＧ、ｄＴ、ｄＴｄＴ、ｄＴｄＴｄＴｄＴ、ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ等が挙げられる。特に好ましくは、dＧｄＧ、ｄＧｄＧｄＧｄＧｄＧ又はｄＴｄＴである。ＤＮＡリンカー中のヌクレオシド間結合としては、ホスホロチオエート結合が好ましい。
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの脂質が結合していない３’末端若しくは５’末端又はリンカーはさらに修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドの追跡を可能にするため、オリゴヌクレオチドの薬物動態又は薬力学を改善するため、あるいはオリゴヌクレオチドの安定性又は結合親和性を向上させるために、当該分野で公知の修飾基を利用することができる。例えば、水酸基の保護基、レポーター分子、コレステロール、リン脂質、色素、蛍光分子等が挙げられる。
また、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの脂質が結合していない３’末端又は５’末端はリン酸エステル部分を含んでいてもよい。「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。リン酸エステル部分は、いずれの末端に位置してもよいが、５’−末端ヌクレオシドであることが好ましい。具体的には、式：−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨで示される基又はその修飾基である。つまり、Ｏ及びＯＨの１以上が、Ｈ、Ｏ、ＯＲ’、Ｓ、Ｎ（Ｒ’）（ここでＲ’は、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はアルキルで置換されていてもよい。５’又は３’末端は、それぞれ独立して置換又は非置換の１〜３のリン酸エステル部分を含んでいてもよい。
本発明は、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド（本発明のワクチン又は本発明のアジュバント）を含む、医薬組成物（本発明の医薬組成物）又はワクチン組成物（本発明のワクチン組成物）を包含する。
また、本発明は、抗原及び本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド（本発明のアジュバント）を含む、医薬組成物又はワクチン組成物も包含する。
「抗原」は、免疫応答を誘発することができる分子である。そのような分子としては、例えば、細胞、細胞抽出物、タンパク質、組換えタンパク質、精製タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、ペプチド、非ペプチドの多糖模倣物、プラスミドＤＮＡがコードする他の分子、ハプテン、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、死滅させた全病原体、ウイルス、ウイルス抽出物、弱毒化生ウイルス、ウイルスベクター、弱毒化生細菌、細菌ベクター、寄生生物等の多細胞生物体、アレルゲン等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗原は、単一の抗原として提供され得るか、又は組み合わせて提供され得る。抗原は、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの複雑な混合物として提供され得る。
抗原には、微生物抗原、自己抗原及び習慣性物質が包含されるが、これらに限定されない。
「微生物抗原」とは、微生物の抗原を意味する。微生物としては、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
「細菌」は、ヒ卜、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる細菌であれば特に限定されない。具体的には、レンサ球菌（溶連菌、肺炎球菌等）、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ、ＭＲＳΑ等）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア属に属する菌、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シ卜ロバクター菌、アシネ卜バクター菌、エンテロバクター菌、マイコプラズマ菌、クロス卜リジウム菌、結核菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、赤痢菌、炭疽菌、卜レポネーマ菌、破傷風菌、らい菌、レジオネラ菌、レプ卜スピラ菌、ボレリア菌、フランシセラ菌、コクシエラ菌、リケッチア菌、クラミジア菌、鼻疽菌、ピロリ菌等が挙げられる。
「ウイルス」は、ヒ卜、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となるウイルスであれば特に限定されない。例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）パピロマウイルス、肝炎ウイルス（Α型、Β型、Ｃ型、Ｄ型、Ε型、Ｆ型、Ｇ型、ΤΤ型等）、ライノウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、サポウイルス、サッポロウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ロタウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等のヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、Τリンパ好性ウイルス、黄熱病ウイルス、サイ卜メガロウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ等のコロナウイルス、エボラウイルス、ポリオーマウイルス、ＪＣウイルス、ΒΚウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）等のヘルペスウイルス、リンホクリプ卜ウイルス、ロゼオロウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、ラッサウイルス、チクングニアウイルス、ハンターンウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ボルナウイルス、リフトバレー熱ウイルス、卜ゴ卜ウイルス、ドーリウイルス、口蹄疫ウイルス、ニューキャッスルウイルス、牛丘疹性口炎ウイルス、牛疫ウイルス、豚水胞病ウイルス、カリシウイルス、卜ロウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アルテリウイルス、羊痘ウイルス、カプリポックスウイルス、羊随伴型悪性カタル熱ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、水胞性口炎ウイルス等が挙げられる。
「寄生生物」は、ヒ卜、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる寄生生物であれば特に限定されない。例えば、アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ、リーシュマニア、クリプトスポリジウム、トリパノソーマ、エキノコックス、日本住血吸虫、フィラリア、回虫、広節裂頭条虫等が挙げられる。
「真菌」は、ヒ卜、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる真菌であれば特に限定されない。具体的には、アスペルギルス菌、カンジダ菌、クリブ卜コッカス菌、白癬菌症、ヒス卜プラズマ菌、ニューモシスチス菌等が挙げられる。
「自己抗原」とは、癌抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原、ヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原等を意味する。
「癌抗原」としては、癌細胞において特異的に発現する抗原であり、タンパク質、ペプチド等が挙げられ、それらを含む融合ペプチドも包含する。例えば、国際公開第２００６／０９０８１０号、国際公開第２００７／１４５３１８号、国際公開第２００８／０４７４７３号、国際公開第２００８／１０２５５７号、国際公開第２００９／０２５１１７号、国際公開第２００９／０２５１９６号、国際公開第２００９／１５３９９９２号、国際公開第２０１０／０１３４８５号、国際公開第２０１０／０２１１１２号、国際公開第２０１０／０７３５５１号、国際公開第２０１０／０９５４２８号、国際公開第２０１０／１３１４５２号、国際公開第２０１０／１３７２９５号、国際公開第２０１１／０６７９２０号、国際公開第２０１１／０７４２３６号、国際公開第２０１１／０８９９２１号、国際公開第２０１１／１１１３９２号、国際公開第２０１２／０５３２００号、国際公開第２０１２／０５３２０６号、国際公開第２０１２／１６９２００号、国際公開第２０１３／０２４５８２号、国際公開第２０１３／０６１５９４号、国際公開第２０１４／０４１７８４号、国際公開第２０１４／０８７６２６号等に記載のペプチド等が挙げられる。
「アルツハイマー病と関連がある抗原」としては、タウ、β−アミロイド等が挙げられる。
「ヒト抗体に対する抗原」としては、ＩｇＥが挙げられる。
「習慣性物質」とは、ニコチン、コカイン等を意味する。ニコチン抗原としては、例えば、担体（例えば、ジフテリア毒素）にコンジュゲートさせたニコチンハプテン等が挙げられる。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの効果を損なわない範囲に限って、公知のアジュバントをさらに含んでいてもよい。例えば、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン、ＴＬＲ９ではないＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストである。ＴＬＲに対するアゴニストとしては、例えば、安定化ポリＩ：Ｃ等のＴＬＲ３に対するアゴニスト；リポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体（例えば、ＭＰＬ若しくはＧＬＡ）等のＴＬＲ４に対するアゴニスト；フラジェリン等のＴＬＲ５に対するアゴニスト；ＴＬＲ７に対するアゴニスト；ＴＬＲ８に対するアゴニスト等が挙げられる。具体的には、水酸化アルミニウム等のアルミニウム塩、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）、水中油型若しくは油中水型の乳剤、リポソーム、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子等の送達系等が挙げられる。
例えば下記実施例に記載の通り、癌抗原を含む本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、下記いずれか、あるいは全ての優れた特徴を有している。
ａ）１％以上のＣＴＬ誘導率を示す。
ｂ）腫瘍生着阻害を示す。
ｃ）腫瘍退縮効果を示す。
ｄ）高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。特に、高いリンパ移行性を示す。
ｅ）代謝安定性が高い。
ｆ）サイトカイン放出症候群が起きない。
ｇ）局所刺激性が軽い。
ｈ）変異原性を有さない。
ｉ）心血管系のリスクが低い。
ｊ）急性毒性のリスクが低い。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、又は治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、又は、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射若しくは点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は皮下投与である。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム又は結晶セルロース等が挙げられる。
結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。
また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、又は、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における医薬組成物又はワクチン組成物蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、及び、繰り返し頻度を定めることができる。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物における本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの含有割合は、特に限定はされないが、通常は医薬組成物又はワクチン組成物１００重量％に対して、０．０１重量％〜９９．９９重量％程度である。
また、抗原を含む場合、該抗原と本発明のアジュバン卜の割合は、抗原１重量部に対して、アジュバン卜は、通常１０重量部〜１０００重量部程度である。
医薬組成物又はワクチン組成物の投与量は、所望する免疫賦活化の程度や、投与対象の年齢、性別等によって区々であるため、適宜設定すればよく、特に限定はされないが、例えば、１日に０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。
また、所望する医薬組成物又はワクチン組成物が発揮する効果の程度、投与対象の年齢、性別等に従って、同一の被験体に対して本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を複数回投与してもよく、例えば、２回〜４回程度を上限とすればよい。なお、同一の被験体に対して本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を複数回投与する際には、その間隔を適宜設けてもよく、例えば、１４日〜３０日程度とすればよい。
本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、１種以上のさらなる薬剤と組み合わせて投与してもよい。該薬剤は、治療される疾患の治療剤として、当該分野で知られている治療剤を用いることができる。例えば、疾患が癌である場合、本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、化学療法薬と共に投与可能である。疾患が細菌感染である場合、本発明の医薬組成物又はワクチン組成物は、抗生物質と共投与可能である。本発明の医薬組成物又はワクチン組成物と同時に投与してもよいし、別々に投与してもよい。また、本発明の医薬組成物又はワクチン組成物と該治療剤は、それぞれ異なる製剤として投与してもよいし、該医薬組成物又はワクチン組成物と該治療剤を含有する単一製剤として投与してもよい。さらに、疾患が癌の場合、本発明の医薬組成物又はワクチン組成物の投与は、当該分野で知られている外科的治療と組み合わせてもよい。
また、本発明は、被験体における免疫応答を増大させるための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を投与して、該被験体における免疫応答を増大させる工程を含む、方法を包含する。「免疫応答」としては、コントロールと比較して、誘導される特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導率の上昇が挙げられる。特異的なＣＴＬ誘導率の測定方法は、例えば、下記実施例３、国際公開第２０１３／０２４５８２号等に開示されている。
さらに、本発明は、癌又は感染性疾患を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を投与して、コントロールと比較して、該癌又は感染性疾患の１以上の症状を低減する工程を含む、方法を包含する。
「被験体」とは、本発明の医薬組成物又はワクチン組成物を使用する処置の標的である任意の個体をいう。例えば、ヒト、実験動物（例えば、マウス、ラット等）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、フェレット、トリ等）、家畜（ウシ、プタ、ニワ卜リ、ヤギ、ダチョウ、ヒツジ、ウマ等）等の哺乳動物が挙げられる。
「有効量」とは、免疫応答を誘導若しくは増強するために、又はそうでなければ所望の薬理学的及び／若しくは生理学的効果を提供するために、処置されている障害、疾患、若しくは状態に対する処置を提供するために十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体依存性の変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患、疾患のステージ、及び行われている処置のような種々の要因に従って変動する。
「癌」としては、ヒ卜、愛玩動物、家畜等が罹患する癌であれば特に限定されない。例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、食道癌、びまん型胃癌等の胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、頭頸部癌、喉頭癌、口腔癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）等の肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、肛門癌、軟骨肉腫、滑膜肉腫、子宮内膜症、軟部組織腫瘍、骨芽細胞腫等が挙げられる。
「感染性疾患」としては、急性若しくは慢性の感染症疾患であり、特に、ウイルス性の感染症疾患を意味する。例えば、局所若しくは全身のウイルス感染症（ＨＩＶ等による免疫不全、ＨＰＶ等によるパピローマ、ＨＳＶ等によるヘルペス、脳炎、ヒトインフルエンザウイルスＡ等によるインフルエンザ、ヒトライノウイルス等による風邪といったウイルス感染等が挙げられるが、これらに限定されない。
なお、本明細書中で用いる略語は以下の意味を表す。
Ａｃ：アセチル
ＣＰＧ：コントロールドポーラーガラス
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＴｒ：ジメトキシトリチル
ＤＭＴ−ＭＭ：４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
Ｅｔ：エチル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート
Ｍｅ：メチル
ＭＭＴｒ：４−メトキシフェニルジフェニルメチル
ＭＭＴｒＣｌ：４−メトキシトリチルクロリド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＢＳ：ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
以下に本発明の実施例及び参考例並びに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例で得られた化合物のＮＭＲ分析は３００ＭＨｚ、４００ＭＨｚで行い、ＣＤ３ＯＤ、ＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯ−ｄ６を用いて測定した。
ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：３．５分間で５％−１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８ ｍＬ／分
ＰＤＡ検出波長：２５４ｎｍ（検出範囲２１０−５００ｎｍ）
実施例１ 本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの合成
Ａ） 脂質の合成
１−１）４−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１−１−１）化合物３−６の合成
工程１
化合物２−６（３．２０ｇ、２２．２ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＴＨＦ−ＤＭＦ（５：１、６０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（４．８４ｍＬ、２７．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（８．８４ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。化合物１（２．２ｇ、２４．４１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）を１０分間かけて滴下し、３時間撹拌した。反応液量を減圧により半分程度に濃縮し、水（１００ｍＬ）中へ滴下してから、１０分間撹拌した。生じた固体を、ろ取した。固体を水（５０ｍＬ）及びアセトニトリル（１５０ｍＬ）で洗浄して、白色固体として化合物３−６（３．２ｇ、９．３４ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.45 (2H, t, J = 6.0 Hz), 4.39 (1H, s), 3.78-3.73 (1H, m), 3.33 (4H, t, J = 5.6 Hz), 2.22 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.67 (4H, dt, J = 31.0, 14.1 Hz), 1.30-1.27 (16H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
１−１−２）化合物４−８の合成
工程１
化合物２−８（７．６５ｇ、４４．４０ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社）をＤＭＦ（５０．０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（１００．０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（８．７２ｍＬ、６６．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８．５２ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（２．０ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を加えて、３時間激しく撹拌した。反応液に飽和重そう水（２０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（１００ｍＬ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄後、乾燥し、白色固体として化合物３−８（６．６ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.29 (brs, 2H), 4.12 (s, 1H), 3.76 (dd, 1H, J = 4.5, 4.5 Hz), 3.42-3.35 (m, 2H), 3.31-3.25 (m, 2H), 2.22 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 1.65-1.60 (m, 4H), 1.29-1.26 (m, 24H), 0.88 (t, 6H, J = 6.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 340 (M+1).

工程２
化合物３−８（２．８８ｇ、７．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（５．３０ｍＬ、３０．３ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（３．２３ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタン（８０ｍＬ）で希釈した有機層を飽和重そう水（２０ｍＬ）で二回、水（２０ｍＬ）で二回、食塩水（２０ｍＬ）で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた褐色オイルである化合物４−８（２．８８ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を粗生成物として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−１−３）化合物４−１０の合成
工程１
化合物２−１０（９．７８ｇ、４８．８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（７５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１２．７９ｍＬ、７３．２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２０．３７ｇ、５３．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく４５分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（２．２ｇ、２４．４１ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、８０℃に昇温しさらに４時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（２００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（２００ｍＬ）、アセトニトリル（４００ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−１０（９．９５ｇ、２１．８８ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 6.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.07 (1H, s), 3.75 (1H, s), 3.44-3.38 (2H, m), 3.29-3.23 (2H, m), 2.22 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.67-1.59 (4H, m), 1.30-1.25 (64H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物３−１０（２３０ｍｇ、０．５０６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１１ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（０．３５３ｍＬ、２．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．２２６ｍＬ、１．０１２ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水（１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で５回、食塩水（１０ｍＬ）で１回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。褐色オイルである化合物４−１０（３６５ｍｇ）を粗生成物として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−１−４）化合物４−１２の合成
工程１
化合物２−１２（５．０７ｇ、２２．１９ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（５１．８ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２８．６ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（５．８１ｍＬ、３３．３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９．２６ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（１．０ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、４０℃に昇温しさらに２時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（１０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（５０ｍＬ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−１２（４．８ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.20 (brs, 2H), 3.96 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.40 (dd, 2H, J=4.0, 12.0 Hz), 3.25 (dd, 2H, J = 4.0, 12.0 Hz), 2.22 (t, 4H, J = 12.0 Hz, 2H), 1.62 (d, 4H, J = 8.0 Hz), 1.29-1.25 (m, 40H), 0.90-0.86 (m, 6H)
ESI-MS(m/z) : 512 (M+1).

工程２
化合物３−１２（５．１０ｇ、９．９８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５７ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（６．９７ｍＬ、３９．９ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（４．４６ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）で二回、水（１００ｍＬ）で二回、食塩水（１００ｍＬ）で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。褐色オイルである化合物４−１２（４．８０ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を粗生成物として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−１−５）化合物４−１４の合成
化合物２−１４（１２．５２ｇ、４８．８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（７５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１２．７９ｍＬ、７３．２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２０．３７ｇ、５３．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく２時間半撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（２．２ｇ、２４．４１ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、８０℃に昇温しさらに５時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（８００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（５００ｍＬ）、アセトニトリル（３００ｍＬ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−１４（１０．９ｇ、１９．２３ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 6.21 (2H, s), 3.97 (1H, d, J = 4.0 Hz), 3.77-3.74 (1H, m), 3.45-3.38 (2H, m), 3.28-3.22 (2H, m), 2.22 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.65-1.61 (4H, m), 1.29-1.25 (48H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物３−１４（１．００ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（０．９２４ｍＬ、５．２９ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．８７０ｍＬ、３．５３ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈後、分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）で二回、水（１００ｍＬ）で二回、食塩水（１００ｍＬ）で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた白色アモルファスである化合物４−１４（１．００ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を粗生成物として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−１−６）化合物４−１６の合成
非特許文献３に記載の方法に従って、化合物２−１６より化合物３−１６を合成し、続けて化合物４−１６の合成を行った。
化合物３−１６：1H-NMR（CDCl3）δ：6.20 (brs, 2H), 3.95 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.40 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 2.24 (m, 4H), 1.68-1.20 (m, 60H), 0.88 (t, 6H, J=8.0 Hz)
化合物４−１６：31P-NMR（CDCl3）δ：1４８．２ (s)
１−１−７）化合物４−１８の合成
工程１
化合物２−１８（１３．９ｇ、４４．４ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（２０７ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２１４ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１６．３ｍＬ、９３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８．５ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（２．０ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、４０℃に昇温しさらに２時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（１０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（１００ｍＬ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−１８（１０．０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.20 (brs, 2H), 3.96 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.42 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 2.22 (m, 4H), 1.68-1.20 (m, 68H), 0.88 (m, 6H)

工程２
化合物３−１８（３．８ｇ、５．６０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２３０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（５．８６ｍＬ、３３．６ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（３．７４ｍＬ、１６．７９ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）で２回、水（５０ｍＬ）で１回、食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残渣にアセトニトリルを加えた後に、白色固体をろ取した。得られた固体を飽和重そう水、水、アセトニトリルで洗浄後、白色固体として化合物４−１８（４．１３ｇ、４．７０ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：1４８．２ (s)
１−１−８）化合物４−２０の合成
工程１
化合物２−２０（１０．２ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２５０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（７．８６ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１２．５２ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（１．３５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、４０℃に昇温しさらに２時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（５０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（５０ｍＬ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−２０（７．２０ｇ、９．７９ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.18 (brs, 2H), 3.75 (m, 1H), 3.41 (m, 2H), 3.27 (m, 2H), 2.22 (m, 4H), 1.58-1.25 (m, 76H), 0.89-0.86 (m, 6H)

工程２
化合物３−２０（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（０．７１３ｍＬ、４．０８ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．６０７ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、激しく撹拌下のアセトニトリル（３００ｍＬ）に対して、反応溶液を滴下した。析出した固体をろ取し、固体を飽和重そう水（２０ｍＬ）で二回、水（２０ｍＬ）で二回、アセトニトリル（２０ｍＬ）で二回洗浄した。得られた固体を減圧下で乾燥し、白色固体である化合物４−２０（８４３ｍｇ、０．９０１ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−１−９）化合物４−２２の合成
工程１
化合物２−２２（８．７９ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２５０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（６．２５ｍＬ、３５．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９．９５ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（１．０７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、４０℃に昇温しさらに２時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（５０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（５０ｍＬ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−２２（８．１０ｇ、８．１７ｍｍｏｌ）を得た。1H-NMR（CDCl3）δ：6.06 (brs, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.36 (dd, 2H, J = 6.0, 14.4 Hz), 3.22 (dd, 2H, J = 5.2, 14.4 Hz), 2.17 (m, 4H), 1.61 (m, 4H), 1.59-1.24 (m, 80H), 0.87-0.84 (m, 6H)

工程２
化合物３−２２（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（０．７１３ｍＬ、４．０８ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．６０７ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、激しく撹拌下のアセトニトリル（３００ｍＬ）に対して、反応溶液を滴下した。析出した固体をろ取し、固体を飽和重そう水（２０ｍＬ）で二回、水（２０ｍＬ）で二回、アセトニトリル（２０ｍＬ）で二回洗浄した。得られた固体を減圧下で乾燥し、白色固体である化合物４−２２（８１４ｍｇ、０．８２１ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)
１−２）４−ｎ，ｏの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎ又はｏは６〜２８の整数である。）
１−２−１）化合物４−８，１８の合成
工程１
化合物２−８をＤＭＦ、ジクロロメタン溶液に溶解し、ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵを加え、室温で撹拌する。得られる白濁溶液に対して、室温で化合物１を加えて、撹拌する。反応容器に対して別途調製した化合物２−１８の活性化溶液［化合物２−１８をＤＭＦ、ジクロロメタン溶液に溶解し、ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵを加え、室温で撹拌する］を加えて室温で撹拌後、４０℃に昇温しさらに撹拌する。反応液に飽和重そう水を加え反応を停止させ、固体をろ取する。得られる固体を水、アセトニトリル、ジクロロメタンで洗浄後、化合物６−８，１８を得る。

工程２
化合物６−８，１８をクロロホルムに懸濁し、ＤＩＥＡを加える。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチルを加え、加熱還流する。室温へ放冷後、撹拌下のアセトニトリルに対して、反応溶液を滴下する。析出した固体をろ取し、固体を飽和重そう水で二回、水で二回、アセトニトリルで二回洗浄する。得られた固体を減圧下で乾燥し、化合物４−８，１８を得る。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断する。
２）化合物８−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
２−１）化合物８−６の合成
化合物７−６（１．００ｇ、７．６８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２．１３ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（１．７１ｍＬ、７．６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応溶液を飽和重そう水により停止し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出した。有機層を飽和重そう水（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）で三回、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、その後硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として褐色オイルである化合物８−６（２．６０ｇ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
２−２）化合物８−１０の合成
化合物７−１０（１．００ｇ、５．３７ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４９ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（１．２０ｍＬ、５．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応溶液を飽和重そう水により停止し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出した。有機層を飽和重そう水（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）で三回、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、その後硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として褐色オイルである化合物８−１０（２．０９ｇ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
２−３）化合物８−１２の合成
化合物７−１２（４．２９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をジクロロメタン（５２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（５．３６ｍＬ、２４．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を飽和重そう水（２０ｍＬ）により停止し、その後混合液を分液漏斗へ移し、有機層を水（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で二回洗浄し、その後硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として褐色オイルである化合物８−１２（４．８０ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.3 (s)
２−４）化合物８−１４の合成
化合物７−１４（１．００ｇ、４．１２ｍｍｏｌ、ナカライテスク株式会社）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．１４ｍＬ、８．２５ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．９２ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応溶液を飽和重そう水により停止し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出した。有機層を飽和重そう水（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）で三回、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、その後硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として褐色オイルである化合物８−１４（１．８７ｇ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
２−５）化合物８−１６の合成
化合物７−１６（５．４１ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をジクロロメタン（５２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（４．９１ｍＬ、２２．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を飽和重そう水（２０ｍＬ）により停止し、その後混合液を分液漏斗へ移し、有機層を水（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で二回洗浄し、その後硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として褐色オイルである化合物８−１６（４．６０ｇ、９．７７ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.3 (s)
２−６）化合物８−１８の合成
化合物７−１８（２．９９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をクロロホルム（８１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（３．６７ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（２．３４ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。析出した固体をろ取し、アセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。その後、黄色固体を減圧下で乾燥して化合物８−１８（１．２２ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
２−７）化合物８−２０の合成
化合物７−２０（３．２７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をクロロホルム（８１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（３．６７ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（２．３４ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。析出した固体をろ取し、アセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。その後、黄色固体を減圧下で乾燥して化合物８−２０（３．１９ｇ、６．０６ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
２−８）化合物８−２２の合成
化合物７−２２（３．５５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をクロロホルム（８１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（３．６７ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（２．３４ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。析出した固体をろ取し、アセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。その後、黄色固体を減圧下で乾燥して化合物８−２２（４．９７ｇ、８．９６ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.2 (s)
３）化合物１０−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
３−１）化合物１０−１６の合成
工程１
窒素気流下、化合物７−１６（１２．１ｇ、４４．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０４ｍＬ）―ジクロロメタン（５７．１ｍＬ）溶液に、ビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（１３．５ｇ、４４．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１１．６ｍＬ、６６．６ｍｍｏｌ）を加えた後、室温下８時間撹拌した。次に、化合物１（２．０ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を加えて、６０℃で２時間、加熱還流した。生じた固体をろ取した後、固体を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した後、減圧下で乾燥し、白色固体である化合物９−１６（１５．４４ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：5.20 (brs, 2H), 4.05 (m, 4H), 3.79 (m, 1H), 3.24 (m, 4H), 1.55-1.21 (m, 68H), 0.88 (m, 6H)

工程２
窒素気流下、化合物９−１６のジクロロメタン（５８２ｍＬ）懸濁液に、ＤＩＥＡ（１５．８ｍＬ、９０．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（１０．１ｍＬ、４５．２ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃で２時間加熱還流した。反応液を室温まで冷ました後、有機層を飽和重層水（３００ｍＬ）で二回、水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、アセトニトリル（１５０ｍＬ）の中へ滴下することで粉末化させた。生じた固体を減圧下乾燥して、化合物１０−１６（１４．２ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）を得た。
31P-NMR（CDCl3）δ：149.1 (s)
３−２）化合物１０−１８の合成
工程１
窒素気流下、化合物７−１８（４ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）―ジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液に、ビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（４．１ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０．１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温下５時間撹拌した。次に、化合物１（０．６ｇ、６．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）を加えて、終夜撹拌した。生じた固体をろ取した後、固体を、ジクロロメタン、水、アセトニトリルで洗浄した後、減圧下で乾燥し、白色固体として化合物９−１８（４．１ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：5.20 (brs, 2H), 4.05 (t, 4H, J = 8Hz), 3.79 (s, 1H), 3.32 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 1.25 (s, 72H), 0.88 (t, 6H, J = 8Hz)

工程２
窒素気流下、化合物９−１８（１．０ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６０ｍＬ）懸濁液に、ＤＩＥＡ（１．２ｍＬ、６．８ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．７５ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃下で１．５時間撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、ジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈して、飽和重層水（４０ｍＬｘ２）、水（４０ｍＬ）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、アセトニトリル（１５０ｍＬ）の中へ滴下することで粉末化させた。生じた固体を減圧下乾燥して、白色固体として化合物１０−１８（０．９８ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を得た。
31P-NMR（CDCl3）δ：149.1 (s)
４）化合物１５−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
４−１）化合物１５−６の合成
工程１及び工程２
化合物１１（米国特許出願公開第２０１４／０１４２２５３号明細書参照）（７２２ｍｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．６ｍＬ）にジエチルアミン（１．４ｍＬ、１３．４０ｍｍｏｌ）加え、室温で１７時間撹拌した。反応液にエタノールを加えて撹拌した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノールで２回共沸し、化合物１２の粗製物を得た。
化合物２−６（２３９ｍｇ、１．５０５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５．０ｍＬ）にＤＭＴ−ＭＭ（４７６ｍｇ、１．７２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。得られた反応液を、化合物１２の粗製物のエタノール溶液（２．５ｍＬ）に加え、室温で４時間半撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣に飽和重そう水及び水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝７０：３０→２０：８０）で精製し、化合物１３−６（３２０ｍｇ、収率５２％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42-7.40 (2H, m), 7.32-7.26 (6H, m), 7.21 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 5.37 (1H, s), 3.79 (6H, s), 3.71-3.65 (1H, m), 3.63-3.57 (1H, m), 3.27 (1H, dd, J = 9.2, 4.0 Hz), 3.25-3.15 (2H, m), 3.07 (1H, dd, J = 9.2, 7.2 Hz), 2.45 (1H, t, J = 5.6 Hz), 2.12 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.78 (1H, s), 1.62-1.58 (2H, m), 1.47-1.40 (2H, m), 1.36-1.20 (12H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.8 Hz).

工程３
化合物１３−６（３１０ｍｇ、０．５３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）にＤＭＡＰ（６．６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２８２ｍＬ、１．６１４ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（８１ｍｇ、０．８０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１４−６（３６０ｍｇ、収率９９％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42-7.40 (2H, m), 7.31-7.25 (6H, m), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.8 Hz), 5.74 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.24 (1H, dd, J = 10.8, 5.2 Hz), 4.12 (1H, dd, J = 10.8, 6.0 Hz), 3.79 (6H, s), 3.52-3.45 (1H, m), 3.24-2.98 (4H, m), 2.90 (1H, q, J = 7.2 Hz), 2.59-2.50 (3H, m), 2.14 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.90-1.85 (1H, m), 1.61-1.58 (2H, m), 1.48-1.18 (14H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.8 Hz).

工程４
化合物１４−６（２１６ｍｇ、０．３２０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（４２ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１８６ｍＬ、１．０６５ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（８９ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（４．２ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、４２ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物１４−６の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が５３μｍｏｌ／ｇの化合物１５−６を得た。
４−２）化合物１５−１０の合成
工程１及び工程２
４−１）の工程１と同様の方法にて化合物１２の粗生成物（３９２ｍｇ）を得た。
化合物２−１０（１５５ｍｇ、０．７７２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２．６ｍＬ）にＤＭＴ−ＭＭ（２１４ｍｇ、０．７７２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。得られた反応液を、化合物１２の粗製物（３９２ｍｇ）のエタノール溶液（１．３ｍＬ）に加え、室温で４時間撹拌した。化合物２−１０（７１ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１．３ｍＬ）にＤＭＴ−ＭＭ（９９ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分間撹拌した後、再び反応液へ加え、室温で１時間半撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣に飽和重そう水及び水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝８０：２０→３０：７０）で精製し、化合物１３−１０（１６５ｍｇ、４４％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.31-7.26 (6H, m), 7.21 (1H, t, J = 6.6 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.4 Hz), 5.35 (1H, s), 3.79 (6H, s), 3.70-3.57 (2H, m), 3.28-3.16 (3H, m), 3.07 (1H, t, J = 8.0 Hz), 2.43 (1H, s), 2.12 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.78 (1H, s), 1.61-1.58 (2H, m), 1.46-1.39 (2H, m), 1.25 (20H, s), 0.87 (3H, t, J = 6.0 Hz).

工程３
化合物１３−１０（２２２ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２．２ｍＬ）にＤＭＡＰ（４．３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．１８４ｍＬ、１．０５５ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（５３ｍｇ、０．５２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１４−１０（２４３ｍｇ、９４％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, d, J = 6.0 Hz), 7.31-7.26 (6H, m), 7.20 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 7.6 Hz), 5.59 (1H, s), 4.29 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.17-4.13 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.23-2.98 (4H, m), 2.58 (4H, s), 2.16 (2H, t, J = 8.0 Hz), 1.90 (1H, s), 1.60 (2H, s), 1.42-1.19 (22H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).

工程４
化合物１４−１０（２０９ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３８ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１６６ｍＬ、０．９５０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（７９ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（３．８ｇ）を加え、２３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、３８ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物１４−１０の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が４０μｍｏｌ／ｇの化合物１５−１０を得た。
４−３）化合物１５−１４の合成
工程１及び工程２
４−１）の工程１と同様の方法にて化合物１２の粗生成物（３９２ｍｇ）を得た。
化合物２−１４（３４５ｍｇ、１．３４６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（４．０ｍＬ）にＤＭＴ−ＭＭ（３７２ｍｇ、１．３４６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。得られた反応液を、化合物１２の粗製物のエタノール溶液（２．０ｍＬ）に加え、室温で２８時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣に飽和重そう水及び水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝７０：３０→２０：８０）で精製し、化合物１３−１４（２２８ｍｇ、収率３７％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.40 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.31-7.21 (7H, m), 6.83 (4H, d, J = 6.4 Hz), 5.35 (1H, s), 3.79 (6H, s), 3.67 (1H, s), 3.61 (1H, s), 3.28-3.19 (3H, m), 3.07 (1H, t, J = 7.2 Hz), 2.43 (1H, s), 2.12 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.77 (1H, s), 1.59 (2H, s), 1.43 (2H, s), 1.25 (28H, s), 0.88 (3H, s).

工程３
化合物１３−１４（２２４ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２．２ｍＬ）にＤＭＡＰ（４．０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．１７１ｍＬ、０．９７７ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（４９ｍｇ、０．４８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１４−１４（１６３ｍｇ、収率６４％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.40 (2H, d, J = 6.4 Hz), 7.30-7.26 (6H, m), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (4H, d, J = 7.2 Hz), 5.57 (1H, s), 4.29 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.17-4.13 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.23-2.98 (4H, m), 2.58 (4H, s), 2.15 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.90 (1H, s), 1.59 (4H, s), 1.46-1.25 (28H, m), 0.87 (3H, t, J = 5.6 Hz).

工程４
化合物１４−１４（１６２ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２８ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１２２ｍＬ、０．７００ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（５８ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（２．８ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、２８ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物１４−１４の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が４２μｍｏｌ／ｇの化合物１５−１４を得た。
４−４）化合物１５−１８の合成
工程１及び工程２
４−１）の工程１と同様の方法にて化合物１２の粗生成物（３９２ｍｇ）を得た。
化合物２−１８（４６６ｍｇ、１．４９０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５．０ｍＬ）にＤＭＴ−ＭＭ（４７１ｍｇ、１．７０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。得られた反応液を、化合物１２の粗製物のエタノール溶液（２．５ｍＬ）に加え、室温で４時間半撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣に飽和重そう水と水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝７０：３０→２０：８０）で精製し、化合物１３−１８（４９４ｍｇ、収率６２％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.32-7.26 (6H, m), 7.21 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 5.36 (1H, s), 3.79 (6H, s), 3.70-3.65 (1H, m), 3.63-3.57 (1H, m), 3.27 (1H, dd, J = 9.2, 4.0 Hz), 3.24-3.13 (2H, m), 3.07 (1H, dd, J = 9.2, 7.2 Hz), 2.45 (1H, t, J = 5.6 Hz), 2.12 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.78 (1H, s), 1.63-1.25 (40H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).

工程３
化合物１３−１８（３５２ｍｇ、０．４７３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．５ｍＬ）にＤＭＡＰ（５．８ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２４８ｍＬ、１．４１９ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（７１ｍｇ、０．７０９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１４−１８（２２５ｍｇ、５６％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.31-7.26 (6H, m), 7.20 (1H, t, J = 6.4 Hz), 6.82 (4H, d, J = 7.6 Hz), 5.57 (1H, s), 4.30 (1H, dd, J = 10.4, 2.4 Hz), 4.15 (1H, dd, J = 10.4, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.24-2.98 (4H, m), 2.59 (4H, s), 2.16 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.90 (1H, s), 1.59 (4H, s), 1.44-1.21 (36H, m), 0.88 (3H, t, J = 5.6 Hz).

工程４
化合物１４−１８（２２３ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３５ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１５４ｍＬ、０．８８０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（７３ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（３．５ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、３５ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物１４−１８の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が５６μｍｏｌ／ｇの化合物１５−１８を得た。
５）化合物１７の合成
Figure 2018179172
工程１及び工程２
化合物１１（米国特許出願公開第２０１４／０１４２２５３号明細書参照、２９２ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）にイミダゾール（７１ｍｇ、１．０４４ｍｍｏｌ）とｔ−ブチルジメチルクロロシラン（７９ｍｇ、０．５２２ｍｍｏｌ）加え、室温で１６時間撹拌した。反応液へ水を加えてシクロペンチルメチルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物１６の粗製物（３５２ｍｇ）を得た。
化合物１６の粗製物（３５２ｍｇ）のジクロロメタン溶液（２．４ｍＬ）にジエチルアミン（０．６ｍＬ、５．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液にエタノールを加えて撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をエタノールで２回共沸し、得られた粗製物をアミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム）で精製し、無色油状物質として化合物１７（１９０ｍｇ、７８％）を得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.45-7.43 (2H, m), 7.32 (4H, d, J = 8.8 Hz), 7.29-7.25 (2H, m), 7.22-7.18 (1H, m), 6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz), 3.79 (6H, s), 3.68-3.61 (2H, m), 3.08-3.02 (2H, m), 2.63 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.75-1.69 (1H, m), 1.41-1.30 (6H, m), 1.27-1.15 (2H, m), 0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s).
６）化合物２２−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
６−１）化合物２２−６の合成
工程１
化合物３−６（１．０ｇ、２．９２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）―クロロホルム（２０ｍＬ）溶液にＤＩＥＡ（１．５３ｍＬ、８．７６ｍｍｏｌ）、ビス（ニトロフェニル）カーボネート（１．３３ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１７８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０→２０：８０）で精製し、化合物１８−６（９８２ｍｇ、６６％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.32-8.26 (2H, m), 7.42 (2H, dt, J = 9.9, 2.5 Hz), 6.36 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.80 (1H, ddd, J = 10.7, 5.6, 3.3 Hz), 3.65-3.50 (4H, m), 2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.69-1.62 (4H, m), 1.28 (16H, dt, J = 19.1, 4.7 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物１７（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０．０ｍＬ）に化合物１８−６（４５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、アミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６５：３５→１０：９０）で精製し、化合物１９−６（６２５ｍｇ、７６％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.31 (4H, t, J = 6.2 Hz), 7.26 (3H, t, J = 3.9 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, t, J = 6.0 Hz), 6.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.70 (2H, dd, J = 10.3, 5.3 Hz), 3.79 (6H, d, J = 4.4 Hz), 3.62 (2H, dd, J = 10.1, 5.1 Hz), 3.51 (2H, dd, J = 13.3, 6.4 Hz), 3.32-3.26 (2H, m), 3.08 (4H, dt, J = 20.2, 6.6 Hz), 2.19 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.70 (1H, t, J = 5.7 Hz), 1.61 (8H, t, J = 9.3 Hz), 1.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (20H, tt, J = 26.0, 10.5 Hz), 0.88 (6H, dd, J = 12.0, 5.3 Hz), 0.83 (9H, s).

工程３
化合物１９−６（６２５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、１．３４ｍＬ、１．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、得られた粗製物をジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→１０：９０）で精製し、化合物２０−６（５４１ｍｇ、９９％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz), 7.26 (9H, ddt, J = 31.6, 12.0, 4.9 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.38 (2H, q, J = 6.1 Hz), 4.88 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.67 (1H, t, J = 5.0 Hz), 3.79 (6H, t, J = 7.5 Hz), 3.69-3.61 (2H, m), 3.50-3.44 (2H, m), 3.30 (3H, tt, J = 20.6, 6.5 Hz), 3.15-3.06 (3H, m), 2.63 (1H, s), 2.21-2.17 (4H, m), 1.78 (1H, s), 1.62 (4H, t, J = 6.9 Hz), 1.43 (2H, t, J = 5.4 Hz), 1.30 (20H, dt, J = 29.2, 11.0 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.9 Hz).
工程４
化合物２０−６（５４１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．３５ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（８．０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１３２ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗精製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１→１０：１）で精製し、化合物２１−６（５９１ｍｇ、９７％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.31-7.25 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.5 Hz), 6.62 (1H, t, J = 6.3 Hz), 6.48 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.91 (1H, t, J = 5.5 Hz), 4.71 (1H, t, J = 5.3 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 11.0, 3.2 Hz), 4.14 (1H, dd, J = 10.9, 5.9 Hz), 3.79 (6H, s), 3.40 (4H, tt, J = 20.4, 7.0 Hz), 3.08 (4H, dq, J = 33.3, 8.0 Hz), 2.69-2.49 (4H, m), 2.20 (4H, dd, J = 15.6, 8.2 Hz), 1.95 (1H, s), 1.61 (4H, d, J = 7.0 Hz), 1.27 (22H, d, J = 5.0 Hz), 0.87 (6H, dd, J = 6.8, 5.1 Hz).

工程５
化合物２１−６（３１２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／塩化メチレン混合溶液（４：１、２５ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．３０ｍＬ、１．７０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（１４２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＨｙｂｒｉｄＣＰＧ ａｍｉｎｏ ｆｏｒｍ ２０００Å（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社）（２．８ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＨｙｂｒｉｄＣＰＧにＴＨＦ／無水酢酸／ピリジン混液（８：１：１、３０ｍＬ）を加えて３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−６の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が１１４μｍｏｌ／ｇの化合物２２−６を得た。
６−２）化合物２２−８の合成
工程１
化合物３−８（１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）及びクロロホルム（２０ｍＬ）にビス（ニトロフェニル）カーボネート（１．１４ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１．３ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１５ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０→２０：８０）で精製し、化合物１８−８（１．１７ｇ、８３％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.27 (2H, dt, J = 9.9, 2.5 Hz), 7.41 (2H, dt, J = 9.9, 2.5 Hz), 6.42 (2H, t, J = 6.5 Hz), 4.81-4.78 (1H, m), 3.65-3.50 (4H, m), 2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.68-1.62 (4H, m), 1.28 (24H, t, J = 9.5 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物１７（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０．０ｍＬ）に化合物１８−８（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．２３ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、アミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→１０：９０）で精製し、化合物１９−８（６６１ｍｇ、７５％）を淡黄色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.31 (4H, t, J = 6.3 Hz), 7.26 (3H, t, J = 3.9 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.25 (2H, t, J = 6.0 Hz), 4.70 (2H, q, J = 5.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.63 (2H, t, J = 5.3 Hz), 3.51 (2H, dd, J = 13.1, 6.5 Hz), 3.29 (2H, dd, J = 12.9, 7.0 Hz), 3.08 (4H, dt, J = 20.0, 6.5 Hz), 2.18 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.70 (1H, t, J = 5.8 Hz), 1.62 (6H, d, J = 11.2 Hz), 1.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.27 (28H, dt, J = 37.9, 14.6 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz), 0.83 (9H, s).

工程３
化合物１９−８（６６１ｍｇ、０．６６９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、１．３４ｍＬ、１．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→１０：９０）で精製し、化合物２０−８（５４９ｍｇ、９４％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, t, J = 4.4 Hz), 7.32-7.19 (9H, m), 6.84 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.35 (2H, q, J = 6.1 Hz), 4.85 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.67 (1H, t, J = 5.1 Hz), 3.79 (6H, s), 3.64 (2H, dd, J = 14.3, 7.4 Hz), 3.47 (2H, dt, J = 14.1, 5.8 Hz), 3.30 (3H, tt, J = 19.5, 6.2 Hz), 3.15-3.06 (3H, m), 2.60 (1H, s), 2.21-2.17 (4H, m), 1.78 (1H, s), 1.62 (4H, s), 1.44 (2H, d, J = 5.1 Hz), 1.27 (28H, dd, J = 11.0, 3.7 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程４
化合物２０−８（５４９ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍＬ）にＤＭＡＰ（７．７ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１２６ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３２ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）で精製し、化合物２１−８（５８２ｍｇ、９５％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.31-7.25 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.7 Hz), 6.61 (1H, t, J = 6.2 Hz), 6.47 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.91 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.71 (1H, t, J = 5.1 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 11.0, 3.2 Hz), 4.14 (1H, dd, J = 10.9, 5.8 Hz), 3.80 (6H, d, J = 6.1 Hz), 3.47-3.33 (4H, m), 3.08 (4H, ddd, J = 33.6, 15.6, 8.5 Hz), 2.69-2.49 (4H, m), 2.20 (4H, dd, J = 15.6, 8.2 Hz), 1.95 (1H, s), 1.55 (4H, dt, J = 34.3, 6.5 Hz), 1.27 (30H, t, J = 7.2 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程５
化合物２１−８（３００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／塩化メチレン混合溶液（４：１、２５ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．２７ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（１２８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＨｙｂｒｉｄＣＰＧ ａｍｉｎｏ ｆｏｒｍ ２０００Å（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社）（２．５ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＨｙｂｒｉｄＣＰＧにＴＨＦ／無水酢酸／ピリジン混液（８：１：１、３０ｍＬ）を加えて３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−８の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が１０７μｍｏｌ／ｇの化合物２２−８を得た。
６−３）化合物２２−１０の合成
工程１
化合物３−１０（２．０ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）にピリジン（０．３７９ｍＬ、４．７０ｍｍｏｌ）、クロロぎ酸４−ニトロフェニル（９４７ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１８−１０（１．１ｇ、４２％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 8.28 (2H, d, J = 8.8 Hz) , 7.42 (2H, d, J = 8.8 Hz),6.91 (2H, d, J = 9.1 Hz),4.80 (1H, s),3.57 (4H, m),2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.66 (4H, t, J = 6.9 Hz),1.27 (40H, d, J = 20.2 Hz),0.88 (6H, t, J = 6.7 Hz).

工程２
化合物１７（４１ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に化合物１８−１０（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１９−１０（８０ｍｇ、９８％）を黄色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 7.5 Hz),7.31 (7H, t, J = 6.4 Hz),6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.23 (2H, d, J = 5.5 Hz),4.68 (1H, s),3.79 (6H, s),3.63 (2H, t, J = 5.4 Hz),3.52 (2H, t, J = 6.8 Hz),3.28 (2H, t, J = 7.3 Hz),3.11-3.04 (4H, m),2.18 (4H, t, J = 7.5 Hz),1.62 (6H, t, J = 7.2 Hz),1.25 (40H, s),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz),0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s)

工程３
化合物１９−１０（５５９．２ｍｇ、０．５３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）にトリエチルアミン（４．４ｍＬ、７．２１ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、０．４ｍＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈した後に飽和重層水（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物２０−１０（３８４ｍｇ、７７％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz),7.31 (7H, d, J = 8.5 Hz),6.84 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.32 (2H, t, J = 6.3 Hz),4.83 (1H, t, J = 6.0 Hz),4.67 (1H, s, J = 5.2 Hz),3.79 (6H, s),3.68-3.63 (2H, m),3.47 (2H, dd, J = 12.9, 6.1 Hz),3.34-3.24 (3H, m),3.10 (3H, dt, J = 17.5, 5.6 Hz),2.59 (1H, s),2.21-2.17 (4H, m),1.71 (1H, m),1.62 (4H, t, J = 7.2 Hz),1.25 (36H, s),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程４
化合物２０−１０（３８４ｍｇ、０．４３１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０．１ｍＬ）にＤＭＡＰ（５．０４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（６２．０ｍｇ、０．６１９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物２１−１０（３０８ｍｇ、７１％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz),7.31 (6H, d, J = 8.5 Hz),6.84 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.81 (1H, br s),6.61 (1H, br s),5.83 (1H, br s),4.70 (1H, s),4.38 (1H, m),4.13 (1H, d, J = 10.4 Hz),3.79 (6H, s),3.78-3.41 (6H, m),3.05 (6H, m),2.89 (6H, m),2.62-2.55 (6H, m),2.20 (4H, d, J = 7.2 Hz),1.94 (1H, s),1.62 (4H, t, J = 7.2 Hz),1.25 (36H, s),0.88 (6H, t, J = 7.2 Hz).

工程５
化合物２１−１０（２４７ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶液（１：１、２０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１６８ｍＬ、０．９８２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（１００ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（２．０ｇ）を加え、１２時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをジクロロメタンで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、２０ｍＬ）を加えて３０分間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをジクロロメタンで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−１０の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が６９μｍｏｌ／ｇの化合物２２−１０を得た。
６−４）化合物２２−１２の合成
工程１
化合物３−１２（２．０ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）にピリジン（０．３７９ｍL、４．７０ｍｍｏｌ）、クロロぎ酸４−ニトロフェニル（９４７ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１８−１２（１．１ｇ、４２％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 8.28 (2H, d, J = 8.8 Hz) , 7.42 (2H, d, J = 8.8 Hz),6.91 (2H, d, J = 9.1 Hz),4.80 (1H, s),3.57 (4H, m),2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.66 (4H, t, J = 6.9 Hz),1.27 (40H, d, J = 20.2 Hz),0.88 (6H, t, J = 6.7 Hz).

工程２
化合物１７（４１ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に化合物１８−１２（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１９−１２（８０ｍｇ、９８％）を黄色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 7.5 Hz),7.31 (6H, t, J = 6.4 Hz),6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.23 (2H, d, J = 5.5 Hz),4.68 (1H, s),3.79 (6H, s),3.63 (2H, t, J = 5.4 Hz),3.52 (2H, t, J = 6.8 Hz),3.28 (2H, t, J = 7.3 Hz),3.11-3.04 (4H, m),2.18 (4H, t, J = 7.5 Hz),1.62 (6H, t, J = 7.2 Hz),1.25 (40H, s),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz),0.84 (6H, s), 0.01 (6H, s)

工程３
化合物１９−１２（９０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）にトリエチルアミン（１．０ｍL、７．２１ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、０．４ｍＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈した後に飽和重層水（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９５：５）で精製し、化合物２０−１２（８４ｍｇ、１００％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz),7.31 (6H, d, J = 8.5 Hz),6.84 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.34 (2H, t, J = 6.3 Hz),4.83 (1H, s),4.67 (1H, s),3.79 (6H, s),3.68-3.63 (2H, m),3.47 (2H, dd, J = 12.9, 6.1 Hz),3.34-3.24 (3H, m),3.10 (3H, dt, J = 17.5, 5.6 Hz),2.60 (1H, s),2.21-2.17 (4H, m),1.62 (4H, t, J = 6.9 Hz),1.25 (40H, s),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程４
化合物２０−１２（６０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２ｍＬ）にＤＭＡＰ（０．７ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（７．３ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を加え、室温で４日間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９５：５）で精製し、化合物２１−１２（５６ｍｇ、８５％）を無色液体物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 1085 (M-H).

工程５
化合物２１−１２（５２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／クロロホルム混合溶液（１：１、１０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．０４３ｍＬ、０．２４８ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（３１ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（０．５ｇ）を加え、２３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、５ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−１２の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が３１μｍｏｌ／ｇの化合物２２−１２を得た。
６−５）化合物２２−１４の合成
工程１
化合物３−１４（１．５ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６０ｍＬ）にピリジン（０．３２０ｍＬ、３．９７ｍｍｏｌ）、クロロぎ酸４−ニトロフェニル（８００ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６６：３４→４５：５５）で精製し、化合物１８−１４（１．５６ｇ、８１％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.29 (2H, d, J = 10.0 Hz), 7.43 (2H, d, J = 10.0 Hz), 6.31 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.81-4.76 (1H, m), 3.65-3.58 (2H, m), 3.55-3.48 (2H, m), 2.25 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.67-1.61 (4H, m), 1.25 (48H, s), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物１７（１．０６ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に化合物１８−１４（１．３８ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６６：３４→４５：５５）で精製し、化合物１９−１４（１．４７ｇ、６８％）を白色固体として得た。
ESI-MS (m/z) : 1155 (M-H).

工程３
化合物１９−１４（１．４７ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３０ｍＬ）にＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、３．８１ｍＬ、３．８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、溶媒を減圧濃縮した。得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→５：９５）で精製し、化合物２０−１４（１．０４ｇ、７９％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.32-7.27 (6H, m), 7.21 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.37-6.35 (2H, m), 4.86 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.69-4.64 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.69-3.61 (2H, m), 3.50-3.24 (6H, m), 3.15-3.06 (3H, m), 2.61 (1H, s), 2.21-2.17 (4H, m), 1.25 (58H, s), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程４
化合物２０−１４（１．０４ｇ、０．９９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にＤＭＡＰ（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５２３ｍＬ、２．９９ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１７０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム）で精製し、化合物２１−１４（１．１７ｇ）を白色固体として得た。
ESI-MS (m/z) : 1141 (M-H).

工程５
化合物２１−１４（５８５ｍｇ、０．５１２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶液（１：１、４０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．４４７ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（２１４ｍｇ、０．５６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（４．０ｇ）を加え、２１時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶液（１：１、１２０ｍＬ）、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）で洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、４０ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジン（４０ｍＬ）、イソプロパノール（６０ｍＬ）、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）で洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−１４の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が４０μｍｏｌ／ｇの化合物２２−１４を得た。
６−６）化合物２２−１８の合成
工程１
化合物３−１８（１．０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４０ｍＬ）にピリジン（０．１４３ｍL、１．７６ｍｍｏｌ）、クロロぎ酸４−ニトロフェニル（３５６ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた固体の粗製物を酢酸エチルで洗浄し、化合物１８−１８（５０８ｍｇ、４１％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 8.29 (2H, d, J = 8.8 Hz),7.43 (2H, d, J = 9.1 Hz),6.29 (2H, s),3.60-3.50 (4H, m),2.25 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.64 (４H, d, J = 6.6 Hz),1.25 (64H, s),0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz).

工程２
化合物１７（６２ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４．０ｍＬ）に化合物１８−１８（９３ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物１９−１８（１１３ｍｇ、８１％）を黄色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 13.4 Hz),7.31 (7H, d, J = 9.3 Hz),6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.22 (2H, s),4.69 (1H, s),3.78 (6H, s),3.62 (2H, t, J = 5.6 Hz),3.51 (2H, dd, J = 10.9, 6.1 Hz),3.32-3.27 (2H, m),3.11-3.04 (4H, m),
2.17 (4H, t, J = 3.7 Hz),1.62 (6H, dd, J = 10.5, 4.7 Hz),1.25 (64H, s),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz),0.83 (9H, s), 0.01 (6H, s).

工程３
化合物１９−１８（１００ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４ｍＬ）にトリエチルアミン（０．１ｍL、０．７９ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、０．３２ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈した後に飽和重層水（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９５：５）で精製し、化合物２０−１８（９０ｍｇ、９９％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, d, J = 8.6 Hz),7.31 (7H, d, J = 8.8 Hz),6.84 (4H, d, J = 8.6 Hz),6.31 (2H, s),4.81 (1H, s),4.67 (1H, s),3.79 (6H, s),3.71-3.63 (2H, m),3.49 (2H, dd, J = 14.7, 11.1 Hz),3.30 (3H, tt, J = 18.8, 7.4 Hz),3.13-3.07 (3H, m),2.58 (1H, s),2.18 (4H, d, J = 7.6 Hz),1.60 (6H, dd, J = 9.2, 4.4 Hz)1.25 (64H, s),0.88 (6H, t, J = 6.3 Hz).
工程４
化合物２０−１８（８７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２ｍＬ）にＤＭＡＰ（０．９ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１５．８ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で７日間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９５：５）で精製し、化合物２１−１８（８５ｍｇ、９０％）を無色液体物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 1253 (M-H).

工程５
化合物２１−１８（８５ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／クロロホルム混合溶液（１：１、１０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．０４３ｍＬ、０．２４８ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（３８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（０．５ｇ）を加え、室温で２３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、５ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−１８の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が１５μｍｏｌ／ｇの化合物２２−１８を得た。
６−７）化合物２２−２０の合成
工程１
化合物３−２０（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３５ｍＬ）に炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．２４１ｍＬ、４．０８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４９８ｍｇ、４．０８ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で１時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残渣に対してアセトニトリル（５０ｍＬ）を加えて沈殿が生じるまで撹拌した。反応溶液に水（２０ｍＬ）を加えて激しく撹拌した。生じた固体をでろ取した。得られた固体を水（５０ｍＬ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）で順に洗浄し、化合物１８−２０（１．１ｇ、９２％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 8.28 (2H, dd, J = 2.0, 6.8 Hz) , 7.42 (2H, dd, J = 2.4, 7.2 Hz),6.30 (2H, s),4.79 (1H, s),3.61 (2H, m),3.52 (2H, m),2.20 (4H, m),1.66 (4H, m),1.25 (72H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程２
化合物１７（２１９ｍｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６．５ｍＬ）に化合物１８−２０（３５０ｍｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４７．５ｍｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２時間撹拌した。反応液に１０％含水アセトニトリル溶液（７０ｍｌ）を加えしばらく撹拌した後に、析出した固体をろ取した。化合物１９−２０（４２０ｍｇ、８２％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.43 (2H, d, J = 7.6 Hz),7.31 (7H, m),6.81 (4H, d, J = 8.4 Hz),6.26 (2H, br s),4.73 (1H, br s),4.69 (1H, br s),3.79 (6H, s),3.79 (6H, s),3.63 (2H, m),3.49 (2H, m),3.29 (2H, d, J = 14.0 Hz),3.10-3.06 (4H, m),2.18 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.68 (4H, m),1.42-1.25 (m, 72H),0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz),0.83 (s, 9H),0.00 (s, 6H).

工程３
化合物１９−２０（５５９ｍｇ、０．４２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）にＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、０．５０６ｍＬ、０．５０６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で５時間撹拌した。反応液を１０％含水アセトニトリル溶液（１００ｍＬ）に滴下し、析出した固体をろ取した。化合物２０−２０（３４４ｍｇ、６７％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz),7.31 (7H, d, J = 8.5 Hz),6.84 (4H, d, J = 8.8 Hz),6.35 (2H, br s),4.85 (1H, s),4.67 (1H, s),3.79 (6H, s),3.68 (2H, m),3.47 (2H, dd, J = 12.9, 6.1 Hz),3.34-3.24 (3H, m),3.10 (3H, dt, J = 17.5, 5.6 Hz),2.60 (1H, s),2.21-2.17 (4H, m),1.62 (4H, m), 1.60-1.45 (m, 4H),1.25-1.01 (72H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程４
化合物２０−２０（３４４ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）にＤＭＡＰ（３．５ｍｇ、０．０２８４ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（４２．６ｍｇ、０．４２６ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を１０％含水アセトニトリル溶液（１００ｍＬ）に滴下し、析出した固体をろ取した。化合物２１−２０（３６１ｍｇ、９７％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 7.6 Hz),7.31-7.26 (7H, m),6.83 (4H, t, J = 8.4 Hz),6.56 (1H, br s),6.40 (1H, br s),5.89 (1H, br s),4.71 (1H, m),4.41 (1H, d, J = 8.0 Hz),4.14 (1H, dd, J = 6.0,11.2 Hz),3.79 (6H, s),3.65 (1H, m), 3.43-3.37 (4H, m),3.05-3.02 (4H, m),2.19-2.17 (4H, m),1.61-1.25 (76H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程５
化合物２１−２０（１９０ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／クロロホルム混合溶液（１：３、１０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．１２７ｍＬ、０．７２５ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（６０．５ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（３．０ｇ）を加え、２時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをクロロホルムで３回、エタノール、アセトニトリルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、２０ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをクロロホルムで３回、アセトニトリルで３回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−２０の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が４８μｍｏｌ／ｇの化合物２２−２０を得た。
６−８）化合物２２−２２の合成
工程１
化合物３−２２（２．０ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３５ｍＬ）に炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．５４ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６１８ｍｇ、５．０５ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残渣に対してアセトニトリル（１００ｍＬ）を加えて沈殿が生じるまで撹拌した。反応溶液に水（２０ｍＬ）を加えて激しく撹拌した。生じた固体をろ取した。得られた固体を水（１００ｍＬ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）で順に洗浄し、化合物１８−２２（２．２７ｇ、８９％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 8.28 (2H, d, J = 8.8 Hz) , 7.43 (2H, d, J = 8.82 Hz),6.29 (2H, br t, J = 6.4 Hz),4.79 (1H, br s),3.61 (2H, m),3.52 (2H, m),2.25 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.64 (4H, m),1.26 (84H, m),0.88 (6H, t, J = 6.0 Hz)

工程２
化合物１７（６６６ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０．０ｍＬ）にＤＭＡＰ（１４４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、化合物１８−２２（１．１３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２時間撹拌した。反応液をにアセトニトリル（１５０ｍＬ）をゆっくりと加え、生じた沈殿をろ取した。得られた固体をアセトニトリルで３回洗浄し、化合物１９−２２（１．５ｇ、９２％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 6.8 Hz),7.32-7.20 (7H, m),6.81 (4H, d, J = 6.8 Hz),6.26 (2H, br m),4.70 (2H, s),3.63 (2H, m),3.49 (2H, m),3.31 (2H, m),3.09-3.04 (4H, m),2.18 (4H, m),1.60 4H, m),1.25 (84H, m),0.86 (6H, t, J = 6.8 Hz),0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s)

工程３
化合物１９−２２（１．５ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（８．９ｍＬ）に、ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、１．６４ｍＬ、１．６９ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２時間撹拌した。反応液をにアセトニトリル（１５０ｍＬ）をゆっくりと加え、生じた沈殿をろ取した。得られた固体をアセトニトリルで３回洗浄し、化合物２０−２２（１．２ｇ、８７％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.41 (2H, t, J = 7.2 Hz),7.31-7.21 (7H, m),6.84 (4H, d, J = 8.0 Hz),6.34 (2H, m),4.83 (1H, s),4.67 (1H, s),3.79 (6H, s),3.67 (2H, m),3.46 (2H, m),3.33-3.24 (3H, m),3.10 (3H, m),2.17 (4H, t, J = 7.6 Hz),1.78 (4H, m),1.44-1.25 (84H, m),0.88 (6H, t, J = 6.0 Hz).
工程４
化合物２０−２２（１００ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）にＤＭＡＰ（１ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１１．９ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で４時間した。反応液にアセトニトリル（１０ｍＬ）に滴下し、析出した固体をろ取した。得られた固体をアセトニトリルで３回洗浄し、化合物２１−２２（３６１ｍｇ、９７％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 7.42 (2H, d, J = 7.6 Hz),7.31-7.26 (7H, m),6.81 (4H, t, J = 8.8 Hz),6.58 (1H, br m),6.43 (1H, br m),5.88 (1H, br m),4.71 (1H, m),4.40 (1H, d, J = 8.0 Hz),4.14 (1H, dd, J = 6.0,10.8 Hz),3.79 (6H, s),3.65 (1H, m), 3.43-3.37 (4H, m),3.13-3.02 (4H, m),2.63-2.53 (4H, m),2.23-2.18 (4H, dd, J = 7.2, 14.8 Hz),2.00-1.25 (4H, m) 1.25-1.11(84H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).

工程５
化合物２１−２２（９２ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロメタン／クロロホルム混合溶液（１：２：２、１０ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．０５９ｍＬ、０．３３６ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（２８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１５分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（０．９ｇ）を加え、４０℃で３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをクロロホルム、アセトニトリル、エタノールで各３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、６０ｍＬ）を加えて１時間半振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで３回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物２１−２２の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が４７μｍｏｌ／ｇの化合物２２−２２を得た。
８−１）化合物２６の合成
Figure 2018179172
窒素気流下、コレステロール（化合物２５、１．００ｇ、２．５９ｍｍｏｌ、和光純薬）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（０．９ｍＬ、５．１７ｍｍｏｌ）を加え、氷冷水で冷却した。Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸メチル（０．８６ｍL、３．８５ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下４０分撹拌した。反応液をジクロロメタン酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した後に飽和重層水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してろ過後，減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２０ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→０：１００）により精製し、化合物２６（１．４５ｇ、収率９５％）を無色泡状物質として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：145.46 (d)
８−２）化合物５３の合成
Figure 2018179172
ファルネソール（化合物５２、１．０ｍＬ、３．９９ｍｍｏｌ、純正化学株式会社）をジクロロメタン（８．９ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１．５３ｍＬ、８．７８ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸２‐シアノエチル（０．９８ｍＬ、４．３９ｍｍｏｌ）を加え、室温で４０分間撹拌した。ジクロロメタン（９０ｍＬ）と飽和重そう水（１００ｍＬ）を反応溶媒に加えて反応を停止し、その後混合液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮後、粗生成物として淡黄色オイルである化合物５３（１．２０ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）を得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.37 (1H, t, J = 6.6 Hz), 5.10-5.08 (2H, m), 4.19-4.13 (2H, m), 3.90-3.77 (2H, m), 3.66-3.54 (2H, m), 2.64 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.08-1.99 (8H, m), 1.68-1.67 (6H, m), 1.61-1.60 (6H, m), 1.20-1.17 (12H, m).
31P-NMR (CDCl3) δ: 147.92 (1H, s).
９）化合物３６-ｎの合成
Figure 2018179172
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
９−１）化合物３６−１６の合成
工程１
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ，４２，８７９６―８８０７（２０１４）に記載の方法に従って、化合物２７より２工程で化合物２８を合成した。

工程２
化合物２８（５．０ｇ、７．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に室温でイミダゾール（６９０ｍｇ、１０．１ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ．）、tert-ブチルジメチルシリルクロリド（１．２９ｇ、８．５７ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を順次加え、室温で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝９０：１０：１→６５：３５：１）により精製し、化合物２９（５．５０ｇ、収率９３％）を無色泡状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは１：１のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 778 (M+H).
1H-NMR（CDCl3）δ： 7.68 (d, J=7.5Hz, 1H), 7.62 (d, J=7.5Hz, 1H), 7.58-7.51 (m, 1H), 7.40-7.05 (m, 14H), 6.74-6.63 (m, 5H), 4.61-4.49 (m, 1H), 4.33-4.15 (2m, 1H), 4.12-4.03 (m, 1H), 3.93-3.85 (m, 1H), 3.62 (s, 6H), 3.56 (dd, J=10.7, 5.4Hz, 0.5H), 3.41-3.31 (m, 1H), 3.16 (dd, J=9.0, 4.3Hz, 0.5H), 3.00 (m, 0.5H), 2.90 (m, 0.5H), 2.13-2.02 (m, 1H), 1.97-1.82 (m, 1H), 0.82 (s, 1.5H), 0.81 (s, 3H), 0.779 (s, 3H), 0.787 (s, 1.5H), 0.007 (s, 1.5H), 0.000 (s, 1.5H), -0.015 (s, 1.5H), -0.026 (s, 1.5H).

工程３
化合物２９（２．６３ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）にピペリジン（０．３７９ｍｌ、３．８３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、室温で２時間撹拌した後、減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。メタノール（１０ｍｌ）を加え、生じた析出物をろ別した後、ろ液を濃縮することにより、化合物３０（２．２０ｇ）の粗生成物を得た。
ESI-MS (m/z) : 524 (M+H). HPLC Peak RT = 3.29 min.

工程４
化合物３０（２．２０ｇ、粗製）のジクロロメタン溶液（１５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（３．６５ｍｌ、３６．９ｍｍｏｌ）、アセトキシアセチルクロリド（３．６５ｍｌ、３６．９ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去することにより、化合物３１の粗生成物を得た。
ESI-MS (m/z) : 634 (M+H). HPLC Peak RT = 3.40 min.

工程５
工程４で得られた化合物３１をメタノール（１０ｍｌ）に溶解した後、２８％ナトリウムメトキシド‐メタノール溶液（０．６０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：８０ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝８０：２０：１→６５：３５：１）により精製し、化合物３２（１．４５ｇ、化合物３０からの収率７１％）を無色泡状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは７８：２２のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 592 (M+H). HPLC Peak RT = 3.36 min.
1H-NMR（CDCl3）δ： (Major) 7.39-7.32 (m, 2H), 7.32-7.18 (m, 7H), 6.86-6.79 (m, 4H), 4.73 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.06 (dd, J=15.1, 4.4Hz, 1H), 3.98 (dd, J=15.1, 4.4Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.57 (dd, J=10.0, 4.0Hz, 1H), 3.52 (dd, J=10.0, 6.0Hz, 1H), 3.47 (dd, J=4.4, 4.4Hz, 1H), 3.13 (dd, J=10.0, 2.5Hz, 1H), 3.08 (dd, J=10.0, 5.0Hz, 1H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (ddd, J=13.0, 8.8, 6.0Hz, 1H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H). (Minor) 7.39-7.32 (m, 2H), 7.32-7.18 (m, 7H), 6.86-6.79 (m, 4H), 4.54 (m, 1H), 4.06-3.98 (m, 1H), 3.92 (dd, J=14.6, 4.3Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.68 (dd, J=12.0, 4.0Hz, 1H), 3.62-3.42 (m, 2H), 3.16-3.02 (m, 2H), 2.11 (ddd, J=13.0, 5.8, 4.0Hz, 1H), 2.02 (m, 1H), 0.86 (s, 9H), 0.051 (s, 3H), 0.049 (s, 3H).
工程６
１−１−６）と同様に合成した化合物３−１６（２．００ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６０ｍｌ）懸濁溶液にＤＩＥＡ（３．３６ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ．）を加えた溶液を、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミドクロリド亜りん酸メチル（２．５４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）のジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液に加え、４５℃で１０分間撹拌した。
室温へ放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に空けて、クロロホルムにて抽出した後、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。撹拌しながら、得られた残渣にアセトニトリル（２０ｍｌ）を加えて、白色の目的物を析出させた後、ろ取することにより、化合物３３−１６（２．３６ｇ、収率９４％）を白色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.39 (t, J = 5.5 Hz, 1H, -NH), 6.18 (t, J = 5.5 Hz, 1H, -NH),3.95 (m, 0.5H), 3.67-3.51 (m, 4.5H), 3.42 (s, 1.5H), 3.39 (s, 1.5H), 3.19-3.11 (m, 1H), 3.05-2.97 (m, 1H), 2.30-2.15 (m, 4H), 1.70-1.57 (m, 4H), 1.36-1.23 (m, 56H), 1.23-1.14 (m, 12H), 0.88 (t, J=6.5Hz, 6H). 31P-NMR（CDCl3）δ: 149.06

工程７
化合物３２（７００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）と化合物３３−１６（１．８７ｇ、２．３７ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）が溶解したジクロロメタン（１４ｍｌ）溶液に１Ｈ-テトラゾール（１２４ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え、室温で２時間撹拌した後、０．５Ｍ ＤＤＴＴ溶液（［(ジメチルアミノ−メチリデン)アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアザオリン−３−チオン、４．７３ｍｌ、３−ピコリン：アセトニトリル＝１：１に溶解）を加え、同温度で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：４５ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝７５：２５：１→５０：５０：１）により精製し、化合物３４−１６（１．１９ｇ、収率７９％）を無色泡状物質として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.11 (m, 9H), 6.87-6.78 (m, 4H), 4.94-4.84 (m, 1H), 4.82-4.72 (m, 1H), 4.58-4.43 (m, 2H), 4.38-4.31 (m, 1H), 3.86-3.53 (m, 4H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.33-2.99 (m, 4H), 2.30-1.88 (m, 6H), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.35-1.20 (m, 56H), 0.91-0.84 (m, 15H), 0.08 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

工程８
化合物３４−１６（１．０２ｇ、０．７８０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）に室温で１ｍｏｌ／ｌ テトラブチルアンモニウムフロリド−ＴＨＦ溶液（０．９３７ｍｌ、１．２ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３０ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９７．５：２．５：１→９０：１０：１）により精製し、化合物３５−１６（６０８ｍｇ、収率６５％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.17 (m, 9H), 6.91 (m, 1H, -NH), 6.88-6.78 (m, 5H),5.00-4.35 (m, 5H), 3.85-3.44 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 6H), 3.35-3.06 (m, 4H), 2.31-2.09 (m, 5H), 2.06-1.94 (m, 1H), 1.68-1.52 (m, 4H), 1.36-1.18 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H).

工程９
化合物３５−１６（２１０ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．０７３ｍｌ、０．５２８ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、無水コハク酸（３５ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）、ＤＭＡＰ（４ｍｇ、０．０３３ ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝１００：０：１→９５：５：１）により精製し、化合物３６−１６（１７２ｍｇ、収率７６％）を無色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.38-7.32 (m, 2H), 7.38-7.32 (m, 7H), 6.90-6.76 (m, 4H), 5.42 (br.s, 1H), 5.04-4.39 (m, 4H), 3.87-3.55 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 6H), 3.31-3.07 (m, 4H), 2.65-2.43 (m, 4H), 2.38-2.28 (m, 1H), 2.28-2.08 (m, 5H), 1.67-1.53 (m, 4H), 1.35-1.19 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.5Hz, 6H).
１０）化合物４６−ｎの合成
Figure 2018179172
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１０−１）化合物４６−１６の合成
工程１
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ，４２，８７９６―８８０７（２０１４）に記載の方法に従って、化合物２８より化合物３７を合成した。

工程２
化合物３７（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（１．９８ｍｌ、１４．３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）、無水コハク酸（７５１ｍｇ、７．５１ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→７５：２５：１）により精製し、化合物３８（３．３７ｇ、収率９１％）を無色粉末として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは６３：３７のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 530 (M+H). HPLC Peak RT = 1.86 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.39-7.33 (m, 2H), 7.30-7.22 (m, 6H), 7.22-7.16 (m, 1H), 6.85-6.77 (m, 4H), 4.50 (br.s, 1H), 4.41 (m, 1H), 3.88 (d, J=11.0Hz, 1H), 3.775 (s, 6H), 3.65 (dd, J=11.0, 4.0Hz, 1H), 3.43 (dd, J=9.2, 4.5Hz, 1H),3.14 (dd, J=9.2, 2.7Hz, 1H), 2.85-1.97 (m, 6H). (Minor) 7.39-7.33 (m, 2H), 7.30-7.22 (m, 6H), 7.22-7.16 (m, 1H), 6.85-6.77 (m, 4H), 4.41 (m, 1H), 4.31 (br.s, 1H), 4.11 (d, J=12.3Hz, 1H), 3.783 (s, 6H), 3.25 (dd, J=12.3, 3.5Hz, 1H), 3.18 (dd, J=9.5, 4.8Hz, 1H),3.10 (dd, J=9.5, 4.8Hz, 1H), 2.85-1.97 (m, 6H).

工程３
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，７７８１（２００５）に記載の方法に従って、化合物１より化合物３９を合成した。

工程４
化合物３９（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−水（９：１）の混合溶液（３０ｍｌ）に室温でトリフェニルホスフィン（１．９８ｍｌ、１４．３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、７０℃に昇温し、４時間撹拌した。室温へ放冷後、反応液を減圧下濃縮することにより、化合物４０の粗生成物をを無色油状物として得た。

工程５
化合物４０（７．１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（２．１０ｍｌ、１５．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３．５９ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた固体をｎ−ヘキサン及び少量のクロロホルムにて洗浄した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５→０：１００）により精製し、化合物４１（４．１８ｇ、化合物３９からの収率６５％）を無色泡状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 512 (M+H). HPLC Peak RT = 2.71 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：7.80 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.40 (dd, J=7.5, 7.5Hz, 2H), 7.30 (dd, J=7.5, 7.5Hz, 2H), 6.02 (br.s, 1H), 5.21 (br.s, 2H), 4.46-4.27 (m, 2H), 4.21 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.45-3.29 (m, 2H), 3.27-3.13 (m, 2H), 1.46 (s, 18H).
工程６
化合物４１（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（３０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した後、減圧下濃縮することにより、化合物４２の粗生成物を得た。
ESI-MS (m/z) : 312 (M+H). HPLC Peak RT = 1.00 min.

工程７
化合物４２のジクロロメタン溶液（１０ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（１．１７ｍｌ、８．４４ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ．）、ステアロイルクロリド（９３８ｍｇ、３．１０ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した。生じた白色の析出物をろ取した後、少量のクロロホルム、水、ｎ−ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥することにより、化合物４３−１６（８８８ｍｇ、化合物４０からの収率７５％）を無色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.76 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.34 (d, J=7.5, 7.5Hz, 2H), 7.31 (d, J=7.5, 7.5Hz, 2H), 6.51 (br.s, 2H), 6.39 (br.s, 1H), 4.39-4.26 (m, 2H), 4.21 (m, 1H), 3.68-3.54 (m, 2H), 3.26-3.07 (m, 2H), 2.29-2.18 (m, 4H), 1.70-1.58 (m, 4H), 1.37-1.17 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H).

工程８
化合物４３−１６（８６０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍｌ）にピペリジン（０．１１１ｍｌ、１．１２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、８０℃で１．５時間撹拌した。室温にて２時間静置した後、生じた析出物をろ取し、ｎ−ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール＝９８：２→７５：２５）により精製し、化合物４４−１６（１９８ｍｇ、収率３１％）を無色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.34 (br.s, 2H), 3.48-3.36 (m, 2H), 3.06-2.98 (m, 2H), 2.99 (s, 1H), 2.25-2.18 (m, 4H), 1.70-1.58 (m, 4H), 1.37-1.18 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H).

工程９
工程２で得られた化合物３８（１３４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に室温でＤＩＥＡ（２２５μｌ、１．２９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１２７ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した後、４５℃で化合物４４−１６（２１８ｍｇ、１７．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に加え、４５℃で３０分間撹拌した。反応液を飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、８０℃でｎ−ヘキサンを加えて、目的物を析出させ、ろ取することで化合物４５−１６（２４４ｍｇ、収率８５％）を無色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは６３：３７のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.35-7.32 (m, 2H), 7.31-7.16 (m, 7H), 6.85-6.77 (m, 4H), 6.46 (br.s, 1H, -NH), 4.38 (br.s, 1H), 3.781 (s, 6H), 3.72-3.58 (m, 2H), 3.51-3.36 (m, 2H), 3.28-3.08 (m, 3H), 2.78-2.60 (m, 2H), 2.48-1.98 (m, 7H), 1.64-1.56 (m, 4H), 1.35-1.19 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H). (Minor) 7.35-7.32 (m, 2H), 7.31-7.16 (m, 7H), 6.85-6.77 (m, 4H), 6.46 (br.s, 1H, -NH), 4.53 (br.s, 1H), 3.783 (s, 6H), 3.72-3.58 (m, 2H), 3.51-3.36 (m, 2H), 3.28-3.08 (m, 3H), 2.48-1.98 (m, 7H), 1.64-1.56 (m, 4H), 1.35-1.19 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H).

工程１０
化合物４５−１６（３４０ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．２３７ｍｌ、１．７１ｍｍｏｌ、５．６ｅｑ．）、無水コハク酸（８５ｍｇ、０．８４４ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ．）、ＤＭＡＰ（４ｍｇ）を順次加え、４５℃で２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝１００：０：１→８０：２０：１）により精製した後、ｎ−ヘキサンで洗浄することで化合物４６−１６（２４６ｍｇ、収率６６％）を無色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは７７：２３のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.38-7.31 (m, 2H), 7.31-7.12 (m, 6H), 7.17-7.11 (m, 1H), 7.00 (br.s, 1H), 6.85-6.77 (m, 4H), 6.74 (br.s, 1H, -NH), 5.33 (br.s, 1H), 4.34 (br.s, 1H), 3.90-3.74 (m, 2H), 3.788 (s, 6H), 3.64-3.37 (m, 2H), 3.35-3.11 (m, 2H), 3.11-2.92 (m, 2H), 2.68-2.07 (m, 11H), 1.68-1.51 (m, 4H), 1.37-1.16 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.6Hz, 6H). (Minor) 7.38-7.31 (m, 2H), 7.31-7.12 (m, 6H), 7.17-7.11 (m, 1H), 7.00 (br.s, 1H), 6.85-6.77 (m, 4H), 6.74 (br.s, 1H, -NH), 5.20 (br.s, 1H), 4.17 (br.s, 1H), 3.90-3.74 (m, 2H), 3.678 (s, 6H), 3.64-3.37 (m, 2H), 3.35-3.11 (m, 2H), 3.11-2.92 (m, 2H), 2.68-2.07 (m, 11H), 1.68-1.51 (m, 4H), 1.37-1.16 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.6Hz, 6H).
１１）化合物４９−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１１−１）化合物４９−１６の合成
工程１
９−１）に記載の化合物３４−１６の合成と同様の手法により、化合物４７−１６を、無色泡状物質として得た（収率７８％）。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.34 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.31-7.21 (m, 6H), 7.18 (m, 1H), 6.87-6.79 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 2.25-2.02 (m, 5H), 1.94-1.84 (m, 1H), 1.64-1.49 (m, 4H), 1.33-1.16 (m, 56H), 0.88 (t, J=7.0Hz, 6H), 0.87 (s, 9H), 0.06 (s, 6H).

工程２
９−１）に記載の化合物３５−１６の合成と同様の手法により、化合物４８−１６を無色泡状物質として得た（収率６１％）。
ESI-MS (m/z) : 1177 (M+). HPLC Peak RT = 3.64 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：7.35 (d, J=7.8Hz, 2H), 7.31-7.16 (m, 7H), 6.87-6.78 (m, 4H), 4.98-4.49 (m, 3H), 4.48-4.31 (m, 2H), 3.91-3.44 (m, 5H), 3.78 (s, 6H), 3.37-3.08 (m, 4H), 2.27-2.11 (m, 5H), 2.08-1.94 (m, 1H), 1.66-1.52 (m, 4H), 1.34-1.21 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.7Hz, 6H).

工程３
化合物４８−１６（６２４ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．３３０ｍｌ、２．３９ｍｍｏｌ、４．５ｅｑ．）、無水コハク酸（１０６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、ＤＭＡＰ（１３ｍｇ、１０．６μｍｏｌ、０．２ｅｑ．）を順次加え、室温で１２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９７．５：２．５：１→８０：２０：１）により精製し、化合物４９−１６（４８２ｍｇ、収率７１％）を無色固体として得た。
なお、化合物４９−１６は２種の異性体の混ざりであるが、一部については、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離し、各種機器データを測定した。

化合物４９−１６の異性体１ （クロロホルム：メタノール＝５：１の溶媒で展開したＴＬＣでＲｆ値が大きい異性体） : １Ｈ−ＮＭＲでは６５：３５のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 1277 (M+). HPLC Peak RT = 3.72 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.34 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.31-7.14 (m, 7H), 6.83 (d, J=8.3Hz, 4H), 5.45 (br.s, 1H), 4.75 (dd, J=14.1, 8.3Hz, 1H), 4.55-4.38 (m, 2H), 4.33 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.72-3.48 (m, 4H), 3.44-3.08 (m, 4H), 2.70-2.44 (m, 4H), 2.38-2.14 (m, 6H), 1.68-1.51 (m, 4H), 1.34-1.21 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.7Hz, 6H). (Minor) 7.34 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.31-7.14 (m, 7H), 6.83 (d, J=8.3Hz, 4H), 5.20 (br.s, 1H), 4.84 (m, 1H), 4.55-4.38 (m, 2H), 4.33 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.72-3.48 (m, 4H), 3.44-3.08 (m, 4H), 2.70-2.44 (m, 4H), 2.38-2.14 (m, 6H), 1.68-1.51 (m, 4H), 1.34-1.21 (m, 56H), 0.88 (t, J=6.7Hz, 6H). 31P-NMR（CDCl3）δ: 58.1

化合物４９−１６の異性体２ （クロロホルム：メタノール＝５：１の溶媒で展開したＴＬＣでＲｆ値が小さい異性体）
ESI-MS (m/z) : 1277 (M+). HPLC Peak RT = 3.72 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：7.83 (br.s, 1H), 7.37-7.10 (m, 9H), 6.74 (d, J=8.6Hz, 4H), 5.30 (br.s, 1H), 4.62 (dd, J=14.0, 9.2Hz, 1H), 4.42-4.33 (m, 2H), 4.30 (dd, J=14.0, 9.2Hz, 1H), 3.71 (s, 6H), 2.63-2.34 (m, 4H),2.31-2.21 (m, 1H), 2.16-2.03 (m, 5H), 1.59-1.42 (m, 4H), 1.24-1.09 (m, 56H), 0.81 (t, J=6.7Hz, 6H). 31P-NMR（CDCl3）δ: 57.3
１２）化合物５０−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１２−１）化合物５０−１６の合成
４）の固相樹脂への担持反応と同様の条件に、９−１）で得られた化合物３６−１６を付すことで化合物５０−１６を得た。化合物３６−１６の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が３２ｕｍｏｌ／ｇの化合物５０−１６を得た。
なお、同様の方法により、化合物４９−ｎを固相樹脂へ担持させることができる。
１３）化合物５１−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１３−１）化合物５１−１６の合成
４）の固相樹脂への担持反応と同様の条件に、１０−１）で得られた化合物４６−１６を付すことで化合物５１−１６を得た。化合物４６−１６の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が３３ｕｍｏｌ／ｇの化合物５１−１６を得た。
１４）化合物５５の合成
Figure 2018179172
４）の固相樹脂への担持反応と同様の条件に、米国特許出願公開第２００８／００８５８６９号明細書に記載されている化合物５４を付すことで化合物５５を得た。化合物５４の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が９０ｕｍｏｌ／ｇの化合物５５を得た。
１５）化合物６３−ｎの合成
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
１５−１）化合物６３−１８の合成
工程１
化合物５７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．５１７ｇ、０．９５２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４．９ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．４４７ｍＬ、３．４６ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（３４９ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。その後、化合物１７（０．４８８ｇ、０．８６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を加えて一晩撹拌した。ヘキサン／酢酸エチル＝１：１（２ｘ５０ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で分液抽出操作をした後に有機層を合わせて飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後にロータリーエバポレータ―で減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→７０：３０）で精製し、化合物５８（０．８３７ｇ、８５％）を無色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.75 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.42-7.38 (4H, m), 7.32-7.28 (7H, m), 7.24 (1H, s), 7.18 (1H, t, J = 7.3 Hz), 6.81 (4H, d, J = 8.9 Hz), 6.49 (1H, s), 6.08 (1H, s), 5.56 (1H, s), 4.39 (2H, d, J = 6.9 Hz), 4.21 (1H, t, J = 6.7 Hz), 3.79 (6H, s), 3.63-3.52 (15H, m), 3.34-3.28 (4H, m), 3.14 (2H, dd, J = 13.9, 6.4 Hz), 3.03 (2H, d, J = 5.6 Hz), 1.80-1.65 (5H, m), 1.63 (4H, s), 1.43-1.36 (2H, m), 1.31-1.26 (2H, m), 1.18-1.12 (2H, m), 0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s).

工程２
化合物５８（８００ｍｇ、０．７３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８ｍＬ）にピペリジン（８０ｕＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。ヘキサン／酢酸エチル＝１：４と水で分液抽出を行い、無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。ろ過の後にロータリーエバポレータ―で減圧濃縮した。アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９７：３）で精製し、化合物５９（０．１７８ｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）を無色オイル状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37 (8H, dt, J = 50.4, 5.2 Hz), 7.26-7.18 (2H, m), 6.89 (1H, s), 6.82 (4H, t, J = 5.9 Hz), 6.25 (1H, t, J = 5.1 Hz), 3.81 (6H, s), 3.66-3.53 (15H, m), 3.35 (2H, q, J = 6.0 Hz), 3.16 (2H, dd, J = 13.9, 6.5 Hz), 3.04 (2H, d, J = 5.5 Hz), 2.80 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.80-1.17 (17H, m), 0.85 (9H, s), 0.03-0.01 (6H, m).

工程３
化合物３−１８（１４０ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（６３ｍｇ、０．５１４ｍｍｏｌ）をフラスコ内で細かく砕いた後にＴＨＦ溶液（１．８ｍＬ）とした。ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１５６ｍｇ、０．５１４ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で３０分間撹拌した。室温まで冷却したのちに、ＴＨＦを減圧留去し、再度アセトニトリル（１０ｍＬ）に懸濁した。加熱してほぼ溶液化したのちに、室温まで冷却したところで固体が析出したので、超音波破砕を加えて析出を促進した。析出した固体をろ取し、アセトニトリル（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、アセトニトリル（１０ｍＬ）の順に洗浄を行い、最後に真空下で乾燥することで化合物１８−１８（１９６ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た。化合物１８−１８（１９６ｍｇ）をＴＨＦ（１．８ｍＬ）に溶解し、化合物５９（１７８ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で２時間撹拌した。室温まで冷却すると固体が析出したので、アセトニトリル（１８ｍＬ）を加えて加熱及び超音波破砕を行い、最後に水（１．８ｍＬ）を加えて桐山ろ過によって目的化合物６０−１８（２５１ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た。
工程４
化合物６０−１８（２４６ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．９ｍＬ）を氷冷し、ＴＢＡＦ溶液（１Ｍ ＴＨＦ溶液、４９５ｕＬ、０．４９５ｍｍｏｌ）を加え、室温まで昇温しながら３０分間撹拌した。溶媒を減圧留去したのちに、得られた粗製物をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムのみ）で精製し、化合物６１−１８（１９２ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）を無色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.30 (5H, dd, J = 8.9, 2.1 Hz), 7.21 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.83 (5H, d, J = 8.7 Hz), 6.76 (1H, t, J = 6.2 Hz), 6.44 (1H, t, J = 6.6 Hz), 5.63 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.72-4.66 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.76-3.74 (1H, m), 3.64-3.48 (17H, m), 3.39-3.14 (6H, m), 3.06 (2H, dd, J = 9.0, 7.6 Hz), 2.76 (1H, t, J = 5.8 Hz), 2.50-2.46 (6H, m), 2.19 (6H, t, J = 7.6 Hz), 1.79-1.73 (7H, m), 1.49-1.42 (6H, m), 1.24 (68H, d, J = 11.8 Hz), 0.89-0.87 (6H, t, J = 6.3 Hz).

工程５
化合物６１−１８（１９１ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１．９ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．０６９ｍＬ、０．３９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（２０ｍｇ、０．１９７ｍｍｏｌ）を加えて３時間還流しながら撹拌した。溶媒を減圧留去し、ジオールシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムのみ）で精製して化合物６２−１８（２０１ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）を無色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.30 (5H, d, J = 8.7 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (5H, d, J = 8.7 Hz), 6.74 (1H, t, J = 5.8 Hz), 6.26 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.55 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.72-4.67 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.58-3.49 (17H, m), 3.32-3.27 (6H, m), 3.14 (2H, q, J = 6.5 Hz), 3.04 (2H, d, J = 5.4 Hz), 2.49-2.46 (4H, m), 2.20 (5H, t, J = 7.5 Hz), 1.76-1.72 (4H, m), 1.65-1.62 (10H, m), 1.42-1.41 (3H, m), 1.25 (68H, s), 0.88 (6H, t, J = 6.6 Hz).

工程６
化合物６２−１８（１５３ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶液（１：１、１０ｍＬ）とし、ＤＩＥＡ（０．０６７ｍＬ、０．３９２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（４１ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分間振とう撹拌した。反応液へＮａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ ｌｃａａ ＣＰＧ １０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）（１．０ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで２回、ジクロロメタンで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＣＰＧにＣａｐＡ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８４００４５−０６）とＣａｐＢ（ＰＲＯＬＩＧＯ社、Ｌ８５００４５−０６）の混合液（１：１、２０ｍＬ）を加えて３０分間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＣＰＧをアセトニトリルで２回、ジクロロメタンで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物６２−１８の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色により算出し、担持量が５６ｕｍｏｌ／ｇの化合物６３−１８を得た。
Ｂ） オリゴヌクレオチドの合成
本明細書の実施例に利用したオリゴヌクレオチドはＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＮＳ−８−Ｉ（大日本精機)、ＮＳ−８−ＩＩ（大日本精機）を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは上記アミダイト合成で得られたアミダイトを用いて、０．１Ｍアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は３２秒〜１０分間とし、１つのモノマーの縮合に８〜１０当量のアミダイト体を用いた。ＰＯ酸化には０．０２Ｍ Ｏｘｉｄｉｚｅｒ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化には５０ｍＭ ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオン）のアセトニトリル／３−ピコリン１／１（ｖ／ｖ）、１／４（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。活性化剤はＥＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５−エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、キャッピング試薬はＣａｐＡ、ＣａｐＢ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。脱トリチル化試薬はＤｅｂ（３ｗ／ｖ％ＴＣＡ ＣＨ２Cｌ２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（和光純薬）、Ｄｅｂ（３ｗ／ｖ％ Ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｎ ａｃｉｄ、Ｔｏｌｕｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。
なお、ＳＥＱ−３２１、ＳＥＱ−３２３、ＳＥＱ−３４０、ＳＥＱ−３４３、ＳＥＱ−３４６、ＳＥＱ−３４９、ＳＥＱ−３５２、ＳＥＱ−３５５、ＳＥＱ−３５８は、ジーンデザイン社に化合物２２−１８を供与し、核酸合成及びオリゴヌクレオチドの精製を委託することで得た。ＳＥＱ−３１６の合成に用いるＤＭＴ−ブタンジオール ホスホロアミダイトに関してはＣｈｅｍＧｅｎｅ社より購入した。
Ｃ） 脂質結合オリゴヌクレオチドの合成
１）合成アミダイト体からの合成
Ｂｉｏｔａｇｅ社製マイクロウェーブチューブ（２−５ｍｌ、１０−２０ｍｌ）に撹拌子、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｅｖｅｓ ４Ａ １／１６、上記Ａ）で合成した合成アミダイト（例えば、化合物４−ｎ、化合物４−ｎ，ｏ、化合物８−ｎ、化合物１０−ｎ等。オリゴヌクレオチドの１０〜１００等量）を入れ、クロロホルム（安定化剤として２−メチル−２−ブテン添加）で０．２Ｍに調製した。５時間乾燥後、オリゴヌクレオチドが結合した固相（ＣＰＧ樹脂、ポリスチレン樹脂）、０．２５Ｍ ＥＴＴ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５−エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール）ジクロロメタン溶液（クロロホルムと同量）を加え密閉し、４０℃で１０分〜１時間加熱した。室温へ放冷後、反応溶液をクロロホルムで２倍希釈し、樹脂をろ取した。得られた樹脂をＮＳ−８−Ｉ（大日本精機)、ＮＳ−８−ＩＩ（大日本精機）上でＰＳ酸化した。その後乾燥した樹脂を下記の脱保護条件Ｉ、ＩＩに付し、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
２）脂質を担持した樹脂からの合成
上記Ａ）で合成した脂質を担持した樹脂（例えば、化合物１５−ｎ、化合物２２−ｎ、化合物５０−ｎ、化合物５１−ｎ、化合物５５、化合物６３−ｎ等）を用いて、上記Ｂ）と同様の方法で望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
Ｄ）脱保護
１） 樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護
ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しは２８％アンモニア水（ＳＥＱ−１、３又は４９）又は２８％アンモニア水／ＥｔＯＨ４／１（ｖ／ｖ）（ＳＥＱ−１、３及び４９以外の実施例記載の一本鎖オリゴヌクレオチド）を用いて、室温下で１時間、５５℃で５時間振とうした。１μｍｏｌ合成の際は、アンモニア溶液を１ｍｌ用い、５μｍｏｌ又は１０μｍｏｌ合成の際は、５ｍｌ、１０ｍｌそれぞれ用いて切り出し反応を行った。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で１〜５ｍＬ程度まで濃縮した。
なおＲＮＡを含む配列の場合は、得られた溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た後に、別途下記の２’−ＴＢＳ基の脱保護反応を行った。
２）２’−ＴＢＳ基の脱保護
得られた白色粉末に、Ｎ−メチルピロリドン／トリエチルアミン／３−フッ化水素トリエチルアミン＝６／１／２（ｖ／ｖ）を加えて６５℃下で１．５時間撹拌した。反応液に同量のエトキシトリメチルシランを加えて室温下で１０分間激しく撹拌すると沈殿物が得られた。２５００ｘｇ（２分間）にて遠心分離後、有機溶媒層を注意深く除去した。得られた沈殿物にジエチルエーテルを加えて激しく撹拌後、同様に遠心分離を行い有機溶媒を除去して、粗ＲＮＡ体（白色固体）を得た。
Ｅ）精製
ＳＥＱ−１、３又は４９等脂質リガンドを導入していないオリゴヌクレオチドは条件１の逆相ＨＰＬＣで精製を行った。

逆相ＨＰＬＣの条件
条件１
移動相 Ａ液：１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．０）水溶液あるいは１００ｍＭ ＡｃＯＮａ水溶液（ｐＨ５．４）
Ｂ液：アセトニトリル
Ｂ濃度グラジエント：１０−３０％
（条件１−１）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（ＹＭＣ社製）１００ｘ２０ｍｍＩ．Ｄ．、Ｓ−５ μｍ、１２ ｎｍ
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ

（条件１−２）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（ＹＭＣ社製）１５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、Ｓ−５ μｍ、１２ ｎｍ
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ

脂質リガンドを導入した一本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ−１、３及び４９以外の実施例記載の一本鎖オリゴヌクレオチド）は条件２の逆相ＨＰＬＣで精製を行った。
条件２
逆相ＨＰＬＣの条件
化合物の脂溶性に応じ、開始時のＢ濃度を２０％〜５０％まで調節した
移動相 Ａ液：１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．０）水溶液あるいは１００ｍＭ ＡｃＯＮａ水溶液（ｐＨ５．４）
Ｂ液：アセトニトリル
Ｂ濃度グラジエント：２０−８０％（Ｌ４−８、Ｌ４−１０を有する化合物）、３０−６０（ＬＴｏｃ、Ｌｃｈｏｌを有する化合物）、３０−８０％（Ｌ４−１２、Ｌ４−１４、Ｌ４−１６、Ｌ４−１８、Ｍ２２−１２、Ｍ５１−１６を有する化合物）、４０−８０％（Ｌ４−２０、Ｌ４−２２を有する化合物）、５０−８０％（Ｍ２２−１８を有する化合物）
（条件２−１）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４（ＹＭＣ社製）１００ｘ２０ｍｍＩ．Ｄ．、Ｓ−５ μｍ、１２ ｎｍ
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ

（条件２−２）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４（ＹＭＣ社製）１５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、Ｓ−５ μｍ、１２ ｎｍ
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ
Ｆ）精製オリゴヌクレオチドの脱塩及び凍結乾燥
得られたオリゴヌクレオチドはＶｉｖａＳｐｉｎ２０（ＭＷＣＯ ３０００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）−４ 遠心式フィルターユニット−３Ｋを用いて、限外濾過を繰り返すことでフラクションに含まれる塩成分を除去した。その後、凍結乾燥にて目的とするオリゴヌクレオチドを粉末として得た。なお、ＴＥＡＡ溶媒を用いて精製したオリゴヌクレオチドに対しては１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で塩フォームの変換を行った後に脱塩操作を行った。
Ｇ）オリゴヌクレオチドの純度分析
得られたオリゴヌクレオチドは、ＵＰＬＣ／ＭＳ測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。
条件１（ＳＥＱ−１、３又は４９）
Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｔｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｑｕｉｔｙ ＯＳＴ Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相 Ａ液：２００ｍＭ １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン
Ｂ液：メタノール
Ｂ濃度グラジエント：１０−３０％（１０ｍｉｎ）
温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ

条件２（ＳＥＱ−１、３及び４９以外の実施例記載の一本鎖オリゴヌクレオチド）
Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｔｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔａｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ Ｃｏｌｕｍｎ、３００Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１／ｐｋｇ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相 Ａ液：２００ｍＭ １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン
Ｂ液：メタノール
Ｂ濃度グラジエント：１０−９５％（１０ｍｉｎ）
温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
結果を表１〜３に示す。
Figure 2018179172
Figure 2018179172
Figure 2018179172
Ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチドの調製
本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドの１００μＭ水溶液を等モル量混合した後、その後７５℃下で５分間加温後、室温まで自然冷却させることで二本鎖核酸を得た。二本鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−ＰＡＣ Ｄｉｏｌ−１２０（４．６ｘ３００ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
移動相：４０％アセトニトリル含有１ｘＰＢＳ溶液
流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：室温
合成したオリゴヌクレオチドを表４〜２７に示す。
Figure 2018179172
Figure 2018179172
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Figure 2018179172
Figure 2018179172
Figure 2018179172
Figure 2018179172
表４〜２７において、ｎ（小文字）はＤＮＡ、ｎＯＭｅは２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、Ｎ（大文字）はＲＮＡ、ＮＦは２’−ｄｅｏｘｙ−２’−Ｆ−ＲＮＡ、ＮＬＮＡはＬＮＡ、５ｍＣは５−メチルシトシンを示す。＾は−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−を、記号がない場合は―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−を意味する。
Figure 2018179172
Ｌはオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の５’末端に導入した化合物を意味し、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基に対して各化合物が表記の結合で共有結合していることを示す。Ｍはオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の３’末端に導入した化合物を意味し、オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基に対して各化合物が表記の結合で共有結合していることを示す。なお、Ｌｘ−ｎにおいて、ｘは二本鎖を示す化合物４−ｎ若しくは化合物１０−ｎ、又は一本鎖を示す化合物８−ｎの構造に準ずる数字であり、ｎは炭素鎖に応じた６〜２８の整数である。Ｍｘ−ｎにおいて、ｘは二本鎖を示す化合物２２−ｎ、化合物４９−ｎ、若しくは化合物５１−ｎあるいは一本鎖を示す化合物１５−ｎの構造に準ずる数字であり、ｎは炭素鎖に応じた６〜２８の整数である。
具体的には、Ｌｘ−ｎは、以下で示される基である。
Figure 2018179172

（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
なお、Ｌ４−ｎは上記Ａ）の１−１）で合成した化合物４-ｎから誘導される基である。Ｌ８−ｎは上記Ａ）の２）で合成した化合物８-ｎから誘導される基である。Ｌ１０−ｎは上記Ａ）の３）で合成した化合物１０−ｎから誘導される基である。
表中のＬｃｈｏｌ又はＬＴＯＣは、それぞれ以下で示される基である。
Figure 2018179172
 なお、Ｌｃｈｏｌは上記Ａ）の８−１）で合成した化合物２６から誘導される基である。ＬＴｏｃはリンクテクノロジーズ社から購入した化合物５’−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−ＣＥ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅから誘導される基である。
表中のＬｆａｒｌは、以下で示される基である。
Figure 2018179172
Ｌｆａｒｌは上記Ａ）の８−２）で合成した化合物５３から誘導される基である。
Ｍｘ−ｎは、以下で示される基である。
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
なお、Ｍ１５−ｎは上記Ａ）の４）で合成した化合物１５-ｎから誘導される基、Ｍ２２−ｎは上記Ａ）の６）で合成した化合物２２-ｎから誘導される基、Ｍ４９−ｎは上記Ａ）の１１）で合成した化合物４９-ｎから誘導される基、Ｍ５１−ｎは上記Ａ）の１３）で合成した化合物５１-ｎから誘導される基である。
表中のＭｃｈｏｌは、以下で示される基である。
Figure 2018179172
Ｍｃｈｏｌは、上記Ａ）の１４）で合成した化合物５５から誘導される基である。
表中のＭＴＥＧ−ｎは、以下で示される基である。
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
ＭＴＥＧ−ｎは、上記Ａ）の１５）で合成した化合物６３−ｎから誘導される基である。
表中のＫ２２−ｎは、以下で示される基である。
Figure 2018179172
（式中、ｎは６〜２８の整数である。）
Ｋ２２−ｎは、上記Ａ）の６）で合成した化合物２２−ｎから誘導される基である。
なお、Ｓ−１５５、Ｓ−１８４及びＳ−１８６には、下記リンカー（表中の＾Ｂｕ＾Ｂｕ＾）を利用した。
Figure 2018179172
実施例２ レポーターアッセイによる本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの活性評価
（材料及び方法）
レポーターアッセイに用いたＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ９ ｃｅｌｌｓ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）はＨＥＫ２９３細胞にヒトＴＬＲ９遺伝子とＮＦ−ｋＢ・ＡＰ−１結合領域配列に分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子を結合したレポーター遺伝子が導入され、それぞれが安定して発現する細胞である。アルカリフォスファターゼに対する基質を含むＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＭ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁した本細胞３．６×１０４細胞を９６ウェルプレートに播種し、３ｎＭ〜３０μＭの本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチド、既知のＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２００６、ＳＥＱ−４９）、特許文献１の設計に基づくアジュバント、つまり、脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―１４２、１４３又は１４４）を添加した。３７℃、５％ＣＯ２ インキュベーター内で１６時間培養後、発色した培養上清を用いて６２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた値はＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアにより解析し、それぞれのオリゴヌクレオチドの５０％活性化濃度（ＥＣ５０）を算出した。
(結果)
ｓｓＣｐＧ ＯＤＮを第１の鎖と第２の鎖としてアニーリングすることにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＣｐＧ ＯＤＮ）として投与するとアジュバントとしての特性が失われることが知られている（非特許文献４）ことはすでに述べたとおりである。当該二重鎖核酸アジュバント設計がＴＬＲ９アゴニストとして活性を示すかを検討するために、レポーターアッセイによる二本鎖オリゴヌクレオチドの活性評価を行った。
表２８及び表２９に示されるようにｓｓＣｐＧ ＯＤＮであるＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）はＴＬＲ９アゴニストとして活性を示し、そのＥＣ５０値は約４６７ｎＭ（試験１、表２８）、約２４５ｎＭ（試験２、表２９）であった。これに対してＣｐＧオリゴヌクレオチドとしてＯＤＮ２００６を含む本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドの活性評価を行ったところ、数十〜千数百ｎＭ範囲でＴＬＲ９アゴニスト活性を示した。表２８及び表２９に記載の本発明のアジュバントの多くはＯＤＮ２００６と比較して活性向上の傾向にあった。また、ＳＥＱ−５７、ＳＥＱ−５９、ＳＥＱ−６１、ＳＥＱ−６３、ＳＥＱ−６５、ＳＥＱ−１１１、ＳＥＱ−１１７、ＳＥＱ−１３５、ＳＥＱ−１４６、ＳＥＱ−２２６、ＳＥＱ−２８２、ＳＥＱ−２８４、ＳＥＱ−２９４、ＳＥＱ−３２４、ＳＥＱ−３６１、ＳＥＱ−３６３の１６配列に関してもＯＤＮ２００６と比較して、若干活性低下の傾向ではあるがその差は３倍程度のとどまったため、いずれの本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドもＴＬＲ９アゴニストとして活性を示すことが明らかとなった。
また特許文献１記載のＳＥＱ−２の修飾様式をヒト型のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列であるＯＤＮ２００６に適用した場合、ＴＬＲ９アゴニストとして活性を示すか検討するため、同様に活性評価を行った（ＳＥＱ−１４１、１４２又は１４３）。ＳＥＱ−１４２、１４３又は１４４は、測定した濃度域においてＴＬＲ９の活性化を誘導することができず、ＥＣ５０値の算出が不可能であった（表２８中のｎ．ｄ．）。このことから特許文献１記載の設計（脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ）は該実施例に示されるようにＯＤＮ１８２６（マウス型）において活性を示すが、ＯＤＮ２００６（ヒト型）では活性を示さず、ワクチンのアジュバント及び／又はワクチンそのものとして利用できない設計であることが示唆された。
それに対し、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ１８２６だけでなく、ＯＤＮ２００６においても活性を示すことから、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの配列に関わらずワクチンのアジュバント及び／又はワクチンそのものとして利用可能であることが示唆された。
試験１
Figure 2018179172
試験２
Figure 2018179172
表３０に示されるようにOＤＮ２００６以外のＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた場合でも、本発明のアジュバントの多くはｓｓＣｐＧ ＯＤＮと比較して活性向上の傾向が見られた。いずれの本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドもＴＬＲ９アゴニストとして活性を示すことが明らかとなった。
Figure 2018179172
実施例３ 本発明のアジュバントのＩｎ ｖｉｖｏ評価
Ａ）ＣＴＬ誘導活性の評価
(動物)
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス(６〜８週齢)を日本クレアから導入した。

（ワクチン１の成分）
・ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号：２２）：ＳＩＧＭＡが合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製したものを購入した。
・本発明のアジュバント又は既知のＣｐＧ ＯＤＮ

（ワクチン２の成分）
・ＴＲＰ２１８０−１８８ペプチド（ＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬ、配列番号：２３）：ＳＩＧＭＡが合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製したものを購入した。
・本発明のアジュバント又は既知のＣｐＧ ＯＤＮ

（ワクチン３の成分）
・ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド又はＴＲＰ２１８０−１８８ペプチド
・Ｍｏｎｉｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ社）
（ワクチン１調製）
マウスに７日ごとの２回のワクチン接種により特異免疫の成立を行った。それぞれのワクチンは１００μｇのＯＶＡペプチドと１．５７又は４．７１ｎｍｏｌの本発明のアジュバント又は既知のＣｐＧ ＯＤＮを１×ＰＢＳ中に溶解したものである。作成したワクチン１００μＬをマウス側腹部に皮下投与した。

（ワクチン２調製）
マウスに７日ごとの２回のワクチン接種により特異免疫の成立を行った。それぞれのワクチンは１００μｇのＴＲＰ２ペプチドと１．５７又は４．７１ｎｍｏｌの本発明のアジュバント又は既知のＣｐＧ ＯＤＮを１×ＰＢＳ中に溶解したものである。作成したワクチン１００μＬをマウス側腹部に皮下投与した。

（ワクチン３調製）
２ｍｇ／ｍｌにＰＢＳで調整したＴＲＰ２ペプチドと１：１の割合でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（上記ワクチン成分３）を注射筒とポンピングコネクターを用いて混和してエマルションを作成した。作成されたワクチンエマルション１００μＬをマウス側腹部に７日ごとに２回皮下投与した。
(テトラマー染色)
２回目のワクチン接種から７日後に採血を行い、赤血球をＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ （ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により除去し、次にＦＡＣＳ緩衝液（１％ウシ胎仔血清、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）に懸濁し、抗マウスＣＤ１６／３２モノクローナル抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を添加し、３０分、４℃におくことによりＦｃレセプターのブロッキングを行った。次にワクチン抗原に対応したＰＥ標識Ｈ−２Ｋｂテトラマー（Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ−２Ｋｂ ＯＶＡ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ 又は Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ−２Ｋｂ ＴＲＰ−２ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ；いずれも医学生物学研究所より購入）とＡｌｅｘａ６４７標識抗ＣＤ８抗体（医学生物学研究所）を添加し、４５分室温におくことにより染色を行った。次にＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、ＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ ｖｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて解析した。解析はＤＡＰＩの陰性画分をゲーティングしたのち、前方散乱と側方散乱を指標により白血球画分を規定した。白血球画分の内、Ａｌｅｘａ６４７−ＣＤ８・ＰＥ−Ｈ−２Ｋｂ Ｔｅｔｒａｍｅｒの両陽性細胞をＣＴＬと規定して、白血球中におけるＣＴＬの割合で評価した。

ＣＴＬ誘導率の指標の算出法
実験ごとに各群の平均ＣＴＬ誘導率を算出後、対照化合物であるｓｓＣｐＧ ＯＤＮ、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）及びＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）のＣＴＬ誘導率の平均値に対する比を算出した。
ＯＤＮ１８２６を含むアジュバントの場合
（アジュバント群のＣＴＬ誘導率の平均）／（ＯＤＮ１８２６群のＣＴＬ誘導率の平均）＝平均値に対する比

ＯＤＮ２００６を含むアジュバントの場合
（アジュバント群のＣＴＬ誘導率の平均）／（ＯＤＮ２００６群のＣＴＬ誘導率の平均）＝平均値に対する比

ｓｓＣｐＧ ＯＤＮのＣＴＬ誘導率を１とした場合の各アジュバントのＣＴＬ誘導率を示すため、数値が大きくなるほどＣＴＬ誘導率が高いことを示す。
Ｂ） 本発明のアジュバントを用いたＴＲＰ２ペプチドワクチンの抗腫瘍効果の評価
ＴＲＰ２ペプチドワクチンによる免疫成立後、ＴＲＰ２蛋白を発現するマウスメラノーマであるＢ１６Ｆ１０細胞（ＡＴＴＣ社）を皮下移植することにより抗腫瘍効果の評価を行った。実施例３Ａ）と同様の手法により７日ごと２回のワクチン投与により免疫が成立したマウスの末梢血中テトラマー陽性率を観察した翌日にＢ１６Ｆ１０細胞（１×１０５細胞／マウス）を右側肩部に皮下移植した。生着した腫瘍の長径と短径を２〜３日おきに測定し、
（長径×短径２）／２
の計算式により腫瘍の体積を算出した。

抗腫瘍効果の指標の算出法
ＯＤＮ１８２６を含むアジュバントの場合
１００−（アジュバント群の平均腫瘍サイズ）／（ＯＤＮ１８２６群の平均腫瘍サイズ）

ＯＤＮ２００６を含むアジュバントの場合
１００−（アジュバント群の平均腫瘍サイズ）／（ＯＤＮ２００６群の平均腫瘍サイズ）

数値の大きな化合物ほど強い抗腫瘍活性を有することを示す。
（ＣｐＧオリゴヌクレオチドとしてＯＤＮ１８２６を用いた結果）
結果１−Ａ：本発明のアジュバントと既知アジュバントのＣＴＬ誘導率の比較
ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）及びＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、ＴＲＰ２特異的なＣＴＬが誘導された。ｄｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―４）を用いた場合、ＴＲＰ２特異的なＣＴＬ誘導率はＯＤＮ１８２６と比較して、０．４６倍に低下した。つまり、二本鎖にすることによって、一本鎖アジュバントと比較してＣＴＬ誘導率が低下する結果となった。このことから非特許文献４等に記載の通り、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単純に二本鎖にするだけでは免疫賦活活性は低下することが分かった。一方で、本発明のアジュバント、つまり、脂質を結合した二本鎖オリゴヌクレオチドアジュバント（ＳＥＱ―１６）を用いて免疫したところ、ＯＤＮ１８２６と比較して、ＣＴＬ誘導率が１．４６倍に向上した。よって、本発明のアジュバントに、予想もしない活性向上が見られることが分かった。結果を表３１に示す。
Figure 2018179172
結果１−Ｂ：本発明のアジュバントと既知アジュバントの抗腫瘍効果の比較
ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）及びＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果はほとんど見られなかった。また、ｄｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―４）を用いた場合にも、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果はほとんど見られなかった。一方で、本発明のアジュバント（ＳＥＱ―１６）を用いた場合、移植後１４日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して４３％という強力なＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果及び増殖抑制効果を示した。結果を図１に示す。
結果２-Ａ，Ｂ：脂質リガンドの炭素数が異なる本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率及び抗腫瘍効果
１０個〜２０個の炭素原子を含むアシル鎖を２本含む脂質をリガンドとして有する本発明のアジュバントの活性を、ＯＶＡペプチドを用いて調べた。ＳＥＱ−１２（１０個の炭素原子）ではＣＴＬの誘導率及び腫瘍の抑制率がＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）と比較して低下することが分かった。一方でＳＥＱ−１４（１４個の炭素原子）、ＳＥＱ−６（１８個の炭素原子）、ＳＥＱ−１６（２０個の炭素原子）と鎖長を伸長するにつれてＣＴＬ誘導率が向上する傾向が見られた。さらに腫瘍の抑制率においてもＳＥＱ−１４においてその腫瘍の増殖を移植後１４日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して９４％程度抑制し、ＳＥＱ−６及びＳＥＱ−１６に至っては移植後１４日目においても、腫瘍の増殖を完全に抑制した。結果を表３２に示す。
Figure 2018179172
結果３−Ａ：両末端への脂質の導入した本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
２０個の炭素原子を含むアシル鎖を２本含む脂質をリガンドとして有するＣｐＧオリゴヌクレオチド３’末端に８個又は１２個の炭素原子を含む一本鎖脂質をさらに導入した本発明のアジュバント（ＳＥＱ―４６及びＳＥＱ―４８）の活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて調べた。ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）と比較して、ＣＴＬの誘導率が、ともに約２．８倍向上した。結果を表３３に示す。
Figure 2018179172
結果３−Ｂ：両末端への脂質の導入した本発明のアジュバントの抗癌効果
本発明のアジュバント、ＳＥＱ―４６又はＳＥＱ―４８と、ＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、移植後１３日目において、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）と比較して、それぞれ５２％、４３％という強いＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果及び増殖抑制効果を示した。結果を図２に示す。
結果４−Ａ：相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
二本鎖オリゴヌクレオチドアジュバント設計において、活性本体であるＣｐＧオリゴヌクレオチドをリンパ節で放出する必要がある。二本鎖のかい離の速度はその二本鎖の熱的な安定性に比例しており、二本鎖構造の相補部位が多いほど二本鎖として安定に存在する。そこで、相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバントの活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて調べた。ＯＤＮ１８２６（２０ｍｅｒ）に対し、相補鎖が１０ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が５０％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−８）及び相補鎖が１５ｍｅｒ、つまり、７５％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−１０）を用いた。ＳＥＱ−８では約１．２倍、ＳＥＱ−１０では２．５倍と、ともにＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）と比較して優位にＣＴＬ誘導を向上させた。結果を表３４に示す。
Figure 2018179172
結果４−Ｂ：相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバントの抗癌効果
特許文献１記載の脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―２）とＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、腫瘍抑制率は、移植後１２日目において、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）と比較して、約３．５％であった。一方で、本発明のアジュバントである、１０ｍｅｒの相補鎖を有するＳＥＱ−８は、移植後１２日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して、約５０％の腫瘍抑制率を示した。さらに１５ｍｅｒの相補鎖を有するＳＥＱ−１０は、移植後１２日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して約７６％という強力なＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果及び増殖抑制効果を示した。結果を図３に示す。
結果５-Ａ：相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
ＯＤＮ１８２６（２０ｍｅｒ）に対し、相補鎖の鎖長が１０ｍｅｒから２０ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が５０〜１００％である本発明のアジュバントの活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて調べた。相補鎖が１４ｍｅｒ（ＳＥＱ−２８）、１５ｍｅｒ（ＳＥＱ−２６）、１７ｍｅｒ（ＳＥＱ−２２）、１９ｍｅｒ（ＳＥＱ−１８）及び２０ｍｅｒ（ＳＥＱ−１６）のアジュバントは、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）と比較してＣＴＬ誘導率の向上が見られた。特に、１９ｍｅｒ（ＳＥＱ−１８）、１７ｍｅｒ（ＳＥＱ−２２）及び１５ｍｅｒ（ＳＥＱ−２６）のアジュバントではＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）に対して３倍程度のＣＴＬの誘導が見られた。結果を表３５に示す。
Figure 2018179172
結果６−Ａ：モンタナイドとのＣＴＬ誘導率の比較
ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ−１）、脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―２）、本発明のアジュバント（ＳＥＱ−２６）、ペプチドワクチンのアジュバントとして臨床治験において多く用いられているアジュバントであるモンタナイドの活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて比較した。ＳＥＱ−２及びＳＥＱ−２６は、ＯＤＮ１８２６と比較して高いＣＴＬ誘導率を示した。一方でモンタナイドのＣＴＬ誘導率はＯＤＮ１８２６と比較して７分の１に低下した。結果を表３６に示す。
Figure 2018179172
結果６−Ｂ：脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮとの抗腫瘍効果の比較
本発明のアジュバント、ＳＥＱ―２６とＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、移植後１２日目において、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）と比較して、７６．８％非常に強力なＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―２）の腫瘍抑制率は移植後１２日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して、６４．３％であった。つまり、本発明のアジュバントは、ＳＥＱ−２のアジュバントより強いＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。一方でモンタナイドをアジュバントとして用いた場合、まったく抗腫瘍活性を示さなかった。結果を図４に示す。
結果７−Ａ：相補鎖の核酸モノマーの種類が異なる本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
相補鎖の核酸モノマーが、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ―ＲＮＡ又は２’−Ｆ―ＲＮＡである本発明のアジュバントの活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて調べた。核酸モノマーが全てＲＮＡであるアジュバント（ＳＥＱ−４０）や全て２’−Ｆ―ＲＮＡであるアジュバント（ＳＥＱ−４２）ではＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）と比較して、大きなＣＴＬ誘導率の向上が見られなかった。一方で、２’−ＯＭｅ―ＲＮＡを核酸モノマーとして有するアジュバント（ＳＥＱ―３８及びＳＥＱ―４４）では、それぞれ、ＯＤＮ１８２６と比較して、２．９倍、２．４倍のＣＴＬ誘導率の向上が見られた。これら結果から、２’−ＯＭｅ―ＲＮＡは本発明のアジュバントの核酸モノマーとしてＤＮＡと同様に有用であることが示された。結果を表３７に示す。
Figure 2018179172
結果７−Ｂ：相補鎖の核酸モノマーの種類が異なる本発明のアジュバントの抗腫瘍効果
２’−ＯＭｅ―ＲＮＡを核酸モノマーとして有する本発明のアジュバント（ＳＥＱ―３８）とＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、移植後１４日目において、ＯＤＮ１８２６（ＳＥＱ―１）と比較して、約８６．２％という非常に強力なＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。脂質リガンドを導入したｓｓＣｐＧ ＯＤＮ（ＳＥＱ―２）の腫瘍抑制率は、移植後１４日目において、ＯＤＮ１８２６と比較して、約７２．６％であった。つまり、本発明のアジュバントは、ＳＥＱ−２のアジュバントより強いＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。また、ＳＥＱ−３８を短鎖化したアジュバント（ＳＥＱ−４４）や、２’−Ｆ―ＲＮＡを核酸モノマーとして有するアジュバント（ＳＥＱ−４２）もＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。一方で、ＲＮＡを核酸モノマーとして有するアジュバント（ＳＥＱ―４０）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を全く示さなかった。結果を表３７及び図５に示す。
（ＣｐＧオリゴヌクレオチドとしてＯＤＮ２００６を用いた結果）
結果８−Ａ：相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバント又はリンカーを有する本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９、２４ｍｅｒ）及び本発明のアジュバントの活性を、ＴＲＰ２ペプチドを用いて比較した。相補鎖の鎖長が２４ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が１００％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−５１）及び、相補鎖の鎖長が１５ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が６２．５％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６１）を用いた。ＳＥＱ−５１及びＳＥＱ−６１は、ともに、ＯＤＮ２００６と比較して５倍以上の高いＣＴＬ誘導を示した。さらに、リンカーとしてｄＴｄＴを有するアジュバント（ＳＥＱ−６３）及びｄＧｄＧを有するアジュバント（ＳＥＱ−６５）を用いた。ＳＥＱ−６３及びＳＥＱ−６５は、ともに、ＯＤＮ２００６と比較して１０倍程度の非常に高いＣＴＬ誘導を示した。結果を表３８に示す。
Figure 2018179172
結果８−Ｂ：相補鎖の鎖長が異なる本発明のアジュバント又はリンカーを有する本発明のアジュバントの抗腫瘍効果
ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ―４９）及びＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果はほとんど見られなかった。一方で、本発明のアジュバントを用いた場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が１００％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−５１）では移植後１０日目において、ＯＤＮ２００６と比較して、２０％のＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果が見られた。また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が６２．５％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６１）、リンカーとしてｄＴｄＴを有するアジュバント（ＳＥＱ−６３）及びｄＧｄＧを有するアジュバント（ＳＥＱ−６５）ではいずれも移植後１０日目において、ＯＤＮ２００６と比較して、５０％程度のＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果が見られた。結果を図６に示す。
結果９−Ａ：相補鎖の核酸モノマーが２’−ＯＭｅ―ＲＮＡである本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率
相補鎖の核酸モノマーが２’−ＯＭｅ―ＲＮＡである本発明のアジュバントの活性をＴＲＰ２を用いて調べた。相補鎖の鎖長が２４ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が１００％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６７）及び、相補鎖の鎖長が１５ｍｅｒ、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が６２．５％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６９）を用いた。ＳＥＱ−６７及びＳＥＱ−６９はそれぞれ、ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）と比較して１．４倍、１．２倍のＣＴＬ誘導を示した。結果を表３９に示す。
Figure 2018179172
結果９−Ｂ：相補鎖の核酸モノマーが２’−ＯＭｅ―ＲＮＡである本発明のアジュバントの抗腫瘍効果
２’−ＯＭｅ―ＲＮＡを核酸モノマーとして有する本発明のアジュバントとＴＲＰ２ペプチドを用いてマウスを免疫したところ、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が１００％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６７）では移植後１０日目においてＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）と比較して、約７５％という非常に強力なＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果を示した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して相補鎖が６２．５％の長さであるアジュバント（ＳＥＱ−６９）においても、移植後１０日目においてＯＤＮ２００６と比較して、約２０％程度のＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果が見られた。結果を図７に示す。
これらから、ＯＤＮ２００６に対しても、２’−ＯＭｅ―ＲＮＡは本発明のアジュバントの核酸モノマーとしてＤＮＡと同様に有用であることが示された。
同様に、本発明のアジュバントのＣＴＬ誘導率又は抗腫瘍効果を測定した。結果を試験別に表４０〜６８及び図８〜１３に示す。なお、これらの試験では、ＴＲＰ２ペプチドを利用し、本発明のアジュバントの投与量は、４．７１ｎｍｏｌである。なお、表中のＮＴは実験していないことを意味する。
Figure 2018179172
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実施例４
ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ―４９）及びＳＥＱ―１２１の癌抗原ペプチド非存在下における抗原特異的ＣＴＬ誘導および抗腫瘍効果を評価した。実施例３のＡ）及びＢ）と同様に癌抗原ペプチド非添加のワクチンを投与した場合の効果を検証した。ＳＥＱ―４９及びＳＥＱ―１２１においていずれも抗原特異的ＣＴＬの値は検出限界以下であった。一方で抗腫瘍効果については、移植後１２日目において、ＯＤＮ２００６と比較して、ＳＥＱ―１２１では８５．３％のＢ１６Ｆ１０細胞の生着阻害効果と増殖抑制効果が見られた。この結果からＳＥＱ―１２１は単剤でも抗腫瘍効果を発揮する治療ワクチンとしての応用が期待される（表６９、図１４）。
Figure 2018179172
実施例５ 本発明のアジュバントの単回刺激性試験
Ａ）単回皮下刺激性試験
単回皮下投与１日及び１、４週後の解剖時の皮膚について、肉眼検査、病理組織学的検査を実施し、本発明化合物の皮下刺激性を評価した。
本発明化合物をラットの肩甲骨間背部中央に皮下投与した。投与１日及び１、４週後の解剖時（イソフルラン麻酔、放血安楽死）に投与部位の皮膚を採取し、肉眼的に観察した後、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定された皮膚は常法に従って、切り出し、包埋、薄切を行い、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色切片を作成した。作成されたＨＥ染色切片を病理観察者が光学顕微鏡下で観察し、組織学的所見を記録した。病理所見の変化の強さはＭｉｎｉｍａｌ；±、Ｍｉｌｄ；＋、Ｍｏｄｅｒａｔｅ；２＋、Ｍａｒｋｅｄ；３＋の４段階で評価した。なお、グレードをつけることが適切でない所見の場合にはＰｏｓｉｔｉｖｅと記録した。
（結果）
本発明のアジュバントの医薬品としての安全性を検証するために、臨床でアジュバントとして用いられているモンタナイドや公知のアジュバントであるＡｍｐｈ１８２６(ＳＥＱ−２)、ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）との皮下刺激性を比較した。
モンタナイドはミネラルオイルと界面活性剤からなるアジュバントで水系製剤とのエマルション作製によりペプチドワクチンのアジュバントとして臨床治験などに使用されている。全身性の安全性懸念については非常に高い安全性プロファイルを持つアジュバントであるものの、投与局所におけるエマルション滞留に伴う皮膚硬結の発生が問題点として挙げられている。本試験においては二重鎖オリゴヌクレオチドの投与局所反応に関してモンタナイドとの比較を行い、局所反応が低いアジュバントとなりうるかどうかについて検討した。
モンタナイド、ＳＥＱ−２、ＳＥＱ−４９又は本発明のアジュバント（ＳＥＱ−６１、ＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０、ＳＥＱ−１９２、ＳＥＱ−２１６）のラット単回皮下刺激性試験を行った。モンタナイドは、生理食塩液と１：１で乳化したエマルションを１ｍＬ／ｓｉｔｅ投与した。ＳＥＱ−２、ＳＥＱ−４９又は本発明のアジュバントはリン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、それぞれ４．７１、１５．７、４７．１ｎｍｏｌ／１ｍＬ／ｓｉｔｅ投与した。
その結果、モンタナイドは、投与１日後、１週間後及び４週間後のいずれにおいても皮下に肉眼的には白色物貯留あるいは白色結節として、組織学的には嚢胞様構造として確認され、吸収/分解/排泄されていないことが明らかとなった。皮下に留まったモンタナイドは投与１日後から投与４週間後まで炎症を惹起し続けており、投与１日後では好中球浸潤及び水腫として、投与１週間後では好中球浸潤、水腫が継続するものの、炎症がやや慢性化し、肉芽腫性炎として認められた。投与４週間後ではモンタナイドを被包化する分厚い線維性被膜が形成され、炎症は投与１週間後と比較してやや軽減していたが、投与４週間後においてもなお、好中球浸潤や水腫が継続する個体も認められた。
ＳＥＱ−２は投与１日後及び１週間後において、炎症細胞の浸潤、水腫又は痂皮が見られ、投与４週間後においても、皮膚の炎症が回復せず、単球／マクロファージ系の持続的活性化による肉芽腫性炎が見られた。
ＳＥＱ−４９及び本発明のアジュバントであるＳＥＱ−６１、ＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０、ＳＥＱ−１９２、ＳＥＱ−２１６は、投与１日後では皮下に好中球浸潤を主体とする急性炎症が認められたが、投与１週間後では皮下から真皮において、リンパ球・マクロファージを主体とする炎症が認められ、投与４週間後では炎症はほぼ収束していた。なおＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０については、投与４週間後の皮下刺激性評価を実施していないが、ＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０及びＳＥＱ−６１の投与１日後及び１週間後における皮下刺激性を比較すると、ＳＥＱ−６１と同等もしくはより軽度であった。このことからＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０についても、投与４週間後には炎症がほぼ完全に収束していると考えられた。
表７０〜７２に投与１日後の結果、表７３〜７５に投与１週後の結果、表７６及び７７に投与４週後の結果を示す。なお、表中の注釈は以下の通りである。
１）所見の後の数値は発現例数。
２）所見の後の数値はスコア。スコアは各個体のグレードをＭｉｎｉｍａｌ；１、Ｍｉｌｄ；２、Ｍｏｄｅｒａｔｅ；３とし、その合計を算出。
以上のことから、本発明のアジュバント及びモンタナイドを比較すると、本発明のアジュバントは皮下に化合物の貯留がないこと（硬結のリスクが低い）、投与１週間後においても壊死や好中球浸潤を伴わないこと、投与４週間後において炎症がほぼ完全に収束していることから、モンタナイドよりも皮下刺激性は軽度であると判断した。また本発明のアジュバント及びＡｍｐｈ１８２６(ＳＥＱ−２)を比較すると、本発明のアジュバントは投与４週間後において炎症がほぼ完全に収束している一方で、ＳＥＱ−２は投与４週間後においても皮膚の炎症が回復せず、単球／マクロファージ系の持続的活性化による肉芽腫性炎が見られたことから、本発明のアジュバントは、ＳＥＱ−２よりも皮下刺激性は軽度であると判断した。なお本発明のアジュバント及びＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）の皮下刺激性に顕著な差は認められなかった。
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Ｂ）単回皮内刺激性試験
単回皮下投与１日及び１、４週後の解剖時の皮膚について、肉眼検査、病理組織学的検査を実施し、本発明のアジュバントの皮内刺激性を評価する。
本発明のアジュバントをラットの背部皮膚に皮下投与する。以降は実施例５のＡ）と同様に行う。
実施例６ 緑膿菌ＰＣＲＶ抗原ワクチン免疫時の本発明アジュバントによる抗体産生誘導能の評価
感染症ワクチンでは、抗原とアジュバントを投与しその免疫動物においてＢリンパ球からの抗体産生を促した場合、感染症からの予防及び治療効果が期待できる。そこで、本アジュバントの感染症ワクチンへの応用を期待して、Ｂリンパ球からの抗体産生を評価した。抗原としては緑膿菌であるＰＣＲＶ抗原を用いて検討を行った。なお、緑膿菌ＰＣＲＶ抗原にはワクチン効果があることが既に報告されている（Ｍｏｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ.、 Ｓｅｐ．２００１、ｖｏｌ. ６９、ｎｏ. ９、 ５９０８−５９１０）ことから、アジュバントによる抗体産生誘導の効果はＰＣＲＶ抗原投与群との比較によって評価した。対照群として、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントを用いた。Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントは、熱殺傷した結核菌をパラフィンオイルとオレイン酸マンニドから成るオイルに混合したアジュバントであり、非臨床において強力な抗体産生を誘導するアジュバントとして知られている。Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントは、非臨床における効果は強力であるが、副作用の懸念から臨床での使用は禁止されている(The European Agancy for the Evaluation of Medical Products Evaluation of Medicines for Human Use, 25 March 2004、インターネット（URL:http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/11/WC500015469.pdf)）。
緑膿菌ＰＡＯ１株由来ｐｃｒｖヌクレオチド配列（配列番号：４８）をｐＥＴ２１ａベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、作製したプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。ｐｃｒＶ−ＢＬ２１（ＤＥ３）株を５００ｍＬのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中に３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に０．１ＭのＩＰＴＧを２００μＬ加え、リコンビナントＰＣＲＶタンパクの発現を誘導した。１６℃で１８時間培養後、菌体を遠心分離し、０．５％のリゾチーム（シグマ社製）を含む緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を１５ ｍｌ加え、４℃で３０分間放置後、超音波処理を行った。１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、可溶性画分を得た。Ｐｏｌｙｐｒｅｐ ｃｏｌｕｍｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を加えて１０ｍＬの緩衝液Ａで平衡化し、可溶性画分をカラムに添加して素通りさせた。２０ｍＬの緩衝液Ａ＋２０ｍＭイミダゾールでカラムを洗浄し、１ｍＬの緩衝液Ａ＋２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０ ＧＬカラムを接続し、１．５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化し、イミダゾール溶出画分をゲル濾過精製してリコンビナントＰＣＲＶタンパクＣ末ＨＩＳ（配列番号：４９）を精製した。得られたリコンビナントＰＣＲＶタンパクはＢＣＡアッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）で濃度測定し、−８０℃で保管した。
リコンビナントＰＣＲＶタンパク７０μｇと本発明のアジュバント３３ｎｍｏｌを合わせて生理食塩水で０．７ｍＬとし、Ａ／Ｊマウス雌５週齢（日本ＳＬＣ社製）５匹ずつに対して試験０日目、７日目、２７日目に、免疫原０．１ｍＬを皮内注射した。対照実験として、リコンビナントＰＣＲＶタンパクのみを同様の方法で免疫した。Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントについては、リコンビナントＰＣＲＶタンパク１００μｇを生理食塩水で０．５ｍＬとし、等量のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）でエマルジョンを作製し、試験７日目に０．１ｍＬを皮内注射して初回免疫とした。試験２７日目に、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）とともに同様の方法で免疫した。試験３３日目にマウスから尾静脈からヘパリン採血し、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収して抗血清として−４０℃保管した。
抗体価は以下のようにして測定した。リコンビナントＰＣＲＶタンパクをＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１μｇ／ｍＬとし、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）に２０μＬ／ｗｅｌｌ加えてプレートシールを貼り、４℃一晩インキュベートした。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ−２０）９０μＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄し、１×Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）６０μＬ／ｗｅｌｌ加えてプレートシールを貼り、室温２時間ブロッキングした。液をタッピングして除き、１×Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで抗血清を１０３〜１０７倍希釈して２０μＬ／ｗｅｌｌ加えてプレートシールを貼り、４℃一晩インキュベートした。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、１×Ａｓｓａｙ ＢｕｆｆｅｒでＧＯＡＴ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を２０，０００倍希釈して２０μＬ／ｗｅｌｌ加えてプレートシールを貼り、室温２時間インキュベートした。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｄａｋｏ社製）を２０μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温３０分間インキュベートし、０．５Ｎ硫酸（Ｎａｃａｌａｉ社製）を２０μＬ／ｗｅｌｌ加え、プレートリーダーでＡｂｓ．４５０ｎｍを測定した。Ａｂｓ．４５０ｎｍ＝１．０となる希釈率を算出し、抗体価とした。結果を図１５に示す。
ＳＥＱ−１２１使用時の抗体価３．０×１０６が最も高く、つづいてＦｒｅｕｎｄ’ｓジュバント使用時の抗体価２．５×１０６、ＳＥＱ−６１使用時の抗体価７．１×１０５、ＯＤＮ２００６（ＳＥＱ−４９）使用時の抗体価５．３×１０５の順であった。ＰＣＲＶタンパクのみの抗体価は１．３×１０５であった。この結果から、本発明のアジュバントには、Ｂ細胞に対して強い免疫賦活作用があることが示された。特に、ＳＥＱ−１２１使用時の抗体価は、ＯＤＮ２００６よりも高い抗体産生誘導能を示し、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント使用時の抗体価とほぼ同等であったことから、感染症ワクチンに用いるアジュバントとして本発明のアジュバントが優れていることが示された。これら結果から本発明のアジュバントの感染症ワクチンへの応用が期待される。
以上の実施例から明らかなように、本発明の脂質結合二本鎖オリゴヌクレオチドは、非常に優れた免疫賦活活性を示す。したがって、特に、ワクチンの効果を増強させるためのアジュバントとして非常に有用である。

Claims (15)

  1. 第１の鎖が、８〜５０塩基のＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、
    第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列を含む８〜６０塩基のオリゴヌクレオチド（但し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを除く）であり、
    第２の鎖の長さが、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さであり、
    第２の鎖に炭素数１２〜３０の炭化水素鎖を含む脂質がリンカーを介して結合している二本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 第２の鎖のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体が結合したオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  3. ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、請求項２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. 糖の４’位と２’位との間に架橋構造が、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）である、請求項３記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  5. 脂質が、ジアシル脂質である、請求項１〜４いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 脂質が、第２の鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合している、請求項１〜５いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  7. リンカーが、オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項１〜６いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  8. 該リンカーが、−（ｄＸ１）ｕ−（ここで、Ｘ１はそれぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴであり、ｕは１〜８の整数である）である、請求項７記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  9. ＳＥＱ−６１、ＳＥＱ−１１９、ＳＥＱ−１２１、ＳＥＱ−１７０及びＳＥＱ−１９２からなる群から選択される、請求項１〜８記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  10. ＳＥＱ−５９、ＳＥＱ−１６６、ＳＥＱ−１６８、ＳＥＱ−２１６、ＳＥＱ−２７２、ＳＥＱ−２８０、ＳＥＱ−２９０、ＳＥＱ−２９４、ＳＥＱ−３１０、ＳＥＱ−３７３、及びＳＥＱ−３８４ からなる群から選択される、請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  11. 請求項１〜１０いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  12. 抗原をさらに含む、請求項１１記載の医薬組成物。
  13. 請求項１〜１２いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする、癌又は感染性疾患の治療又は予防方法。
  14. 癌又は感染性疾患の治療又は予防剤を製造するための、請求項１〜１０いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの利用。
  15. 癌又は感染性疾患を治療又は予防するための、請求項１〜１０いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3079157A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide constructs and uses thereof
US20220267771A1 (en) 2019-06-03 2022-08-25 Shionogi & Co., Ltd. Production method for bifurcated lipid-linked oligonucleotide, and intermediate

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001012804A2 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Hybridon, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
JP2005526497A (ja) * 2002-02-04 2005-09-08 ビオミラ，インコーポレーテッド 免疫刺激性、共有結合性脂質化オリゴヌクレオチド
JP2012500827A (ja) * 2008-08-28 2012-01-12 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
JP2014012009A (ja) * 2008-12-09 2014-01-23 Pfizer Vaccines Llc ＩｇＥＣＨ３ペプチドワクチン
JP2015514108A (ja) * 2012-04-05 2015-05-18 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 免疫刺激組成物およびその使用方法
WO2015105083A1 (ja) * 2014-01-07 2015-07-16 塩野義製薬株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
JP2015131852A (ja) * 2006-03-15 2015-07-23 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ＣＤ１ｄリガンドを使用する免疫化のための組成物および方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001012804A2 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Hybridon, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
JP2005526497A (ja) * 2002-02-04 2005-09-08 ビオミラ，インコーポレーテッド 免疫刺激性、共有結合性脂質化オリゴヌクレオチド
JP2015131852A (ja) * 2006-03-15 2015-07-23 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ＣＤ１ｄリガンドを使用する免疫化のための組成物および方法
JP2012500827A (ja) * 2008-08-28 2012-01-12 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
JP2014012009A (ja) * 2008-12-09 2014-01-23 Pfizer Vaccines Llc ＩｇＥＣＨ３ペプチドワクチン
JP2015514108A (ja) * 2012-04-05 2015-05-18 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 免疫刺激組成物およびその使用方法
WO2015105083A1 (ja) * 2014-01-07 2015-07-16 塩野義製薬株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMB REPORTS, 2010, VOL.43, NO.3, PP164-169, JPN7019002427, ISSN: 0004135295 *
EUROPEAN J. PHARMACEUTICAL SCIENCES, 2012, VOL.47, PP.352-358, JPN6019029790, ISSN: 0004135297 *
NATURE, 2014, VOL.507, PP.519-522, JPN6019029781, ISSN: 0004135294 *
PLOS ONE, 2014, VOL.9, NO.4, E94596, JPN6019029786, ISSN: 0004135296 *

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