IT202100007238A1 - Nuovo uso di un composto polifenolico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Nuovo uso di un composto polifenolico?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto lo pterostilbene per uso nel trattamento o nella prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit? o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?.
STATO DELL?ARTE
L?infertilit? ? definita dall?Organizzazione Mondiale della Sanit? (OMS) come l?incapacit? di concepire dopo 12 mesi di rapporti regolari non protetti. Questo intervallo di tempo deve essere ridotto a 6 mesi per le donne di et? oltre 35 anni o in presenza di fattori di rischio.
Si stima che circa il 15% delle coppie in et? fertile, su scala mondiale, presenti una difficolt? di concepimento; parliamo quindi di una condizione relativamente comune che affligge circa 100 milioni di persone. Secondo i dati pi? recenti, risulta che questi numeri siano in costante aumento; ci? ? dovuto a vari fattori quali errate abitudini di vita (Fumo, Alcol e Droghe), inquinamento e agenti chimici che incidono negativamente sulla capacit? riproduttiva femminile e maschile, l?obesit? e le Infezioni.
Inoltre, le cause dell?infertilit? possono essere legate ad una condizione patologica della donna, dell?uomo o di entrambi. Il fattore femminile sembra essere responsabile in circa il 30-40% dei casi di infertilit?; il fattore maschile ? il solo responsabile in circa il 30-40% dei casi, mentre nel 10-20% dei casi partecipa, insieme a quello femminile, a un?infertilit? di coppia.
In circa il 10-20% dei casi, infine, si parla di infertilit? idiopatica, ovvero quando gli esami diagnostici non sono riusciti a individuare alcuna causa specifica.
Le cause di infertilit? femminile sono numerose e di diversa natura: infezioni, alterazioni ormonali, immunologiche o dell'apparato riproduttivo, malformazioni congenite, endometriosi ecc. Indipendentemente dalla causa, la capacit? riproduttiva della coppia subisce un declino con l'et? e tale fenomeno si manifesta in maniera pi? sensibile nella donna a causa di fattori ormonali, di un aumento degli aborti correlato con l?et? e, soprattutto, a causa di una diminuita riserva ovarica e dell?invecchiamento degli ovociti.
La fertilit? si riduce gradualmente con l?et?, subendo un considerevole calo dopo i 35 anni che diventa ancora pi? evidente dopo i 40 anni (a 30 anni la possibilit? di concepire per ciclo fertile ? intorno al 30-40%, possibilit? ? ridotta al 10% a 40 anni).
Nel caso di alterazioni tubariche, ed in particolare di ostruzioni, qualora queste siano di lieve entit? ? possibile combinare tecniche microchirurgiche alla somministrazione di farmaci. Nel caso in cui, invece, la mancata gravidanza sia da correlare alla sindrome delle ovaie policistiche, il medico pu? decidere di far ricorso a un trattamento farmacologico a base di FSH e LH a supporto dell?ovulazione. Tuttavia, la terapia farmacologica pu? non produrre effetti rilevanti e in questi casi la soluzione pi? opportuna resta la fecondazione assistita.
La capacit? fertile nel maschio si basa su una fase secretoria (produzione degli spermatozoi) e una successiva fase escretoria (trasporto attraverso le vie escretrici). Pertanto, l?infertilit? maschile ? dovuta sia a cause idiopatiche (fino al 60%) sia a cause note, cio? correlate a una insufficiente produzione di spermatozoi, ad anomalie nella qualit? degli spermatozoi prodotti (per ridotta motilit?, alterata morfologia o danni al DNA) o a un ostacolo nel trasporto lungo le vie spermatiche.
La terapia farmacologica per il trattamento dell?infertilit? maschile ? finalizzata a correggere quelle alterazioni che hanno determinato l?infertilit? non esistendo una terapia univoca che aumenti la concentrazione degli spermatozoi e ne corregga le anomalie di forma. Ad esempio, determinati ormoni vengono utilizzati con successo per combattere l?ipogonadismo ipogonadotropo o dopo l?intervento di varicocele. Antibiotici ed antinfiammatori si usano nella terapia delle infiammazioni del testicolo e della prostata e gli antiossidanti che si utilizzano per migliorare la qualit? dello spermatozoo.
Nel caso in cui l?infertilit? sia legata a patologie non suscettibili di approccio medico interviene la chirurgia; questa ? finalizzata alla risoluzione delle patologie come il varicocele, l?ostruzione delle vie genitali, cisti o malformazioni dell?utricolo prostatico.
Pertanto, ? di attuale interesse lo sviluppo di una terapia in grado di trattare e/o di prevenire l?infertilit? sia femminile che maschile in modo non invasivo. In particolare, ? molto sentita l?esigenza di una terapia farmacologica in grado di agire su pi? concause che possono determinare l?infertilit? sia maschile che femminile.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda lo pterostilbene per uso nel trattamento o nella prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit?, o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?. Preferibilmente, detto trattamento o prevenzione dell?infertilit? comprende aumentare la fertilit?, o ridurre il tasso di declino della fertilit? o ripristinare la fertilit? in un individuo.
Un secondo aspetto della presenta invenzione si riferisce ad una composizione comprendente lo pterostilbene per gli usi medici sopra descritti. In una forma di attuazione, la composizione comprende sali, tamponi, eccipienti, veicolanti, preservanti e/o loro combinazioni accettati per la preparazione di prodotti farmaceutici.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda un metodo in vitro per aumentare la percentuale di successo di una fecondazione in vitro o in vivo, comprendente almeno una fase di coltura di uno zigote o di un embrione fecondato in vitro, in un mezzo di coltura comprendente pterostilbene.
Un quarto aspetto della presente invenzione, si riferisce ad un metodo per il trattamento o la prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit?, o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?.
Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace di pterostilbene o di una composizione che lo comprenda ad un individuo che ne abbia necessit?.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 mostra un grafico con l?effetto dose-risposta di concentrazioni crescenti di pterostilbene sulla decidualizzazione: a) espressione del marker prolattina (PRL); b) espressione del marker IGFBP-1;
La Figura 2 mostra l?espressione dei geni PRL e IGFBP-1 valutata nel corso del processo di decidualizzazione ottenuto con pterostilbene [1?M], protocollo classico o protocollo classico pterostilbene [1?M];
La Figura 3 mostra un grafico dell?effetto dose-risposta di concentrazioni crescenti di pterostilbene sull?espressione del marker di impianto LIF;
La Figura 4 mostra l?espressione di LIF valutata nel corso del processo di decidualizzazione ottenuto con pterostilbene [1?M], protocollo classico o protocollo classico pterostilbene [1?M];
La Figura 5 mostra: A) la prolattina secreta nel mezzo quantificata mediante saggio ELISA; B) IGFBP-1 secreto nel mezzo quantificato mediante saggio ELISA;
La Figura 6 mostra LIF secreto nel mezzo quantificato mediante saggio ELISA; e
La Figura 7 mostra un immunoblot: le colonne si riferiscono a: 1 ESC controllo; 2 ESC pterostilbene [1?M]; 3 ESC progesterone cAMP; 4 ESC progesterone cAMP pterostilbene [1?M].
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?conta ecografica di follicoli antrali? o ?AFC? si intende la conta dei follicoli antrali in un individuo tramite una ecografia pelvica transvaginale.
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?riserva ovarica? si intende il numero di ovociti ovvero la capacit? dell'ovaio di produrre follicoli ovarici capaci di essere fertilizzati per iniziare una gravidanza.
Nel contesto della presente invenzione con l?espressione ?ridurre il tasso di declino dei livelli sierici dell?ormone anti-mulleriano (AMH)? si intende ridurre di almeno il 30% il normale declino dei valori sierici di AMH in un individuo femminile. In individuo con un?et? compresa tra 18 e 40 anni, la riduzione dei valori sierici di AMH ? compresa tra 0,1 e 0,15 ng/ml in 12 mesi.
Nel contesto della presente invenzione con il temine ?infertilit?? si intende una condizione patologica di un individuo caratterizzata dall?assenza di concepimento dopo almeno 12 mesi di regolari rapporti sessuali non protetti.
Nel contesto della presente invenzione con il temine ?declino di fertilit?? si intende una condizione sub-patologica caratterizzata da difficolt? nel concepimento e/o da valori sieri di AMH al di sotto dei valori standard della norma e/o con valori di AFC inferiori alla norma.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda lo pterostilbene per uso nel trattamento o nella prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit?, o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?.
Preferibilmente, detto trattamento o prevenzione dell?infertilit? comprende aumentare la fertilit?, o ridurre il tasso di declino della fertilit? o ripristinare la fertilit? in un individuo.
In una forma di realizzazione, il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende ripristinare o stimolare l?ovulazione in un individuo anovulatorio di sesso femminile o migliorare la qualit? dello sperma in un individuo di sesso maschile.
Preferibilmente, il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende ridurre il tasso di declino della conta di follicoli antrali (AFC), o ridurre il tasso di declino dei livelli sierici dell?ormone anti-mulleriano (AMH), o aumentare la decidualizzazione dell?endometrio, o diminuire il tasso di declino degli ovociti, o aumentare il numero di ovociti, o aumentare il tasso di successo della gravidanza in un individuo di sesso femminile che soffre di un declino della fertilit?, o prevenire diabete gestazionale o la preclampsia.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, l?individuo ? affetto dalla sindrome dell?ovaio policistico (PCOS).
In una forma di attuazione, il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende aumentare la conta spermatica, o aumentare la motilit? spermatica, o ridurre la percentuale di frammentazione del DNA spermatico in un individuo di sesso maschile che soffre di un declino della fertilit?.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una riserva ovarica nella norma. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH superiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una ridotta riserva ovarica. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC inferiore a 10, pi? preferibilmente inferiore a 8 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml.
In una forma di realizzazione preferita, il trattamento con pterostilbene riduce il tasso di declino dei valori sierici di AMH e di AFC del 35-60% rispetto ai valori di riduzione di AMH e AFC attesi in base all?et? dell?individuo.
Preferibilmente, ridurre il tasso di declino dei valori sierici di AMH comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,05 e 0,1 ng/ml di AMH in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,06 e 0,09 ng/ml in 12 mesi.
Preferibilmente, ridurre il tasso di declino di AFC comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,1 e 0,5 follicoli in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,2 e 0,4 follicoli in 12 mesi.
Preferibilmente, aumentare la decidualizzazione dell?endometrio comprende aumentare i livelli di espressione genica e/o proteica di prolattina (PRL), e/o di insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) e/o di leukemia inhibiting factor (LIF) rispetto ai livelli di espressione genica e/o proteica in un individuo non trattato con pterostilbene.
In una forma di realizzazione, detto pterostilbene ? assunto, per gli scopi medici sopra riportati, in una quantit? compresa e tra 50 e 400 mg al giorno, pi? preferibilmente tra 70 e 250 mg al giorno, ancor pi? preferibilmente compresa tra 100 e 150 mg al giorno.
In una forma di attuazione, lo pterostilbene ? assunto almeno una volta al giorno, preferibilmente almeno due volte al giorno. Per gli scopi medici sopra descritti, lo pterostilbene ? assunto per un periodo di tempo di almeno 45 giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra 50 e 365 giorni, pi? preferibilmente compreso tra 70 e 200 giorni.
In una forma di realizzazione preferita, lo pterostilbene viene assunto per almeno 60 giorni.
Preferibilmente, lo pterostilbene ? assunto per via enterale, preferibilmente per via orale.
In una forma di realizzazione, lo pterostilbene ? assunto in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit?, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
Preferibilmente, lo pterostilbene ? assunto prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
In una forma di attuazione, lo pterostilbene ? assunto in associazione o in combinazione con almeno un farmaco utilizzato per il trattamento dell?infertilit?. Preferibilmente, detto almeno un farmaco ? scelto tra: FSH, hMG, clomifene citrato, un antiestrogeno, un analogo dell?FSH, un analogo del GnRH, un integratore, complessi vitaminici, probiotici, paraprobiotici, coenzima Q10, carnitina, d-chiro-inositolo, mio-inositolo, resveratrolo e loro combinazioni.
Infatti, la Richiedente ha dimostrato che lo pterostilbene agisce sull?apparato riproduttivo di un individuo di sesso femminile migliorando la decidualizzazione dell?endometrio, ripristinando l?ovulazione nelle pazienti anovulatorie e riducendo il tasso di declino dei follicoli primordiali. In un individuo di sesso maschile, lo pterostilbene riduce la percentuale di frammentazione del DNA degli spermatozoi con possibili ripercussioni positive sulla fertilizzazione.
Un secondo aspetto della presente invenzione si riferisce ad una composizione comprendente lo pterostilbene per gli usi medici sopra descritti. In una forma di attuazione, la composizione comprende sali, tamponi, eccipienti, veicolanti, preservanti e/o loro combinazioni accettati per la preparazione di prodotti farmaceutici.
In una forma di attuazione preferita dell?invenzione, la composizione comprende come unico principio attivo lo pterostilbene, ovvero la composizione non comprende ulteriori molecole con attivit? farmacologica sull?apparato riproduttivo di un individuo di sesso maschile o femminile. In una forma di realizzazione dell?invenzione, detta composizione ? formulata per una somministrazione enterale, preferibilmente per la somministrazione orale. In particolare, la composizione ? formulata in forma solida, preferibilmente in forma di compresse, capsule, tavolette, polvere granulare, opercoli, granuli orosolubili, bustine o confetti.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per aumentare la percentuale di successo della fecondazione in vitro. Detto metodo in vitro comprende almeno una fase di coltura di uno zigote o di un embrione fecondato in vitro in un mezzo di coltura comprendente pterostilbene. Preferibilmente, il gamete utilizzato per la fecondazione in vitro ? prelevato da un individuo che ha assunto pterostilbene per almeno 3 mesi prima del prelievo del gamete. Preferibilmente, l?individuo ha assunto pterostilbene per almeno 3 mesi al dosaggio di 125 mg die prima del prelievo del gamete. Infatti, detto trattamento con pterostilbene ? associato ad un aumento del recupero ovocitario e ad un aumento della percentuale di embrioni euploidi disponibili per il transfer in utero.
Un quarto aspetto della presente invenzione, si riferisce ad un metodo per il trattamento o la prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit?, o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?.
Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace di pterostilbene o di una composizione che lo comprenda ad un individuo che ne abbia necessit?.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, l?individuo ? affetto dalla sindrome dell?ovaio policistico (PCOS).
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una riserva ovarica nella norma. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH superiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una ridotta riserva ovarica. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC inferiore a 10, pi? preferibilmente inferiore a 8 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml.
In una forma di realizzazione preferita, il metodo sopra descritto riduce il tasso di declino dei valori sierici di AMH e di AFC del 35-60% rispetto ai valori di riduzione di AMH e AFC attesi in base all?et? dell?individuo.
Preferibilmente, ridurre il tasso di declino dei valori sierici di AMH comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,05 e 0,1 ng/ml di AMH in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,06 e 0,09 ng/ml in 12 mesi.
Preferibilmente, ridurre il tasso di declino di AFC comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,1 e 0,5 follicoli in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,2 e 0,4 follicoli in 12 mesi.
Preferibilmente, il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende aumentare i livelli di espressione genica e proteica di prolattina (PRL), e/o di insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) e/o di leukemia inhibiting factor (LIF) rispetto ai livelli di espressione genica e/o proteica in un individuo non trattato con pterostilbene.
In una forma di realizzazione, detto pterostilbene ? somministrato, per gli scopi medici sopra riportati, in una quantit? compresa e tra 50 e 400 mg al giorno, pi? preferibilmente tra 70 e 250 mg al giorno, ancor pi? preferibilmente compresa tra 100 e 150 mg al giorno.
In una forma di attuazione, lo pterostilbene ? somministrato almeno una volta al giorno, preferibilmente almeno due volte al giorno. Per gli scopi medici sopra descritti, lo pterostilbene ? somministrato per un periodo di tempo di almeno 45 giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra 50 e 365 giorni, pi? preferibilmente compreso tra 70 e 200 giorni.
In una forma di realizzazione preferita, lo pterostilbene viene somministrato per almeno 60 giorni. Preferibilmente, lo pterostilbene ? somministrato per via enterale, preferibilmente per via orale.
In una forma di realizzazione, lo pterostilbene ? somministrato in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit?, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
Preferibilmente, lo pterostilbene ? somministrato prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
In una forma di attuazione, lo pterostilbene ? somministrato in associazione o in combinazione con almeno un farmaco utilizzato per il trattamento dell?infertilit?. Preferibilmente, detto almeno un farmaco ? scelto tra: FSH, hMG, clomifene citrato, un antiestrogeno, un analogo dell?FSH, un analogo del GnRH, un integratore, complessi vitaminici, probiotici, paraprobiotici, coenzima Q10, carnitina, d-chiro-inositolo, mioinositolo, resveratrolo e loro combinazioni.
ESEMPIO
Effetti di un trattamento di 12 mesi con lo pterostilbene in pazienti con sindrome dell?ovaio policistico.
? stato svolto un trial pilota di natura prospettica su 13 pazienti affette da sindrome dell?ovaio policistico (PCOS). Scopo dello studio era studiare gli affetti sulla ciclicit? mestruale e sulla riserva ovarica di un trattamento di 12 mesi con pterostilbene.
Le pazienti sono state arruolate in un range di et? tra 18 e 40 anni. Il principale criterio di inclusione era il rispetto dei criteri di Rotterdam per la diagnosi di PCOS (presenza di oligo/anovulazione e almeno uno tra: iperandrogenismo/iperandrogenemia, oppure ovaie di aspetto policistico all?ecografia).
Criteri di esclusione erano: presenza di cisti ovariche, presenza di malattie endocrino-metaboliche. Le pazienti sono state sottoposte allo studio della riserva ovarica tramite il dosaggio dell?AMH sierico e la conta dei follicoli antrali all?ecografia (AFC). Le caratteristiche demografiche delle pazienti sono rappresentate in Tabella I.
Tutte le pazienti hanno assunto per 12 mesi pterostilbene al dosaggio di 100 mg due volte al giorno.
Obiettivi dello studio
Obiettivo primario dello studio: valutare l?effetto del trattamento sulla ciclicit? mestruale delle pazienti.
Obiettivi secondari:
? Valutare l?effetto del trattamento sulla perdita di peso
? Riduzione dell?AMH in 12 mesi
? Riduzione della AFC in 12mesi
Risultati
Dallo studio ? emerso che, dopo trattamento per 12 mesi con pterostilbene, il 68% delle pazienti ha recuperato mestruazioni regolari (con ciclicit? 25?7giorni), in associazione a una modesta perdita di peso. Il tempo medio per il recupero della ciclicit? mestruale ? stato di 5,5 mesi. Si ? osservato in particolare che le pazienti che hanno recuperato regolare ciclicit? mestruale erano quelle con AMH e AFC pi? bassi alla visita basale (Tabella II).
Alcune delle pazienti (n=6) stavano assumendo inositolo come integratore alimentare. In queste pazienti il tempo medio di recupero della ciclicit? mestruale ? stato significativamente pi? breve (3,8 mesi vs 6.5; p<0.01).
Inoltre, in tutte le pazienti trattate con pterostilbene, il tasso di riduzione nel tempo di AMH e AFC ? stato del 50% pi? basso rispetto a quanto atteso in base ai nomogrammi che rappresentano il declino di questi markers con l?et? (Tabella II).
Tabella I. Caratteristiche demografiche delle pazienti
Tabella II. Effetti del trattamento
Valutazione dell?attivit? di pterostilbene sulla decidualizzazione e sull?espressione di proteine dell?impianto in colture primarie di cellule endometriali stromali
Sono stati analizzati gli effetti di pterostilbene sulla decidualizzazione di ESC indifferenziate con particolare attenzione alla regolazione di geni considerati marker di decidualizzazione (prolattina, PRL; insulin-like growth factor binding protein-1, IGFBP-1) e del gene considerato marker della ricettivit? endometriale (leukemia inhibiting factor, LIF) attraverso metodiche di PCR quantitativa (qPCR). La traduzione di questi geni in proteine ? stata poi analizzata attraverso saggi immunoenzimatici (ELISA), immunoblot e colorazione immunoistochimica. Il ruolo di pterostilbene nell?indurre decidualizzazione ? stato inoltre confrontato con ESC della stessa paziente trattate applicando il protocollo di decidualizzazione diretta (controllo positivo interno).
I dati ottenuti dimostrano che pterostilbene induce ESC indifferenziate ad assumere un fenotipo decidualizzato, con tempistiche e livelli di attivazione dei geni marker paragonabili tra loro e a quelli ottenuti con la decidualizzazione indotta da progesterone e cAMP (diretta). I risultati ottenuti a livello genico sono stati confermati anche a livello proteico dimostrando la similarit? dei protocolli applicati nell?indurre decidualizzazione.
Da questo studio si evince inoltre che, quando al sistema colturale oltre a pterostilbene vengono aggiunti progesterone e cAMP secondo il protocollo di decidualizzazione diretta, i livelli di espressione genica e di proteine prodotte aumentano significativamente, anticipando di fatto il conseguimento dello stato decidualizzato delle ESC, come confermato dalle percentuali di cellule decidualizzate contate dopo analisi immunoistochimica.
La possibilit? che pterostilbene possa influire positivamente sul microambiente uterino migliorandone la decidualizzazione e di conseguenza la recettivit? durante la finestra di impianto ? di notevole importanza soprattutto per lo sviluppo di nuovi trattamenti/indagini per aumentare le possibilit? di concepimento sia in vivo che in vitro (FIVET). Materiali e metodi
Raccolta dei campioni di endometrio
I campioni endometrio sono stati prelevati dall?utero di 3 pazienti donne con regolare ciclo mestruale che si sono sottoposte a isteroscopia diagnostica esplorativa eseguita come prassi per pazienti candidate alla fecondazione in vitro a causa della infertilit? del maschio della coppia. Il consenso informato ? stato ottenuto da ogni paziente prima dell?intervento chirurgico al fine di usare i tessuti derivanti dalla paziente per questo studio.
I pazienti impiegati in questo studio avevano et? media 42 ? 4 e non avevano seguito nessuna terapia ormonale nei 6 mesi precedenti all?intervento.
Colture cellulari primarie di ESC
I campioni di endometrio sono stati ottenuti durante la fase proliferativa ciclo mestruale.
Le colture primarie sono state allestite seguendo il protocollo riportato in Ciarmela et al., 2011 e qui brevemente descritto
1) 2 lavaggi in 1X PBS
2) I singoli campioni sono stati deposti su una piastra Petri sterile con l?addizione di collagenasi tipo II [0.1%, or 10 mg in 10 ml] o di tipo VIII [10 mg in 12 ml] diluite in DMEM senza FBS (siero);
3) Dopo l?eliminazione del sottile strato esterno il campione ? stato sminuzzato in pezzi pi? piccolo possibili;
4) il tessuto cos? frammentato ? stato posto in un tubo da 50 ml e ricoperto con la soluzione collagenasica fino a 8 ml;
5) I campioni sono stati poi incubati a 37?C fino alla completa digestione del tessuto (il processo dura almeno 4 ore);
6) I campioni digeriti sono stati filtrati;
7) I lisati cos? ottenuti sono stati centrifugati a 1200 rpm per 12 minuti; 8) Rimozione del surnatante;
9) Risospensione delle cellule accumulate sul fondo del tubo (circa 1 ml) con addizione di 3 ml di FBS e poi incubazione a 37 ?C in atmosfera controllata con 5% CO2 per 20 minuti;
10) Ripetizione dei punti 7, 8 e 9; e
11) La sospensione cellulare ? stata distribuita in piastre multi-pozzetto alla concentrazione di 10<6 >cellule/pozzetto e incubate a 37 ?C con 5% di CO2 per 24 ore.
Il trattamento con la collagenasi permette di ottenere una popolazione cellulare di cellule stromali endometriali ?pura? ovvero senza la contaminazione di altri tipi cellulari come le cellule epiteliali ghiandolari. Le ESC cos? ricavate sono state piastrate in 4 piastre e tenute in coltura fino al raggiungimento della confluenza del 70% secondo questo schema: Piastra 1: ESC controllo (10<6 >cellule/pozzetto)
Piastra 2: ESC (10<6 >cellule/pozzetto) Pterostilbene [0, 0.5, 1 ?M] Piastra 3: ESC trattate secondo il protocollo di decidualizzazione riportato in Dimitriadis et al., 2005, ovvero sciogliendo nel mezzo 600 ng/ml di progesterone e 10 ng/ml di cAMP per 8-10 giorni.
Piastra 4: ESC trattate secondo il protocollo di decidualizzazione riportato in Dimitriadis et al., 2005, ovvero sciogliendo nel mezzo 600 ng/ml di progesterone e 10 ng/ml di cAMP per 8-10 giorni pterostilbene [0, 0.5, 1 ?M]
Per eseguire le successive analisi i campioni sono stati processati quotidianamente come descritto in seguito.
Misurazione dell?mRNA per la quantificazione dell?attivazione genica Le cellule (controllo e trattate) presenti in ogni singolo pozzetto sono state direttamente lisate nel prodotto commerciale Tri-reagent per l?estrazione di RNA totale secondo il protocollo fornito dalla ditta.
Dopo la quantificazione e la determinazione del grado di purezza dell?RNA estratto valutato allo spettrofotometro, circa 1 ?g di RNA totale ? stato retrotrascritto a cDNA (RTmaxima, Biorad, USA). 1?l di cDNA derivante da ciascun campione ? stato impiegato come stampo per la reazione di qPCR utilizzando i primer specifici per ogni gene analizzato e l?enzima SYBRgreen (Biorad). L?espressione dei geni analizzati (PRL; IGFBP-1, LIF) ? stata normalizzata utilizzando il gene costitutivamente espresso ?actina. La specificit? degli amplificati cos? ottenuti ? stata controllata sia mediante analisi della curva di melting sia dopo il frazionamento dei suddetti amplificati in una corsa su gel di agarosio all?1% in tampone trisacido acetico-EDTA (TAE) 1X.
ELISA
Le proteine PRL, IGFBP-1 e LIF in quanto secrete nel mezzo sono state misurate nel sopranatante come descritto in Rose et al., 1978. La secrezione delle proteine ? stata misurata mediante saggio ELISA (R&D) seguendo il protocollo specifico per ogni proteina fornito dalla casa produttrice. La densit? ottica generata in ogni pozzetto corrispondente a ciascun trattamento ? stata letta a una lunghezza d?onda di 450 nm usando il lettore di piastre MultiSkan FC (Thermo Fisher). La sensibilit? e il limite di detection del saggio sono state calcolate in accordo con le istruzioni del kit comparando la densit? ottica del controllo positivo con lo standard pi? diluito usato per ottenere la curva di calibrazione (Sensibilit? = 0.67 pmol/ml; Limite di detection = 0.31 pmol/ml; Coefficiente di variazione R2 = 0.9974) grazie al tool informatico MyAssay per calcolare le concentrazioni delle proteine secrete nel mezzo.
Western blot analisi di PRL, IGFBP-1 e LIF
Solo i campioni relativi a 6 giorni di incubazione sono stati impiegati per l?analisi mediante tecnica dell?immunoblot. Le proteine totali dei campioni sono state estratte dalle cellule in coltura trattate o controllo a 4 ?C per 20 minuti, dopo la rimozione del surnatante utilizzato per il test ELISA, usando il buffer di lisi preparato come segue (50 mM Tris-Cl, pH 7.8, contenente 1% Nonidet P40, 140 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.1% Na desossicolato, 1 mM Na3VO4, 1 X cocktail di inibizione delle proteasi). I lisati sono stati poi centrifugati per 15 minuti in una centrifuga refrigerata alla massima velocita di 16000 x g e immediatamente bolliti in sodiododecil-solfato (SDS) buffer per il caricamento dei campioni. Le proteine estratte sono state quantificate col metodo Bradford. Circa 50 ?g di proteine totali per ogni campione ? stato sottoposto a elettroforesi verticale in condizioni denaturanti e riducenti (SDS-PAGE) e le proteine cos? frazionate sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa.
Il protocollo di questa metodica chiamata Immunoblot seguito ? quello descritto in Sacchi et al., 2017. Ad avvenuto trasferimento, la membrana ? stata bloccata con 5% di latte intero in polvere in TBS-Tween 20 (TBS-T) per un?ora a temperatura ambiente. I seguenti anticorpi diluiti 1:1000 in TBS-T sono stati messi in incubazione con le membrane overnight a 4 ?C in agitazione: anti-PRL; anti-IGFBP-1; anti-LIF. Tutti gli anticorpi sono stati ricavati in coniglio (rabbit anti-human) e acquistati da Santa Cruz. AL termine dell?incubazione con gli anticorpi primari, dopo 3 lavaggi in TBS-T per rimuovere l?eccesso di anticorpo primario non legato, la membrana ? stata incubata con il seguente anticorpo secondario coniugato all? horseradish peroxidase (HRP): goat anti-rabbit IgG antibody (1:10000) per 90 minuti a temperatura ambiente. Le proteine immunoreattive sono state rilevate con ECL (Amersham). Dopo una prima acquisizione le membrane sono state trattate al fine di rimuovere l?anticorpo primario usato (stripping della membrana) per poter permettere una ulteriore incubazione con un diverso anticorpo primario ovvero l?anti-human ?- tubulina (SIGMA) come controllo interno sulla quantit? di proteina caricata.
Colorazione immunocitochimica
Le colture cellulari di ESC controllo e trattate sono state incubate con una soluzione PBS-tripsina-EDTA (Life Technologies) per 15 minuti a 37 ?C per permettere il distacco delle cellule dal pozzetto. Le sospensioni cellulari ottenute sono state lavate tre volte con PBS 1X e in seguito trasferite su vetrino mediante l?uso del citospin (Shandon Cytospin4, Thermo Scientific) a 1000 rpm per 5 minuti e infine fissate con formalina (parafolmaldeide 4%) a 4 ?C per 1 ora e ulteriormente lavate con PBS 1X tre volte. Le cellule fissate sono state impiegate in metodiche di immunofluorescenza e analizzate da due investigatori diversi in doppio cieco.
Dopo il trattamento con 3% di albumina sierica purificata da bovino (BSA) in PBS 1X per 30 minuti a temperatura ambiente, i vetrini sono stati incubati con gli anticorpi primari (gli stessi usati per l?Immunoblot) a concentrazione 1:25 in PBS 1X per un?ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con 1X PBS i campioni sono stati incubati per 1 ora a temperatura ambiente con l?anticorpo secondario diluito 1:200 in 1X PBS contenente il 3% di BSA (goat anti-rabbit FITC conjugated). Dopo un lavaggio in 1X PBS e uno in acqua i campioni sono stati contro-colorati con 1 ?g/ml di DAPI in H2O e montati usando and anti-fading medium (0.21 M DABCO and 90% glicerolo in 0.02 M Tris, pH 8.0). I controlli negativi sono stati incubati con la mix d?incubazione senza l?anticorpo primario.
Le immagini sono state acquisite al microscopio ottico equipaggiato con lampada a fluorescenza Leica TCS SP2 AOBS. I campioni che hanno legato il DAPI (colorante blu del DNA contenuto nel nucleo) e il FITC legato all?anticorpo secondario, sono stati eccitati alla lunghezza d?onda di -405nm/25mW line- generata dal diodo laser blu e alla lunghezza d?onda di 488-nm/20mW generata dal laser all?Argon. L?eccitazione e il rilevamento della fluorescenza dei campioni sono state effettuate in modo sequenziale evitando la sovrapposizione dei segnali.
Le immagini originali ottenute in verde al confocale sono state convertite in scale di grigio applicando un filtro chiamato mediano. Un valore di intensit? compreso tra 0 (nero) e 255 (bianco) ? stato assegnato a ogni pixel. La fluorescenza in background (rumore di fondo) ? stata sottratta dall?analisi e l?intensit? dell?immunofluorescenza ? stata calcolata come intensit? media per ogni area selezionata. La frequenza della positivit? di cellule positive per PRL ? stata determinate osservando pi? di 1000 nuclei per ogni campione sperimentale.
Analisi statistica
L?analisi statistica ? stata stata eseguita con il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di Bonferroni con una probabilit? P<0.001 scelta come soglia di significativit?. L?analisi statistica sulle proteine secrete analizzate con metodo ELISA ? stata eseguita utilizzano il tool informatico specificato nel kit. L?espressione relativa di ogni gene analizzato ? stata ricavata mediante il metodo del 2<-??Ct >[Livak and Schmittgen, 1992] ed espressa come ratio nei confronti dei campioni controllo posti arbitrariamente ad 1. Risultati
ESC purificate e messe in coltura sono state incubate con concentrazioni crescenti di pterostilbene (range 0, 0.5, 1 ?M). Per seguire gli effetti di pterostilbene sul processo di decidualizzazione ? stata analizzata l?espressione di 2 geni marker (PRL e IGFBP-1) mediante qPCR. Come mostrato in Figura 1, pterostilbene aumenta l?espressione dei geni marker di decidualizzazione e di ricettivit? endometriale con un andamento dosedipendente.
Come controllo sulla capacit? di decidualizzare delle ESC impiegate nel nostro esperimento, abbiamo confrontato i profili di espressioni di PRL, IGFBP-1 generati dal dosaggio a pi? alta concentrazione di pterostilbene (1 ?M) con il profilo di espressione ottenuto in ESC trattate col protocollo classico di decidualizzazione diretta. Come si evince dalla figura 2, pterostilbene induce profili di espressione genica paragonabili a quelli indotti dal classico protocollo di decidualizzazione. Inoltre, l?addizione di pterostilbene alla coltura di ESC trattata col protocollo di decidualizzazione classico aumenta l?espressione di tutti i geni presi in esame a livelli decisamente maggiori rispetto alla coltura semplice o alle ESC trattate col protocollo di decidualizzazione in assenza di pterostilbene. Lo pterostilbene pertanto favorisce il raggiungimento del fenotipo decidualizzato in tempo minore (Figura 2).
Per capire se lo pterostilbene oltre che a influenzare la decidualizzazione, potessero influenzare anche la ricettivit? endometriale l?espressione del marker LIF ? stata seguita nel corso del trattamento dose-risposta e analizzata con qPCR. Come si evince dai dati riportati in Figura 3 il trattamento delle ESC con dosaggio crescente di pterostilbene genera livelli di espressione di LIF significativamente pi? alti dei controlli. Inoltre, i livelli di LIF indotti da pterostilbene indotti dal sono paragonabili a quelli in ESC in decidualizzazione (protocollo classico). Inoltre, i livelli di espressione di LIF sono significativamente pi? alti nei campioni dove pterostilbene ? stato aggiunto a ESC trattate col protocollo di decidualizzazione classico (Figura 4) confermando un possibile ruolo benefico di pterostilbene nel migliorare la ricettivit? dell?endometrio durante la decidualizzazione.
Al fine di confermare i risultati ottenuti sulla regolazione genica con metodiche di qPCR, la presenza e l?effettiva produzione delle proteine finali sono state confermate con metodi immunoenzimatici del tipo ELISA. Come si evince dalla figura 5, la quantificazione delle due proteine secrete nel mezzo mostrano un andamento generale paragonabile a quello osservato sulla regolazione genica con rapporti e livelli di produzione sovrapponibili per quanto riguarda la co-coltura semplice e ESC sottoposte a protocollo di decidualizzazione. Di nuovo si nota un generale contributo positivo dello pterostilbene al protocollo di decidualizzazione. Questo apporto positivo ? riscontrabile anche nel caso del marker della ricettivit? endometriale LIF (Figura 6) sebbene marginali discrepanze in termini di tempistiche esistano sia tra i trattamenti che sulle tempistiche e vanno probabilmente ricondotte alle specifiche cinetiche di trascrizione proteica.
Al fine di confermare ottenuti con la metodica dell?ELISA campioni derivanti dai diversi trattamenti sono stati analizzati con la metodica dell?Immunoblot. In base ai risultati ottenuti con la qPCR solo i campioni trattati per 6 giorni con pterostilbene [1?M] e i loro relativi controlli sono stati valutati con questa metodica. Come si evince dalla Figura 7 tutte e tre le proteine prese in esame mostrano un significativo aumento di espressione a seguito dei trattamenti.
I risultati delle colorazioni immunoistochimiche sono riportati in Tabella III. I risultati si riferiscono alla conta di 1000 cellule a vetrino a campo ed espressi come percentuale della conta media delle cellule positive all?anticorpo anti-PRL. come si evince dai risultati riassunti in tabella le percentuali di cellule positive decidualizzate aumenta se oltre al protocollo di decidualizzazione le ESC vengono co-incubate con pterostilbene [1?M].
Tabella III: immunoistochimica (percentuale di cellule positive all?anticorpo anti-prolattina: le colonne si riferiscono a quanto segue: 1 ESC controllo; 2 ESC pterostilbene [1?M]; 3 ESC progesterone cAMP; 4 ESC progesterone cAMP pterostilbene [1?M].
Valutazione effetti dello pterostilbene su outcomes di un ciclo di fecondazione in vitro.
? stato svolto un trial pilota di natura prospettica su 20 pazienti in attesa di eseguire un ciclo di fecondazione in vitro (FIVET/ICSI) per esclusivo fattore maschile. Le pazienti hanno assunto per 3 mesi prima del ciclo lo pterostilbene oppure hanno assunto per 3 mesi un placebo (gruppo di controllo).
Nelle pazienti trattate lo pterostilbene ? stato somministrato al dosaggio di 125 mg due volte die.
Le pazienti sono state arruolate scegliendo progressivamente 10 casi e 10 controlli di pari et?, in un range tra 18 e 40anni. Tutte le pazienti erano simili per caratteristiche demografiche (Tabella IV), avevano cicli regolari e nessun noto fattore femminile di infertilit? . Criteri di esclusione erano: cicli irregolari, presenza di cisti ovariche, presenza di malattie endocrinometaboliche o endometriosi stadio III/IV.
Il ciclo di fecondazione in vitro ? stato svolto in tutte le pazienti secondo la comune pratica clinica. La stimolazione ovarica ? stata effettuata con FSH ricombinante (rFSH) a partire dal 2?giorno della mestruazione, scegliendo un dosaggio giornaliero personalizzato sulla base dell?et?: 150 IU di rFSH per pazienti di et? <35anni, o 225 IU di rFSH per pazienti > 35anni. La soppressione ipofisaria ? stata ottenuta con GnRH antagonista, dal giorno in cui il follicolo maggiore ha raggiunto i 14mm di diametro medio fino al giorno del rhCG. La crescita follicolare ? stata monitorizzata con ecografie transvaginali a giorni alterni. hCG ricombinante (rhCG) ? stato somministrato per indurre la maturazione ovocitaria finale quando 3 o pi? follicoli avevano diametro ?16mm, esattamente 35.5 ore prima dell?intervento di recupero ovociti ( pick-up). Nessun ciclo ? stato interrotto per risposta ovarica inadeguata o eccessiva. Sugli embrioni ? stato eseguito lo screening genetico preimpianto (PGS). Gli embrioni sono stati dunque congelati in attesa del risultato dell?analisi genetica, per successivo eventuale trasferimento in utero.
Obiettivi dello studio
Obiettivo primario dello studio era confrontare il numero di ovociti recuperati tra le pazienti che avevano effettuato un pre-trattamento con pterostilbene e le pazienti controllo.
Obiettivi secondari erano:
? numero di follicoli in crescita (diametro >10mm) per paziente
? % di ovociti maturi MII per paziente
? %di fertilizzazioni per paziente
? numero di embrioni di qualit? elevata (A o B) per paziente
? % di embrioni euploidi per paziente
Risultati dello studio
Dallo studio ? emerso che, nel gruppo di pazienti che aveva assunto per 3 mesi lo pterostilbene, il numero di ovociti recuperati e il numero di follicoli in crescita era maggiore rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, anche la % di ovociti maturi, la percentuale di fertilizzazioni, il numero di embrioni di elevata qualit? e la percentuale di embrioni euploidi era maggiore nel gruppo in studio rispetto al gruppo di controllo (Tabella V).
Tabella IV. Caratteristiche demografiche delle pazienti
Tabella V. Outcomes del ciclo FIVET
Valutazione effetti pterostilbene sulla riserva ovarica in pazienti sub-fertili.
? stato svolto un trial pilota di natura prospettica su 30 pazienti affette da infertilit? idiopatica. Scopo dello studio era studiare gli affetti sulla riserva ovarica di un trattamento di 12 mesi con la composizione in studio pterostilbene
Le pazienti sono state arruolate in un range tra 18 e 40 anni. Criteri di esclusione erano: presenza di noti fattori di infertilit? (fattore endocrinoovulatorio, ridotta riserva ovarica, fattore tubarico, endometriosi), presenza di cisti ovariche, presenza di malattie endocrino-metaboliche. Le caratteristiche demografiche delle pazienti sono rappresentate in Tabella VI.
Le 30 pazienti in studio hanno assunto per 12 mesi pterostilbene al dosaggio di 100mg due volte die. Sono state sottoposte allo studio della riserva ovarica tramite il dosaggio dell?AMH sierico e la conta ecografica dei follicoli antrali (AFC) al tempo 0 e al tempo 12mesi.
La riserva ovarica di queste pazienti ? stata messa a confronto con quella di 300 pazienti controllo con caratteristiche demografiche analoghe, che non assumevano alcuna terapia. I dati relativi alla riserva ovarica delle pazienti controllo erano stati raccolti in modo prospettico, misurando la riserva ovarica in ogni paziente due volte a distanza di 12 mesi. Era emerso che in 12 mesi AMH subisce un declino di 0,2 ng/ml, mentre l?AFC decresce di 2 follicoli.
Obiettivi dello studio
Obiettivo primario dello studio era valutare nelle pazienti in studio:
? Riduzione dell?AMH in 12 mesi
? Riduzione della AFC in 12mesi
Obiettivo secondario era confrontare la riduzione dei markers di riserva ovarica tra le pazienti in studio e le pazienti controllo.
Risultati dello studio
Dallo studio ? emerso che, dopo trattamento per 12 mesi con pterostilbene, nelle pazienti in studio l?AMH e l?AFC al tempo 0 e al tempo 12 mesi risultavano pressoch? invariati (Tabella VII).
Il confronto con la popolazione controllo, dove era stata segnalata una riduzione dei suddetti markers in 12 mesi, ha dunque confermato gli effetti benefici del trattamento con pterostilbene.
Tabella VI. Caratteristiche demografiche delle pazienti
Tabella VII. Markers di riserva ovarica a 12 mesi
Claims (18)
1. Pterostilbene per uso nel trattamento o nella prevenzione di infertilit? in un individuo che ? affetto da infertilit? o da un declino della fertilit? o che ? a rischio di soffrire di infertilit? o di declino della fertilit?.
2. Pterostilbene per l?uso secondo la rivendicazione 1, dove il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende aumentare la fertilit?, o ridurre il tasso di declino della fertilit? o ripristinare la fertilit? in un individuo.
3. Pterostilbene per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, dove l?individuo ? affetto dalla sindrome dell?ovaio policistico (PCOS).
4. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove l?individuo ha una riserva ovarica nella norma definita come dosaggio sierico di AMH superiore a 2 ng/ml, preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml e/o definita come AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12.
5. Pterostilbene per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, dove l?individuo ha una ridotta riserva ovarica definita come dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml e/o definita come AFC inferiore a 10, preferibilmente inferiore a 8.
6. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 dove il trattamento o la prevenzione dell?infertilit? comprende ripristinare la normale ciclicit? mestruale ed ovulatoria, ridurre il tasso di declino della conta di follicoli antrali (AFC), o ridurre il tasso di declino dei livelli sierici dell?ormone anti-mulleriano (AMH), o aumentare la decidualizzazione dell?endometrio, o diminuire il tasso di declino degli ovociti, o aumentare il numero di ovociti, o aumentare il tasso di successo della gravidanza, o prevenire il diabete gestazionale o la preclampsia in un soggetto femminile che soffre di un declino della fertilit?, o aumentare la conta spermatica, o aumentare la motilit? spermatica, o ridurre la percentuale di frammentazione del DNA spermatico in un individuo maschile che soffre di un declino della fertilit?.
7. Pterostilbene per l?uso secondo la rivendicazione 6, dove ridurre il tasso di declino dei valori sierici di AMH comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,05 e 0,1 ng/ml di AMH in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,06 e 0,09 ng/ml di AMH in 12 mesi.
8. Pterostilbene per l?uso secondo la rivendicazione 6 o 7, dove ridurre il tasso di declino di AFC comprende mantenere una riduzione compresa tra 0,1 e 0,5 follicoli in 12 mesi, pi? preferibilmente tra 0,2 e 0,4 follicoli in 12 mesi.
9. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, dove aumentare la decidualizzazione dell?endometrio comprende aumentare i livelli di espressione genica e/o proteica di prolattina (PRL), di insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) e di leukemia inhibiting factor (LIF).
10. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, dove detto pterostilbene ? assunto per via enterale, preferibilmente per via orale.
11. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, dove detto pterostilbene ? assunto in una quantit? compresa e tra 50 e 400 mg al giorno, pi? preferibilmente tra 70 e 250 mg al giorno, ancor pi? preferibilmente compresa tra 100 e 150 mg al giorno.
12. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, dove lo pterostilbene ? assunto per un periodo di tempo di almeno 45 giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra 50 e 365 giorni, pi? preferibilmente compreso tra 70 e 200 giorni.
13. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 dove lo pterostilbene ? assunto in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit? in un individuo, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
14. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13, dove lo pterostilbene ? assunto prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
15. Pterostilbene per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14, dove lo pterostilbene ? assunto in associazione o in combinazione con almeno un farmaco per il trattamento dell?infertilit? scelto tra: FSH, hMG, clomifene citrato, un antiestrogeno, un analogo dell?FSH, un analogo del GnRH, un integratore, complessi vitaminici, probiotici, paraprobiotici, coenzima Q10, carnitina, d-chiro-inositolo, mio-inositolo, resveratrolo e loro combinazioni.
16. Una composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, dove la composizione comprende come unico principio attivo lo pterostilbene.
17. Un metodo in vitro per aumentare la percentuale di successo di una fecondazione in vitro, comprendente almeno una fase di coltura di uno zigote o di un embrione fecondato in vitro in un mezzo di coltura comprendente pterostilbene.
18. Un metodo in vitro secondo la rivendicazione 17, dove un gamete utilizzato per la fecondazione in vitro ? stato prelevato da un individuo che ha assunto pterostilbene per almeno 3 mesi prima del prelievo del gamete, preferibilmente, l?individuo ha assunto pterostilbene al dosaggio di 125 mg die per almeno 3 mesi prima del prelievo del gamete.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO2022200848A1 (en) | 2022-09-29 |
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