JPWO2017138627A1 - 食道類基底細胞癌罹患鑑別方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)前記配列番号141〜145で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(1)に記載の方法。
(3)前記配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号1〜5で示す塩基配列からなる、(2)に記載の方法。
(4)前記測定工程において、配列番号146〜148で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記配列番号146〜148で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(4)に記載の方法。
(6)前記配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号6〜8で示す塩基配列からなる、(5)に記載の方法。
(7)前記測定工程において、配列番号149〜153で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記配列番号149〜153で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(7)に記載の方法。
(9)前記配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号9〜13で示す塩基配列からなる、(8)に記載の方法。
(10)前記測定工程において、配列番号154〜210で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(12)前記配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号14〜70で示す塩基配列からなる、(11)に記載の方法。
(13)前記遺伝子の単位量あたりの発現レベルは、該遺伝子のmRNA若しくはそのヌクレオチド断片、又は該遺伝子がコードするタンパク質又はそのペプチド断片の単位量あたりの絶対量又は相対量として測定される、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)前記判定工程において健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が2倍以上である、(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(15)配列番号141〜145で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子群からなるBSCEマーカー。
(16)前記5種の遺伝子がそれぞれ配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(15)に記載のBSCEマーカー。
(17)前記配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号1〜5で示す塩基配列からなる、(16)に記載のBSCEマーカー。
(18)配列番号146〜148で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、(15)〜(17)のいずれかに記載のBSCEマーカー。
(19)前記配列番号146〜148で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(18)に記載のBSCEマーカー。
(20)前記配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号6〜8で示す塩基配列からなる、(19)に記載のBSCEマーカー。
(22)前記配列番号149〜153で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(21)に記載のBSCEマーカー。
(23)前記配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号9〜13で示す塩基配列からなる、(22)に記載のBSCEマーカー。
(24)配列番号154〜210で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、(15)〜(23)のいずれかに記載のBSCEマーカー。
(25)前記配列番号154〜210で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、(24)に記載のBSCEマーカー。
(26)前記配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号14〜70で示す塩基配列からなる、(25)に記載のBSCEマーカー。
(27)配列番号141〜145で示す塩基配列からなるプローブ群を含むBSCE検出用試薬。
(28)配列番号146〜148で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、(27)に記載のBSCE検出用試薬。
(29)配列番号149〜153で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、(27)又は(28)に記載のBSCE検出用試薬。
(30)配列番号154〜210で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、(27)〜(29)のいずれかに記載のBSCE検出用試薬。
(31)(27)〜(30)のいずれかに記載のBSCE検出用試薬を含むBSCE検出用キット。
1−1.概要
本発明の第1の態様は食道類基底細胞癌マーカー(BSCEマーカー)である。本発明のBSCEマーカーは、少なくとも5種の遺伝子群からなり、被験者及び健常者又は健常者群の試料中におけるその発現レベルを測定することでBSCEの罹患の有無、又は罹患している食道癌がBSCEか、それ以外の他の食道癌かを正確に鑑別することができる。
「食道」とは、輪状軟骨の下端から胃に移行するまでの長さ20〜25cmの管状の臓器で、頚部食道、胸部食道、腹部食道の3領域から形成されている。
本態様のBSCEマーカーは、BSCE鑑別遺伝子群で構成される。本明細書において「BSCE鑑別遺伝子群」とは、配列番号141〜145で示す塩基配列をそれぞれ含む少なくとも5種の遺伝子(COL9A2遺伝子、FGF3遺伝子、NPTX2遺伝子、COL9A3遺伝子、及びCOL9A1遺伝子)からなる。すなわち、この5種の遺伝子が本態様のBSCEマーカーの必須BSCE鑑別遺伝子群となる。前記5種の遺伝子は、それぞれが表1においてNo.R-1〜R-5に相当し、配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。具体的には、それぞれが配列番号1〜5で示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。なお、BSCEマーカーを構成する個々の遺伝子を本明細書では「BSCE鑑別遺伝子」と表記する。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、被験者の食道類基底細胞癌(BSCE)の罹患鑑別を補助する方法である。本発明のBSCE罹患鑑別方法は、被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料中に含まれる第1態様に記載のBSCEマーカーの発現プロファイルを得て、該発現プロファイルに基づいて該被験者における食道癌が食道類基底細胞癌であるか又はそれ以外の食道癌であるかの鑑別を補助する方法である。「BSCEマーカーの発現プロファイル」とは、BSCEマーカーを構成する各BSCE鑑別遺伝子の発現レベルに関する情報をいう。本明細書では、特に複数のBSCE鑑別遺伝子の発現レベルに関する情報から構築される遺伝子発現パターンをいう。一般に、取得する遺伝子の発現プロファイルが多いほど精度の高い鑑別が可能となる。
本発明のBSCE罹患鑑別方法は、測定工程、算出工程、及び判定工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
「測定工程」とは、被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料において第1態様のBSCEマーカーの単位量あたりの発現レベルを測定してその測定値を得る工程である。
BSCE鑑別遺伝子の転写産物の測定は、mRNA量の測定であっても、またmRNAから逆転写されて得られたcDNA量の測定であってもよい。一般に遺伝子の転写産物の測定には、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブに用いて、遺伝子の発現レベルを絶対値又は相対値として測定する方法が採用される。
BSCE鑑別遺伝子の翻訳産物の測定は、BSCE鑑別遺伝子がコードするタンパク質(ペプチド)量の測定であってもよいし、そのタンパク質が有する活性の測定であってもよい。
一般にタンパク質量の測定には、そのタンパク質のアミノ酸配列、特に特異性の高い特徴的なアミノ酸配列を認識して、結合する結合子を用いる方法が採用される。そのような結合子には、例えば、抗体若しくはその抗体フラグメント又は核酸アプタマーが挙げられる。
本工程で使用する抗体又はその断片は、BSCE鑑別遺伝子がコードするタンパク質(BSCRマーカータンパク質)の一部をエピトープとして認識し、抗原抗体反応によってそれに特異的に結合することで、BSCEマーカータンパク質を検出することができる。ここでいう「一部」とは、5〜15個、好ましくは5〜10個、より好ましくは6〜10個の連続するアミノ酸からなる領域をいう。
「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。核酸アプタマーを構成するヌクレオチドは、通常は天然核酸であるRNA及び/又はDNAであるが、転写又は複製可能な非天然型ヌクレオチドを含んでいてもよい。好適には、RNAのみで構成されるRNAアプタマー、又はDNAのみで構成されるDNAアプタマーである。
タンパク質活性の測定には、そのタンパク質が有する活性に応じた測定方法が採用される。例えば、リガンドと受容体、又は転写因子とDNAのようなペプチド−タンパク質、低分子化合物−タンパク質、又はタンパク質−核酸のように、BSCEマーカータンパク質が他の物質と結合して機能する場合であれば、BSCEマーカータンパク質の結合活性を測定すればよい。結合活性を測定する具体例としては、上述の表面プラズモン共鳴法や水晶振動子マイクロバランス法を利用して測定する方法が挙げられる。例えば、BSCEマーカータンパク質が転写因子の場合、その標的DNA配列を金属薄膜表面に標的核酸の塩基配列に固定化し、BSCEマーカータンパク質を含み得る被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料を金属薄膜表面に流通させてBSCEマーカータンパク質と標的DNA配列の結合量を検出することによってBSCEマーカータンパク質の活性を測定することができる。また、BSCEマーカータンパク質が酵素として機能する場合であれば、基質を添加してその触媒活性を測定すればよい。
「算出工程」とは、前記測定工程で得られた測定値に基づいて、特定の値を算出する工程である。本工程は、合算値算出工程と平均測定値算出工程の2つの独立した工程を含み、いずれか一方、又は両方を選択することができる。
合算値算出工程では、前記測定工程で得られた測定値に基づいてBSCEマーカーを構成する各BSCE鑑別遺伝子の発現比を算出し、その合算値を得る。ここでいう「遺伝子の発現比」とは、BSCEマーカーを構成する一の遺伝子において、測定工程で得た被験者及び健常者又は健常者群の測定値から算出される比率をいう。発現比は、すべての検体について共通のサンプル(以下「共通リファレンス」という。)に対する相対比として算出される。発現比を算出する際の共通リファレンスは、共通であればどのようなものでも構わない。例えば、特定の細胞株でもよく、複数の細胞株を混合したものでもよい。また、健常者でもよい。その場合、健常者は一人であってもよいが、複数からなる健常者群が好ましい。
平均測定値算出工程では、前記測定工程で得られた測定値に基づいて被験者及び健常者群のそれぞれにおいて、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群から平均測定値を算出する。また、ここでは健常者群を構成するそれぞれの健常者において、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群から平均測定値を算出する。平均測定値は、例えば、BSCEマーカーが必須BSCE鑑別遺伝子群を含む7種のBSCE鑑別遺伝子で構成される場合、各BSCE鑑別遺伝子の測定値の総和を種類数である7で除することで算出できる。平均測定値算出工程では、原則として平均測定値を算出するが、必要に応じて、被験者及び健常者群のそれぞれの測定値の総和、すなわちBSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群の種類数で除する前の値を算出することもできる。
「判定工程」とは、前記算出工程で得られた値に基づいて、被験者におけるBSCEの罹患を判定する工程である。本工程は、前記算出工程における2つの工程、すなわち合算値算出工程と平均測定値算出工程のそれぞれで得られた値に基づいて異なる方法で判定を行う。
算出工程で合算値算出工程を行った場合、得られた合算値がROC曲線から導かれる所定のカットオフ値(cutoff value)を超えたときには、その被験者はBSCEに罹患している可能性が高いと判定する。
算出工程で平均測定値算出工程を行った場合、得られた健常者群又はBSCE以外の食道癌患者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が統計学的に有意に大きい場合、その被験者は食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する。
本態様のBSCE罹患鑑別方法によれば、生検や手術により摘出した検体を調べることで、その検体を提供した被験者がBSCEか、又はその他の食道癌かを正確に鑑別することができる。正診率の高い本態様のBSCE罹患鑑別方法によって、BSCEであると確定診断をすることが可能となり、通常型食道扁平上皮癌とは違う病態であると認識し、再発リスクや治療法の判断を考慮し、対応できる利点がある。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、食道類基底細胞癌(BSCE)検出用試薬である。本態様のBSCE検出用試薬は、例えば食道癌に罹患している被験者由来の試料に適用することで、その被験者の食道癌が食道類基底細胞癌であるか、その他の食道癌であるかを鑑別することができる。
本態様のBSCE検出用試薬は、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子の転写産物、すなわちmRNA又はcDNAを検出するためのプローブ又はプライマーセット、又はBSCEマーカータンパク質を検出するための抗体又は核酸アプタマーからなる。これらの具体的な構成については、第2態様の測定工程に記載している。例えば、BSCEマーカーを構成する5種の必須BSCE鑑別遺伝子群の転写産物を検出する場合、BSCE検出用試薬は、配列番号141〜145で示す塩基配列からなるプローブ群(相補配列を含む)を含むことができる。また、この場合、BSCE検出用試薬は、配列番号146〜148で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含むことができる。より好ましくは、配列番号149〜153で示す塩基配列からなる一以上のプローブを、またさらに好ましくは154〜210で示す塩基配列からなる一以上のプローブを含んでいてもよい。
本態様のBSCE検出用試薬を用いて、食道癌罹患歴のある被験者又は食道癌罹患の疑いのある被験者に適用することで、食道癌罹患歴のある被験者がBSCEに罹患しているか否か若しくは罹患していたか否か、又はBSCEとBSCE以外の他の主要な食道癌のどちらに罹患しているか、また食道癌罹患の疑いのある被験者がBSCEに罹患しているか否かを客観的かつ正確に判定することができる。特に、従来の病理診断では鑑別することが困難であったBSCEと食道扁平上皮癌との区別も、本態様のBSCE検出用試薬を用いることで容易に鑑別することが可能となる。
4−1.概要
本発明の第4の態様は食道類基底細胞癌(BSCE)検出キットである。本発明のBSCE検出キットは、第3態様のBSCE検出用試薬を必須の構成要素として含む。
本発明のBSCE検出キットを構成する第3態様のBSCE検出用試薬の構成は、特に限定されず、プローブ、プライマーセット、抗体、核酸アプタマーのいずれであってもよい。それぞれは、少なくともBSCEマーカーを構成する5種の必須BSCE鑑別遺伝子群の転写産物又は翻訳産物を検出できればよいが、好ましくは配列番号146〜148で示す塩基配列を含む3種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上、より好ましくは配列番号149〜153で示す塩基配列を含む5種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上、さらに好ましくは配列番号154〜210で示す塩基配列を含む57種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上を検出できればよい。また、プローブ、プライマーセット、抗体、核酸アプタマー等を組み合わせて包含することもできる。
(目的)
BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子を特定する。
(方法と結果)
1−1.対象
2008年1月から2015年7月の間に、福島県立医科大学臓器再生外科学講座において、本研究に対する同意が得られた食道癌患者のうち、手術及び内視鏡的生検で生体試料の採取が可能であった患者98名を対象とした。
(1)手術検体に関しては、癌摘出直後、病変部分及び病変部から5cm以上離れた正常部分から約7×7mm大の検体を試料として採取した後、凍結用チューブに入れ、液体窒素で凍結させた。残りの癌標本は、ホルマリン固定後、パラフィン包埋(FFPE:Formalin-Fixed Paraffin Embedded)切片を作製し、後述する病理学的診断を行った。手術検体数は、BSCEと診断された7サンプルを含む57サンプルである。
検証用のサンプルとして、USbiomax社から「食道類基底細胞癌」として販売されていたFFPE組織20検体を購入した。
上記「1-2.生体試料の採取方法」で作製したFFPE切片の組織(FFPE組織)、又は「1-3.ホルマリン固定パラフィン包理組織の入手」で購入したFFPE組織から病理切片を作製した。病理切片をH.E(Hematoxylin and Eosin)染色し、二人の病理医により独立に組織学的診断を行った。病理学的診断は、Wainらの示した病理学的基準を用いて行い、かつ、Imamhasanら(Imamhasan A., et al., 2012, Human Pathology 43:2012-2023)らが示した病理学的形態の6パターンを参照とした。当該6パターンは、次のA〜Fに示す通りである。
(B)篩状偽房状(Cribriform pattern and pseudoacini formation)
(C)導管様配列(ductal differentiation)
(D)腺様小嚢胞様胞巣(small nests with a microcystic and/or trabecular pattern)
(E)硝子様物質の沈着(hyaline-like material deposition)
(F)扁平上皮癌部分の併存(coexistence of invasive SCC component)
各症例の診断は、上記A〜Fの所見の発現割合も検討し、総合的に診断した。なお、本実施例では、検体の大部分が扁平上皮癌成分であっても、一部に食道類基底細胞癌成分が混在している検体は、食道類基底細胞癌と認定した。
上記手術検体を対象としてBSCEとその他の食道癌を区別するマーカー遺伝子を抽出した。具体的には次の通りである。
マイクロアレイ用合成DNAを用いてDNAマイクロアレイを作製した。polyA+RNA(mRNA)を対象としたDNAマイクロアレイ(以下「システム1」という。)は、ヒト由来の転写産物に対応する31797種類の合成DNA(80 mers)をスライドガラス上にアレイ化して作製した。また、全RNAを対象としたDNAマイクロアレイ(以下「システム2」という)は、ヒト由来の転写産物に対応する14400種類の合成DNA(80 mers)をスライドガラスにアレイ化して作製した。DNAマイクロアレイの作製方法は、Schena M., et al., 1995, Science, 270:467-470に記載の作製方法を参照した。具体的には、超微量分注装置(マイクロダイアグノスティク社製)を用いて、同社推奨のプロトコルに従ってヒト遺伝子断片ライブラリー(マイクロダイアグノスティック社製)をスライドガラス(松波硝子工業社製、HAコートスライドガラス)にプリントして作製した。このDNAマイクロアレイを気相恒温器内にて80℃で1時間静置し、さらにUVクロスリンカー(Hoefer社製、UVC500)を用いて120mJの紫外線を照射した。DNAマイクロアレイの後処理は、特許第4190899号に記載の方法に従った。
3−1.凍結組織からの全RNA抽出
前記「1−2.生体試料の採取方法」で採取し、液体窒素で凍結させた試料から、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて、添付のプロトコルに従い、全RNAを抽出した。
前記「1−3.ホルマリン固定パラフィン包埋組織の入手」で購入したFFPE組織から、ISOGEN PB Kit(ニッポンジーン社製)を用いて、添付のプロトコルに従って全RNAを抽出した。
125 μg以上の全RNAが取得できたサンプルについては、引き続き、MicroPoly(A)purist kit(Ambion社製)を用い、添付のプロトコルに従ってpolyA+RNAを精製した。
調製したpolyA+RNA又は全RNAを鋳型として逆転写反応により検体標識cDNAを調製した。具体的には、2.0μgの前記polyA+RNA又は5.0μgの前記全RNA、SuperScript II(登録商標)逆転写酵素(Thermo Fisher Scientific社製)及びCyanine5 -deoxyuridinetriphosphate(Cyanine 5-dUTP)(Perkin Elmer社製)を用いて、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬(マイクロダイアグノスティック社製)により調製した。
前記標識cDNA溶液を99℃で5分間加熱して熱変性させ、標識プローブを調製した。標識プローブを「1.DNAマイクロアレイの作製」で作製したDNAマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションカセット(マイクロダイアグノスティック社製)に格納した。該ハイブリダイゼーションカセットを気相恒温器(三洋電機バイオメディカ社製)に入れ、42℃で20時間静置した状態で保温した。
5−1.遺伝子発現レベルの測定
各遺伝子の発現レベルは、前記「4.ハイブリダイゼーション」においてDNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAと結合した標識プローブの蛍光強度に基づいて測定した。洗浄後のDNAマイクロアレイ上の蛍光をスキャナGenePix4000B(Axon Instrument社製)を用いて測定した後、スキャナに付属の解析ソフトウェアGenePixPro(Axon Instrument社製)を用いて光学的に評価し、蛍光強度の相対値を数値化した。具体的には、DNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAスポットにおける検体標識cDNA由来の蛍光強度(Cyanine 5蛍光強度)と対照標識cDNA由来の蛍光強度(Cyanine 3蛍光強度)をスポット毎に測定し、各スポットにおけるCyanine5/Cyanine3蛍光強度比(対数変換相対的発現比:log2比)を算出することで、スポット間の遺伝子発現レベルの補正(スケーリング)を行った。また、DNAマイクロアレイ上のスポット以外の場所における蛍光強度からバックグラウンドを算出し、ノイズとして各スポットの蛍光強度比から控除した。
BSCEと病理診断された7検体を含む手術57検体から、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得した。その中から、DNAマイクロアレイのシステム1及びシステム2に共通して搭載されている14400遺伝子を抽出した。次に、食道類基底細胞癌と病理診断された7検体中2検体以上で、蛍光強度が検出限界以下であった遺伝子を除外した。続いて、57検体中少なくとも1検体以上で、対数変換相対的発現比が1以上又は−1以下の条件を満たす遺伝子群を抽出した。さらに、各遺伝子について全検体の対数変換相対的発現比の平均値を算出し、少なくとも1検体以上で、当該平均値との差が1以上又は−1以下の値を有する遺伝子群を抽出した(7379遺伝子)。当該遺伝子群の対数変換相対的発現比の値をもとに、二次元方向でクラスタ分析を行った。
(目的)
生検検体を用いたときのBSCEマーカーによるBSCE鑑別有効性の検証をする。
検体(57検体)の70遺伝子発現スコアと生検検体の70遺伝子発現スコアを合わせてROC曲線を作成して検証した。生検検体の70遺伝子発現スコアは、実施例1で採取した生検312検体からDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、対数変換相対的発現比に変換した後に、BSCEマーカー(70遺伝子群)のデータを抽出して70種全てのBSCE鑑別遺伝子群について70遺伝子発現スコアを算出した。その結果、図2(D)に示すようにAUCが0.9927となった。また、BSCEマーカー(70遺伝子群)を用いて、手術検体(57検体)と生検検体(312検体)を合わせて感度特異度曲線を作成して検証した結果、図2(E)に示すように、カットオフ値を33.1368に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。これらの結果から、本発明のBSCEマーカーを用いることで、生検検体のBSCEを高精度に鑑別できることが示された。
(目的)
FFPE組織を用いたときのBSCEマーカーによるBSCE鑑別有効性の検証をする。
BSCEマーカー検証用のFFPE組織検体として、USbiomax社から購入した前述のFFPE組織20検体を用いた。全FFPE組織を改めて病理学的に診断したところ、13検体が食道類基底細胞癌、2検体が扁平上皮癌、そして5検体が内分泌細胞癌であることが明らかとなった。
(目的)
手術検体、生検検体、及びFFPE検体を用いた群散布図によるBSCE鑑別有効性の検証をする。
手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせて、BSCEマーカー(70遺伝子群)の70遺伝子発現スコアによる群散布図を作成した。その結果、図2(J)に示すように、非BSCE検体群の平均値は8.970であり、BSCE検体群の平均値は70.549であった。両者間には統計的に有意差(P=1.43×10-9)が存在した。
(目的)
BSCEマーカーにおける必須BSCE鑑別遺伝子群を選択する。
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、表1のNo.R-1〜R-5で示す5種のBSCE鑑別遺伝子群で、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[1]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-6〜R-8で示す3種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む8種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[2]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-9〜R-13で示す5種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む10種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[3]
実施例5〜7で検証した、必須BSCE鑑別遺伝子群を含む表1のNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[4]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-14及びR-15示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む7種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[5]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例6で示した表1のNo.1-〜R-8で示す8種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む10種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[6]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例7で示した表1のNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む12種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
<実施例12>
(目的)
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。[7]
実施例1で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、t検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例7で示した表1のNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表1のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む15種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。
Claims (31)
- 食道類基底細胞癌の罹患鑑別を補助する方法であって、
被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料において配列番号141〜145で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子の単位量あたりの発現レベルを測定してその測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた測定値に基づいて、
被験者及び健常者又は健常者群の測定値から各遺伝子の発現比を算出し、その発現比の合算値を得る、又は
被験者及び健常者群においてそれぞれの前記測定工程で測定した全遺伝子の測定値から平均測定値を算出する
算出工程、
前記算出工程で得られた値に基づいて、
合算値がROC曲線から導かれる所定のカットオフ値を超える場合、又は
健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が統計学的に有意に大きい場合、その被験者は食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する判定工程
を含む前記方法。 - 前記配列番号141〜145で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号1〜5で示す塩基配列からなる、請求項2に記載の方法。
- 前記測定工程において、配列番号146〜148で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列番号146〜148で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項4に記載の方法。
- 前記配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号6〜8で示す塩基配列からなる、請求項5に記載の方法。
- 前記測定工程において、配列番号149〜153で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列番号149〜153で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項7に記載の方法。
- 前記配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号9〜13で示す塩基配列からなる、請求項8に記載の方法。
- 前記測定工程において、配列番号154〜210で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列番号154〜210で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号14〜70で示す塩基配列からなる、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子の単位量あたりの発現レベルは、該遺伝子のmRNA若しくはそのヌクレオチド断片、又は該遺伝子がコードするタンパク質又はそのペプチド断片の単位量あたりの絶対量又は相対量として測定される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記判定工程において健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が2倍以上である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号141〜145で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子群からなる食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記5種の遺伝子がそれぞれ配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項15に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号71〜75で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号1〜5で示す塩基配列からなる、請求項16に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 配列番号146〜148で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項15〜17のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号146〜148で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項18に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号76〜78で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号6〜8で示す塩基配列からなる、請求項19に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 配列番号149〜153で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項15〜20のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号149〜153で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項21に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号79〜83で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号9〜13で示す塩基配列からなる、請求項22に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 配列番号154〜210で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項15〜23のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号154〜210で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項24に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 前記配列番号84〜140で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号14〜70で示す塩基配列からなる、請求項25に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
- 配列番号141〜145で示す塩基配列からなるプローブ群を含む食道類基底細胞癌検出用試薬。
- 配列番号146〜148で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項27に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
- 配列番号149〜153で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項27又は28に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
- 配列番号154〜210で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
- 請求項27〜30のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬を含む食道類基底細胞癌検出用キット。
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