JPWO2017057622A1 - 免疫測定用抗体とその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕SCC−3細胞を培養すること;及び
該細胞の培養物から可溶性インターロイキン2レセプターを回収すること、
を含む、可溶性インターロイキン2レセプターの製造方法。
〔2〕SCC−3細胞を培養して可溶性インターロイキン2レセプターを調製すること;
及び
該可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫すること、
を含む、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体の製造方法。
〔3〕前記抗体がモノクローナル抗体である、〔2〕記載の方法。
〔4〕前記免疫した動物から採取した脾臓細胞又はリンパ節由来B細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製することをさらに含む、〔2〕又は〔3〕記載の方法。
〔5〕前記SCC−3細胞をインフルエンザウイルス刺激する工程を含まない、〔2〕〜〔4〕のいずれか1項記載の方法。
〔6〕SCC−3細胞を培養して可溶性インターロイキン2レセプターを調製すること;
該可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫すること;及び
該免疫した動物から採取した脾臓細胞又はリンパ節由来B細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合すること、
を含む、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体産生ハイブリドーマの製造方法。
〔7〕92212(NITE BP−02124)及び92215R(NITE BP−02125)からなる群より選択される可溶性インターロイキン2レセプター抗体産生ハイブリドーマ。
〔8〕SCC−3細胞に産生された可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫することによって得られたことを特徴とする、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体。
〔9〕モノクローナル抗体である、〔8〕記載の抗体。
〔10〕〔2〕〜〔5〕のいずれか1項記載の方法で製造された抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を用いることを特徴とする、ヒト可溶性インターロイキン2レセプターの免疫測定方法。
〔11〕エピトープが異なる2種類のモノクローナル抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法である、〔10〕記載の免疫測定方法。
〔12〕前記サンドイッチ免疫測定法が、ラテックス免疫比濁法又はサンドイッチELISAである、〔11〕記載の免疫測定方法。
〔13〕〔2〕〜〔5〕のいずれか1項記載の方法で製造された抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を含む、ヒト可溶性インターロイキン2レセプター測定用試薬。
〔14〕ラテックス免疫比濁法又はサンドイッチELISAを行うための試薬である、〔13〕記載の試薬。
(1)動物への免疫
Recombinant Human sIL−2 Receptor α(Peprotech社製;Code:200−02R)を10mMリン酸緩衝液(pH7.2;以下、PBSという)に溶解し、フロインド完全アジュバンドを等量混合してエマルジョン調製した。該エマルジョンを、メスのBALB/cマウス及びF344/Jclラットの皮下に1匹あたり50μg/回の量で1週間ごとに5回注射した。その後、該マウス及びラットの尾静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ELISA法にて測定した。
上記(1)で免疫抗原として用いたRecombinant Human sIL−2 Receptor αを0.5μg/mLになるようPBSに溶解した。該溶液50μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で1時間静置した。次いで、各ウェルを0.05%Tween(登録商標)20を含むPBS(以下、PBSTという)300μLで3回洗浄した後、1%牛血清アルブミンを含むPBST(以下、BSA−PBSTという)200μLを加え、室温で1時間ブロッキングを行った。さらに各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、BSA−PBSTで数百倍から数万倍に希釈したマウス抗血清50μLを添加し、室温で1時間静置し、次いでPBSTで3回洗浄した。その後、マウス抗血清サンプルに対しては、7500倍希釈したAnti mouse IgG(H+L)Goat IgG HRP(Southern Biotech社製)50μLを上記各ウェルに分注し、室温で1時間静置した。ラット抗血清サンプルに対しては、Recombinant Human sIL−2 Receptor αをウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体(自家作製)をビオチン標識し、BSA−PBSTで希釈した希釈液(IgG含量として2.0μg/mL)を調製した。該希釈液50μLを上記各ウェルに分注し、室温で1時間静置させ、PBSTで3回洗浄した後、HRP標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)のBSA−PBST溶液(0.2μg/mL)50μLを添加し、室温で30分間静置した。
上記(2)で調製された脾臓細胞又はリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞とを細胞数で6対1の比で混合し、ポリエチレングリコールを用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はSP2/Oを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として2.5×106cells/mLになるようにヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン(HAT)、ならびに15%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地に懸濁した。該懸濁液200μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、CO2インキュベーター内で37℃、5%CO2にて7日間培養して、融合細胞(ハイブリドーマ)を得た。
(i)マウス由来のハイブリドーマの選別
AffiniPure Goat Anti−mouse IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Code:115−005−071)を10μg/mLになるようPBSに溶解した。該溶液50μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で1時間静置した。各ウェルを300μLのPBSTで3回洗浄した後、200μLのBSA−PBSTを加え、室温で1時間ブロッキングを行った。次いで各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、2倍希釈したマウス細胞由来ハイブリドーマの培養上清50μLを添加し、室温で1時間静置した。免疫用抗原であるRecombinant Human sIL−2 Receptor αをBSA−PBSTにて希釈し、希釈液(250ng/mL)を調製した。上記各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、該抗原希釈液50μLを添加し、室温で1時間静置し、PBSTで3回洗浄した。Recombinant Human sIL−2 Receptor αをウサギに免疫して作製した抗sIL−2Rウサギポリクローナル抗体を精製し、ビオチン標識して標識ポリクローナル抗体を調製し、BSA−PBSTにて希釈した(2μg/mL)。該抗体希釈液50μLを上記各ウェルに添加し、室温で1時間静置し、次いでPBSTで3回洗浄した後、HRP標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)のBSA−PBST溶液(0.2μg/mL)50μLを添加し、室温で30分間静置した。各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、0.3mg/mLのテトラメチルベンジジン(TMB)及び0.02%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液(pH3.7)50μLを加え、室温で10分間放置後、7.7%の硫酸50μLを加えて酵素反応を停止させ、波長450nmにおける吸光度を測定し、抗sIL−2R抗体産生ハイブリドーマの存在するウェル(陽性ウェル)を選別した。
AffiniPure Goat Anti−rat IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Code:112−005−008)を10μg/mLになるようPBSに溶解した。該溶液50μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で1時間静置した。各ウェルを、300μLのPBSTで3回洗浄した後、200μLのBSA−PBSTを加え、室温で1時間ブロッキングを行った。次いで、各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、2倍希釈したラット細胞由来ハイブリドーマの培養上清50μLを添加し、室温で1時間静置した。免疫用抗原であるRecombinant Human sIL−2 Receptor αをBSA−PBSTにて希釈し、希釈液(250ng/mL)を調製した。各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、該抗原希釈液50μLを添加し、室温で1時間静置し、PBSTで3回洗浄した。Biotylated Anti−human IL−2Rα Goat Antibody(R&D systems社製、Code:BAF223)をBSA−PBSTで希釈した(250ng/mL)。該抗体希釈液50μLを上記各ウェルに添加し、室温で1時間静置し、次いでPBSTで3回洗浄した後、HRP標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)のBSA−PBST溶液(0.2μg/mL)50μLを添加し、室温で30分間静置した。各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、0.3mg/mLのテトラメチルベンジジン(TMB)及び0.02%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液(pH3.7)50μLを加え、室温で10分間放置後、7.7%の硫酸50μLを加えて酵素反応を停止させ、波長450nmにおける吸光度を測定し、抗sIL−2R抗体産生ハイブリドーマの存在するウェル(陽性ウェル)を選別した。
上記(i)及び(ii)で選別された抗sIL−2R抗体産生ハイブリドーマの中から、nativeなsIL−2Rに反応するハイブリドーマを選別した。選別は、上記(i)又は(ii)と同様の手順で行った、但し、ハイブリドーマ培養上清としては、上記陽性ウェルに含まれていたものと同じハイブリドーマの培養上清を用い、また免疫用抗原としては、Recombinant Human sIL−2 Receptor αの代わりに、コンカナバリンAで刺激したヒトPBMC(sIL−2Rを分泌する)の培養上清を用いた。
上記(iii)で得られた抗sIL−2R抗体産生ハイブリドーマから、限界希釈法にてハイブリドーマの単クローン化を行った。マウス由来で3種類(クローン番号;92201、92202、92203)、及びラット由来で8種類(クローン番号;92204R、92205R、92206R、92207R、92208R、92209R、92210R、92211R)の合計11種類のハイブリドーマが得られた。上記ハイブリドーマのうち92204Rは、出願人により、2015年9月25日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託されている。
92204R:受領番号 NITE BP−02123
上記(4)で作製した11種類のハイブリドーマのそれぞれからモノクローナル抗sIL−2R抗体を精製し、以下に示す方法にてサンドイッチELISA系が成立する抗体の組み合わせを評価した。各モノクローナル抗sIL−2R抗体をPBSに溶解した(10μg/mL)。該溶液50μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、室温で1時間静置した。各ウェルを、300μLのPBSTで3回洗浄した後、200μLのBSA−PBSTを加え、室温で1時間ブロッキングを行った。次いで各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、ヒトPBMC由来native sIL−2R(2000U/mL)を50μL添加し、室温で1時間静置した。ビオチン標識した各モノクローナル抗sIL−2R抗体をBSA−PBSTにて希釈し、希釈液(0.4μg/mL)を調製した。上記各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、該抗体希釈液50μLを添加し、室温で1時間静置し、PBSTで3回洗浄した後、HRP標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)のBSA−PBST溶液(0.2μg/mL)50μLを添加し、室温で30分間静置した。各ウェルをPBSTで3回洗浄した後、0.3mg/mLのテトラメチルベンジジン(TMB)及び0.02%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液(pH3.7)50μLを加え、室温で10分間放置後、7.7%の硫酸50μLを加えて酵素反応を停止させ、波長450nmにおける吸光度を測定した。
独立行政法人 医薬基盤研究所 JCRB細胞バンクよりSCC−3細胞株(細胞番号JCRB0115)を分譲し、指定の培地(10%fetal bovine serum(FBS)、penicillin/streptomycinを含むRPMI−1640)で起眠後、十分に細胞を増殖させた。増殖したSCC−3細胞を遠心分離により集め、FBS不含RPMI−1640にて洗浄後、細胞濃度が1×106cells/mLとなるように同培地で希釈し、37℃にてCO2インキュベーターにて7日間培養した。
その後、遠心分離により細胞を除去し、培養上清を回収した。培養上清中のsIL−2Rの濃度を市販キット(セルフリーN IL−2R;協和メデックス社製)で測定した結果、18000U/mLと高濃度であり、免疫原や標準品の調製に十分な量のsIL−2Rを容易に確保できることが分かった。
ヒトの血液からPBMCを回収し、コンカナバリンAで刺激してsIL−2Rを分泌させた。分泌されたsIL−2Rを回収し、実施例1と同様の手順で濃度を測定した。回収されたsIL−2Rの濃度は、実施例1と同じ手順(セルフリーN IL−2R;協和メデックス社製)で測定した結果、ヒト血液1mL当たり4000Uであった。
自家調製した抗sIL−2Rウサギポリクローナル抗体の精製IgGを、CNBr−activated sepharose 4FF(GE Healthcare社)に結合させ、抗体結合樹脂をカラムに詰めた。該カラムに、実施例1で得られたSCC−3細胞培養物から回収した培養上清を通し、十分な量のPBSで洗浄し、溶出バッファ(150mM NaClを含む0.1M Citrate−Na、pH3.0)でsIL−2Rを含むフラクションを溶出させた。該sIL−2Rを含むフラクションを限外濾過フィルターによって濃縮後、PBSにて透析し、精製sIL−2Rを得た。実施例1と同じ手順(セルフリーN IL−2R;協和メデックス社製)で精製物を定量した結果、培養上清6Lから250000kUの精製sIL−2Rが得られたことが分かった。
(1)抗sIL−2R抗体産生ハイブリドーマの作製
実施例2で精製したSCC−3細胞由来sIL−2RをPBSで希釈し、フロインド完全アジュバンドを等量混合してエマルジョンを調製した。該エマルジョンを、メスのBALB/cマウス、C57BL/6JJclマウス及びF344/Jclラットの皮下に1匹あたり5μg(sIL−2R 約1000kU相当)/回の量で1週間ごとに5回注射した。各マウス又はラットから得られた抗血清から、比較例1(1)〜(4)と同様の手順でハイブリドーマを作製した。BALB/cマウス由来で1種類(クローン番号;92212)、C57BL/6JJclマウス由来で1種類(クローン番号;92218)、及びF344/Jclラット由来で6種類(クローン番号;92213R、92214R、92215R、92216R、92217R、92219R)の合計8種類のハイブリドーマが得られた。上記ハイブリドーマのうち92212と92215Rは、出願人により、2015年9月25日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託されている。
92212:受領番号 NITE BP−02124
92215R:受領番号 NITE BP−02125
上記(1)で作製した8種類のハイブリドーマのそれぞれからモノクローナル抗sIL−2R抗体を精製し、比較例1(5)と同様の方法でサンドイッチELISA系が成立する抗体の組み合わせを評価した。8種類のモノクローナル抗体の組み合わせを評価した結果を表2に示す。33組の抗体の組み合わせでサンドイッチELISA系が成立するレベルの吸光度変化が達成された。
比較例1で作製した11種類の抗体と実施例3で作製した8種類の抗体を合わせた合計19種類のモノクローナル抗sIL−2R抗体の間で、比較例1(5)と同様の方法にてサンドイッチELISA系が成立する抗体の組み合わせを評価した。結果を表3に示す。122組の抗体の組み合わせでサンドイッチELISA系が成立するレベルの吸光度変化が生じたが、そのほとんどは、少なくとも一方がSCC−3細胞由来sIL−2Rを免疫原としたモノクローナル抗体である抗体の組み合わせであった。さらにSCC−3細胞由来sIL−2Rを免疫原としたモノクローナル抗体同士の組み合わせの場合、大きな吸光度変化が生じる割合はより高くなった。以上の結果から、SCC−3細胞株由来sIL−2Rを免疫原として作製したモノクローナル抗sIL−2R抗体は、サンドイッチ免疫測定用の抗体として好適であることが示された。
実施例3の抗体組み合わせ評価の結果より、リコンビナントsIL−2R蛋白質とSCC−3細胞由来sIL−2R蛋白質との間に構造的な違いが存在することが示唆されたことから、両蛋白質を解析して構造を比較した。
実施例3(3)で調べた抗体を用いた抗体の組み合わせについて、ラテックス免疫比濁法(LTIA)用抗体としての適性を調べた。なお、以下の実施例において、特に言及しない限り、%濃度は(w/v)%を意味する。
(a.材料)
抗sIL−2Rモノクローナル抗体(92204R抗体)液:0.5Abs/mL(280nm)、感作液:20mM MOPS−NaOH(pH7.0)
抗sIL−2Rモノクローナル抗体(92212抗体)液:0.5Abs/mL(280nm)、感作液:10mM Glycine−NaOH(pH9.0)
ラテックス粒子:平均粒子径0.307μm及び0.216μm
(b.方法)
上記92204R抗体液と感作液で希釈した1%ラテックス粒子液(平均粒子径0.307μm)とを等容量混合して、4℃で2時間撹拌後、混合液と等容量の1%BSAを添加して4℃にて1時間ブロッキングした。これをMOPS緩衝液(pH7.0)で透析して得られた液を、抗体担持ラテックス粒子溶液とした。
同様に、上記92212抗体液と感作液で希釈した1%ラテックス粒子液(平均粒子径0.216μm)を用い、上記と同様の方法で抗体担持ラテックス粒子溶液を得た。
400mMの塩化ナトリウム、0.1%BSA、0.05% ProClin300を含む30mM Citrate−NaOH緩衝液(pH6.0)を調製し、第1試薬とした。
上記92212抗体担持ラテックス粒子溶液と上記92204R抗体担持ラテックス粒子溶液とをラテックス粒子の含量比で1:1になるよう混合し、5mM MOPS緩衝液(pH7.0)で最終吸光度3.0OD(600nm)に希釈して、第2試薬とした。
市販キット(セルフリーN IL−2R;協和メデックス社製)により予めsIL−2Rの濃度を測定したヒト血清検体(n=43)を準備した。これらの検体のsIL−2Rの濃度を、上記第1試薬と第2試薬とを用いたLTIA法により測定した。測定には、日立7170形自動分析装置を用いた。具体的には、ヒト血清検体4μLに、上記第1試薬100μLを加えて37℃で5分間加温後、上記第2試薬100μLを加えて攪拌した。その後5分間の凝集形成に伴う吸光度変化(測光ポイント:19−34)を、主波長570nm、副波長800nmにて吸光度測定した。
Claims (14)
- SCC−3細胞を培養すること;及び
該細胞の培養物から可溶性インターロイキン2レセプターを回収すること、
を含む、可溶性インターロイキン2レセプターの製造方法。 - SCC−3細胞を培養して可溶性インターロイキン2レセプターを調製すること;及び
該可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫すること、
を含む、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体の製造方法。 - 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項2記載の方法。
- 前記免疫した動物から採取した脾臓細胞又はリンパ節由来B細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製することをさらに含む、請求項2又は3記載の方法。
- 前記SCC−3細胞をインフルエンザウイルス刺激する工程を含まない、請求項2〜4のいずれか1項記載の方法。
- SCC−3細胞を培養して可溶性インターロイキン2レセプターを調製すること;
該可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫すること;及び
該免疫した動物から採取した脾臓細胞又はリンパ節由来B細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合すること、
を含む、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体産生ハイブリドーマの製造方法。 - 92212(NITE BP−02124)及び92215R(NITE BP−02125)からなる群より選択される可溶性インターロイキン2レセプター抗体産生ハイブリドーマ。
- SCC−3細胞に産生された可溶性インターロイキン2レセプターで動物を免疫することによって得られたことを特徴とする、抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項8記載の抗体。
- 請求項2〜5のいずれか1項記載の方法で製造された抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を用いることを特徴とする、ヒト可溶性インターロイキン2レセプターの免疫測定方法。
- エピトープが異なる2種類のモノクローナル抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法である、請求項10記載の免疫測定方法。
- 前記サンドイッチ免疫測定法が、ラテックス免疫比濁法又はサンドイッチELISAである、請求項11記載の免疫測定方法。
- 請求項2〜5のいずれか1項記載の方法で製造された抗可溶性インターロイキン2レセプター抗体を含む、ヒト可溶性インターロイキン2レセプター測定用試薬。
- ラテックス免疫比濁法又はサンドイッチELISAを行うための試薬である、請求項13記載の試薬。
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JPS6270761A (ja) * | 1985-04-19 | 1987-04-01 | アメリカ合衆国 | 疾患指示体としての可溶性インタ−ロイキン−2レセプタ及びその試験法 |
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---|---|---|---|---|
US4578335A (en) | 1984-05-21 | 1986-03-25 | Immunex Corporation | Interleukin 2 receptor |
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AU2793099A (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-15 | Cli Oncology, Inc. | Methods and compositions using tumor specific soluble interleukin-2 receptor alpha molecules |
WO2005121795A1 (ja) * | 2004-06-14 | 2005-12-22 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 非特異反応が抑制された免疫測定方法および試薬 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6270761A (ja) * | 1985-04-19 | 1987-04-01 | アメリカ合衆国 | 疾患指示体としての可溶性インタ−ロイキン−2レセプタ及びその試験法 |
JP2014186041A (ja) * | 2009-05-22 | 2014-10-02 | Kyowa Medex Co Ltd | 可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法及び測定用試薬 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JACQUES Y.,ET AL. A SOLUBLE INTERLEUKIN 2 RECEPTOR PRODUCED BY A NORMAL ALLOREACTIVE HUMAN T CELL CL, JPN6020036214, 1987, ISSN: 0004435909 * |
KIMURA, YOSHIKO ET AL., (1986). ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF A MONOCYTIC CELL LINE WHICH EX, JPN6020036216, 1986, ISSN: 0004355306 * |
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