JPWO2017056905A1 - アミロイドβオリゴマーの検出方法、アミロイドβオリゴマー検出装置及びアミロイドβオリゴマー検出プログラム - Google Patents
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Abstract
Description
蛍光比s1=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)
蛍光比s1が1未満の場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s1が1以上の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定するものであってよい。蛍光比s1を指標とすることにより、より客観的な判定が可能となる。
蛍光比s2=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)
蛍光比s2が1を超える場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s2が1以下の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定するものであってよい。蛍光比s2を指標とすることにより、より客観的な判定が可能となる。
本実施形態に係るAβオリゴマーの検出方法は、被験試料とチオフラビンTとを接触させるステップ(「接触ステップ」ともいう。)と、チオフラビンTの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップ(「取得ステップ」ともいう。)と、時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップ(「規格化ステップ」ともいう。)と、両規格化スペクトルに基づいて、被験試料にAβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップ(「判定ステップ」ともいう。)と、を含む。
接触ステップでは、被験試料とチオフラビンTとを接触させる。接触させる方法には特に制限はなく、例えば、アミロイドをThTで蛍光染色する際に用いられる方法を採用することができる。
取得ステップでは、被験試料と接触させたチオフラビンTの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得る。
規格化ステップでは、時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得る。ここで、t1<t2≦t3<t4である。
判定ステップでは、両規格化スペクトルに基づいて、被験試料にAβオリゴマーが存在するか否かを判定する。
蛍光比s1=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)
蛍光比s1が1未満の場合、Aβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s1が1以上の場合、Aβオリゴマーが存在しないと判定する。
蛍光比s2=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)
蛍光比s2が1を超える場合、Aβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s2が1以下の場合、Aβオリゴマーが存在しないと判定する。
本実施形態に係るAβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法は、被験試料とチオフラビンTとを接触させるステップと、チオフラビンTの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、を含む。当該方法により収集されたデータ(時間t1〜t2の規格化スペクトル、時間t3〜t4の規格化スペクトル)は、被験試料にAβオリゴマーが存在するか否かの判定に使用できる。
Aβオリゴマー検出装置の構成について説明する。図1は、一実施形態に係るアミロイドβオリゴマー検出装置Dのハードウェア的構成を示す概要図であり、図2は、一実施形態に係るAβオリゴマー検出装置Dの機能的構成を示す概要図である。
Aβオリゴマー検出プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段D1、算出手段D2、比較手段D3、判定手段D4、及び表示手段D5として機能させるものである。コンピュータにAβオリゴマー検出プログラムを読み込ませることにより、コンピュータはAβオリゴマー検出装置Dとして動作する。Aβオリゴマー検出プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、CD、DVD等の記録媒体、ROM等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。
Aβオリゴマー検出装置Dにより行われるAβオリゴマー検出方法について説明する。図3はAβオリゴマー検出方法のフローチャートである。Aβオリゴマー検出装置Dにより行われるAβオリゴマー検出方法により、被験試料が、Aβオリゴマーを含むか否かを自動的に精度高く行うことができる。
最初に、取得手段D1が蛍光測定装置から時間分解蛍光スペクトルデータを取得する。
次に、算出手段D2が取得した時間分解蛍光スペクトルデータから規格化スペクトルを算出する。
次に、比較手段D3が、算出ステップS2にて算出した時間t1〜t2の規格化スペクトルと、時間t3〜t4の規格化スペクトルを比較し、その結果を抽出する。
次に、判定手段D4が、比較ステップS3にて抽出した比較の結果に基づき、Aβオリゴマーが検出されたか否か(被験試料にAβオリゴマーが存在するか否か)を判定する。
次に、表示手段D5が、判定ステップS4にて判定した結果を表示する。例えば、被験試料にAβオリゴマーが存在するか否かが表示手段D5によって表示される。
(Aβオリゴマーの調製)
非特許文献(J.Biol.Chem.,2003年,278巻(13号),pp.11612−11622)に記載された方法に基づき、下記手順でAβオリゴマーを調製した。まず、Aβ1−42(商品名:Amyloid β−prоtein Human、1−42、株式会社ペプチド研究所製)をジメチルスルホキシドに5mmol/Lとなるように溶解し、さらにハム培地(L−グルタミン含有、フェノールレッド不含)を用いて、Aβ1−42の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて4℃で24時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβオリゴマー(Aβ42オリゴマー)を含む試料を調製した。
上述の非特許文献に記載された方法に基づき、下記手順でAβ線維を調製した。まず、Aβ1−42をジメチルスルホキシドに5mmol/Lとなるように溶解し、さらにハム培地(L−グルタミン含有、フェノールレッド不含)を用いて、Aβ1−42の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて37℃で24時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβ線維(Aβ42線維)を含む試料を調製した。
ThT(AAT Bioquest Inc.社製)3.4mgを20mLの純水に溶解してThT溶液を調製した。この水溶液には蛍光性不純物が含まれているため、水溶液を分液ロートに入れ、ヘキサン50mLを添加し、勢いよく混合して抽出操作を行った後、分液ロートの下方のコックからThT溶液を取り出した。このThT溶液の一部をキュベットに取り、蛍光分光光度計RF−5000(株式会社島津製作所製)で励起波長350nm、観測波長440nmにおける蛍光強度を測定した。上記抽出操作を、蛍光強度がバックグラウンドレベルに達するまで(蛍光強度の測定値がそれ以上低下しなくなるまで)、10回繰り返した。染色に用いるThT水溶液は、上記操作により調製した蛍光性不純物を含まないThT水溶液を、蒸留水でThT濃度が100μmol/Lになるまで希釈して調製した。Aβオリゴマー又はAβ線維を含む試料10μLに、100μmol/LのThT水溶液20μL、50mmol/Lグリシン−水酸化ナトリウム溶液(pH9.0)220μLを添加及び混合し、ThT染色した。
染色された試料を、内径3mmの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus−Tau型、浜松ホトニクス株式会社製)を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長405nmにおける蛍光減衰曲線を、420nmから620nmまで10nmおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の5%の立ち上がり部分を時刻0とし、時間0〜2ns及び時間10〜18nsの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、ハム培地(L−グルタミン含有、フェノールレッド不含)10μLに蒸留水240μLを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。
各時間分解蛍光スペクトルについて、蛍光強度の最大値で各波長の蛍光強度を除して、蛍光強度の最大値が1となるように規格化を行った。
このようにして得られた時間0〜2ns及び時間10〜18nsの規格化スペクトルをそれぞれ図4に示した。図4(A)は、Aβ42線維の規格化スペクトルであり、図4(B)は、Aβ42オリゴマーの規格化スペクトルである。時間0〜2nsの規格化スペクトルと時間10〜18nsの規格化スペクトルを比較すると、Aβ線維ではわずかな長波長シフトが見られるのに対して、Aβオリゴマーでは明らかな短波長シフトが生じているのが分かる。
蛍光比s=時間10〜18nsの規格化スペクトルの蛍光強度(波長500nm)/時間0〜2nsの規格化スペクトルの蛍光強度(波長500nm)
実施例2は、Aβ線維の調製及び蛍光測定を下記方法で実施したこと以外は、実施例1と同様の手順により実施した。
まず、Aβ1−40(商品名:Amyloid β−prоtein Human、1−40、株式会社ペプチド研究所製)をジメチルスルホキシドで5mmol/Lとなるように溶解し、さらに50mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)を用いて、Aβ1−40の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて37℃で10日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβ線維(Aβ40線維)を含む試料を調製した。
染色された試料を、内径3mmの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus−Tau型、浜松ホトニクス株式会社製)を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長405nmにおける蛍光減衰曲線を、420nmから620nmまで10nmおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の5%の立ち上がり部分を時刻0とし、時間0〜2ns及び時間10〜18nsの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、50mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)10μLに蒸留水240μLを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。
実施例1と同様にして蛍光比sを計算した。計算された蛍光比sを図6に示す。図6に示すとおり、Aβモノマーの種類が異なっても、Aβ線維(Aβ40線維)の蛍光比sは1以上である。すなわち、別種のAβモノマーから構成されるAβ線維が存在しても、実施例1と同様の手順によりAβオリゴマー(Aβ42オリゴマー)を識別できることが示された。
実施例3は、Aβオリゴマーの調製、Aβ線維の調製及び蛍光測定を下記方法で実施したこと以外は、実施例1と同様の手順により実施した。
まず、Aβ1−40(商品名:Amyloid β−prоtein Human、1−40、株式会社ペプチド研究所製)をジメチルスルホキシドで5mmol/Lとなるように溶解し、さらに50mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)を用いて、Aβ1−40の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて37℃で1日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβオリゴマー(Aβ40オリゴマー)を含む試料を調製した。
まず、Aβ1−40(商品名:Amyloid β−prоtein Human、1−40、株式会社ペプチド研究所製)をジメチルスルホキシドで5mmol/Lとなるように溶解し、さらに50mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)を用いて、Aβ1−40の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて37℃で7日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβ線維(Aβ40線維)を含む試料を調製した。
染色された試料を、内径3mmの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus−Tau型、浜松ホトニクス株式会社製)を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長405nmにおける蛍光減衰曲線を、420nmから620nmまで5nmおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の5%の立ち上がり部分を時刻0とし、時間0〜2ns及び時間10〜18nsの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、0.8%DMSOを含む50mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)10μLに50mmol/Lグリシン−水酸化ナトリウム溶液(pH9.0)240μLを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。
実施例1と同様にして蛍光比sを計算した。計算された蛍光比sを図7に示す。図7に示すとおり、Aβ線維(Aβ40線維)の蛍光比sは1以上であるのに対し、Aβオリゴマー(Aβ40オリゴマー)の蛍光比sは1未満である。すなわち、実施例1と同様の手順によりAβオリゴマー(Aβ40オリゴマー)を識別できることが示された。
Claims (8)
- 被験試料とチオフラビンTとを接触させるステップと、
チオフラビンTの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、
時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、
両規格化スペクトルに基づいて、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップと、を含み、
t1<t2≦t3<t4であり、
時間t1〜t2の規格化スペクトルと比較して、時間t3〜t4の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、アミロイドβオリゴマーの検出方法。 - 判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルの波長λ1(ただし、λ1>480nm)における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比s1を算出し、
蛍光比s1=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ1における蛍光強度)
蛍光比s1が1未満の場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s1が1以上の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項1に記載の検出方法。 - 判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルの波長λ2(ただし、λ2<480nm)における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比s2を算出し、
蛍光比s2=(時間t3〜t4の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)/(時間t1〜t2の規格化スペクトルの波長λ2における蛍光強度)
蛍光比s2が1を超える場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比s2が1以下の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項1に記載の検出方法。 - 判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルのピークトップの波長を比較し、
時間t3〜t4の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間t1〜t2の規格化スペクトルのピークトップの波長よりも短い場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は時間t3〜t4の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間t1〜t2の規格化スペクトルのピークトップの波長と同じか若しくは長い場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項1に記載の検出方法。 - 被験試料とチオフラビンTとを接触させるステップと、
チオフラビンTの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、
時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、
を含む、アミロイドβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法であって、
t1<t2≦t3<t4であり、
時間t1〜t2の規格化スペクトルと比較して、時間t3〜t4の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、データ収集方法。 - 被験試料に接触させたチオフラビンTの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段と、
取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段と、
両規格化スペクトルを比較する比較手段と、
比較結果に基づき、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段と、を備え、
t1<t2≦t3<t4である、
アミロイドβオリゴマー検出装置。 - コンピュータを、
被験試料に接触させたチオフラビンTの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段、
取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間t1〜t2の時間分解蛍光スペクトル、及び時間t3〜t4の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段(ただし、t1<t2≦t3<t4である)、
両規格化スペクトルを比較する比較手段、
比較結果に基づき、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段、
として機能させるためのアミロイドβオリゴマー検出プログラム。 - 請求項7に記載のアミロイドβオリゴマー検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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