JPWO2018056409A1 - 卵巣機能の低下予防又は改善剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[2] [1]に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用医薬組成物。
[3] [1]に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用飲食品組成物。
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、プテロスチルベンを有効成分とすることを特徴とする。本発明に用いられるプテロスチルベンは、化学的に合成されたもの又は天然物より得られるもののいずれをも用いることができる。天然物より得られるものとしては、例えばマメ科シタン属に属する植物インドキノキ(Pterocarpus marsupium)から得られるものが挙げられる。プテロスチルベンの製造方法の一例としては、インドキノキの幹、枝、葉、花、根を含む全木、あるいは、インドキノキの幹、枝、葉、花、根を常法で破砕し、破砕粉体から常法でプテロスチルベンを含有する抽出物を得る方法等が挙げられる。本発明においては、プテロスチルベンは抽出物、破砕物の状態であっても、適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなプテロスチルベンを含有する抽出物、破砕粉体物、精製物、化学合成物の1種又は2種以上を組み合わせて使用することができる。また、プテロスチルベンは、市販のものを用いてもよい。
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、卵巣機能の低下の予防、及び、低下した卵巣機能を改善・治療する作用を有する。卵巣機能の低下の予防又は改善・治療作用は、特に限定されないが、例えば、排卵卵子数の低下の抑制・排卵卵子数の増加、卵子内ミトコンドリア活性の低下の抑制・卵子内ミトコンドリア活性の増加、受精卵着床率の低下の抑制・受精卵着床率の増加、生児(生仔)率の低下の抑制・生児(生仔)率の増加、流産率の増加の抑制・流産率の低下、人工受精・体外受精・顕微授精成功率の増加等であり得る。
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、有効成分としてのプテロスチルベン以外に、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤等の医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤等を含有させて、医薬組成物とすることも可能である。
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、医薬品として以外にも、医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食品等として使用することができる。医薬部外品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品等の技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、または飲食品として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤等の食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、固体状、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等の所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれるプテロスチルベンの割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。例えば、医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食物におけるプテロスチルベンの含有量は、組成物の全質量に対して、通常0.01質量%〜10質量%、好ましくは0.05質量%〜5質量%、より好ましくは0.01質量%〜0.5質量%であり得る。医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食品等は、各分野の通常の製造方法を用いて製造することができる。
(実験動物)
25週齢のICR雌マウス(日本クレア, Tokyo, Japan)20匹をランダムに5匹ずつ、4ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55%、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料(オリエンタル酵母, Tokyo, Japan)もしくはプテロスチルベン(シルビノール90%, サビンサジャパンコーポレーション, Tokyo, Japan)含有飼料(プテロスチルベン0.04質量%含有)マウス一匹あたり一日6 gを、図1の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。飼育中は週に一回の体重測定を行った。25週における各群のマウスの体重(群平均値)、及び、47週における各群のマウスの体重(群平均値)を図2に示す。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。
47週齢を過ぎたマウスは膣スメアにより性周期を確認した。発情前期のタイミングでゴナトロピン(ASKA Pharmaceutical. Co., Tokyo, Japan) 10 IUを腹腔内投与した。投与後15時間で卵子卵丘細胞複合体(COCs:Cumulus Oocyte Complexes)を卵管内から回収し、100mL TYH medium(LSI Medience corporation, Tokyo, Japan)内で30分間前培養した。その間にICR雄マウス(10-12週齢)にソムノペンチル麻酔薬(共立製薬, Tokyo, Japan)で全身麻酔を施し、精巣上体尾部を摘出した。精巣上体尾部の一部を切開し内部の精子を押し出すように回収した。回収した精子塊を400mL TYH mediumが入った1.5 mLマイクロチューブに沈めてCO2 incubator 内で10分間swim upした(37℃、5% CO2、95% in air)。Swim up後の精子をCOCsが入った100mL TYH mediumに最終濃度2-3×105/mLとなるように加え、CO2 incubator (37℃、5% CO2、95% in air)内で5-6時間培養した。培養後の卵子は30mL KSOM Medium(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)内で精子の除去を行い、その際に正確な排卵卵子数を算出した。その後、別の30mL KSOM Mediumに移し、CO2 incubator 内で4日間培養した。受精率と胚盤胞形成率はそれぞれ、二細胞期胚数/第二減数分裂中期(MII)卵子数、胚盤胞数/二細胞期胚数で算出した。結果を図3に示す。
4日間の培養後、胚盤胞期胚に到達した胚を胚移植した。Recipientマウスは6-10週齢のICR雌マウスで、採卵日の前日に精管結紮されたICR雄マウスと交配させ、翌日膣栓が確認できた個体を使用した。ソムノペンチル麻酔薬で全身麻酔を施し、後背部切開により子宮を露出させた。子宮をピンセットで固定し30G の注射針(Dentronics, Tokyo, Japan)で卵管接合部に穴を開け、胚盤胞を吸引したガラスキャピラリーを挿入し子宮内部に胚を移植した。移植後、子宮を慎重に体内に戻し、後腹膜及び皮膚を縫合した。移植に際しては、各群のマウスから得られた胚盤胞を個体毎にそれぞれRecipientマウスに移植した。採卵の翌日を1日目として、19日目で帝王切開を実施した。Recipientマウスを安楽死させ開腹、子宮を摘出して胎仔及び胎盤を取り出した。着床率は着床痕数/胚移植数、生仔獲得率は生仔数/胚移植数、流産率は1-生仔獲得率で算出した。結果を図4に示す。また、生仔体重及び胎盤重量を測定した。結果を図5に示す。
プテロスチルベンと同じくスチルベン誘導体であるレスベラトロールを用いて実験を行った。
(実験動物)
25週齢のICR雌マウス(日本クレア, Tokyo, Japan)15匹をランダムに5匹ずつ、3ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55%、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料(オリエンタル酵母, Tokyo, Japan)もしくはレスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシ-trans-スチルベン(trans-1,2-(3,4',5-トリヒドロキシジフェニル)エチレン),東京化成工業株式会社, Tokyo, Japan)含有飼料(レスベラトロール0.04質量%含有)マウス一匹あたり一日6 gを、図7の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。飼育中は週に一回の体重測定を行った。25週における各群のマウスの体重(群平均値)、及び、47週における各群のマウスの体重(群平均値)を図8に示す。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。
実施例1に記載の方法に基づき、47週齢を過ぎた各群のマウスについて、体外受精及び胚培養を行った。排卵卵子数、受精率及び胚盤胞形成率を算出した。結果を図9に示す。
実施例1に記載の方法に基づき、胚盤胞期胚に到達した胚の胚移植及び帝王切開を行った。着床率、生仔獲得率、流産率を算出した。結果を図10に示す。
(実験動物)
25週齢のICR雌マウス(日本クレア, Tokyo, Japan)20匹をランダムに5匹ずつ、4ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55%、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料(オリエンタル酵母, Tokyo, Japan)もしくはプテロスチルベン(シルビノール90%, サビンサジャパンコーポレーション, Tokyo, Japan)含有飼料(プテロスチルベン0.04質量%含有)マウス一匹あたり一日6 gを、図11の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。本試験は3回繰り返しおこない、各群総計30匹のマウスを実験に用いた。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。
47週齢を過ぎたマウスは膣スメアにより性周期を確認した。発情前期のタイミングでゴナトロピン(ASKA Pharmaceutical. Co., Tokyo, Japan) 10 IUを腹腔内投与した。投与後15時間で卵子卵丘細胞複合体(COCs:Cumulus Oocyte Complexes)を卵管内から回収し、M16 medium + ヒアルロニダーゼにて卵丘細胞を剥離、卵子を単離した。その際、各群の排卵数を記録した。結果を図12に示す。
単離した卵子をMitotracker 及びHoechst33342を加えたM16 mediumにて10分処理した。その後、M16 mediumにて3回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡(LSM 510: Zeiss)にて観察・蛍光強度の測定を行った。結果を図13に示す。
単離した卵子をAcidified Tyrode's solutionで処理し、透明帯を除去した。得られた卵細胞質を5μLのM16 mediumと共に、1.5mLマイクロチューブに移し-20℃にて保存した。後日、ATP-Glo assay kitを用いて、マルチスペクトロマイクロプレートリーダー(Varioskan Flash : Thermo Scientific)により発光を測定することでATP量を測定した。結果を図14に示す。
単離した卵子をAcidified Tyrode's solutionで処理し、透明帯を除去した。得られた卵細胞質を10μL のLysis bufferと共に、1.5mLマイクロチューブに移し-20℃にて保存した。後日、細胞ライセートそれをtemplateにリアルタイムPCRを実施した。得られた結果から、ミトコンドリアDNAコピー数を算出した。結果を図15に示す。
(血中プテロスチルベン及びレスベラトロール濃度測定)
実施例1及び比較例1における妊孕性試験実施時に回収して、-80℃にて保存していた血清サンプルを用いて実施した。血清サンプルは凍結状態のまま、株式会社住化分析センターに送付した。LC-MSとHPLCにより解析を依頼した。結果を図16に示す。
(トランスレスベラトロール投与実験)
プテロスチルベンはレスベラトロールのメチル化構造体であり、一般的によく用いられているトランスレスベラトロールよりも安定した構造体である。実施例2のプテロスチルベン投与の添加実験デザインと全く同じデザインで、トランスレスベラトロール添加投与実験を実施し血中濃度を比較することで生体内での安定性を検討した。結果を図17に示す。
(卵巣組織解析)
実施例1における妊孕性試験実施時に回収しホルマリン固定後、保存していた卵巣組織(コントロール及び22wk)を用いて組織解析を実施した。卵巣組織はパラフィン包埋し、ミクロトームにて4μmの厚さの切片を作製した。作製した切片を用いて、TUNEL染色及び8-OHdG染色を実施し、蛍光顕微鏡(BZ-X710:KEYENCE)にて観察した。TUNEL染色では細胞のアポトーシスを検出し、8-OHdG染色では細胞DNAの酸化ダメージを検討した。結果を図18及び19に示す。
Claims (3)
- プテロスチルベンからなる、卵巣機能の低下予防又は改善剤。
- 請求項1に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用医薬組成物。
- 請求項1に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用飲食品組成物。
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