JPWO2018087820A1 - 画像群生成装置、球面収差補正算出装置、顕微鏡、プログラム及び球面収差補正算出方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】球面収差補正光学系を有する対物レンズと、撮像対象物を載置するステージと、第一の収差補正量で球面収差補正光学系を調整した状態で、対物レンズとステージの相対距離を変えながら、撮像対象物を連写することで得られる第一の画像群と、第二の収差補正量で球面収差補正光学系を調整した状態で、対物レンズとステージの相対距離を変えながら、撮像対象物を連写することで得られる第二の画像群とを含む画像群を生成する画像群生成部とを備える画像群生成装置である。

Description

本発明は、画像群生成装置、球面収差補正算出装置、顕微鏡、プログラム及び球面収差補正算出方法に関する。

従来、標本及び顕微鏡の光学系により生じる球面収差の影響を調節する補正環を電動モータなどからの動力によって駆動する顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１）。

米国特許第６５６３６３４号明細書

球面収差補正光学系を有する対物レンズと、撮像対象物を載置するステージと、第一の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第一の画像群と、第二の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第二の画像群とを含む画像群を生成する画像群生成部とを備える画像群生成装置。

球面収差補正光学系システムの外観構成の一例を示す図である。 撮像光学系の外観構成の一部分を拡大した図である。 球面収差補正算出装置の機能構成の一例を示す図である。 球面収差補正算出装置の動作の一例を示す流れ図である。 撮像画像の一例を示す図である。 評価値同士を二次曲線フィッティングした一例を示す図である。 球面収差補正算出装置の機能構成の一例を示す図である。 球面収差補正算出装置の動作の一例を示す流れ図である。

［第１の実施形態］
以下、図面を参照して球面収差補正光学系システムについて説明する。
図１は、球面収差補正光学系システム１００の外観構成の一例を示す図である。
球面収差補正光学系システム１００は、球面収差補正算出装置１０と、球面収差補正部２０とを備える。

球面収差補正部２０とは、電動モータにより球面収差の補正の程度を制御可能な補正環を備えた対物レンズにより、試料を拡大して観察と観察像の取得に関わる顕微鏡の一部構成である。試料とは、具体的には、観察対象となる生体試料、ビーズなどである。生体試料とは、厚みがある蛍光染色された細胞などの試料である。ビーズとは、蛍光標識されたポリスチレンの微小球体（例えば直径０．２ｕｍなど）である。
球面収差とは、点光源から出射される光線が、光学系を通過後に１点の焦点に集束しない収差である。球面収差は、具体的には、観察対象を通過した光の観察波長や、温度変化、カバーガラス厚、観察面の深さに応じて変化する。補正環は、この球面収差を補正する。

［球面収差補正部２０について］
ここで、図２を参照して球面収差補正部２０について説明する。以下の説明では、球面収差補正部２０を倒立顕微鏡の一部構成の場合について説明するが、これに限られない。球面収差補正部２０は、微分干渉顕微鏡（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＤＩＣ）、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、二光子励起蛍光顕微鏡等の一部構成であってもよい。
図２は、顕微鏡の一部である球面収差補正部２０の外観構成の一部分を拡大した図である。図１中、球面収差補正部２０は、対物レンズ２１と、補正環駆動部２２と、ステージ２３と、対物レンズ駆動部２４と、撮像部２５と、分岐部２６とを備える。
対物レンズ駆動部２４は、対物レンズ２１の位置を光軸ＯＡ方向に動かすモータを有しており、対物レンズを保持するレボルバ（不図示）を上下動することで、対物レンズを光軸ＯＡ方向に動かすことができる。図２中、対物レンズ２１と、撮像対象ＴＰとの相対位置が変化すると、対物レンズ２１の焦点位置が変化する。以下の説明において、対物レンズ２１の焦点位置を、ＯＦと記載する。

本実施形態において、対物レンズ２１は、補正環２１ａを備える。補正環２１ａを調節し対物レンズ２１を保持する鏡筒内であって、対物レンズ２１の光軸に配置される収差補正レンズの光軸方向の位置を変更することにより、対物レンズ２１の球面収差は補正される。対物レンズ２１の球面収差の補正量ＣＬは、対物レンズ２１の光軸ＯＡ方向の変位に対応付いている。つまり、補正量ＣＬを調節すると、対物レンズ２１の焦点位置ＯＦは光軸ＯＡ方向に移動する。補正量ＣＬとは、補正環２１ａが補正する球面収差の程度である。このような環状の構成の補正環２１ａは、必須のものではなく、カム構造を用い収差補正レンズを光軸ＯＡ方向に移動させる構成でも良い。また、収差補正レンズの代わりに、球面収差を補正するミラーや、液晶素子などの光学素子を用いてもよい。球面収差を補正するミラーや、液晶素子などの光学素子は収差補正光学系として対物レンズと接眼レンズとの間に配置され、観察光学系に入射される観察光の透過を調整することにより、球面収差を補正する。

補正環駆動部２２は、補正環２１ａの補正位置を駆動する。補正環２２ａは、補正位置が駆動されることにより、球面収差の補正量ＣＬを調節する。補正環駆動部２２とは、具体的には、電動モータなどの駆動装置であり、電動モータによりレンズを保持する保持部材をカム機構などで光軸方向に移動させるものが使用できる。

ステージ２３に置かれた撮像対象ＴＰは、対物レンズ２１を介して不図示の結像レンズで撮像部２５の撮像面に結像される。この一例では、撮像対象ＴＰは、厚さＴＰＤの生体試料である。撮像部２５は、対物レンズ２１によって結像された像を撮像する。本実施形態においては、撮像部２５は、撮像素子としてＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを備えるカメラである。この一例では、撮像対象ＴＰは、カバーガラスＣＧの上に配置される。撮像対象ＴＰには、照明光が照射される。対物レンズ２１は、撮像対象ＴＰを透過した光を受光する。球面収差は、撮像対象ＴＰを透過した光の波長によっても生じる。

分岐部２６は、対物レンズ２１が結像する撮像対象ＴＰからの光を、撮像部２５及び接眼レンズ（不図示）へと分岐する。具体的には、分岐部２６は、撮像対象ＴＰからの光を光路ＯＰを介して撮像部２５に分岐する。分岐部２６とは、具体的には、ダイクロイックプリズムや、ハーフミラーなどの光学素子である。

また、撮像部２５は、細胞に蛍光物質を励起する励起光を照射することで、細胞に添加された蛍光試薬から発光される蛍光を撮像画像として撮像する。
本実施形態においては、細胞を蛍光試薬で染色して、細胞画像を取得する。具体的には、本実施形態では、細胞を固定し、免疫染色する。ホルムアルデヒド等の試薬を用いて細胞を固定する処理を行う。なお、撮像部２５が撮像する生体試料は、例えば、固定標本、透明化標本、生きたままの標本であってもよい。

また、球面収差補正部２０は、生体物質内に取り込まれた発色物質そのものから生じる発光或いは蛍光や、発色団を持つ物質が生体物質に結合することによって生じる発光或いは蛍光を、上述した撮像画像ＴＩとして撮像してもよい。これにより、球面収差補正部２０は、蛍光画像、二光子励起蛍光顕微鏡画像を取得することができる。
本実施形態における細胞とは、例えば、初代培養細胞や、株化培養細胞、組織切片の細胞等である。細胞を観察するために、観察される試料は細胞の集合体や組織試料、臓器、個体（動物など）を用い観察し、細胞を含む画像を取得しても構わない。なお、細胞の状態は、特に制限されず、生きている状態であっても、或いは固定されている状態であってもよく、“in-vivo”又は“in-vitro”のどちらでもよい。勿論、生きている状態の情報と、固定されている情報とを組み合わせても構わない。

カバーガラスＣＧと、対物レンズ２１との間には、液浸空間ｉが設けられる。液浸空間ｉは、液体によって満たされる。液浸空間ｉに液体が満たされることにより、対物レンズ２１の開口数が改善され、分解能、焦点深度及び明るさなどの対物レンズ２１の分解能を高めることができる。液浸空間ｉを満たす液体とは、具体的には、油、水などである。液浸空間ｉに油が満たされる場合には、温度変化による球面収差の変化が生じる。液浸空間ｉに水が満たされる場合には、カバーガラス厚による球面収差の変化が生じる。さらに、撮像対象ＴＰ内部における観察位置の変化に伴い、カバーガラスＣＧと焦点位置ＯＦとの距離が変化する。対物レンズ２１が油浸対物レンズの場合には、カバーガラスＣＧと焦点位置ＯＦとの距離の変化により球面収差が発生する。

図１に戻り、球面収差補正算出装置１０は、像の球面収差の補正量を算出する。
本実施形態において、球面収差補正算出装置１０は、表示部１１と、制御部１２とを備える。制御部１２は、対物レンズ２１の、球面収差の補正の程度を算出する。表示部１１は、球面収差補正部２０が撮像した撮像画像を表示する。表示部１１は、制御部１２が算出した結果を表示する。球面収差補正算出装置１０は、これに限らずパソコンや無線により情報の送受信が可能なタブレット型の装置でもよい。

［球面収差補正算出装置１０の機能構成］
次に、図３を参照して、球面収差補正算出装置１０の機能構成について説明する。
図３は、第１実施形態の球面収差補正算出装置１０の機能構成の一例を示す図である。

制御部１２は、画像取得部１３と、評価値算出部１４と、基準フォーカス面情報取得部１６と、操作検出部１７と、補正量を算出する程度算出部１５とを備える。ここで、程度算出部１５とは、収差補正量算出部の一例である。

画像取得部１３は、撮像部２５で撮像された画像信号である撮像画像ＴＩを取得する。
撮像画像ＴＩとは、対物レンズ２１の絶対位置ＺＬが互いに異なる複数の位置毎に、互いに異なる複数の補正量ＣＬによって撮像対象ＴＰが撮像された撮像画像ＴＩである。言い換えると、撮像画像ＴＩとは、互いに異なる複数の補正量ＣＬごとに、絶対位置ＺＬが互いに異なる複数の相対位置で撮像対象ＴＰが撮像された複数の画像からなる撮像画像ＴＩである。ここで、絶対位置ＺＬとは、撮像対象ＴＰと対物レンズ２１の位置の相対位置を変えた際の対物レンズの位置である。撮像画像ＴＩの詳細は、後述する。
画像取得部１３は、取得した撮像画像ＴＩを、評価値算出部１４に対して出力する。

基準フォーカス面情報取得部１６は、基準フォーカス面情報ＴＦＩを取得する。基準フォーカス面情報ＴＦＩとは、この一例では、観察者が観察したい焦点位置ＯＦが撮像された画像である。観察者とは、球面収差補正算出装置１０及び球面収差補正部２０を操作して、撮像対象ＴＰを観察する者である。基準フォーカス面情報取得部１６は、取得した基準フォーカス面情報ＴＦＩを、評価値算出部１４に対して出力する。

操作検出部１７は、観察者の入力操作を検出する。操作検出部１７は、具体的には、観察者からの入力操作によって入力された、基本パラメータを検出する。基本パラメータとは、対象領域ＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、補正環開始位置ＣＢ及び撮像開始位置ＺＢなどの情報である。

対象領域ＲＯＩとは、撮像画像ＴＩの撮像ピクセルうちの、ある一部の領域のことである。対象領域ＲＯＩとは、この一例では、撮像画像のサイズの９０％以下の領域である。なお、対象領域ＲＯＩは、撮像画像のサイズの全ての領域であってもよい。

補正環開始位置ＣＢ及び撮像開始位置ＺＢとは、撮像画像ＴＩの撮像を開始する初期位置である。球面収差補正部２０は、対物レンズ２１の補正環２１ａの位置を補正環開始位置ＣＢ、対物レンズ２１と撮像対象ＴＰとの相対位置を撮像開始位置ＺＢに合わせてから、撮像対象ＴＰの撮像を開始する。
操作検出部１７は、検出した操作結果を評価値算出部１４に対して出力する。

評価値算出部１４は、画像取得部１３から撮像対象ＴＰの画像信号を取得する。
評価値算出部１４は、撮像画像群を構成する画像ごとの評価値を算出する。本実施形態では、評価値算出部１４は、画像取得部１３から取得した複数の画像からなる撮像画像ＴＩのうちから、基準フォーカス面情報取得部１６が取得する基準フォーカス面情報ＴＦＩが示す変位と対応する変位にして撮像されている撮像画像を選択する。換言すると、評価値算出部１４は、基準フォーカス面情報ＴＦＩが示すフォーカス面と、類似するフォーカス面を撮像した撮像画像を、撮像画像ＴＩから選択する。
評価値算出部１４は、選択した撮像画像が撮像された絶対位置ＺＬにおいて撮像された撮像画像ＴＩのうちから、補正量ＣＬが異なる撮像画像ＴＩに基づいて、補正量ＣＬの評価値ＲＶを、撮像画像ＴＩ毎にそれぞれ算出する。
評価値算出部１４は、算出した評価値ＲＶを、程度算出部１５に対して出力する。

程度算出部１５は、評価値算出部１４から評価値ＲＶを取得する。
程度算出部１５は、評価値算出部１４から取得した評価値に基づいて、収差補正量の最適値を求める。本実施形態では、程度算出部１５は、評価値算出部１４が算出する評価値ＲＶ同士を補間して、基準フォーカス面の変位と対応する補正量ＣＬを算出する。換言すると、程度算出部１５は、評価値算出部１４が算出する評価値ＲＶ間の値を補間し、補正量ＣＬの違いが評価値ＲＶに与える影響を推定する。程度算出部１５は、推定した評価値ＲＶのピークの位置の補正量ＣＬが、球面収差をよく補正する補正の程度ＣＰであるとする。なお、上述した収差補正量の最適値とは、補正の程度ＣＰである。
程度算出部１５は、算出した基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを、表示部１１と、補正環駆動部２２に対して出力する。

本実施形態では、表示部１１は、程度算出部１５が算出した基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを表示する。補正環駆動部２２は、程度算出部１５から基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを取得する。補正環駆動部２２は、取得した基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰに基づいて、補正環２１ａを駆動させる。

［球面収差補正算出装置１０の動作の概要］
次に、図４を参照して、球面収差補正算出装置１０の動作の概要について説明する。
図４は、球面収差補正算出装置１０の動作の一例を示す流れ図である。
球面収差補正算出装置１０は、観察者の操作により基本パラメータを取得する（ステップＳ１１０）。

［撮像画像ＴＩについて］
図５は、撮像画像ＴＩの一例を示す図である。
図５中、横軸は、収差補正量を変えた各収差補正の程度ＣＬを示し、縦軸は対物レンズの絶対位置を変えた際の撮像対象ＴＰと対物レンズ２１の相対位置を示している。
撮像画像ＴＩには、補正量ＣＬ毎に撮像対象ＴＰと対物レンズ２１の位置が異なる絶対位置ＺＬで撮像された複数の画像が含まれる。
具体的には、撮像画像ＴＩ１とは、対物レンズ２１が備える補正環２１ａは補正量ＣＬ１に調節され、撮像対象ＴＰと対物レンズ２１の位置が異なる複数の絶対位置ＺＬで撮像された画像である。撮像画像ＴＩ２から撮像画像ＴＩ７は、それぞれ対物レンズ２１が備える補正環２１ａは各々異なる補正量ＣＬ２から補正量ＣＬ７に調節され、複数の絶対位置ＺＬで撮像された画像である。撮像画像ＴＩ１から撮像画像ＴＩ７には、絶対位置ＺＬが異なる位置において撮像された撮像画像が、それぞれ７枚含まれる。この一例では、補正量ＣＬ１から補正量ＣＬ７までのそれぞれの補正量ＣＬは、対物レンズ２１の補正環２１ａの設定可能な値の全域を、７等分にしたものである。補正量ＣＬの分割数が多いほど、程度算出部１５が算出する基準フォーカス面の変位と対応する補正量ＣＬの精度が向上する。

撮像部２５は、撮像画像ＴＩとなる観察対象物の像を撮像する。撮像部２５は、撮像画像ＴＩを、画像取得部１３に対して出力する。画像取得部１３は、球面収差補正部２０から撮像画像ＴＩとなる複数の画像(ＴＩ１〜ＴＩ１７)を取得する（ステップＳ１２０）。基準フォーカス面情報取得部１６は、観察者の操作により基準フォーカス面情報ＴＦＩを取得する（ステップＳ１３０）。具体的には、観察者が観察対処物の像（目視で確認した像や撮像された画像）を見ながら、観察したい部分に対物レンズの焦点を合わせる。このとき、収差補正は行う必要は無い。なお、ステップＳ１２０の処理と、ステップＳ１３０の処理とは、どちらの処理を先に行っても良い。評価値算出部１４は、画像取得部１３が取得した撮像画像ＴＩ毎に基準フォーカス面情報ＴＦＩとの相関関係をそれぞれ算出する。詳細は下記で説明する。

［基準フォーカス面情報ＴＦＩと近い絶対位置ＺＬを選択する方法］
評価値算出部１４が、基準フォーカス面情報ＴＦＩとフォーカス位置が近い画像を撮像画像ＴＩの中から選択する方法について説明する。基準フォーカス面情報ＴＦＩとフォーカス位置が近い画像を撮像画像ＴＩの中から選択する方法には、輝度の空間分布が近い画像を選択する方法がある。輝度の空間分布が近い画像を選択するには、基準フォーカス面情報ＴＦＩと撮像画像ＴＩとの相関関係を算出する他に、基準フォーカス面情報ＴＦＩと撮像画像ＴＩとの差分を計算する方法などがある。

具体的には、基準フォーカス面情報ＴＦＩと同じ焦点位置ＯＦを撮像した画像は、空間分布が近い画像である。空間分布が近い画像とは、撮像した観察対象の形状や配置などが類似した画像である。
評価値算出部１４は、基準フォーカス面情報ＴＦＩと、撮像画像ＴＩとを、それぞれ輝度の相関関係を算出してもよい。輝度の相関関係は、正規化相互相関などによって算出される。
評価値算出部１４は、基準フォーカス面情報ＴＦＩと撮像画像ＴＩとの相関をそれぞれ算出し、算出された相関同士を比較してもよい。この場合には、評価値算出部１４は、より高い相関を示す撮像画像が、基準フォーカス面情報ＴＦＩに撮像された焦点位置ＯＦに近いフォーカス面を撮像したと判定する。

評価値算出部１４は、撮像画像ＴＩを形成する複数の画像の中から基準フォーカス面情報ＴＦＩとの相関が高い撮像画像を選択する。評価値算出部１４は、基準フォーカス面情報ＴＦＩとの相関が高い画像が撮像された相対位置ＺＬにおいて撮像された撮像画像ＴＩの評価値をそれぞれ算出する（ステップＳ１４０）。

［基準フォーカス面の変位と対応する補正量ＣＬの算出方法］
図５に示す撮像画像ＴＩ８は、評価算出部１４により算出された結果に基づき、各撮像画像ＴＩの中から選択された画像である。これは、各撮像画像ＴＩの中において、基準フォーカス面情報ＴＦＩに撮像された焦点位置ＯＦに近いフォーカス面を撮像した撮像画像と同じ面を撮像した撮像画像である。言い換えると、撮像画像ＴＩ同士は、同じフォーカス面を撮像した画像である。ただし、各撮像画像ＴＩの収差補正の程度は異なるものである。
撮像画像ＴＩ８−４は、最初に撮像された撮像画像であり、基準フォーカス面画像である基準画像である。つまり、球面収差補正部２０は、絶対位置ＺＬ４及び補正量ＣＬ４を撮像した後に、絶対位置ＺＬ及び補正量ＣＬを変化させて撮像画像ＴＩを撮像する。なお、撮像画像ＴＩを撮像を開始する絶対位置ＺＬ及び補正量ＣＬは、どの絶対位置ＺＬ及び補正量ＣＬから撮像を初めてもよく、上述した絶対位置ＺＬ及び補正量ＣＬに限られない。また、撮像画像ＴＩ８−４は、撮像画像のうちの対象領域ＲＯＩであってもよい。
評価値算出部１４は、撮像画像ＴＩ８に含まれる撮像画像それぞれの評価値を算出する。具体的には、評価値算出部１４は、撮像画像の輝度の統計値、撮像画像の輝度分布、撮像画像のコントラスト、撮像画像の周波数成分、撮像画像の点像分布関数などにより、評価値を算出する。

具体的には、評価値算出部１４は、撮像画像の輝度値に基づいて評価値を算出する場合には、撮像画像に含まれる輝度の最大値の比較をすることにより評価値を算出する。
また、評価値算出部１４は、コントラストが大きくなるほど、輝度分散値が大きくなるほど、又は、隣接画素との輝度微分値が大きくなるほど、球面収差が良好に補正されていると判断して、評価値を算出する。

評価値算出部１４は、撮像画像ＴＩ８の画像の空間周波数の周波数成分に基づいて、評価値を算出する場合には、フーリエ変換などにより得られる周波数成分の値を評価値にする。球面収差が良好に補正されるほど、高周波成分の値は大きくなるからである。
評価値算出部１４は、点像分布関数に基づいて評価値を算出する場合には、点像分布関数を評価値にする。球面収差が良好に補正されるほど、点像分布関数が小さくなる。

評価値算出部１４は、算出した評価値ＲＶを、程度算出部１５に対して出力する。程度算出部１５は、評価値算出部１４から評価値ＲＶを取得する。程度算出部１５は、取得した評価値ＲＶ同士を補間する。程度算出部１５は、補間した結果に基づいて、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを算出する（ステップＳ１５０）。程度算出部１５は、算出した基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを、補正環駆動部２２に対して出力する。

なお、球面収差補正算出装置１０は、厚みが薄い試料が撮像される場合には、対物レンズ２１の絶対位置ＺＬを算出しなくてもよい。この場合には球面収差補正算出装置１０は、絶対位置ＺＬを算出せずに、評価値の算出から行えばよい。

程度算出部１５は、評価値算出部１４が算出した評価値ＲＶを補間する。この一例では、程度算出部１５は、評価値ＲＶ同士を二次曲線フィッティングする。具体的には、程度算出部１５は、最小二乗法により、評価値ＲＶ同士を二次曲線フィッティングする。なお、程度算出部１５は、評価値ＲＶによって、一次関数フィッティングや、指数関数フィッティングによって、評価値ＲＶ同士をフィッティングしてもよい。
図６は、評価値ＲＶ同士を二次曲線フィッティングした一例を示す図である。
図６に示すグラフは、横軸に補正量ＣＬ、縦軸に評価値ＲＶをもつグラフである。
評価値ＲＶ１から評価値ＲＶ７とは、それぞれ評価値算出部１４が算出した評価値ＲＶである。曲線Ｌ１とは、二次曲線フィッティングした結果である。曲線Ｌ１のうち、ピーク部分の評価値は評価値ＲＶＰである。評価値ＲＶＰと対応する補正の程度ＣＰとは、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度である。

［第１の実施形態のまとめ］
以上説明したように、球面収差補正算出装置１０は、評価値算出部１４と程度算出部１５とを備える。評価値算出部１４は、撮像画像ＴＩから、基準フォーカス面情報ＴＦＩと相関が高い撮像画像を選択する。評価値算出部１４は、基準フォーカス面情報ＴＦＩと相関が高い撮像画像が撮像された絶対位置ＺＬにおいて撮像された撮像画像ＴＩ毎に、評価値ＲＶを算出する。程度算出部１５は、評価値算出部１４が算出した評価値ＲＶを補間する。程度算出部１５は、補間された評価値に基づいて、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを算出する。球面収差補正算出装置１０は、基準フォーカス面情報ＴＦＩに焦点位置が合う球面収差の補正の程度を算出することができる。つまり、球面収差補正算出装置１０は、観察者が所望する焦点位置に合わせて球面収差を補正することができる。

言い換えると、球面収差補正算出装置１０は、対物レンズを含む球面収差補正部の球面収差の補正の程度が球面収差補正部のフォーカス面の球面収差補正部の光軸方向の変位に対応付いた球面収差補正光学系を介して、撮像対象と対物レンズとの相対位置が互いに異なる複数の相対位置毎に、互いに異なる複数の補正の程度によって撮像対象が撮像された複数の撮像画像を取得する画像取得部１３と、画像取得部１３が取得する複数の撮像画像ＴＩのうちから、基準フォーカス面の画像と対応する画像が撮像されている補正量ＣＬが異なる複数の撮像画像ＴＩに基づいて、補正の程度の評価値ＲＶを、複数の撮像画像ＴＩ毎にそれぞれ算出する評価値算出部１４と、評価値算出部１４が算出する複数の評価値ＲＶより曲線を求め、最適な補正量を算出する程度算出部１５とを備える装置である。

上述した説明では、撮像対象ＴＰは、厚みがある試料の場合について説明した。この場合には、基準フォーカス面情報ＴＦＩは、基準画像に撮像されたフォーカス面である。しかし、撮像対象ＴＰが、ビーズのように厚みが薄い撮像対象ＴＰを観察する場合には、基準フォーカス面情報ＴＦＩは撮像画像でなくてもよい。この場合には、球面収差補正部２０は、カバーガラスＣＧと撮像対象ＴＰとが接触する面に焦点位置ＯＦを固定すればよい。評価値算出部１４は、対物レンズ２１と撮像対象ＴＰとの絶対位置ＺＬを固定して撮像された撮像画像ＴＩの評価値ＲＶを算出すればよい。

なお、上述した説明では、対物レンズ２１が油浸対物レンズ、又は水浸対物レンズなど液浸対物レンズの場合について説明したが、どのような対物レンズであってもよい。つまり、対物レンズ２１は、液浸に対応していないドライ対物レンズであってもよい。

上述した、対象領域ＲＯＩの縦及び横のピクセル数が、３２ピクセルの整数倍の数のピクセルの場合には、評価値算出部１４は、対象領域ＲＯＩ中の空間周波数を、高速フーリエ変換によって算出することができる。この場合には、評価値算出部１４は、高速に評価値ＲＶを算出することができる。

なお、上述した説明では、評価値算出部１４は、撮像画像の輝度値、撮像画像の輝度分布、撮像画像のコントラスト、撮像画像の空間周波数の周波数成分、撮像画像の点像分布関数などに基づいて評価値を算出する場合について説明した。
評価値算出部１４は、空間周波数成分に基づいて評価値を算出する場合には、補正量ＣＬが異なる撮像画像ＴＩ毎に、基準フォーカス面情報ＴＦＩが示す空間周波数と、撮像画像ＴＩのうちのある撮像画像が示す空間周波数とに基づいて、ある撮像画像についての評価値を算出する。

具体的には、評価値算出部１４は、空間周波数のうち所定の帯域の空間周波数に基づいて、評価値を算出する。この一例では、評価値算出部１４は、低周波成分と高周波成分との値の比に基づいて評価値を算出する。

［第２の実施形態］
ここまでは、球面収差補正算出装置１０が、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを算出する構成について説明した。次に、第２の実施形態の球面収差補正算出装置が、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを固定して、対物レンズ２１の基準フォーカス面の変位と対応する相対位置を算出する構成について説明する。なお、第１の実施形態と同一の構成及び動作については同一の符号を付してその説明を省略する。

次に、図７を参照して、球面収差補正算出装置１０ａの機能構成について説明する。
図７は、第２実施形態の球面収差補正算出装置１０ａの機能構成の一例を示す図である。
球面収差補正算出装置１０ａは、制御部１２ａを備える。制御部１２ａは、第２の画像取得部１３０と、撮像状態評価値算出部１３１と、相対位置算出部１３２とを備える。

第２の画像取得部１３０は、第２の撮像画像ＺＩを撮像部２５から取得する。
第２の撮像画像ＺＩとは、撮像対象ＴＰと対物レンズ２１との相対位置が互いに異なる複数の第２の相対位置毎に、程度算出部１５が算出した基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰによって撮像された複数の撮像画像である。
第２の画像取得部１３０は、撮像部２５から取得した第２の撮像画像ＺＩを、撮像状態評価値算出部１３１に対して出力する。

撮像状態評価値算出部１３１は、第２の画像取得部１３０から第２の撮像画像ＺＩを取得する。
撮像状態評価値算出部１３１は、第２の画像取得部１３０から取得した第２の撮像画像ＺＩに基づいて、第２の評価値ＺＶを算出する。第２の評価値ＺＶとは、撮像対象ＴＰの撮像状態の程度を示す評価値である。撮像対象ＴＰの撮像状態の程度を示す評価値とは、第２の撮像画像ＺＩの撮像画像の輝度値、撮像画像の輝度分布、撮像画像のコントラスト、撮像画像の周波数成分及び撮像画像の点像分布関数などの評価値である。
撮像状態評価値算出部１３１は、算出した第２の評価値ＺＶを、相対位置算出部１３２に対して出力する。

相対位置算出部１３２は、撮像状態評価値算出部１３１から第２の評価値ＺＶを取得する。相対位置算出部１３２は、撮像状態評価値算出部１３１から取得した第２の評価値ＺＶ同士を補間する。相対位置算出部１３２は、補間した第２の評価値ＺＶに基づいて、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを算出する。相対位置算出部１３２は、算出した基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを、対物レンズ駆動部２４及び表示部１１に対して出力する。

対物レンズ駆動部２４は、相対位置算出部１３２から基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを取得する。対物レンズ駆動部２４は、対物レンズ２１と、撮像対象ＴＰとの相対位置を、絶対位置ＺＬＰに調節する。球面収差補正部２０は、対物レンズ２１が、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰ及び基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰの状態で、撮像対象ＴＰを撮像する。

表示部１１は、相対位置算出部１３２から基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを取得する。表示部１１は、相対位置算出部１３２から取得した基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを表示する。

［球面収差補正算出装置１０ａの動作の概要］
次に、図８を参照して、球面収差補正算出装置１０ａの動作の概要について説明する。
図８は、球面収差補正算出装置１０ａの動作の一例を示す流れ図である。

第２の画像取得部１３０は、撮像部２５から、第２の撮像画像ＺＩを取得する（ステップＳ２１０）。第２の画像取得部１３０は、撮像部２５から取得した第２の撮像画像ＺＩを、撮像状態評価値算出部１３１に対して出力する。

撮像状態評価値算出部１３１は、第２の画像取得部１３０から第２の撮像画像ＺＩを取得する。撮像状態評価値算出部１３１は、第２の画像取得部１３０から取得した第２の撮像画像ＺＩの評価値を、第２の評価値ＺＶとして算出する（ステップＳ２２０）。
撮像状態評価値算出部１３１は、上述した評価値算出部１４と同様の方法で、第２の撮像画像ＺＩ毎に第２の評価値ＺＶを算出する。撮像状態評価値算出部１３１は、算出した第２の評価値ＺＶを、相対位置算出部１３２に対して出力する。

相対位置算出部１３２は、撮像状態評価値算出部１３１から第２の評価値ＺＶを取得する。相対位置算出部１３２は、取得した第２の評価値ＺＶを２次元フィッティングにより補間する。相対位置算出部１３２は、上述した程度算出部１５と同様の方法で、第２の評価値ＺＶを補間する。相対位置算出部１３２は、補間した第２の評価値ＺＶから、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを算出する（ステップＳ２３０）。相対位置算出部１３２は、補間した第２の評価値ＺＶのピークと対応する相対位置が、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰであると算出する。

［第２の実施形態のまとめ］
以上説明したように、球面収差補正算出装置１０ａは、撮像状態評価値算出部１３１と、相対位置算出部１３２とを備える。撮像状態評価値算出部１３１は、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを固定し、絶対位置ＺＬが異なる第２の撮像画像ＺＩの第２の評価値ＺＶを算出する。相対位置算出部１３２は、第２の評価値ＺＶ同士を補間し、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを算出する。球面収差補正部２０は、球面収差補正算出装置１０ａが算出する基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰ及び基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰに、対物レンズ２１を調節する。球面収差補正部２０は、基準フォーカス面情報ＴＦＩにより近い面に、対物レンズ２１の焦点位置を調節することができる。

［評価値の算出順について］
上述の説明では、評価値算出部１４は、観察者によって入力される補正環開始位置ＣＢ及び撮像開始位置ＺＢから順に、評価値ＲＶを算出する。

評価値算出部１４は、補正環開始位置ＣＢの代わりに、補正環２１ａが補正できる範囲の中央値近傍の補正の程度によって撮像された撮像画像から順に評価値ＲＶを算出してもよい。具体的には、評価値算出部１４は、図５に示す補正量ＣＬ４から評価値ＲＶを算出し、補正量ＣＬ４から補正量ＣＬ７、補正量ＣＬ４から補正量ＣＬ１の順に評価値ＲＶを算出する。

また、評価値算出部１４は、補正量ＣＬ４の近傍の補正の程度から評価値ＲＶを算出してもよい。具体的には、評価値算出部１４は、ＣＬ３及び補正量ＣＬ５、補正量ＣＬ２及び補正量ＣＬ６、補正量ＣＬ１及び補正量ＣＬ７の順に、評価値ＲＶを算出する。

評価値算出部１４は、対物レンズ２１の光学特性に基づいて、撮像画像ＴＩのうちから評価値ＲＶを算出する順番を決定してもよい。評価値算出部１４は、対物レンズ２１の光学特性に基づくと、補正量ＣＬの調節に伴う焦点位置ＯＦの変位と、絶対位置ＺＬの変化とが対応付けられる。評価値算出部１４は、焦点位置ＯＦの変位に基づいて、評価値ＲＶを算出する順番を決定することができる。評価値算出部１４は、評価値ＲＶのピークの算出に必要な撮像画像ＴＩの撮像枚数を減らすことができる。球面収差補正部２０は、撮像画像ＴＩを撮像する回数を減らすことができる。つまり、撮像対象ＴＰが染色された試料の場合には、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを算出するための撮像による、試料の退色の程度を抑えることができ、より鮮明な撮像画像を撮像することができる。

［基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰの算出について］
程度算出部１５は、評価値算出部１４が算出する評価値ＲＶ同士を順次補間していき、補完された評価値ＲＶのピークを算出できればよい。程度算出部１５は、評価値ＲＶのピークが検出できた時点で処理を終了し、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰを算出してもよい。程度算出部１５は、ピークが検出できた時点で処理を終了する為、基準フォーカス面の変位と対応する補正の程度ＣＰの算出にかかる時間を短くすることができる。

［絶対位置ＺＬの調節について］
上述した説明では、対物レンズ２１と撮像画像ＴＩとの絶対位置ＺＬは、対物レンズ２１を対物レンズ駆動部２４が駆動することにより調節する構成について説明したが、ステージ２３を光軸ＯＡ方向に移動させて調節してもよい。ステージ２３を調節する場合には、球面収差補正部２０はステージ駆動部（不図示）を備える。この場合には、ステージ駆動部は、基準フォーカス面の変位と対応する絶対位置ＺＬＰを取得すると、ステージ２３を駆動させる。ステージ２３が駆動されると、対物レンズ２１と撮像対象ＴＰとの絶対位置ＺＬが調節される。なお、ステージの上下動駆動機構は、一般的な顕微鏡のステージ上下動機構が使用できる。例えば、カム機構や歯車と歯車にかみ合う係合部材が使用できる。また、対物レンズ側を光軸方向に移動させる機構も一般的な顕微鏡で用いられている機構を使用できる。例えば、歯車と係合部材、リンク機構による上下動機構、カム機構などが使用できる。

次に、球面収差補正部２０を備える顕微鏡について説明する。
顕微鏡は、球面収差補正光学系を有する対物レンズと、撮像対象物を載置するステージと、画像群生成部を備える。ここで、顕微鏡とは、画像群生成装置の一例である。

画像群生成部は、第一の画像群と、第二の画像群とを含む画像群を生成する。画像群生成部とは、図７の例えば画像取得部１３内に設けられる装置である。また、画像生成装置とは、画像取得部を有する装置である。

第一の画像群は、第一の収差補正量で球面収差補正光学系を調整した状態で、対物レンズとステージの相対距離を変えながら、撮像対象物を連写することで得られる。相対距離とは、対物レンズとステージとの間隔であり、対物レンズとステージの各位置とを対象とすれば相対位置と同義である。

第二の画像群は、第二の収差補正量で球面収差補正光学系を調整した状態で、対物レンズとステージとの相対距離を変えながら、撮像対象物を連写することで得られる。なお、第１の画像群とは、図５において、例えば撮像画像ＴＩ１であり、第２の画像群とは、例えば撮像画像ＴＩ２である。

連写とは、上述した図５の補正量ＣＬ１の補正の程度において撮像され、各対物レンズの位置ＺＬを各位置で停止して、異なる対物レンズの位置ＺＬの画像を続けて撮像することである。

画像群生成部とは、上述した図７の例えば画像取得部１３内に設けられる装置である。また、画像生成装置とは、画像取得部を有する装置である。

以上、本発明の実施形態を、図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加えることができる。

なお、上述の球面収差補正算出装置１０及び球面収差補正算出装置１０ａは内部にコンピュータを有している。そして、上述した装置の各処理の過程は、プログラムの形式でコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記憶されており、このプログラムをコンピュータが読み出して実行することによって、上記処理が行われる。ここでコンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等をいう。また、このコンピュータプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータが当該プログラムを実行するようにしてもよい。

また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよい。
さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。

１０…球面収差補正算出装置、１１…表示部、１２，１２ａ…制御部、１３…画像取得部、１４…評価値算出部、１５…程度算出部、１６…基準フォーカス面情報取得部、１７…操作検出部、２０…球面収差補正部、２１…対物レンズ、２１ａ…補正環、２２…補正環駆動部、２３…ステージ、２４…対物レンズ駆動部、２５…撮像部、１００…球面収差補正光学系システム、１３０…第２の画像取得部、１３１…撮像状態評価値算出部、１３２…相対位置算出部

Claims (11)

1. 球面収差補正光学系を有する対物レンズと、
   撮像対象物を載置するステージと、
   第一の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第一の画像群と、
   第二の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第二の画像群と
   を含む画像群を生成する画像群生成部と
   を備える画像群生成装置。
2. 請求項１に記載の前記画像群生成装置と、
   前記画像群を構成する前記画像ごとの評価値を算出する評価値算出部と、
   前記評価値に基づいて、前記収差補正量の最適値を求める収差補正量算出部と
   を更に備える球面収差補正算出装置。
3. 前記評価値算出部は、
   前記画像群の中から予め定めた基準画像に更に基づいて評価値を算出し、
   前記基準画像とは、前記対物レンズの収差補正量を任意の収差補正量に設定し、前記撮像対象物に前記対物レンズの焦点が合った状態で撮像された観察位置の画像である
   請求項２に記載の球面収差補正算出装置。
4. 前記収差補正量算出部は、
   前記評価値算出部が算出する複数の前記評価値同士を補間して前記収差補正量を算出する
   請求項２又は請求項３に記載の球面収差補正算出装置。
5. 前記評価値算出部は、
   前記収差補正量が異なる複数の前記撮像画像毎に、
   前記基準画像が示す空間周波数と、複数の前記撮像画像のうちのある前記撮像画像が示す空間周波数とに基づいて評価値を算出する
   請求項２から請求項４の何れか一項に記載の球面収差補正算出装置。
6. 前記評価値算出部は、
   前記空間周波数のうち所定の帯域の空間周波数に基づいて、前記評価値を算出する、
   請求項５に記載の球面収差補正算出装置。
7. 請求項２から請求項６のいずれかの前記評価値算出部で算出された評価値に基づいて、前記対物レンズの球面収差補正光学系を光軸方向に移動する収差補正光学系の駆動部を備える顕微鏡。
8. 前記顕微鏡は、前記駆動部による収差補正光学系を移動した後に前記対物レンズと前記ステージの相対位置を光軸方向に移動させる駆動部を備える
   請求項７に記載の顕微鏡。
9. コンピュータに
   球面収差補正光学系を有する対物レンズと、
   撮像対象物を載置するステージと、
   第一の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第一の画像群と、
   第二の収差補正量で前記球面収差補正光学系を調整した状態で、前記対物レンズと前記ステージの相対距離を変えながら、前記撮像対象物を連写することで得られる第二の画像群と
   を含む画像群を生成する画像群生成ステップ
   を実行させるための画像群生成プログラム。
10. コンピュータに
    複数の収差補正量で対物レンズとステージの相対位置を光軸方向に変更し撮像した画像群の中から予め定めた基準画像に基づき異なる収差補正量で撮像された撮像画像を複数抽出し、前記抽出した各撮像画像の評価値を算出するステップと、
    前記各評価値を基に前記収差補正量を算出するステップと
    を実行させるための球面収差補正算出プログラム。
11. 複数の収差補正量で対物レンズとステージの相対位置を光軸方向に変更し撮像した画像群の中から予め定めた基準画像に基づき異なる収差補正量で撮像された撮像画像を複数抽出し、前記抽出した各撮像画像の評価値を算出し、
    前記各評価値を基に前記収差補正量を算出する
    球面収差補正算出方法。