JPWO2017110817A1 - クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 - Google Patents
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Abstract
還元糖等の有機化合物の分離性能に優れた、特に糖分析においてシッフ塩基の形成及びアノマー分離を防止可能な、クロマトグラフィー用分離剤が提供される。このクロマトグラフィー用分離剤は下記式：
【化１】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０のアルキレン基又はオキシアルキレン基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して炭素数１〜６のアルキレン基又はアルキレンオキシアルキレン基である）で表される、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる。
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Description
本発明は、クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法に関するものである。
クロマトグラフィー用分離剤は、クロマトグラフィーカラム内に充填又は形成されることで固定相として機能する材料である。そのようなクロマトグラフィー用分離剤として、シリカゲルが広く用いられている。シリカゲルは物理的強度が高く、比表面積が大きいといった利点を有する。
近年、クロマトグラフィー性能の向上を図るべく、シリカゲルの表面にアミノ基ないしアミン含有基を結合させた（すなわち表面修飾した）分離剤が知られている。例えば、特許文献１（特開平１−９６００９号公報）にはアミノプロピル化シリカゲルの１級アミンを架橋により３級アミンにした分離剤が開示されている。また、特許文献２（特開２００６−３２１８４４号公報）にはビスアミノアルキルテトラアルキルジシロキサンをシリカゲルと反応させて得られた１級アミンの分離剤が開示されている。特許文献３（ＵＳ２０１０／０３００９７２Ａ１）及び特許文献４（ＵＳ２００６／００２１９３９Ａ１）には、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリドンの共重合体にピペラジン構造を有するアミンと反応させた、２級アミン及び環状構造を有する分離剤が開示されている。特許文献５（ＵＳ２００５／００２３２０３Ａ１）には、３級アミンがシリカゲルに結合した疎水性の強い分離剤が開示されている。
ところで、従来の分離剤を固定相として用いた糖分析には幾つかの問題がある。例えば、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）モードでの糖分析において、アミノプロピルをシリカゲルに固定したアミノカラムが用いられることがある。しかし、そのようなアミノカラムで還元糖を分析する場合、固定相側の１級アミンと還元糖が反応して、シッフ塩基と呼ばれるイミンが形成され、カラムから溶出しなくなるといった問題が生じうる。特に、微量の還元糖を分析する場合、これは大きな問題となる。一方、２級アミンを有する固定相は、還元糖とエナミンを形成して、還元糖の分析に悪影響を及ぼす。
また、２種類の立体異性体を有する還元糖を分析する場合、立体異性体間の変換速度が遅い場合には、アノマー分離が生じて検出ピークが割れてしまうとの問題もある。このアノマー分離は、（ｉ）塩基性固定相を用いてアノマー変換を加速させ一方の異性体に偏らせること、あるいは（ｉｉ）分析温度を８０℃にしてアノマー変換を加速させることにより解消することができる。しかしながら、シリカゲルベースの固定相を用いた場合、８０℃もの高温の水溶液をカラムに通すと、塩基性下でシリカゲルは溶出してしまい、中性下でもシリカゲルは若干溶出する。特に、高圧下ではシリカゲルの劣化が速くなる傾向がある。
本発明者は、今般、３級アミンを有し且つ分子末端に水酸基を有する特定のシラン官能基で多孔質基材を表面修飾することにより、還元糖等の有機化合物の分離性能に優れた、特に糖分析においてシッフ塩基の形成及びアノマー分離を防止可能な、クロマトグラフィー用分離剤を提供できるとの知見を得た。
したがって、本発明の目的は、還元糖等の有機化合物の分離性能に優れた、特に糖分析においてシッフ塩基の形成及びアノマー分離を防止可能な、クロマトグラフィー用分離剤を提供することにある。
本発明の一態様によれば、下記式：
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０のアルキレン基又はオキシアルキレン基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して炭素数１〜６のアルキレン基又はアルキレンオキシアルキレン基である）で表される、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる、クロマトグラフィー用分離剤が提供される。
本発明の他の一態様によれば、筒状のカラム本体と、前記カラム本体に充填又は形成される、上記クロマトグラフィー用分離剤とを備えた、クロマトグラフィーカラムが提供される。
本発明の他の一態様によれば、上記クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む、クロマトグラフィーによる分離方法が提供される。
クロマトグラフィー用分離剤
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる。このシラン官能基は下記一般式：
で表されるものであり、３級アミンを有し且つ分子末端に水酸基を有することで特徴付けられる。このような構成とすることで、還元糖等の有機化合物の分離性能に優れた、特に糖分析において、シッフ塩基の形成及びアノマー分離を防止可能な、クロマトグラフィー用分離剤を提供することができる。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる。このシラン官能基は下記一般式：
このように分離剤のシラン官能基が３級アミンを有し且つ分子末端に水酸基を有することで分離性能が向上するメカニズムは必ずしも定かではないが、以下のように推察される。すなわち、本発明の分離剤のシラン官能基は３級アミン及び水酸基を有するため、親水性を向上させるとともに、弱いカチオン交換性を有する。このように分離剤が被検物質との間で複数の相互作用を呈することが優れた分離性能に寄与するものと考えられる。特に、還元糖等の有機化合物を分析する場合、３級アミンは立体障害が大きいため、還元糖のアルデヒド基と反応せず、その結果還元糖と分離剤の間でシッフ塩基が形成されないものと考えられる。また、３級アミンは塩基性を有するため、２種類の立体異性体を有する還元糖を分析する場合であっても、還元糖のアノマー変換が速くなり、その結果アノマー分離が解消されるものと考えられる。
本発明の分離剤の表面は３級アミンと水酸基が水素結合性を有するので親水性を呈する。このため、本発明の分離剤は、親水性固定相を用いるクロマトグラフィーであるＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）や順相クロマトグラフィーに好適に使用可能であるが、それら以外のクロマトグラフィーにも使用可能である。
本発明に用いられる多孔質基材は、シラン官能基で表面修飾可能なものであれば特に限定されず、クロマトグラフィー用分離剤（ないし固定相）として知られる公知各種の多孔質基材であることができる。多孔質基材の形態は多孔質であるかぎり特に限定されず、粒子状であってもよいし、モノリス等のバルク状であってもよい。すなわち、多孔質基材は多孔質粒子であってもよいし、多孔質バルク体であってもよい。典型的な多孔質基材は、多孔質無機粒子、多孔質無機バルク体、多孔質高分子粒子及び多孔質高分子バルク体からなる群から選択される少なくともいずれか１種であり、好ましくは多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体、特に好ましくは多孔質無機粒子である。多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体の例としては、シリカゲル、アルミナシリカゲル、その他表面に水酸基を有する各種セラミック粒子、及びシリカモノリスが挙げられ、特に好ましくはシリカゲルである。シリカゲルは、高速分析を視野に入れた場合、機械的強度が高いため望ましい。多孔質高分子粒子の例としては、セルロース粒子、アガロース粒子、その他表面に水酸基を有する多孔質高分子粒子が挙げられる。もっとも、シラン官能基で表面修飾された状態の多孔質基材にあっては水酸基が残存していてもよいし、水酸基がシリル化反応により消失していてもよい。
多孔質基材としてシリカゲルを用いた場合、塩基性の強い官能基はシリカゲルを溶解させ充填剤の劣化は速いのが一般的である。この点、本発明の分離剤に含まれる３級アミンは水溶液中で塩基性が低いため、シリカゲルの劣化が１級アミンや２級アミンと比べ少ないものと考えられる。また、水酸基を有する３級アミンはより小さな塩基性を呈し、水酸基を有しない３級アミンと比較して、シリカゲルの溶解が抑えられ耐久性が向上するものと考えられる。
被検物質がアノマー分離してしまう場合、アノマー分離を解消するため、８０℃程度の高温で分析するのが一般的である。しかし、分離剤がシリカゲルベースである場合、高温分析は分離剤の劣化を速めてしまう。この点、本発明の分離剤によれば、より低温（例えば２５℃）でアノマー分離させることなく分析を行うことができ、分離剤の劣化を抑制することができる。したがって、本発明の分離剤が使用される好ましい分離温度は５０℃以下、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃、特に好ましくは２０〜３０℃である。
多孔質基材はシラン官能基で表面修飾される。典型的には、多孔質基材の表面に存在する水酸基（例えばシリカゲルの場合はシラノール基）とシリル化剤とが反応することにより、シラン官能基が多孔質基材の表面に結合する。
シラン官能基は、シラン官能基のケイ素と３級アミンの窒素との間に、炭素数１〜１０のアルキレン基又はオキシアルキレン基からなる連結基Ｒ１を含む。アルキレン基の例としては、メチレン基、ジメチレン基（エチレン基）、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、及びエチルエチレン基が挙げられる。オキシアルキレン基の例としては、オキシメチレン基、オキシジメチレン基（オキシエチレン基）、オキシトリメチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシペンタメチレン基、オキシヘキサメチレン基、及びオキシプロピレン基が挙げられる。アルキレン基又はオキシアルキレン基の炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜７であり、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜５、特に好ましくは２〜４、最も好ましくは３である。典型的な連結基Ｒ１は−（ＣＨ２）ｍ−で表されるものであり、ｍは１〜１０であり、好ましくは１〜７であり、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜５、特に好ましくは２〜４、最も好ましくは３である。すなわち、特に好ましい連結基Ｒ１は−（ＣＨ２）３−である。
シラン官能基のＲ２及びＲ３は独立して炭素数１〜６のアルキレン基又はアルキレンオキシアルキレン基を含む。アルキレン基又はオキシアルキレン基の炭素数は好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは２である。典型的なＲ２及びＲ３は−（ＣＨ２）ｎ−で表されるものであり、ｎは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは２である。すなわち、特に好ましいＲ２及びＲ３は−（ＣＨ２）２−である。
したがって、最も好ましいシラン官能基はＲ１が−（ＣＨ２）３−であり、かつ、Ｒ２及びＲ３が−（ＣＨ２）２−であるもの、すなわち下記式：
で表されるものである。
本発明の分離剤は、上述したようなシラン官能基を有するシリル化剤を用意して、このシリル化剤と多孔質基材（典型的にはその表面に存在する水酸基）とをシリル化反応させることにより作製することができる。シリル化反応は公知の条件に従って行えばよく、特に限定されるものではない。
クロマトグラフィーカラム
本発明の分離剤を用いることで、クロマトグラフィーカラムを提供することができる。本発明によるクロマトグラフィーカラムは、筒状のカラム本体と、カラム本体に充填又は形成される本発明の分離剤とを備えたものである。カラム本体を構成する材料は特に限定されず、例えばステンレスやガラスなどが挙げられる。カラム本体の内径及び長さは用途に応じて適宜決定すればよく特に限定されない。分離剤の充填又は形成はいかなる手法により行ってもよい。例えば、カラム本体に粒子状の分離剤を詰め込んでもよいし、カラム本体（例えばキャピラリーチューブ）中にモノリス等のバルク状の多孔質基材（例えばモノリス型シリカゲル）を形成させてもよい。すなわち、本発明によるクロマトグラフィーカラムは、モノリス型キャピラリーカラムの形態としてもよい。
本発明の分離剤を用いることで、クロマトグラフィーカラムを提供することができる。本発明によるクロマトグラフィーカラムは、筒状のカラム本体と、カラム本体に充填又は形成される本発明の分離剤とを備えたものである。カラム本体を構成する材料は特に限定されず、例えばステンレスやガラスなどが挙げられる。カラム本体の内径及び長さは用途に応じて適宜決定すればよく特に限定されない。分離剤の充填又は形成はいかなる手法により行ってもよい。例えば、カラム本体に粒子状の分離剤を詰め込んでもよいし、カラム本体（例えばキャピラリーチューブ）中にモノリス等のバルク状の多孔質基材（例えばモノリス型シリカゲル）を形成させてもよい。すなわち、本発明によるクロマトグラフィーカラムは、モノリス型キャピラリーカラムの形態としてもよい。
クロマトグラフィーによる分離方法
本発明のクロマトグラフィー用分離剤或いはそれを含むクロマトグラフィーカラムを用いて複数の物質の分離を行うことができる。すなわち、本発明のクロマトグラフィーによる分離方法は、クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む。すなわち、クロマトグラフィーの固定相として本発明の分離剤を用いる。一方、クロマトグラフィーに用いる移動相は、液体、気体、及び超臨界流体のいずれであってもよいが、液体又は超臨界流体が好ましい。すなわち、本発明の分離方法は、クロマトグラフィーの原理を利用したいかなる分離方法であってよく、化学分析手法としての各種クロマトグラフィーは勿論のこと、化学分析の前処理として化合物を分離又は濃縮するために用いられる手法の一つである固相抽出を含むものである。本発明の分離方法が採用可能なクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、ガスクロマトグラフィー、及び超臨界クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーが好ましい。液体クロマトグラフィーの分離モードは特に限定されず、順相クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）、逆相クロマトグラフィー等であってよいが、本発明の分離剤は親水性固定相としての性質を望ましく有しうることから、順相クロマトグラフィー又はＨＩＬＩＣ（順相クロマトグラフィーの一種）が特に好ましい。シリカゲル等の多孔質基材の劣化を防ぐ観点から、好ましい分離温度は５０℃以下、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃、特に好ましくは２０〜３０℃である。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤或いはそれを含むクロマトグラフィーカラムを用いて複数の物質の分離を行うことができる。すなわち、本発明のクロマトグラフィーによる分離方法は、クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む。すなわち、クロマトグラフィーの固定相として本発明の分離剤を用いる。一方、クロマトグラフィーに用いる移動相は、液体、気体、及び超臨界流体のいずれであってもよいが、液体又は超臨界流体が好ましい。すなわち、本発明の分離方法は、クロマトグラフィーの原理を利用したいかなる分離方法であってよく、化学分析手法としての各種クロマトグラフィーは勿論のこと、化学分析の前処理として化合物を分離又は濃縮するために用いられる手法の一つである固相抽出を含むものである。本発明の分離方法が採用可能なクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、ガスクロマトグラフィー、及び超臨界クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーが好ましい。液体クロマトグラフィーの分離モードは特に限定されず、順相クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）、逆相クロマトグラフィー等であってよいが、本発明の分離剤は親水性固定相としての性質を望ましく有しうることから、順相クロマトグラフィー又はＨＩＬＩＣ（順相クロマトグラフィーの一種）が特に好ましい。シリカゲル等の多孔質基材の劣化を防ぐ観点から、好ましい分離温度は５０℃以下、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃、特に好ましくは２０〜３０℃である。
分離に供する複数の物質は、いかなる物質でもよいが、本発明の分離剤は特に還元糖等の有機化合物の分析に優れていることから、少なくとも一つが糖（例えば還元糖）であることが好ましく、より好ましくは少なくとも二つが糖（例えば還元糖）である。
本発明を以下の例によってさらに具体的に説明する。
実施例１
（１）分離剤の合成
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを１１ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
（１）分離剤の合成
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを１１ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
得られた分離剤を元素分析したところ、Ｃ：４．５３％、Ｈ：０．５６％、Ｎ：０．５７％であった。
（２）ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価
得られた分離剤をステンレス製のカラム本体（カラム長：２５０ｍｍ、カラム内径：４．６ｍｍ）に充填し、クロマトグラフィーカラムを得た。このクロマトグラフィーカラムに対し、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価（評価１及び２）を、以下の化合物の幾つか又は全部に対して行った。
得られた分離剤をステンレス製のカラム本体（カラム長：２５０ｍｍ、カラム内径：４．６ｍｍ）に充填し、クロマトグラフィーカラムを得た。このクロマトグラフィーカラムに対し、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価（評価１及び２）を、以下の化合物の幾つか又は全部に対して行った。
＜評価１：検量線の作成＞
以下に示される３種類の糖の各々について、以下に示される各濃度の各種標準溶液サンプルを調製し、各標準溶液サンプルに対し、以下の条件で上記クロマトグラフィーカラムを用いて分析した。
‐ サンプル：
Ｄ−（＋）−キシロース ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（＋）−グルコース ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、並びに
Ｄ−（−）−マンニトール ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：アセトニトリル／水＝７５／２５
‐ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
‐ 温度：２５℃
‐ 検出：ＲＩ（示差屈折）
‐ サンプル注入量：２０μＬ
以下に示される３種類の糖の各々について、以下に示される各濃度の各種標準溶液サンプルを調製し、各標準溶液サンプルに対し、以下の条件で上記クロマトグラフィーカラムを用いて分析した。
‐ サンプル：
Ｄ−（＋）−キシロース ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（＋）−グルコース ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、並びに
Ｄ−（−）−マンニトール ０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６２５ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：アセトニトリル／水＝７５／２５
‐ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
‐ 温度：２５℃
‐ 検出：ＲＩ（示差屈折）
‐ サンプル注入量：２０μＬ
その結果、図１に示される検量線が得られた。得られた検量線は優れた直線性を示し、還元糖であるグルコース及びキシロースの回収低下は見られなかった。この結果から、実施例１の３級アミンを有する分離剤と還元糖であるグルコース及びキシロースとの間でシッフ塩基は形成されなかったことが示唆された。また、２５℃であっても還元糖のグルコース及びキシロースのいずれもアノマー分離は起こらず、本例の分離剤は図１２に示されるとおり塩基として還元糖に作用してアノマー変換を促進させたことが示唆された。
＜評価２：糖混合物の分離＞
以下に示される４種類の糖を以下の濃度で含むサンプル溶液を調製し、以下の分析条件でクロマトグラフィーカラムを用いて分析した。
‐ サンプル：Ｄ−（＋）−キシロース ０．８ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（＋）−グルコース ０．８ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（−）−マンニトール ０．８ｍｇ／ｍＬ及び
Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物 ０．８ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：アセトニトリル／水＝８５／１５
‐ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
‐ 温度：２５℃
‐ 検出：ＲＩ（示差屈折）
‐ サンプル注入量：２０μＬ
以下に示される４種類の糖を以下の濃度で含むサンプル溶液を調製し、以下の分析条件でクロマトグラフィーカラムを用いて分析した。
‐ サンプル：Ｄ−（＋）−キシロース ０．８ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（＋）−グルコース ０．８ｍｇ／ｍＬ、
Ｄ−（−）−マンニトール ０．８ｍｇ／ｍＬ及び
Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物 ０．８ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：アセトニトリル／水＝８５／１５
‐ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
‐ 温度：２５℃
‐ 検出：ＲＩ（示差屈折）
‐ サンプル注入量：２０μＬ
その結果、図２に示されるクロマトグラムが得られた。図２から分かるように、糖混合物サンプルに含まれる４種類の糖（キシロース、グルコース、マンニトール及びトレハロース）が十分に分離された。したがって、本例で作製した分離剤及びカラムは糖分離に優れることが分かる。
比較例１
比較例１はＨＩＬＩＣモードで糖分析する場合における、最も一般的な分離剤に関する例である。
比較例１はＨＩＬＩＣモードで糖分析する場合における、最も一般的な分離剤に関する例である。
（１）分離剤の合成
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、３−アミノプロピルトリエトキシシランを４ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、３−アミノプロピルトリエトキシシランを４ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
得られた分離剤を元素分析したところ、Ｃ：５．３８％、Ｈ：１．０１％、Ｎ：１．５４％であった。
（２）ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価
上記分離剤を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価１及び２を行った。
上記分離剤を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価１及び２を行った。
＜評価１：検量線の作成＞
実施例１の評価１と同様にして評価を行った結果、各糖について図３に示される検量線が得られた。図３から分かるように、還元糖であるグルコースの回収率が低く、同じく還元糖であるキシロースの回収率はさらに低かった。このことから、還元糖であるグルコース及びキシロースと本例の分離剤との間でシッフ塩基が形成されたものと考えられる。なお、本例の分離剤は塩基性であるため、還元糖のアノマー分離は起こらなかった。
実施例１の評価１と同様にして評価を行った結果、各糖について図３に示される検量線が得られた。図３から分かるように、還元糖であるグルコースの回収率が低く、同じく還元糖であるキシロースの回収率はさらに低かった。このことから、還元糖であるグルコース及びキシロースと本例の分離剤との間でシッフ塩基が形成されたものと考えられる。なお、本例の分離剤は塩基性であるため、還元糖のアノマー分離は起こらなかった。
＜評価２：糖混合物の分離＞
実施例１の評価２と同様にして評価を行った結果、図４に示されるクロマトグラムが得られた。しかしながら、図４から分かるように、グルコースとマンニトールとを分離できなかった。
実施例１の評価２と同様にして評価を行った結果、図４に示されるクロマトグラムが得られた。しかしながら、図４から分かるように、グルコースとマンニトールとを分離できなかった。
比較例２
比較例２は、還元糖等の有機化合物との間でシッフ塩基が形成されない立体障害の大きい４級アンモニウムの分離剤である。
比較例２は、還元糖等の有機化合物との間でシッフ塩基が形成されない立体障害の大きい４級アンモニウムの分離剤である。
（１）分離剤の合成
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、Ｎ−（トリメトキシシリルエチル）ベンジル―Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドを１０ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、Ｎ−（トリメトキシシリルエチル）ベンジル―Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドを１０ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
得られた分離剤を元素分析したところ、Ｃ：１０．６６％、Ｈ：１．６３％、Ｎ：０．９６％であった。
（２）ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価
上記分離剤を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価１を行った。
上記分離剤を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価１を行った。
＜評価１：検量線の作成＞
実施例１の評価１と同様にして分析したところ、図５〜７に示されるクロマトグラムが得られた。図５に示されるようにマンニトールはピークが割れずに検出されたが、図６及び７に示されるように還元糖であるグルコース及びキシロースはそれぞれピークが割れて検出されてしまい、還元糖であるグルコース及びキシロースのアノマー分離が発生したことが示唆された。本比較例の分離剤を用いた固定相は４級アンモニウムを有する強塩基性固定相であるが、ルイス塩基のようにプロトンを引き込むことはできないため、アノマー変換を促す塩基として作用しなかった結果、アノマー分離が発生したものと考えられた。
実施例１の評価１と同様にして分析したところ、図５〜７に示されるクロマトグラムが得られた。図５に示されるようにマンニトールはピークが割れずに検出されたが、図６及び７に示されるように還元糖であるグルコース及びキシロースはそれぞれピークが割れて検出されてしまい、還元糖であるグルコース及びキシロースのアノマー分離が発生したことが示唆された。本比較例の分離剤を用いた固定相は４級アンモニウムを有する強塩基性固定相であるが、ルイス塩基のようにプロトンを引き込むことはできないため、アノマー変換を促す塩基として作用しなかった結果、アノマー分離が発生したものと考えられた。
そこで、温度を２５℃の代わりに８０℃としたこと以外は実施例１の評価１と同様にして分析した。その結果、図８〜１０に示されるように各サンプルは分離され、図９及び１０に示されるようにグルコース及びキシロースはそれぞれピークが割れずに検出された。すなわち、アノマー分離が回避されたことが示唆された。図１１に示されるように得られた検量線は直線性を示し、還元糖であるグルコース及びキシロースいずれも著しい回収低下を示さなかった。このことから、還元糖と本例の分離剤との間でシッフ塩基は形成されなかったものと考えられた。
しかし、本例の分離剤を用いた固定相は強塩基性固定相であるため、カラムに移動相を通液する際、平衡化に長時間を要し、図８〜１０から分かるように、ベースラインは他の固定相と比べると乱れやすかった。また、得られた検量線の直線性は実施例１の直線性に比べ劣っていた。このため、本例の分離剤は微量分析には不向きである。
まとめ
実施例１、比較例１及び２の各分離剤での還元糖の分析結果を表１にまとめた。さらに各分離剤での分析の再現性を評価するため、各濃度３回ずつ実施した先述の測定の中で比較的ピーク面積値のばらつきが大きかったキシロース０．０６２５ｍｇ／ｍＬの面積値からＣＶ値（変動係数）を算出し、表に併記した。
実施例１、比較例１及び２の各分離剤での還元糖の分析結果を表１にまとめた。さらに各分離剤での分析の再現性を評価するため、各濃度３回ずつ実施した先述の測定の中で比較的ピーク面積値のばらつきが大きかったキシロース０．０６２５ｍｇ／ｍＬの面積値からＣＶ値（変動係数）を算出し、表に併記した。
表１に示されるように、実施例１は、特に還元糖と分離剤の間でシッフ塩基が形成されず、かつ、２５℃で還元糖のアノマー分離が起こらなかったため、糖分析に優れた分離剤と考えられる。さらに、実施例１は分析再現性が相対的に高いという利点も有することが分かった。
各分離剤の分析再現性の結果は以下のとおり考察される。実施例１の分離剤は微量濃度サンプルの回収率が高く、クロマトグラムのベースラインが安定しやすかったため、ピーク面積値のばらつきは小さかったと考えられる。比較例１の分離剤は、キシロースと分離剤の間でシッフ塩基が形成されたためカラムからキシロースが溶出しにくく、微量濃度サンプルの回収率は低くばらつきは大きかったと考えられる。また、比較例２の分離剤はクロマトグラムのベースラインが不安定であったことから、微量濃度サンプルのピーク面積値はばらつきやすかったと考えられる。
Claims (9)
- 下記式：
- 前記Ｒ１が−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは１〜１０である）である、請求項１に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記Ｒ２及びＲ３が独立して−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜６である）である、請求項１又は２に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記Ｒ１が−（ＣＨ２）３−であり、かつ、Ｒ２及びＲ３が−（ＣＨ２）２−である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記多孔質基材が、多孔質無機粒子、多孔質無機バルク体、多孔質高分子粒子及び多孔質高分子バルク体からなる群から選択される少なくともいずれか１種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記多孔質基材が多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体であり、該多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体がシリカゲルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 筒状のカラム本体と、
前記カラム本体に充填又は形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤と、
を備えた、クロマトグラフィーカラム。 - 請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む、クロマトグラフィーによる分離方法。
- 前記複数の物質の少なくとも一つが糖である、請求項８に記載の分離方法。
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| JP2013501243A (ja) * | 2009-08-04 | 2013-01-10 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | イオン性修飾剤を含有する高純度クロマトグラフィー材料 |
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