JP6368430B2 - クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 - Google Patents
クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 Download PDFInfo
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Description
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる。このシラン官能基はジアミンで修飾された芳香環を含み、この芳香環が多孔質基材とジアミンの間に介在する。このような構成とすることで、選択性、保持力等の分離性能に全般的に優れたクロマトグラフィー用分離剤を提供することができる。芳香環を多孔質基材とジアミンの間に介在させることで、選択性、保持力等の分離性能が全般的に向上するメカニズムは必ずしも定かではないが、以下のように推察される。すなわち、ジアミンの存在自体が選択性や保持力等の分離性能の向上に寄与するところ、本発明の分離剤では他の官能基として芳香環をさらに有する。芳香環はππ相互作用を呈するため、ジアミンの呈する相互作用と相まって、分離剤全体として複数の相互作用を好都合に呈することができ、それらが優れた分離性能をもたらすものと考えられる。そのような優れた分離性能は、保持力、OH選択性、CH3選択性、立体配置選択性、位置異性体選択性、分子形状選択性、アニオン交換性、固定相表面pH効果といった多岐にわたるものである。特に、本発明の分離剤の表面は親水性を呈するのが典型的である。このため、本発明の分離剤は、親水性固定相を用いるクロマトグラフィーであるHILIC(親水性相互作用クロマトグラフィー)や順相クロマトグラフィーに好適に使用可能であるが、それら以外のクロマトグラフィーにも使用可能である。
本発明の分離剤を用いることで、クロマトグラフィーカラムを提供することができる。本発明によるクロマトグラフィーカラムは、筒状のカラム本体と、カラム本体に充填又は形成される本発明の分離剤とを備えたものである。カラム本体を構成する材料は特に限定されず、例えばステンレスやガラスなどが挙げられる。カラム本体の内径及び長さは用途に応じて適宜決定すればよく特に限定されない。分離剤の充填又は形成はいかなる手法により行ってもよい。例えば、カラム本体に粒子状の分離剤を詰め込んでもよいし、カラム本体(例えばキャピラリーチューブ)中にモノリス等のバルク状の多孔質基材(例えばモノリス型シリカゲル)を形成させてもよい。すなわち、本発明によるクロマトグラフィーカラムは、モノリス型キャピラリーカラムの形態としてもよい。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤或いはそれを含むクロマトグラフィーカラムを用いて複数の物質の分離を行うことができる。すなわち、本発明のクロマトグラフィーによる分離方法は、クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む。すなわち、クロマトグラフィーの固定相として本発明の分離剤を用いる。一方、クロマトグラフィーに用いる移動相は、液体、気体、及び超臨界流体のいずれであってもよいが、液体又は超臨界流体が好ましい。すなわち、本発明の分離方法は、クロマトグラフィーの原理を利用したいかなる分離方法であってよく、化学分析手法としての各種クロマトグラフィーは勿論のこと、化学分析の前処理として化合物を分離又は濃縮するために用いられる手法の一つである固相抽出を含むものである。本発明の分離方法が採用可能なクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー(例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC))、ガスクロマトグラフィー、及び超臨界クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーが好ましい。液体クロマトグラフィーの分離モードは特に限定されず、順相クロマトグラフィー、HILIC(親水性相互作用クロマトグラフィー)、逆相クロマトグラフィー等であってよいが、本発明の分離剤は親水性固定相としての性質を望ましく有しうることから、順相クロマトグラフィー又はHILIC(順相クロマトグラフィーの一種)が特に好ましい。
平均粒子径5μm、平均細孔径12nm、比表面積300m2/gの多孔質シリカゲル10gをトルエン50mLに分散させ、アミノエチルアミノメチルフェネチルトリメトキシシランを8g添加後、還流するまで加温し6時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
平均粒子径5μm、平均細孔径12nm、比表面積300m2/gの多孔質シリカゲル10gをトルエン50mLに分散させ、ビス(2−ヒドロキシエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを11g添加後、還流するまで加温し6時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。
実施例1で得られた分離剤をステンレス製のカラム本体(カラム長:100mm、カラム内径:4.6mm)に充填して、クロマトグラフィーカラムを得た。このクロマトグラフィーカラムに対して、HILICモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価を、非特許文献1(Yuusuke Kawachi, et al., "Chromatographic characterization of hydrophilic interaction liquid chromatography stationary phases: Hydrophilicity, charge effects, structural selectivity, and separation efficiency", Journal of Chromatography A. 1218 (2011) pp.5903-5919、この文献は参照により本明細書に組み込まれる)に開示される評価手法に準じた手順で、様々なサンプルに対して行った。また、比較のため、比較例1で得られた分離剤を用いて上記と同様にして作製したクロマトグラフィーカラムを用いて、実施例1と同様の評価を行った。
サンプル1として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル1:トルエン1.0mg/mL、2’−デオキシウリジン(2dU)0.1mg/mL、及びウリジン(U)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ 流速:0.5mL/min
‐ サンプル注入量:4.0μL
サンプル2として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル2:トルエン1.0mg/mL、5−メチルウリジン(5MU)0.1mg/mL、及びウリジン(U)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル3として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル3:トルエン1.0mg/mL、アデノシン(A)0.1mg/mL、及びビダラビン(V)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル4として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル:トルエン1.0mg/mL、3’−デオキシグアノシン(3dG)0.1mg/mL、及び2’−デオキシグアノシン(2dG)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル5として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル5:トルエン1.0mg/mL、4−ニトロフェニルβ−D−グルコピラノシド(NPβGlu)0.1mg/mL、及び4−ニトロフェニルα−D−グルコピラノシド(NPαGlu)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル6として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル6:トルエン1.0mg/mL、ウリジン(U)0.1mg/mL、及びp−トルエンスルホン酸ナトリウム(SPTS)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル7として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル7:トルエン1.0mg/mL、ウリジン(U)0.1mg/mL、及びN,N,N−トリメチルフェニルアンモニウムクロリド(TMPAC)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
サンプル8として、以下に示される3種類の化合物の混合物を用意した。
‐ サンプル:トルエン1.0mg/mL、テオフィリン(Tp)0.1mg/mL、及びテオブロミン(Tb)0.1mg/mL
‐ 移動相:20mM CH3CO2NH4(pH4.7)/CH3CN=10/90
‐ 温度:30℃
‐ 検出:UV254nm
‐ サンプル注入量:4.0μL
‐ 流速:0.5mL/min
‐ ZIC−HILIC(3.5μm,5μm,150×4.6mm.I.D)[Merck],Nucleodur HILIC(3μm,150×4.6mm.I.D)[NAGEL]
‐ Xbridge Amide(3.5μm,150×4.6mm.I.D[Waters]
‐ Amide−80(3μm,5μm,150×4.6mm.I.D)[Tosoh]
‐ PolySULFOETHYL A(3μm,100×2.1mm.I.D)[PolyLC]
‐ PolyHYDROXYETHYL A(3μm,100×2.1mm.I.D)[PolyLC]
‐ CYCLOBOND I 2000(5μm,250×4.6mm.I.D.)[Astec]
‐ LiChrospher Diol(5μm,100×4.6mm.I.D)[Merck]
‐ Chromolith Si(100×4.6mm.I.D)[Merck]
‐ Halo HILIC(2.7μm,150×4.6mm.I.D)[AMT]
‐ COSMOSIL HILIC(5μm,150×4.6mm.I.D)[Nacalai]
‐ Sugar−D(5μm,150×4.6mm.I.D)[Nacalai]
‐ NH2−MS(5μm,150×4.6mm.I.D)[Nacalai]
‐ Tpk:テオフィリン(Tp)のキャパシティファクター
‐ Tbk:テオブロミン(Tb)のキャパシティファクター
‐ α(Tp/Tb):Tpを第2化合物、Tbを第1化合物とした場合の分離係数
上記(1)〜(8)において評価された各種項目についての実施例1と比較例1の結果のレーダーチャートを図10に示す。なお、図10のレーダーチャートの各項目において1.00とされるべき基準は実施例1、比較例1及び非特許文献1に開示される各種分離剤の結果の中で最も高い評価のサンプルの評価結果に対応しており、それに対する相対評価を数値化したものが図10に示される。図10に示されるレーダーチャートから明らかなように実施例1において作製された分離剤の各種クロマトグラフィー性能は多くの評価項目で比較例1よりも大きく向上しており、その他の評価項目においても比較例1に匹敵する高い性能を発揮している。また、非特許文献1に開示される各種分離剤と比較した場合、実施例1の分離剤は、カチオン交換性は無いものの、広い観点から分離性能を発揮する点で全般的に優れた分離性能を発揮することが分かる。特に、実施例1の分離剤は2種類のアミンとベンゼン環を有するため、水素結合性k(U)は大きくなったと考えられる。また、実施例1の分離剤は第2級アミンを有するため、アニオン交換性α(SPTS/U)は大きくなったと考えられる。さらに、実施例1の分離剤は2種類のアミン以外に、ベンゼン環を有し、それ故ππ相互作用も呈するため、多様な相互作用が分離性能の向上に寄与したものと考えられる。
Claims (16)
- ジアミンで修飾された芳香環を含むシラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなり、前記芳香環が前記多孔質基材と前記ジアミンの間に介在し、かつ、前記ジアミンが前記シラン官能基の末端に導入されたものである、クロマトグラフィー用分離剤。
- 前記芳香環のメタ位又はパラ位が前記ジアミンで修飾されている、請求項1に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記ジアミンが第2級アミンを含む、請求項1又は2に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記ジアミンが炭素数2〜17のアルキレンジアミンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記ジアミンが−(CH2)nNH(CH2)mNH2(式中、nは1〜11、mは1〜6である)で表される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記ジアミンが−CH2NH(CH2)2NH2である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記芳香環がベンゼン環である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記シラン官能基に含まれる前記芳香環の数が1である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記シラン官能基が、該シラン官能基のケイ素と前記芳香環との間に、炭素数1〜6のアルキレン基又はオキシアルキレン基からなる連結基を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記連結基が−(CH2)x−(式中、xは1〜3である)で表される、請求項9に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記連結基が−(CH2)2−である、請求項10に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記シラン官能基が下記式:
- 前記多孔質基材が、多孔質無機粒子、多孔質無機バルク体、多孔質高分子粒子及び多孔質高分子バルク体からなる群から選択される少なくともいずれか1種である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 前記多孔質基材が多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体であり、該多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体がシリカゲルである、請求項1〜13のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。
- 筒状のカラム本体と、
前記カラム本体に充填又は形成される、請求項1〜14のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤と、
を備えた、クロマトグラフィーカラム。 - 請求項1〜14のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む、クロマトグラフィーによる分離方法。
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