JPWO2017038958A1 - 造血系細胞の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて得た動物の体内から前記霊長類動物の造血系細胞を得る第三工程と、
を有する、霊長類動物の造血系細胞の作製方法である。
本発明において、前記第一工程において、霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件でBrachyury、PDGFRα、Etv2、又は、Sclの遺伝子又はタンパク質を発現する細胞が出現するまで培養してもよい。
本発明において、前記霊長類動物とは異なる動物は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又は、ヤギから選択してもよい。
本発明において、前記霊長類動物はヒトでもよい。
本発明において、前記胎仔が出生に至って得られた仔動物に対して、前記キメラ非ヒト動物とは異種の動物のリンパ球を投与してもよい。
本発明において、前記胎仔の内因性の造血細胞の増殖を抑制する工程において、化学療法剤若しくは免疫抑制剤を前記胎仔に投与してもよく、または、放射線を前記胎仔に照射してもよい。
本発明の他の一態様は、
霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて前記霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ動物を得る第三工程と、
を有する、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ非ヒト動物の作製方法である。
本発明において、前記第一工程の前に多能性幹細胞に対して遺伝子改変処理する工程を有してもよい。
霊長類動物の血液系細胞を生産する、前記霊長類動物とは異種の体細胞を有する、キメラ非ヒト動物である。
本発明の他の一態様は、
上記のキメラ非ヒト動物から得られた造血系細胞である。
霊長類動物由来の造血系細胞を有するキメラ非ヒト動物に対して、前記キメラ非ヒト動物とは異種の動物のリンパ球を投与する工程を有する、キメラ非ヒト動物の体内の造血系細胞について前記霊長類動物由来の造血系細胞の比率を高める方法である。
前記リンパ球が、NK細胞、γδT細胞、又はNKT細胞であることが好ましい。
前記キメラ非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギに対してヒト、類人猿又はサル由来の造血幹細胞を移植して得たものであってもよい。
本発明の他の一態様は、
本発明の作製方法によって得られた造血系細胞を前記霊長類動物に投与する工程を有する、霊長類動物の造血系細胞を用いた治療方法である。
霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて得た動物の体内から前記霊長類動物の造血系細胞を得る第三工程と、
前記造血系細胞を前記霊長類動物に投与する第四工程と、
を有することを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を用いた治療方法である。
本発明において、前記治療方法の治療疾患は、再生不良性貧血、白血病、免疫不全症(X−SCID、ZAP70欠損症、Jak3欠損症、ADA欠損症、慢性肉芽腫症、Bloom症候群、Wiscott−Aldrich症候群等)、心筋梗塞等の虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、及びその他遺伝性疾患(免疫不全症、Fanconi貧血、血友病、サラセミア、鎌状赤血球貧血症、白質ジストロフィー,ムコ多糖症等)のいずれかであってもよい。
I.霊長類動物の造血系細胞の作製方法
本発明は、1つの態様において、
霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて得た動物の体内から前記霊長類動物の造血系細胞を得る第三工程と、を有することを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞の作製方法を提供する。
この方法において、まず、当該技術分野における従来からの知見に従って、霊長類動物の多能性幹細胞から、CD34陰性細胞を含む霊長類動物の細胞群を、in vitroにおいて形成させる。
造血系細胞を作製するための原料細胞は、霊長類動物の多能性幹細胞であれば生物種は特に限定されない。好ましくは、ヒト、類人猿(チンパンジー、ゴリラ又はオランウータン)、もしくはサル(ヒヒ、マカクサル、マーモセット等)などに由来する。より好ましくは、ヒトに由来する。
本発明において、前記霊長類動物の多能性幹細胞由来のCD34陰性細胞が含まれる細胞群をさらに造血系に分化・誘導することを目的として、CD34陰性細胞が含まれる霊長類動物の細胞群を、前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する。
− 妊娠約40〜85日目(満期147日)の妊娠ヒツジを、予め移植の1週間〜10日前に、移植時における飼育環境に慣れさせ、
− 母体を麻酔し、
− ヒツジを施術するに適切な体位に固定し、
− 清潔操作で、移植箇所への移植用細胞の移植を容易にするように、種々の手術、例えば、腹腔内又は肝実質内に細胞を移植する場合、下腹部正中切開で開腹後、子宮母体腹腔外に翻転させること
等により行なわれうる。
i) 仔動物より、肝臓の組織生検、骨髄等の組織を得、
ii) 得られた組織について、トリプシン処理、DNaseI処理、溶解処理等の組織に応じた適切な処理を行ない、細胞を得、
iii) 得られた細胞を、10% FBS(ウシ胎仔血清)−IMDMに懸濁して、細胞浮遊液を得、
iv) 得られた細胞浮遊液と、メチルセルロース培地{例えば、商品名:MethoCult GF+〔ステムセルテクノロジーズ(StemCell Technologies)社製、カタログ番号:ST−04435〕等}とを混合して、攪拌し、
v) ついで、得られた細胞を含む培地を、ディッシュに注入し、37℃、5体積% CO2の条件下で14日間培養する
ことにより行なわれる。
霊長類動物の造血系細胞の分離は、例えば、
1)上記のようにして得られた動物から、肝臓、骨髄、血液(末梢血、臍帯血)、胸腺、脾臓等を採取し、
2)得られた器官から、適切な手法により、細胞群を得、
3)得られた細胞群から、霊長類動物に由来する造血系細胞を分離すること等により得られうる。
II.キメラ動物
本発明の方法により、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ非ヒト動物を作製することができる。したがって、本発明は、一態様において、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ非ヒト動物及びその作製方法に関する。
霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて前記霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ動物を得る第三工程と、
を有することを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ非ヒト動物の作製方法により作製できる。
第一工程の前に多能性幹細胞に対して、既述の方法によって遺伝子改変処理する工程を有してもよい。遺伝子変異に起因する疾患の治療に使用できる血液系細胞を生産するキメラ非ヒト動物を作成できる。
III.キメラ非ヒト動物から得られた造血系細胞
本発明の他の態様は、本発明のキメラ非ヒト動物から得られた造血系細胞である。
IV.治療方法
本発明の他の態様は、本発明の作製方法によって得られた造血系細胞を前記霊長類動物に投与する工程を有する、霊長類動物の造血系細胞を用いた治療方法である。
治療方法は、造血系細胞の移植を必要とする疾患の治療に用いることができ、その疾患としては、例えば、再生不良性貧血、白血病、免疫不全症(X−SCID、ZAP70欠損症、Jak3欠損症、ADA欠損症、慢性肉芽腫症、Bloom症候群、Wiscott−Aldrich症候群等)、心筋梗塞等の虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、及びその他遺伝性疾患(Fanconi貧血、血友病、サラセミア、鎌状赤血球貧血症、白質ジストロフィー,ムコ多糖症等)が挙げられる。
(1)フィーダー細胞の作製
マクロファージコロニー刺激因子の機能不全マウスである(C57BL/6×C3H)F2−op/opマウスの新生仔頭蓋冠より作製されたストロマ細胞株で、前脂肪細胞株であるOP9細胞を、OP9細胞用培地{1250mlあたりの組成:α−MEM〔ギブコ(Gibco)社製、カタログ番号:12000−022〕 980ml、ウシ胎仔血清 250ml(最終濃度20%)、ペニシリン(100U/ml)−ストレプトマイシン(100μg/ml) 10ml、200mM L−グルタミン溶液 10ml}で、37℃、5% CO2条件下で培養した。
(2)iPS細胞の造血系分化培養
成人末梢血からFicoll−Hypaque(GEヘルスケア社製)液を用いて回収した単核球に、ヒトOct3/4、ヒトSox2、ヒトKlf4及びヒトc−Mycを搭載したセンダイウイルスベクター(IDファーマ社製)を用いて遺伝子導入し、ヒトiPS細胞を作製した。ヒトiPS細胞は、マイトマイシンCによる不活化処理をしたマウス胚線維芽細胞上で、霊長類ES細胞用培地〔Primate ES Cell Medium(リプロセル社製)500mlにbFGF(和光純薬工業社製)を2.5μg(終濃度5ng/ml)添加〕中で維持した。剥離液 1mlに回収されたヒトiPS細胞を、分化用培地〔100mlあたりの組成:IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) 84ml、8% ウマ血清 8ml、8% ウシ胎仔血清 8ml、5×10−6M ヒドロコルチゾン 0.18μg、BMP−4 2μg(最終濃度20ng/ml)、SCF 2μg(最終濃度20ng/ml)、IL−3 2μg(最終濃度20ng/ml)、IL−6 1μg(最終濃度10ng/ml)、VEGF 2μg(最終濃度20ng/ml)、G−CSF 2μg(最終濃度20ng/ml)、Flt−3リガンド2μg(最終濃度10ng/ml)、EPO 200U(2U/ml)、TPO4μg(最終濃度40ng/ml)〕 5mlに懸濁した。得られた細胞懸濁液を、前記造血系分化誘導培養におけるフィーダー細胞上に播種した。なお、培養は、37℃、5% CO2条件のインキュベーター内で行なった。また、分化用培地は、2日に1回交換した。
<遺伝子の相対発現量解析>
前述の通りに調整した造血分化細胞のRNAをサンプルとして、brachyury, Etv2, Gata2, Scl, Runx1A, 及びRunx1B遺伝子の検出を試みた。まずRNA PCR kit(TaKaRa社製)をプロトコールどおりに用いて、total RNAよりcDNAを合成した。各遺伝子検出用プライマーの配列は、Brachyuryのプライマーセットは5’−ACAAAGAGATGATGGAGGAACCCG−3’と5’−AGGATGAGGATTTGCAGGTGGACA−3’、Etv2のプライマーセットは5’−CAGAAGGCCTTCATCGCATCCA−3’と5’−GCTTGCCAGGGATGAGCTTGTA−3’、GATA2のプライマーセットは5’−AAGGACTTGGAGACTTGGTGGTC−3’と5’−GGCTATTTCAGAGAGGGAAGCCA−3’、Sclのプライマーセットは5’−ATGCCTTCCCTATGTTCACCACCA−3’と5’−TGAAGATACGCCGCACAACTTTGG−3’、Runx1aのプライマーセットは5’−CCGAGAACCTCGAAGACATC−3’と5’−GCTGTGTCTTCCTCCTGCAT−3’、Runx1bのプライマーセットは5’−CGACTCTCAACGGCACCCGA−3’と5’−ATGGCCGACATGCCGATGCC−3’とした。RT反応後のPCR増幅条件は、95℃で5分間の後、95℃を30秒間、60℃を30秒間、72℃を30秒間の組み合わせを45サイクルとした。結果を下表に示す。
<FACS解析>
前述の通り分化させた細胞に対し、抗ヒトPDGFRα(中胚葉系マーカー)、CD34 (造血幹細胞マーカー)、CD43 (汎血球マーカー)、CD45(汎血球マーカー)抗体を用いてFACS解析を行なった。細胞浮遊液に抗体溶液を添加し、4℃ で20−60分間反応させた後、蛍光標識した細胞をFACS Accuri flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて解析した。結果を図1に示す。
前記実施例1(2)で得られた、培養6日目の造血系ヒトiPS細胞を移植細胞とした。
細胞群移植1ヶ月後のヒツジ胎仔の肝臓及び細胞群移植2ヶ月後のヒツジ胎仔の骨髄を採取し、抗活性化Notch抗体、ヒトCD34抗体及び抗ヒトCD45抗体を用いて染色して観察した。蛍光顕微鏡像を図3及び4に示す。
<iPS細胞の造血系分化培養と移植細胞の準備>
前記実施例1(2)で得られた、培養6日目の造血系ヒトiPS細胞を移植用細胞とした。
<臍帯中のCD34陽性細胞群の調製>
凍結ヒト臍帯血細胞は、理研セルバンクより購入したものを用いた。Ficoll−Hypaque(GEヘルスケア)液上に重層して単核球分画を得て、磁気標識した抗ヒトCD34抗体(Miltenyi Biotech)をプロトコールどおりに反応させてCD34陽性細胞を分離回収した。得られた細胞群を、ヒツジ胎仔への移植に用い、対照とした。
<ヒツジの胎仔への細胞の移植>
実験用ヒツジ取り扱い業者ジャパンラムから購入した妊娠ヒツジを使用した。妊娠約60日目に移植を予定し、移植の1週間〜10日前に、移植時における飼育環境に慣れさせた。また、腹部超音波検査による胎仔の確認を行なった。移植6日前には、ブスルファンを母体重量換算で3 mg/kg、母体静脈内から投与した。
<サンプルの取得>
ヒトiPS細胞由来の細胞群を移植したヒツジから、出生後よりおよそ2週間に1回のペースで末梢血と骨髄を採取した。対照として、臍帯中の細胞群を移植したヒツジから、出生後よりおよそ2週間に1回のペースで末梢血と骨髄を採取した。採取した試料を、無菌コニカルチューブに入れて、室温で振とう保管し、一日以内に凍結保存した。
<ヒト造血比率の算出方法>
供試体からの造血系前駆細胞のコロニー培養には、前述のヒト細胞用メチルセルロース培地MethoCultTMGF+を使用した。採取および分離した骨髄細胞を35mm培養ディッシュ(Cat No.1008, FALCON)中で1mlメチルセルロース培地中に5−10x104の濃度で培養した(37℃、5%CO2 in air)。10−14日後、ディッシュ上の骨髄球・マクロファージコロニー(CFU−GM)、赤芽球コロニー(CFU−E)及び混合コロニー(CFU−Mix)の形成を観察した。個々のコロニーは96ウェルプレート中の50μlの蒸留水(ニッポンジーン社製)中に移し、99.0℃で5分間処理した後に55.0℃で1時間20μg/ml Proteinase K(タカラ社製)で除蛋白し、DNAを溶出した。それぞれのサンプルの5μlをPCR分析に用いた。96ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、250ngのDNAをテンプレートとして用い、ヒトに特異的な ND5遺伝子配列(ヒツジND5は検出できない)をターゲットとしてnested PCRを行った。ND5配列に対する外側のプライマーセットは5’−ACTGAGCCACAACCCAAACA−3’と5’−CTGCTCGGGCGTATCATCAA−3’、そして内側のプライマーセットは5’−TTCATCCCTGTAGCATTGTTCG−3’と5’−GTTGGAATAGGTTGTTAGCGGTA−3’である。PCR反応には、MasterCycler(エッペンドルフ)を用い、各PCRサイクルは変性、アニーリングおよび伸長の3ステップからなり、外側のPCR増幅条件は、95℃を30秒間、60℃を30秒間、72℃を30秒間の組み合わせを25サイクルとした。内側のPCR増幅条件は、95℃を30秒間、58℃を30秒間、72℃の組み合わせを30サイクルとした。反応液はTakara Taq DNA ポリメラーゼ(RR001B, タカラ)のTaq入りのバッファーにDNAとプライマーをプロトコールどおりに混合して作製した。陰性コントロールには反応液の作製に用いた蒸留水(ニッポンジーン社製)、コロニー分析で使用したメチルセルロースおよび通常のヒツジの血液サンプルDNA、そして陽性コントロールにはヒトDNAを用いた。増幅された生成物(135bp)はLoading Buffer(Wako社製)と10:1で混合し、エチジウムブロマイド(15585−011, GIBCO社製)を加えた2%アガロースゲルで電気泳動した。分子量マーカーには100b Plus DNA Ladder(Invtrogen社製)を使用した。電気泳動後のゲルは、紫外線照射下で可視化した。個体のキメラ率の算出は、β−actinの検出されたウェル数に対するヒトND5の検出されたウェル数の比によって算出した。
<結果>
各条件における移植した細胞の総数、CD34陽性細胞数、CD34陰性細胞数、CD34陰性細胞の割合、ヒト造血比率、及びヒト造血比率1%を得るのに必要なCD34陽性細胞数(CD34陽性細胞数÷ヒト造血比率)を調べた。結果を下表に示す。
以下のポイントにより、ヒト臍帯血幹細胞という本来の造血幹細胞に匹敵する、きわめて高い効率でヒツジ体内におけるヒト造血が再現できると考えられる。
(1)培養法
Brachyury、Etv2、Scl、 Runxが波状に発現しながら、PDGFRα、CD34も順を追って発現するような培養法を工夫し、汎血球マーカーのCD43、CD45が出現すべきポイントより前となる、培養6日目に移植した。培養12日目よりも後のような、汎血球マーカーのCD43、CD45が出現すべきポイントから遅れると、造血分化のタイミングを逸すると思われる。培養17日目で移植した例があったが(Blood.2006 Mar 1;107(5):2180−2183.doi:10.1182/blood−2005−05−1922)、これでは移植するタイミングが遅いと考えられる。
(2)移植細胞
CD34陰性分画を含む細胞を移植した。従来、ヒト造血幹細胞はCD34陽性分画にあると考えられており、実際、臨床でもCD34陽性細胞移植が行われている。しかし、マウスでも同様に、CD34陰性分画に造血幹細胞が存在する。このことは次の実施例で証明する。
(3)胎仔の前処理
前処置としてブスルファンを投与した上でヒトiPS由来細胞を移植したことも理由の一つである。
(4)移植部位
胎仔の肝臓内、すなわち造血組織の中に細胞を移植したことである。
従来、マウスの造血幹細胞はCD34陰性と言われ、一方、ヒトの造血幹細胞はCD34陽性と言われていた。本実施例では、ヒトにおいてもCD34陰性分画にも造血幹細胞は存在することを示す。
<ヒツジの胎仔への細胞の移植及びヒツジからの試料採取>
<実施例1の<iPS細胞の造血系分化培養>で得られた細胞群中のCD34陽性細胞の除去>
細胞分離用磁気ビーズ試薬及び精製カラム(CD34に対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体(ミルテニーバイオテク社製)と純化カラム(ミルテニーバイオテク社製)を用いて、実施例3の<iPS細胞の造血系分化培養>で得られた細胞群から細胞表面CD34発現細胞を除去した。
本実施例では、リンパ球をヒツジに移植した場合に、ヒツジ体内のヒト造血が亢進することを示す。
<臍帯中のリンパ球の調製>
臍帯血幹細胞を移植する際、通常リンパ球は不要成分として取り除くが、本実施例ではそのリンパ球を捨てずに用いた。具体的には、ヒト臍帯血からCD34陽性細胞を分離したあと、残りの細胞を凍結保存した。CD34陽性細胞を移植したヒツジが出生した後、凍結保存した細胞を融解し、CD3/28磁気ビーズ(Dynal)を添加したリンパ球培養培地(ヒト組換えIL−2を30U/ml添加したRPMI−1640(インビトロジェン社製))で14日間培養後、得られた細胞群を生後のヒツジへの注入に用いた。注入に用いたリンパ球には、NK細胞、γδT細胞及びNKT細胞が含まれている。
<臍帯血由来の細胞群を移植したヒツジへのヒトリンパ球の輸注効果>
臍帯由来の細胞群を移植したヒツジが出生後、4.8×107/kg又は10.2×107/kgのヒトリンパ球を静脈内投与した。そして、このヒツジから2週間に1回のペースで末梢血と骨髄を採取した。採取した試料について、ヒト造血比率(ヒトCFU率(%))を調べた。結果を図6及び表5に示す。
本実施例では、実施例3で得られたヒトiPS細胞由来細胞群を移植したヒツジに対してリンパ球を輸注すると、ヒツジ体内のヒト造血が亢進することを示す。
<ヒトリンパ球の調製>
ヒトiPS細胞由来細胞を移植したヒツジが出生した後、iPS細胞が由来した同一人物からの末梢血単核球を、CD3/28磁気ビーズ(Dynal)を添加したリンパ球培養培地(ヒト組換えIL−2を30U/ml添加したRPMI−1640[インビトロジェン社製])で14日間培養後、得られた細胞群を生後のヒツジへの注入に用いた。注入に用いたリンパ球には、NK細胞、γδT細胞及びNKT細胞が含まれる。
<ヒトiPS細胞由来細胞群を移植したヒツジへのヒトリンパ球の輸注効果>
ヒトiPS細胞由来細胞群を移植したヒツジが出生後、9.3×107/kgのヒトリンパ球を静脈内投与した。そして、ヒトリンパ球の注入8週間後に、このヒツジから骨髄を採取した。採取した試料について、ヒト造血比率(ヒトCFU率[%])を調べた。結果を表6に示す。実施例5と同様に、ヒト造血比率が上昇した。
Claims (23)
- 霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて得た動物の体内から前記霊長類動物の造血系細胞を得る第三工程と、
を有する、霊長類動物の造血系細胞の作製方法。 - 前記第一工程において、霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で2〜12日間培養する、請求項1に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記第一工程において、霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件でBrachyury、PDGFRα、Etv2、又は、Sclの遺伝子又はタンパク質を発現する細胞が出現するまで培養する、請求項1又は2に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記第一工程の前に多能性幹細胞に対して遺伝子改変処理する工程を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記霊長類動物とは異なる動物が、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又は、ヤギから選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記第二工程において、前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔の造血発生器官に移植する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記霊長類動物がヒトである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記胎仔が出生に至って得られた仔動物に対して、前記キメラ非ヒト動物とは異種の動物のリンパ球を投与する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記第二工程の前に、前記胎仔の内因性の造血系細胞の増殖を抑制する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記胎仔の内因性の造血細胞の増殖を抑制する工程において、化学療法剤若しくは免疫抑制剤を前記胎仔に投与する、または、放射線を前記胎仔に照射する、請求項10に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 前記胎仔の内因性の造血細胞の増殖を抑制する工程において、ブスルファンを前記胎仔に投与する、請求項11に記載の霊長類動物の造血系細胞の作製方法。
- 霊長類動物の多能性幹細胞の細胞群を、造血系細胞への分化誘導に適した条件で培養する、CD34陰性細胞が含まれる細胞群を得る第一工程と、
前記第一工程で得た細胞群の少なくとも一部を前記霊長類動物とは異なる動物の胎仔に移植する第二工程と、
前記胎仔が出生に至って得られた仔動物を育成させて前記霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ動物を得る第三工程と、
を有する、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラ非ヒト動物の作製方法。 - 前記第一工程において、造血系細胞への分化誘導に適した条件で2〜12日間培養する、請求項13に記載のキメラ非ヒト動物の作製方法。
- 前記第一工程の前に多能性幹細胞に対して遺伝子改変処理する工程を有する、請求項13又は14に記載のキメラ非ヒト動物の作製方法。
- 霊長類動物の血液系細胞を生産する、前記霊長類動物とは異種の体細胞を有する、キメラ非ヒト動物。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法により作製された、請求項16に記載のキメラ非ヒト動物。
- 請求項16又は17に記載のキメラ非ヒト動物から得られた造血系細胞。
- 霊長類動物由来の造血系細胞を有するキメラ非ヒト動物に対して、前記キメラ非ヒト動物とは異種の動物のリンパ球を投与する工程を有する、キメラ非ヒト動物の体内の造血系細胞について前記霊長類動物由来の造血系細胞の比率を高める方法。
- 前記リンパ球が、MHC非拘束性リンパ球である、請求項19に記載の方法。
- 前記リンパ球が、NK細胞、γδT細胞、又はNKT細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記キメラ非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギに対してヒト、類人猿又はサル由来の造血幹細胞を移植して得たものである、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法に対し、前記キメラ動物から造血系細胞を得る工程をさらに有する、造血系細胞の作製方法。
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