JPWO2018159655A1 - 有用物質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち本発明は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がOgataea属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Hansenula属、Pichia属、Yarrowia属及びCandida属からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、培養液がアニオン界面活性剤(A1)、カチオン界面活性剤(A2)、及び両性界面活性剤(A3)からなる群から選ばれる1種以上の界面活性剤(A)を含有する有用物質の生産方法である。
アニオン界面活性剤(A1)、カチオン界面活性剤(A2)、及び両性界面活性剤(A3)は、ノニオン性の界面活性剤とは異なり、イオン性の界面活性剤であるといえる。
すなわち、本発明における界面活性剤(A)はイオン性の界面活性剤である。
pKaが1〜5のイオン性基として具体的には、カルボキシ基(−COOH)、硫酸基(−OSO3H)、スルホ基(−SO3H)、スルフィノ基(−SO2H)、スルフェノ基(−SOH)、リン酸基{−OP(=O)(−OH)2}等の酸性基及びその塩の基が挙げられる。
pKaが8〜14のイオン性基として具体的には、第4級アンモニオ基、第1級〜第3級アミノ基等及びその塩の基が挙げられる。
(A)がイオン性基を複数有する場合は、(A)中のイオン性基のうち、有用物質の分泌効率の観点から、いずれか1つのpKaが上記範囲であることが好ましく、さらに好ましくはすべてのイオン性基のpKaが上記範囲であることである。
エーテルとしては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルキレンオキサイド付加物が好ましく、さらに好ましくはエチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドの1種又は2種の付加物であり、特に好ましくはエチレンオキサイド付加物である。
アルキレンオキサイドの重合度としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10が好ましい。
エーテルカルボン酸(A11)及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。
エーテルとしては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルキレンオキサイド付加物が好ましく、さらに好ましくはエチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドの1種又は2種の付加物であり、特に好ましくはエチレンオキサイド付加物である。
アルキレンオキサイドの重合度としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10が好ましい。
エーテル硫酸エステル(A13)及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
なお、スルホン酸(塩)は、スルホン酸及び/又はスルホン酸塩を意味し、カルボン酸(塩)は、カルボン酸及び/又はカルボン酸塩を意味し、リン酸(塩)は、リン酸及び/又はリン酸塩を意味する。塩としては、アルカリ金属塩(ナトリウム塩及びカリウム塩等)、アルカリ土類金属塩(カルシウム塩及びマグネシウム塩等)及びオニウムカチオン塩(アンモニウムカチオン、第4級アンモニウムカチオン、第3級スルホニウムカチオン、第4級ホスホニウムカチオン及び第3級オキソニウムカチオン等)等を含む。
炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
オキシアルキレン基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、オキシエチレン基が好ましい。
sは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10の整数が好ましく、さらに好ましくは1〜5の整数である。
一般式(2)において、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、R2、R3、R4及びR5のうち少なくとも1つは炭素数8〜22の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくはR2、R3、R4及びR5のうち少なくとも1つは炭素数10〜18の一価の炭化水素基である。
R2、R3、R4及びR5において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
また、Z−としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、ハロゲンイオンが好ましく、さらに好ましくは塩化物イオンである。
また、一般式(2)において、炭化水素基は、炭化水素基のいずれかの位置に、水酸基、エーテル基、カルボニル基及びエステル基からなる群より選ばれる少なくとも1種の置換基を有していてもよい。
R6において、炭化水素基の炭素数は、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、8〜22が好ましく、さらに好ましくは10〜18である。
R6において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
また、アミノ酸型両性界面活性剤(A311)として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤(ドデシル−β−アミノプロピオン酸ナトリウム、コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等);アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤(ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等)及びN−ラウロイル−N’−カルボキシメチル−N’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
R7において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
一般式(6)中、R11及びR12はそれぞれ炭素数1〜30の一価の炭化水素基を表し、qは1以上の整数であり、Yはスルホン酸(塩)基、カルボン酸(塩)基又はリン酸(塩)基を表す。
一般式(7)中、R13、R14、R15及びR16はそれぞれ炭素数1〜30の一価の炭化水素基を表し、rは1以上の整数である。
R8、R9及びR10において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
また、pは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10の整数であることが好ましく、さらに好ましくは1〜5の整数である。
R11及びR12において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
qは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10の整数であることが好ましく、さらに好ましくは1〜5の整数である。
塩としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩である。
R13、R14、R15及びR16において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは0〜3個の不飽和結合を有する直鎖及び/又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を1〜3個有するアルケニル基である。
また、rは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、1〜10の整数であることが好ましく、さらに好ましくは1〜5の整数である。
さらに好ましくは一般式(1)、(2)、(5)〜(7)で表される化合物のうち炭素数8〜22の脂肪族炭化水素基を有する化合物であり、特に好ましくは一般式(1)、(2)、(5)〜(7)で表される化合物のうち炭素数10〜18の脂肪族炭化水素基を有する化合物である。
水性希釈液における、界面活性剤(A)の合計濃度(重量%)は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、有用物質の分泌効率及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、0.1〜99重量%が好ましく、より好ましくは1〜50重量%である。
培地のpHは、4〜7に調整するのが好ましい。
培養工程では、本培養開始から6〜800時間後に培養温度を維持したまま界面活性剤(A)を添加し、本培養開始から20〜1000時間培養を継続することが好ましい。
培養中の培養液は公知の撹拌装置(撹拌羽根及びマグネティックスターラー等)を用いて撹拌することが好ましい。
培養工程に用いる装置としては、公知の培養装置を用いることができるが、例えば試験管、ディープウェルプレート(例えば、ビーエム機器株式会社製品等)、微生物培養装置(例えば、エイブル社製等)等が挙げられる。
溶剤による沈殿処理としては、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理が挙げられる。
独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンターより分譲していただいたSaccharomyces cerevisiaeを用いて形質転換を行うことにより、ルシフェラーゼ発現微生物を作製した。pYES2ベクター(Thermo社製)をHindIIIとXbaIで切断し、人工合成(Thermo社で委託合成)した両端にHindIIIとXbaI切断部位を持つαファクター−ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。αファクター−ルシフェラーゼ遺伝子組み込みpYES2ベクターの微生物への形質転換は、pYES2ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。当該ルシフェラーゼ発現微生物をYPD培養液(Difco社製Yeast extract 1wt%、Difco社製Bacto peptone 2wt%、グルコース2wt%)に白金耳を用いて植菌して30℃で15時間、200rpmで振とう培養して作製した培養液を最終濁度(以下ODと略記することがある)が0.1OD/mlとなるように、125mlYPD培養液(100mMリン酸水素カリウム緩衝液含有 pH6)に再懸濁した。
なお、培養液の濁度は、後述の「培養液の濁度の測定方法」と同様の条件で測定した。
更に、その再懸濁液を、30℃で約17時間、1100rpmでODが20〜30となるまで攪拌培養を続けた。ODが20〜30となった時点で培養液を遠心(1500g、10分)し、125mlのガラクトース誘導培養液(前記のYPD培養液に100mMリン酸カリウム緩衝液含有し、グルコースの代わりに2%ガラクトースを含む、pH6)に再懸濁し、30℃、1100rpmで2時間培養した。
その後、表1に記載の界面活性剤を表1に記載の重量%となるように添加し、8時間30℃、1100rpmで培養した。その後、濁度(培養終了時の濁度)測定用、分泌効率測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
実施例1において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンターより分譲していただいたPichia pastorisを用いて形質転換を行うことにより、ルシフェラーゼ発現微生物を作製した。pPICZαベクター(Thermo社製)をXhoIとXbaIで切断し、人工合成(Thermo社で委託合成)した両端にXhoIとXbaI切断部位を持つルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ルシフェラーゼ遺伝子組み込みpPICZαベクターの微生物への形質転換は、pPICZα」ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。当該ルシフェラーゼ発現微生物をBMGY培養液に白金耳を用いて植菌して30℃で15時間、200rpmで振とう培養して作製した培養液を最終ODが0.1OD/mlとなるように、125mlBMGY培養液(Difco社製Yeast extract 1wt%、Difco社製Bacto peptone 2wt%、Difco社製Yeast nitrogen base w/o amino acid 1.34wt%、グルコース2wt%、100mMリン酸水素カリウム、pH6.0)に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、30℃で約17時間、1100rpmでODが20〜30となるまで攪拌培養を続けた。ODが20〜30となった時点で培養液を遠心(1500g、10分)し、125mlBMMY培養液に再懸濁し、30℃、1100rpmで2時間培養した。
2時間経過後、表2に記載の界面活性剤を表2に記載の重量%となるように添加し、8時間30℃、1100rpmで培養した。その後、濁度(培養終了時の濁度)測定用、分泌効率測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
実施例12において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
公知文献(Regulation and evaluation of five methanol−inducible promoters in the methylotrophic yeast Candida boidinii, H. Yurimoto et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1493, 2000, 56−63)に記載の方法に基づき、Candida boidiniiを形質転換し、酸性ホスファターゼ発現微生物を作製した。当該酸性ホスファターゼ発現微生物をBMGY培養液に白金耳を用いて植菌して30℃で15時間、200rpmで振とう培養して作製した培養液を最終ODが0.1OD/mlとなるように、125mlBMGY培養液に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、30℃で約17時間、1100rpmでODが2〜5となるまで攪拌培養を続けた。ODが2〜5となった時点で2v/v%となるようにメタノールを添加し、30℃、1100rpmで2時間培養した。
2時間経過後、表3に記載の界面活性剤を表3に記載の重量で添加し、8時間30℃、1100rpmで培養した。8時間後、濁度(培養終了時の濁度)測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
菌体に50mM 酢酸NaBf(pH4.0)を加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、50mM 酢酸NaBf(pH4.0)で再懸濁し、菌体表面の酸性ホスファターゼ活性測定サンプルとした。
実施例23において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
界面活性剤(A1−1):ポリオキシエチレン(平均2.5モル付加物)ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、イオン性基の25℃水中でのpKaが2.0
界面活性剤(A1−2):ポリオキシエチレン(平均3モル付加物)ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、イオン性基の25℃水中でのpKaが3.6
界面活性剤(A2−1):ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、イオン性基の25℃水中でのpKaが14
界面活性剤(A3−1):2−(ドデシルアミノ)エタンスルホン酸ナトリウム、イオン性基の25℃水中でのpKaが2.0と10.8
界面活性剤(A3−2):ドデシル−β−アミノプロピオン酸ナトリウム、イオン性基の25℃水中でのpKaが3.6と10.8
界面活性剤(A3−3):ドデシルジメチル(3−スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド[ラウリルスルホベタイン]、イオン性基の25℃水中でのpKaが2.0と14
界面活性剤(A3−4):ミルテホシン、イオン性基の25℃水中でのpKaが2.2と14
界面活性剤(A3−5):ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、イオン性基の25℃水中でのpKaが3.6と14
表1〜3中の数値は、培養液の重量に基づく、培養液中の界面活性剤の含有量(重量%)である。
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計[(株)島津製作所社製、UV−1700]を用いて、光路長1cmの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
培養液は、1500rpm、5分、4℃で遠心し、上清を破棄した。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度(0.1〜0.8)になるように生理食塩水で希釈して600nmの吸光度を測定した。培養液の濁度は下記(数式1)によって算出した。
培養液の濁度(OD)=(希釈した培養液の600nmの吸光度)×培養液の希釈倍率 (数式1)
○分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定
実施例1〜22及び比較例1〜2で得た各培養液を0.2M Tris−HCl緩衝液(pH 7.4)で10〜1000倍希釈したもの20μlに、下記のルシフェリン溶液60μl添加した混合液を試料として、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
ルミノメーター:プロメガ株式会社製の「Glomax Navigator」
ルシフェリン溶液:ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品
測定温度:25℃
検出装置:発光検出器
検出波長:350〜700nm
〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕=〔発光強度〕×希釈倍率/〔培養終了時の濁度〕
実施例1〜22及び比較例1〜2で得た菌体に、除去した上清と同量の0.2M Tris−HCl緩衝液(pH 7.4)200μlを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の0.2M Tris−HCl緩衝液(pH 7.4)200μlで再懸濁し、0.2M Tris−HCl緩衝液(pH 7.4)で10〜1000倍希釈したものを菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプルとした。
この菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプル20μlに上記のルシフェリン溶液60μl添加した混合液を試料として、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定」と同様の条件で発光強度を測定し、測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕=〔発光値〕×希釈倍率/〔培養終了時の濁度〕
実施例1〜22及び比較例1〜2で得た各培養上清と菌体を用いて、上記により求めた「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」から、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。結果を表1及び2に示す。
分泌効率(%)=100×「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」/「ルシフェラーゼ活性合計」
ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」+「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。
実施例23〜33及び比較例3で得た各培養上清に1/40量の2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)5μlを添加した。緩衝液を添加した培養上清又は実施例23〜33で得た各菌体表面測定サンプルに基質溶液(p−nitrophenylphosphate 0.64mg/ml含有 50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0)を容量比=1:1で混合し、35℃で10分間反応した。
反応後、反応液と等量の10%トリクロロ酢酸溶液を添加し反応停止をした。反応停止をした溶液に、炭酸ナトリウム飽和溶液を反応液全体と等量加え、発色させた。発色させた液は、1500×g、5分で不溶画分を除去し、(Biotek社製マイクロプレートリーダーPowerWave)を用いて420nmの吸光度を測定した。参照波長には630nmを測定した。
培養上清、菌体表面測定サンプルそれぞれについて、下記の式より算出した値を酸性ホスファターゼ活性とした。得られた培養上清の酸性ホスファターゼ活性を「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とし、菌体表面測定サンプルの酸性ホスファターゼ活性を「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とした。
酸性ホスファターゼ活性={(Abs420nm)−(Abs630nm)}/(培養終了時の濁度)
実施例23〜33及び比較例3で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表3に示す。
分泌効率(%)=100×「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」/「酸性ホスファターゼ活性合計」
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」+「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。
Claims (3)
- 培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がOgataea属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Hansenula属、Pichia属、Yarrowia属及びCandida属からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、培養液がアニオン界面活性剤(A1)、カチオン界面活性剤(A2)、及び両性界面活性剤(A3)からなる群から選ばれる1種以上の界面活性剤(A)を含有する有用物質の生産方法。
- 培養液中の界面活性剤(A)の含有量が、培養液の重量に基づいて、0.0001〜20重量%である請求項1に記載の有用物質の生産方法。
- 有用物質がタンパク質である請求項1又は2に記載の有用物質の生産方法。
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