JPWO2017038473A1 - エンドトキシン低減サーモリシン - Google Patents
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Abstract
Description
以上の成果に基づき、本願は以下の発明を提供する。
[1]夾雑エンドトキシン量が1 EU/mg以下である、サーモリシン。
[2]夾雑エンドトキシン量が0.5 EU/mg以下である、[1]に記載のサーモリシン。
[3][1]又は[2]のサーモリシンを有効成分とする酵素製剤。
[4]培養細胞の分散又は回収に用いられる、[3]に記載の酵素製剤。
[5]再生医療用である、[3]に記載の酵素製剤。
[6]生体組織の再生に用いられる、[5]に記載の酵素製剤。
[7]サーモリシンを失活させる工程を含む、サーモリシンに夾雑するエンドトキシンを測定する方法。
[8]前記工程が99℃〜100℃、3分〜5分の熱処理である、[7]に記載の測定法。
[9]サーモリシン量を180 PU/mL以下に調整した試料を用いて前記工程が行われる、[8]に記載の測定法。
[10]エンドトキシンフリーの環境下で精製することを特徴とする、サーモリシンの製造法。
[11][7]〜[9]のいずれか一項に記載の測定法によって、夾雑エンドトキシン量が1 EU/mg以下であることを確認する工程を含む、[10]に記載の製造法。
(1)方法
リムルスカラーKYテストワコー(和光純薬工業株式会社)に添付のエンドトキシン標準品(Control Standard Endotoxin)を各濃度(0.001〜1 EU/mL)に希釈した。規定時間(0〜10分)、沸騰水中で加熱した(沸騰水浴)。直ちに冷却し、リムルスカラーKYテストワコーでエンドトキシン量を測定し、各濃度における加熱時間0分の測定値を100%とした相対値を算出した。
測定結果を図1に示す。処理時間1〜5分の場合、エンドトキシン濃度に影響を与えなかった。従って、沸騰水浴による熱処理の条件は1〜5分が適切と判断した。
(1)方法
所定濃度(90、180、900 PU/mL)のサーモリシン溶液(pH6〜7)を用意し、所定温度(70℃、80℃、90℃、又は沸騰浴中)で所定時間(1、2、3、5分間)、前処理を行った。前処理の後、フリルアクリロイル−グリシル−L−ロイシン−アミド(FAGLA)の加水分解を測定することにより酵素活性を評価した。加水分解の測定には検体検査システムTBA-120FR(東芝メディカルシステムズ株式会社)を用いた。7,000,000 PU/g サーモリシン(天野エンザイム製)の吸光度と比較して各試料の測定値を算出した。各試料の測定値を前処理なしの試料の測定値と比較して、相対活性値を算出した
エンドトキシン測定に影響がない5分以内の加熱処理によりサーモリシンの失活がみられるかどうかを確認した。酵素活性を180 PU/mL以下とし、3〜5分の沸騰水浴での加熱を行うことでサーモリシンの失活がみられ(図2)、エンドトキシン測定に適したサーモリシンが得られる。
サーモリシン(天野エンザイム製)をエンドトキシンフリーの器具、設備及び材料を用いて精製した。酵素活性が180 PU/mL以下になるように精製後の試料を希釈した後、前処理(99〜100℃で3分間)に供した。前処理後の試料を直ちに氷上に移し、急冷した。その後、リムルスカラーKYテストワコーでエンドトキシン量を測定した。測定の結果、検出限界(0.001 EU/mg)以下であった(N=3)。
Claims (11)
- 夾雑エンドトキシン量が1 EU/mg以下である、サーモリシン。
- 夾雑エンドトキシン量が0.5 EU/mg以下である、請求項1に記載のサーモリシン。
- 請求項1又は2のサーモリシンを有効成分とする酵素製剤。
- 培養細胞の分散又は回収に用いられる、請求項3に記載の酵素製剤。
- 再生医療用である、請求項3に記載の酵素製剤。
- 生体組織の再生に用いられる、請求項5に記載の酵素製剤。
- サーモリシンを失活させる工程を含む、サーモリシンに夾雑するエンドトキシンを測定する方法。
- 前記工程が99℃〜100℃、3分〜5分の熱処理である、請求項7に記載の測定法。
- サーモリシン量を180 PU/mL以下に調整した試料を用いて前記工程が行われる、請求項8に記載の測定法。
- エンドトキシンフリーの環境下で精製することを特徴とする、サーモリシンの製造法。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の測定法によって、夾雑エンドトキシン量が1 EU/mg以下であることを確認する工程を含む、請求項10に記載の製造法。
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