JPWO2018025856A1 - 簡便な遺伝子検査法およびコピー数計測法ならびにその支援技術 - Google Patents
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Abstract
Description
(項目1)
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、
(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材と
を含む、核酸含有生体材料を含む試料から核酸増幅用のサンプルを調製するためのキット(サンプル調製キット)。
(項目2)
前記基材(B)は一定範囲量の核酸含有生体材料を含む試料を提供するように構成される、項目1に記載のキット。
(項目3)
前記基材(B)の表面積は前記一定範囲量を提供するのに十分である、項目2に記載のキット。
(項目4)
前記担体(A)は水に入れた際に核酸増幅を許容する、項目1〜3のいずれか1項に記載のキット。
(項目5)
前記担体(A)は光学的検出を許容する、項目1〜4のいずれか1項に記載のキット。
(項目6)
前記核酸増幅後の前記サンプル中の核酸は光学的検出される、項目1〜5のいずれか1項に記載のキット。
(項目7)
前記担体(A)は水解性担体である、項目1〜6のいずれか1項に記載のキット。
(項目8)
前記一定範囲量は、核酸増幅後にコピー数を識別し得る量である、項目2〜7のいずれか1項に記載のキット。
(項目9)
前記一定範囲量は、基準量に対してX倍〜X分の1以内であって、X2は前記核酸増幅においてコピー数が1違う際に識別可能な倍率の相違である、項目2〜8のいずれか1項に記載のキット。
(項目10)
前記(B)基材は、核酸含有生体材料を結合せずに担持する基材である、項目1〜9のいずれか一項に記載のキット。
(項目11)
前記基材は、ポリウレタン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレン、キチン、キトサン、コラーゲン、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、ポリプロピレン、セルロースおよびその誘導体、紙類、コラーゲン、ゼラチン、ウレタン、シリコンおよび脱脂綿(セルロース脱脂綿、アセテート脱脂綿)、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つの材料を含む、項目1〜10のいずれか1項に記載のキット。
(項目12)
前記一定範囲量は、前記担体を一定面積で取り出すことによって達成される、項目2〜11のいずれか一項に記載のキット。
(項目13)
前記基材(B)の表面積は、前記一定面積と同じまたはそれより広い、項目12に記載のキット。
(項目14)
前記基材(B)は、前記一定面積を覆うのに十分な形状である、項目12または13に記載のキット。
(項目15)
前記一定面積は、該一定面積を切除し得る切除器によって切除することで達成される、項目12〜14のいずれか一項に記載のキット。
(項目16)
前記切除器は生検トレパン、およびパンチから選択される、項目15に記載のキット。
(項目17)
前記一定範囲量は、前記試料を一定量で提供することによって達成される、項目2〜16のいずれか一項に記載のキット。
(項目18)
前記担体は水解性紙である、項目1〜17のいずれか1項に記載のキット。
(項目19)
前記核酸増幅は、非特異的増幅が生じる核酸増幅法である、項目1〜18のいずれか1項に記載のキット。
(項目20)
項目1〜19のいずれか一項に記載のキットと、(C)核酸増幅のための試薬とを含む、精製せずに核酸を増幅するためのキット(核酸増幅キット)。
(項目21)
前記核酸増幅のための試薬は、プライマー、核酸増幅酵素、および必要な緩衝剤を含む、項目20に記載のキット。
(項目22)
前記(A)は非吸水性材料と吸水性材料とをさらに含む、項目1〜21のいずれか一項に記載のキット。
(項目23)
(X)非吸水性材料と、
(Y)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、
(Z)吸水性材料と
を含む、生体試料を乾燥するためのデバイス。
(項目23A)
(X)非吸水性材料と、
(Y)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、
を含む、生体試料を乾燥するためのデバイス。
(項目24)
前記担体(Y)は、水に入れた際に核酸増幅を許容する、項目23または23Aに記載のデバイス。
(項目25)
前記担体(Y)は光学的検出を許容する、項目23、または23Aまたは24に記載のデバイス。
(項目26)
前記担体(Y)は水解性担体である、項目23、23A、または24〜25のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目27)
前記非吸水性材料は前記担体を保持するように配置され、該非吸水性材料は前記吸水性材料と脱着可能に連結される、項目18に記載のキットまたは項目23、23A、または24〜26のいずれか一項に記載のデバイス。
(項目28)
前記非吸水性材料は前記吸水性材料と脱着可能な粘着部材を介して連結される、項目22、23、23A、または24〜27のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
(項目29)
前記非吸水性材料は前記担体の周囲を取り囲むように配置される、項目22、23、23A、または24〜28のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
(項目30)
前記担体は、前記非吸水性材料および前記吸水性材料と接触する、項目22、23、23A、または24〜29のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
(項目31)
前記担体は、前記吸水性材料と直接接触しないように配置される、項目22、23、23A、または24〜30のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
(項目32)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を検出する方法であって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを用いて
該核酸含有生体材料を含む被検試料を提供する工程、
該担体を、該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーを含む核酸増幅試薬含有水溶液に接触させ、核酸が増幅する条件に供する工程、
該光学的手段を用いて、該水溶液中に該特定遺伝子が含まれるか否かおよび/または該特定遺伝子のコピー数を検出する工程を包含する、方法。
(項目33)
前記基材を前記核酸含有生体材料に接触させ、その後、前記担体に該基材を接触させることによって、前記核酸含有生体材料を含む被検試料が提供される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記被検試料は、一定範囲量の核酸含有生体材料を含むように提供される、項目32または33に記載の方法。
(項目34A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目32〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を光学的手段を用いて検出するための試料を提供するキットであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
を備える、キット。
(項目35A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目35のいずれか一項に記載のキット。
(項目36)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を光学的手段を用いて検出するための試料を提供するシステムであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
を備える、システム。
(項目36A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目36のいずれか一項に記載のシステム。
(項目37)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を検出するシステムであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
光学的手段と
を備える、システム。
(項目37A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目37のいずれか一項に記載のシステム。
(項目38)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出する方法であって、
該核酸含有生体材料を含む被検試料を、非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスに接触させる工程、
該担体を該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーを含む核酸増幅試薬含有水溶液に接触させ、該水溶液を核酸が増幅する条件に供する工程、
該光学的手段を用いて、該水溶液中に該特定遺伝子が含まれるか否かおよび/または該特定遺伝子のコピー数を検出する工程を包含する、方法。
(項目38A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目38のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するための試料を提供するキットであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
を備える、キット。
(項目39A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目39のいずれか一項に記載のキット。
(項目40)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するための試料を提供するシステムであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
を備える、システム。
(項目40A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目40のいずれか一項に記載のシステム。
(項目41)
核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するシステムであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
光学的手段と
を備える、システム。
(項目41A)
項目1〜23、23A、および24〜31に記載の1または複数の特徴をさらに含む、項目41のいずれか一項に記載のシステム。
1)一定面積(例えば、6mmΦ(直径))のパンチ担体(新聞紙、定性濾紙No.1、水溶紙60MDP)を用意し、
2)その担体に一定量の細胞含有溶液(例えば、唾液10μL)をたらして1時間自然乾燥し、
3)その後、担体を水の中に浸し、
4)その後、一定時間内(0〜60分、0分、2分、5分、10分、30分、60分)に水中に遊離して来る細胞数をADH1BのコントロールプラスミドからリアルタイムPCR法にて定量する。その後、95℃5分間熱処理する事により、担体または基材にどのぐらいの細胞が接着し、水中に浸漬した場合に細胞が遊離しうるか「核酸含有生体材料を結合し得る保持力」を判定することができる。
(結合能比較法(1))
1)担体および基材を用意し、
2)その基材に一定量の細胞含有溶液をたらして何分間(例えば、5分間)か置き、
3)その後、基材と担体とを一定時間(例えば、5秒)接触させ、
4)その後、基材と担体にどのぐらいの細胞または核酸が残っているか測定し(核酸の場合、例えば、上述した定量的PCR等を用いる))、測定結果をもって、半数以上の核酸含有生体材料が担体に移っていれば、好ましくは実質的にすべて核酸含有生体材料が移っていれば、「担体より核酸含有生体材料の結合能が低い基材」と判断する。本発明において通常用いられる担体または基材は、「核酸含有生体材料を結合し得る」ものである。
(1)担体および基材を提供する。
(2)担体に一定量(例えば、10μL)の核酸を含む試料を接触させる。
(3)この担体と試験対象となる基材候補とを一定時間接触させる。
(4)一定時間経過後、担体および基材候補で互いに接触していた面を一定面積(例えば、6mmΦ(直径))切り取る。
(5)切り取った切片に含まれる核酸量をそれぞれ測定し(例えば、上述した定量的PCR等を用いる)、比較する。
(6)試験担体から抽出される核酸量よりも少ない量の核酸量が基材候補から見いだされた場合に、その基材候補を本発明において用いられる基材として採用する。
May ; 17(5): 244−251では、薬理遺伝学での応用が記載されている。Whitney E. Kramer et al., Pharmacogenet Genomics. 2009 October ; 19(10): 813−822では、CYP2D6のコピー数多型が論じられており、代謝や薬理学的作用への影響が論じられている。特開2008−49668では、コピー数多型を用いてがん発症体質の判定方法が開示されている。Philip S. Bernard et al., Clinical Chemistry 48:8 1178−1185 (2002)では、がん診断においてリアルタイムPCT技術を用いることおよびその中でコピー数多型も論じられている。最近では、特開2015−73506では、遺伝子多型の判定においてコピー数多型を応用する方法も紹介されている。このように、種々の方法で、コピー数多型が実施可能であり、本発明を用いて調製されたサンプルを利用することができる。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
1つの局面において、本発明は、(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む試料から核酸増幅用のサンプルを調製するためのキット(本明細書において、「サンプル調製キット」ともいう。)を提供する。本発明は、2種類の材料が必要であり、(Aの担体)>(Bの基材)の順序で核酸含有生体材料(例えば、細胞)結合能があるという特性をもつことで、一定範囲量の核酸含有生体材料を含む試料から核酸増幅用のサンプルを調製することができることを見出し完成されたものである。これらの担体および基材は本明細書に記載される判定方法で特定することができる。基材(B)は一定範囲量の核酸含有生体材料を含む試料を提供するように構成される。このような構成は、例えば、一定面積で担体に接触できるような形式で構成されたり、接触前または後に一定面積で切除するように構成されてもよい。担体(A)は水に入れた際に核酸増幅を許容することが好ましい。サンプルの調製後直ぐに核酸増幅反応を開始することができるからである。好ましい実施形態では、担体(A)は水に入れた際に核酸増幅を許容することが有利である。担体(A)は、核酸含有生体材料(例えば、細胞)が結合しており、これをそのまま利用することで、核酸増幅までの時間を短縮することができるからである。さらに、基材・担体の洗浄等の煩雑な工程を省略することができ、簡便化を可能にし、加えて、洗浄等に伴うクロスコンタミネーションも防止することが可能である。
(基材:担体)=ポリウレタン(スワブ):水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製)が挙げられる)
(基材:担体)=ポリビニルアルコール(PVA;トラストキャッチャー):水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製))
(基材:担体)=脱脂綿(綿棒):水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製))
(基材:担体)=ポリエステル(綿棒):水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製))
(基材:担体)=ウレタンスポンジ(スポンジスワブ):水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製))
(基材:担体)=天然スポンジ:水解紙(例えば、30MDP、60MDP、120MDP、30CD、60CD、120CD(日本製紙パピリア社製))
(基材:担体)=ポリウレタン(スワブ):定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)
(基材:担体)=ポリビニルアルコール、PVA(トラストキャッチャー):定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)
(基材:担体)=脱脂綿(綿棒):定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)
(基材:担体)=ポリエステル(綿棒):定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)
(基材:担体)=ウレタンスポンジ(スポンジスワブ):定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)
(基材:担体)=天然スポンジ:定性濾紙(例えば、AD-1、AD-2、AD-3、AD-4A、AD-6(アドバンテック社製)が挙げられる)。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
(サンプリング手法)
検査対象(被検者30名)からの唾液(ヒト口腔粘膜細胞を含む)の採取は、以下のマニュアルに従って行った。
(1)スワブスティック(ポリウレタン製、Texwipe社製、STX708AまたはSTX712A)を持ち、スポンジの片面で歯茎の外側・内側、頬の内側を、10回ほどこすった。もう片面で同様に10回ほどこすった。スワブ両面を唾液で湿らせた。
(2)スティックの根元を持ち、サンプリングプレート(プラスチック板に水溶紙を貼り付けたプレート)の中央にスポンジの片面を5秒間押し当て、もう片面も同様に5秒間押し当てた。 注意:プレートを擦らない
(3)使用済みのスワブは元の袋に戻して破棄した。
(4)サンプリングシートを二つ折に戻し、30分以上乾かした。他人の飛沫する唾がサンプルプレートに付かないように注意して乾燥した。
TaqMan(登録商標) PCR法は、以下の手順で、検査対象(被検者30名)から上述のようにそれぞれ採取した唾液(ヒト口腔粘膜細胞を含む)について、アルコール脱水素酵素ADH1Bの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ALDH2の遺伝子の遺伝子多型の検出をリアルタイムPCR装置ABI7300(Applied Biosystems社製)を用いてTaqMan(登録商標)プローブ法により行なった。唾液試料の採取については、上述のように、角型のスワブ、丸型のスワブ、トラストキャッチャーまたはスポイトを用いて行い、本明細書に記載されるように水解性担体に移動させ、検出反応に用いるサンプルを調製した。
(ADH1B遺伝子用TaqMan(登録商標)プローブ・プライマーセット)
・TaqMan(登録商標) Drug Metabolism Genotyping Assays(Applied Biosystems社製)、
・遺伝子名: alcohol dehydrogenase 1B(class I), beta polypeptide
・TaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assay Mix ID: C_2688467_20。
(ADH1B遺伝子用TaqMan(登録商標)反応液)
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix:1 5μL
Taqman(登録商標) Assay Mix C_2688467_20:0.5μL
50X ROX reference dye: 0.2μL
DW(蒸留水): 2.3μL
被検試料調製液: 2μL
全量: 10μL
(ALDH2遺伝子用TaqMan(登録商標)プローブ・プライマーセット)
・TaqMan(登録商標)Drug Metabolism Genotyping Assays(Applied Biosystems社製)
・遺伝子名:aldehyde dehydrogenase 2 family(mitochondrial)
・TaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assay Mix ID:C_11703892_10。
(ALDH2遺伝子用TaqMan(登録商標)反応液)
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix: 5μL
Taqman(登録商標) Assay Mix C_11703892_10: 0.5μL
50X ROX reference dye: 0.2μL
DW(蒸留水): 2.3μL
被検試料調製液: 2μL
全量: 10μL
(増幅条件)
熱変性:50℃、2分→95℃、10分、 95℃、15秒→60℃、1分を40サイクル。
結果は、ABI Prism 7300 SDSソフトウェアを用いて解析した。
結果を図1〜2に示す。図1にはADH1Bの結果を示し、図2にはALDH2での結果を示す。スポイトで唾液採取した場合には、識別できなかったのに対して、それ以外の3つはいずれも、識別力は十分であると考えられる。実用的にはスワブ角が使い勝手がよく有利である。
本実施例では、水溶紙と定性濾紙とを対比して実験を行った。
本実施例では、水溶紙および定性濾紙に加えて、さらに他の担体を用いて実験を行った。実験手順は実施例1に基づき、水溶紙をキムワイプ(日本製紙クレシア)、キムタオル(日本製紙クレシア)、新聞紙(讀賣新聞)およびティッシュペーパー(クリネックス、日本製紙クレシア)に置き換えて実験を実施した。
本実施例においては、様々な基材・サンプリング方法を用いた場合の差異と、担体を滅菌水に投入した後の加熱の有無による差異とを検証した。
スワブについては、口腔内を擦った回数には依存せず、高い遺伝子型の識別力が示された(図3D、図3E)。したがって、この結果から、試料採取には採取する体積が重要なのではなく採取面の表面積が重要であることが示唆される。
本実施例においては、スワブを基材として用い、担体を滅菌水に投入した後に、懸濁したままでPCR反応に供する場合と、遠心分離した上清のみをPCR反応に供した場合との差異を検証した。実験手順は実施例1に基づくが、担体を滅菌水に投入した後に、懸濁液を遠心分離(15,000×rpm)にかけ、上清のみをPCR反応に供した。
基材としてスワブ(ポリウレタン製、Texwipe社製、STX708AまたはSTX712A)およびアプリケーター(ポリビニルアルコール製トラストキャッチャー(登録商標))を用いて、6名の被験者のADH1Bの遺伝子多型を解析した。
(スワブのサンプルの反応溶液の組成)
20×Probe (ADH1B) 0.5μL
50×ROX reference dye 0.2μL
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix: 5μL
Φ4mm in DW(蒸留水) 4.3μL
計 10.0μL
(※)100μLの蒸留水にΦ4mmでパンチしたサンプルを入れて、95℃、5分間THERMO BLOCK ND-G962(日伸理化製)で温めた。保存は−20℃で行った。
(アプリケーターのサンプルの反応溶液の組成)
20×Probe (ADH1B) 0.5μL
50×ROX reference dye 0.2μL
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix: 5μL
KODFXNEO 1μL
Φ6mm in DW(蒸留水) 4.3μL
計 10.0μL
(※)200μLの蒸留水にΦ6mmでパンチしたサンプルを入れて、加熱するサンプルについては95℃、5分間THERMO BLOCK ND-G962(日伸理化製)で温めた。
(増幅条件)
リアルタイムPCRのサイクルは以下のとおりであった。
Program:7300,linda, ADH1B_TaqMan(登録商標)_kit
50℃、2分→95℃、10分→(95℃、15秒→60℃、1分)×40サイクル
(結果)
結果を図3Hに示す。ひし形はAと判定されたサンプルを示し、三角はA/Gと判定されたサンプルを示し、丸はA/Gのポジティブコントロール(pc)を示す。スワブおよびアプリケーターで、6名の被験者が、黒ひし形◆(A)(2名)、黒三角▲(A/G)(4名)と判定され、明確に分離されていることが理解される。黒ひし形◆はスワブとアプリケーターとで同等の良好な感度を示している。したがって、ポリウレタンおよびPVAはいずれも基材の材質として使用して、遺伝子型の判定に用いることができる。そして、本来このように使用されることを意図していないアプリケーターであっても、同様に用いることができると解釈することができる。好ましい実施形態では、アプリケーターのように体積部分があり接触ないし適用時に表面積が変動する形状ではなく、スワブのように表面積が変動しない形状が好ましいことも示唆された。
本実施例では、リアルタイムPCR 融解曲線分析法でも本発明が応用し得るか確認した。以下にその手順等を示す。本実施例では、融解曲線(melting curve、dissociation curve)を利用した実験を行った。手短には以下のとおりである。
検査対象(被検者30名)からの唾液(ヒト口腔粘膜細胞を含む)の採取は、実施例1と同様に以下のマニュアルに従って行った。
(1)スワブスティック(実施例1と同様)を持ち、スポンジの片面で歯茎の外側・内側、頬の内側を、10回ほどこする。もう片面で同様に10回ほどこすった。スワブ両面を唾液で湿らせた。
(2)スティックの根元を持ち、サンプリングプレート(プラスチック板に水溶紙を貼り付けたプレート)の中央にスポンジの片面を5秒間押し当て、もう片面も同様に5秒間押し当てた(注意:プレートを擦らない)。
(3)使用済みのスワブは元の袋に戻して破棄した
(4)サンプリングシートを二つ折に戻し、30分以上乾かした。他人の飛沫する唾がサンプルプレートに付かないように注意して乾燥した
(方法)
インターカレーター法によるリアルタイムPCRにおいて、PCR増幅産物のTm値を確認する方法を利用した。融解曲線分析では、PCR反応後、反応液の温度を60℃から95℃まで徐々に上昇させ蛍光値をモニタリングする。PCR産物が二本鎖を形成している状態では強い蛍光が検出されるが、ある一定の温度(Tm値)に達すると一本鎖に解離し、蛍光値が急激に低下する。Tm値はPCR産物の長さやGC含量により異なるので、目的の増幅産物とプライマーダイマーのような短い増幅産物を区別することができる。
アンギオテンシンIIはアンギオテンシン変換酵素(Angiotensin converting enzyme: ACE)によりアンギオテンシンIから変換される。ACEをコードするACE遺伝子は、ヒトでは17番染色体長腕(17q23)に位置し、26のエクソンと25のイントロンを含む。ACE遺伝子の16番目のイントロンに287bpのDNAフラグメントを含むinsertion allele (I)とこれを欠くdeletion allele (D)が存在し、これによってII、ID、DDの3つの遺伝子型に分類される。1990年にRigatらは、それぞれの遺伝子型により血清ACE濃度が異なり、D alleleの方がI alleleより濃度が高いと報告する。(J Clin Invest 1990;86:1343-1346)
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PCR増幅はKOD (登録商標) SYBR (登録商標) qPCR Mix (東洋紡(株)製)を使用して、それぞれ以下の試薬を含む20μL反応液を調製した。遺伝子型判定は、本反応の結果、融解曲線解析により判定した。
(試薬)
KOD SYBR(登録商標) qPCR Mix: 10μL
Forward Primer 1.0μL(10 pmol)
Reverse Primer 1.0μL(10 pmol)
50X ROX reference dye: 0.4μL
DW(distilled water): 2.6μL
被検試料調製液: 5μL
全量: 20μL
(プライマー)
Forward Primer:5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'(配列番号1)
Reverse Primer:5'-ATGTGGCCATCACATTCGTCGTCAGAT-3'(配列番号2)
(増幅条件)
熱変性: 98℃ 2分→98℃ 10秒→60℃ 10秒→68℃ 1分を40サイクル。
95℃ 15秒→60℃ 1分→99℃ 15秒→60℃ 15秒
(結果)
結果を図4に示す。図でも示されているように、Insert(490bp):I/I 87.2℃、Delete(190bp):D/D 80.7℃、I/D 80.7℃および87.2℃という結果が示された。この結果から、遺伝子型の相違を簡易に検出することができることが示された。本実施例から、本発明により、簡便さや感度は改善したといえる。すなわち、DNAを抽出しなくとも、20〜30サイクルで増幅してくるので高感度遺伝子判定できており、本発明により簡便に定量的な分析が可能であることが理解される。
さらに本発明に従って調製したサンプルを用いて、PCR増幅産物を電気泳動に供し、ACE遺伝子型の判定を成功裡に行うことができることを確認した。実施例3のリアルタイムPCR産物を、マイクロチップ電気泳動装置MultiNA(Shimadzu)を用いて分析した結果は図4Aに示され、ここで、ACE電気泳動の図面(図4A)は、先の融解曲線分析の結果と一致する。
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本実施例では、リアルタイムPCRによるコピー数多型(CNV)の検査を行った。
検査対象(被検者30名)からの唾液(ヒト口腔粘膜細胞を含む)の採取は、実施例1と同様に以下のマニュアルに従って行った。
(1)スワブスティックを持ち、スポンジの片面で歯茎の外側・内側、頬の内側を、10回ほどこすった。もう片面で同様に10回ほどこすった。スワブ両面を唾液で湿らせた。(2)スティックの根元を持ち、サンプリングプレート(プラスチック板に水溶紙を貼り付けたプレート)の中央にスポンジの片面を5秒間押し当て、もう片面も同様に5秒間押し当てた(注意:プレートを擦らない)。
(3)使用済みのスワブは元の袋に戻して破棄した。
(4)サンプリングシートを二つ折に戻し、30分以上乾かした。他人の飛沫する唾がサンプルプレートに付かないように注意して乾燥した。
ゲノム構造変化に起因して起こるコピー数多型(Copy Number Variations, CNVs)は、近年疾患との関連性や薬剤応答性との関連が指摘されつつある。これを受けてゲノムワイドにCNVsを探索する手法(DNAチップ、シークエンサーなど)が開発され、世界中の研究者の努力の成果としてデータベースが構築され、日々情報が更新されている。しかし一方で、誰もが定量的に多くの検体のターゲットCNVsをバリデーションできる技術は、これまでそれほど多く存在していない。TaqMan(登録商標) Copy Number Assaysは、CNVsバリデーションに適した方法で、ヒト用にデザインされた160万種以上のTaqMan(登録商標)プローブとプライマーがセットになっており、ターゲットCNVs用のTaqMan(登録商標) Copy Number Assaysと、内部コントロールとなるTaqMan(登録商標) Copy Number Reference Assaysを用いて、リアルタイムPCR装置にてコピー数を3〜4時間で決定することができる。
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix: 5μL
20x CNV Probe (CYP2D6*5, Hs00010001_cn) : 0.5μL
20x Copy Number Reference Assay RNaseP : 0.5μL
50X ROX reference dye: 0.2μL
DW(蒸留水): 1.8μL
被検試料調製液: 2μL
全量: 10μL
(増幅条件)
熱変性:50℃、2分→95℃、10分、 95℃、15秒→60℃、1分を40サイクル。
(結果)
TaqMan(登録商標)PCRによるCYP2D6のコピー数多型解析の結果を図5に示す。示されるように、1コピーの場合と2コピーの場合とで明確にその増幅曲線が識別できるため、曲線状態からいくつコピーが存在するのかを判定することができる。ここで、CYP2D6のコピー数多型を検出する方法として利用することができることが示された。欠損をCYP2D6*5と表現した。
本実施例では、サンプリングキットを用いて、遠隔地での試料収集方法を構築した。
図14左欄に示すようにサンプリングシートとスワブ(滅菌袋に封入される)を用意し、被験者に送付する。シートは何度でも剥がせる両面テープを施し水溶紙上には両面テープで固定する。
口の中に異物(飲食物など)→ うがいしてください。
(2)コーヒーを飲んですぐの場合→ うがいしてください。
(3)口紅やグロスなどを水溶紙に付着させないでください。
(1)スワブスティックを持ち、スポンジの片面で歯茎の外側・内側、頬の内側を、10回ほどこする。もう片面で同様に10回ほどこする。スポンジの両面が十分に湿るようにする。
(2)スティックの根元を持ち、水溶紙の○印に、スポンジの片面をあてて5秒間押す。もう片面も同様に5秒間。 (注意)水溶紙をこすらない。
(3)スワブは元の袋に戻し、ゴミとして破棄する。
(4)水溶紙を30分間以上乾かす。ほこりや他人の唾が水溶紙に付かないように注意して、乾燥させる。乾燥後、二つ折りにする。
次に被験者には今般の試験についてインフォームドコンセントに同意する同意書を作成するよう依頼する。同意書は「アルコール体質チェック」(ADH1BおよびALDH2の場合)などのタイトルを付した説明書の中綴じの同意書として作成してもよい。
(サンプル郵送)
(1)被験者はサンプルIDのシール1枚を剥がしテキスト裏面に貼り付ける。
(2)被験者はサンプリングシートと同意書を封筒に収め、郵送する。(例えば、図14のものを封入できるもの)。
新聞紙、定性ろ紙No.1、および水溶紙 60MDPを直径(Φ)6mmでパンチし、5μLの唾液を滴下したのち1時間乾燥させたサンプルを200μLの蒸留水に入れ、1、2、5、10、30、60分ごとに撹拌し各時点で取り出した上清5μL、および60分の後に95℃5分間インキュベートして取り出した上清5μLをTaqMan(登録商標) PCR反応液に加え、リアルタイムPCRに供した。50×ROX reference dyeは蛍光を調整するためのレファレンスとして用いた。Thunderbird(東洋紡)(1000回用のQPS-201X5(QPS-201の5セット組))を購入し使用した。
20×Probe (ADH1BおよびALDH2) 0.5μL
50×ROX reference dye 0.2μL
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix: 5μL
Φ4mm in DW(蒸留水) 4.3μL
計 10.0μL
(※)200μLの蒸留水にΦ6mmでパンチしたサンプルを入れて、加熱するサンプルについては95℃、5分間THERMO BLOCK ND-G962(日伸理化製)で温めた。
50℃、2分→95℃、10分→(95℃、15秒→60℃、1分)×40サイクル
ポジティブコントロールとしては、目的遺伝子を組み込んだプラスミドDNAについて、260nmでの吸光度とDNAの長さから理論的にコピー数を計算して基準とした。ADH1Bの場合、約500万コピー/μLの精製されたプラスミドDNAを希釈した物(10倍の段階希釈)をコントロールとして使用した。一般的には、定量的PCR反応では、10コピーから100万コピーの範囲で定量する。そして、Ct値で20サイクルから30サイクルの間が最も定量性が良好であるが、これは、コピー数としては1000コピーから100000コピーの範囲である。目的遺伝子を組み込んだプラスミドを10倍の希釈系列で調製したものをPCR反応に供し、ポジティブコントロールとした。
口腔内粘膜細胞を採取した同じスワブの片面だけを、4枚の水溶紙に順次5秒間押し当てて乾燥したサンプルを使用して、実施例6と同様の手法によりリアルタイムPCR解析を行った。水溶紙は、4mmΦに切り抜き、蒸留水100μLに入れたのち、95℃5分の加熱処理を行った。リアルタイムPCRの反応組成は、上記実施例6のとおりであった。
6mmΦに切り抜いた水溶紙60MDPに、10倍の希釈系列で段階的に希釈した唾液を10μL滴下し、1時間乾燥させたのち、蒸留水に加え、95℃で5分加熱処理を行い、上清5μLを、実施例6に記載されるものと同様のリアルタイムPCR反応に供した。また、唾液の希釈液10μLを蒸留水に加えて同様に加熱処理を行ったサンプルも同様にリアルタイムPCR反応に供した。
担体として水溶紙(60MDPおよび120MDP)を用いて、実施例6に記載されるのと同様のプロトコルによりADH1Bについて、遺伝子の増幅を確認した。乾燥唾液サンプルは実施例5に記載されるようにスワブを用いて調製した。本実施例では血液10μLを水溶紙に滴下し、乾燥させた後に5mmを打ち抜いたものも使用して同様の増幅の確認を行った。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許庁に2016年8月2日に出願された特願2016−152125に対して優先権主張をするものであり、この出願の内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
配列番号2:実施例3で使用したReverse Primer
Claims (41)
- (A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、
(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材と
を含む、核酸含有生体材料を含む試料から核酸増幅用のサンプルを調製するためのキット。 - 前記基材(B)は一定範囲量の核酸含有生体材料を含む試料を提供するように構成される、請求項1に記載のキット。
- 前記基材(B)の表面積は前記一定範囲量を提供するのに十分である、請求項2に記載のキット。
- 前記担体(A)は水に入れた際に核酸増幅を許容する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
- 前記担体(A)は光学的検出を許容する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキット。
- 前記核酸増幅後の前記サンプル中の核酸は光学的検出される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキット。
- 前記担体(A)は水解性担体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のキット。
- 前記一定範囲量は、核酸増幅後にコピー数を識別し得る量である、請求項2〜7のいずれか1項に記載のキット。
- 前記一定範囲量は、基準量に対してX倍〜X分の1以内であって、X2は前記核酸増幅においてコピー数が1違う際に識別可能な倍率の相違である、請求項2〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 前記(B)基材は、核酸含有生体材料を結合せずに担持する基材である、請求項1〜9のいずれか一項に記載のキット。
- 前記基材は、ポリウレタン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレン、キチン、キトサン、コラーゲン、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、ポリプロピレン、セルロースおよびその誘導体、紙類、コラーゲン、ゼラチン、ウレタン、シリコンおよび脱脂綿、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つの材料を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のキット。
- 前記一定範囲量は、前記担体を一定面積で取り出すことによって達成される、請求項2〜11のいずれか一項に記載のキット。
- 前記基材(B)の表面積は、前記一定面積と同じまたはそれより広い、請求項12に記載のキット。
- 前記基材(B)は、前記一定面積を覆うのに十分な形状である、請求項12または13に記載のキット。
- 前記一定面積は、該一定面積を切除し得る切除器によって切除することで達成される、請求項12〜14のいずれか一項に記載のキット。
- 前記切除器は生検トレパン、およびパンチから選択される、請求項15に記載のキット。
- 前記一定範囲量は、前記試料を一定量で提供することによって達成される、請求項2〜16のいずれか一項に記載のキット。
- 前記担体は水解性紙である、請求項1〜17のいずれか1項に記載のキット。
- 前記核酸増幅は、非特異的増幅が生じる核酸増幅法である、請求項1〜18のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のキットと、(C)核酸増幅のための試薬とを含む、精製せずに核酸を増幅するためのキット。
- 前記核酸増幅のための試薬は、プライマー、核酸増幅酵素、および必要な緩衝剤を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記(A)は非吸水性材料と吸水性材料とをさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のキット。
- (X)非吸水性材料と、
(Y)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、
(Z)吸水性材料と
を含む、生体試料を乾燥するためのデバイス。 - 前記担体(Y)は、水に入れた際に核酸増幅を許容する、請求項23に記載のデバイス。
- 前記担体(Y)は光学的検出を許容する、請求項23または24に記載のデバイス。
- 前記担体(Y)は水解性担体である、請求項23〜25のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記非吸水性材料は前記担体を保持するように配置され、該非吸水性材料は前記吸水性材料と脱着可能に連結される、請求項18に記載のキットまたは請求項23〜26のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記非吸水性材料は前記吸水性材料と脱着可能な粘着部材を介して連結される、請求項22〜27のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
- 前記非吸水性材料は前記担体の周囲を取り囲むように配置される、請求項22〜28のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
- 前記担体は、前記非吸水性材料および前記吸水性材料と接触する、請求項22〜29のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
- 前記担体は、前記吸水性材料と直接接触しないように配置される、請求項22〜30のいずれか一項に記載のキットまたはデバイス。
- 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を検出する方法であって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを用いて
該核酸含有生体材料を含む被検試料を提供する工程、
該担体を、該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーを含む核酸増幅試薬含有水溶液に接触させ、核酸が増幅する条件に供する工程、
該光学的手段を用いて、該水溶液中に該特定遺伝子が含まれるか否かおよび/または該特定遺伝子のコピー数を検出する工程を包含する、方法。 - 前記基材を前記核酸含有生体材料に接触させ、その後、前記担体に該基材を接触させることによって、前記核酸含有生体材料を含む被検試料が提供される、請求項32に記載の方法。
- 前記被検試料は、一定範囲量の核酸含有生体材料を含むように提供される、請求項32または33に記載の方法。
- 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を光学的手段を用いて検出するための試料を提供するキットであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
を備える、キット。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を光学的手段を用いて検出するための試料を提供するシステムであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
を備える、システム。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子および/または該特定遺伝子のコピー数を検出するシステムであって、
(A)核酸含有生体材料を結合し得る担体と、(B)該担体より該核酸含有生体材料の結合能が低い基材とを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
光学的手段と
を備える、システム。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出する方法であって、
該核酸含有生体材料を含む被検試料を、非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスに接触させる工程、
該担体を該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーを含む核酸増幅試薬含有水溶液に接触させ、該水溶液を核酸が増幅する条件に供する工程、
該光学的手段を用いて、該水溶液中に該特定遺伝子が含まれるか否かおよび/または該特定遺伝子のコピー数を検出する工程を包含する、方法。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するための試料を提供するキットであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
を備える、キット。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するための試料を提供するシステムであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
を備える、システム。 - 核酸含有生体材料に含まれる特定遺伝子を検出するシステムであって、
非吸水性材料と核酸含有生体材料を結合し得る担体と吸水性樹脂とを含むデバイスとを含む、核酸含有生体材料を含む被検試料を提供するためのキットと
該特定遺伝子の特異的増幅を可能とするプライマーと、
核酸増幅試薬または核酸増幅試薬含有水溶液と、
核酸増幅装置と
光学的手段と
を備える、システム。
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