KR101681142B1 - 속성 멸균 마이크로분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 여과가능한 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 약제학적 조성물을 여과하여 약제학적 조성물이 침전되는 적어도 3개의 막을 제공하는 단계; 3개의 막을 고체 배양물 배지에 두어 적어도 3개의 잔류 배양물을 생성하는 단계; 호기성 및 혐기성 조건하에서 배양하는 단계 및 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니를 검출하는 단계(살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 막 상의 콜로니의 존재는 약제학적 조성물의 살아있는 미생물의 존재를 나타낸다)를 포함하는 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

속성 멸균 마이크로분석{RAPID STERILITY MICROASSAY}
이 출원은 2009년 5월 4일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/175,271의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시는 참고로써 여기에 포함된다.
미국의 연방법규, 및 다른 국가의 유사한 법규는, 약제학적 생성물이 박테리아 및 진균과 같은 미생물이 실질적으로 없다는 것을 보장하는 멸균 시험을 필요로 한다. 이러한 멸균 시험을 수행하기 위해 3가지의 일반적인 방법, 직접 전달 멸균 시험, 막 여과 멸균 시험 및 생성물 플러쉬 멸균 시험이 사용되어 왔다. EP 2.1.6 "Sterility" (유럽 약전 2.1.6 "Sterility" EP 6th Edition (2007)참조) 및 다른 적절한 약전에서, 전통적인 멸균 시험은 2가지의 액체 양료 배지로 수행되고(20-25℃에서 인큐베이팅된 TSB(Tryptic Soy Broth), 30-35℃에서 인큐베이팅된 티오글리콜레이트 양료 배지 FTM(Thioglycollate Nutrient Medium)) 유체로 린스되고, 14일의 배양 시간을 필요로 한다(예를 들어, USP <71> "Sterility Tests," Pharmacopeial Forum. 제1 보충물을 통한 USP 30-NF 25 The United States Pharmacopeial Convention , Inc .). 유동성 티오글리콜레이트 배지(FTM)는 2가지의 상을 함유하며- 액체 배지의 하부 상은 혐기성 상이고, 상부 상은 호기성 인큐베이션을 위한 산소를 함유한다.
일반적으로, 막 여과 방법, 액체, 에멀젼화 또는 용해된 약제학적 또는 의학적 생성물(예를 들어, 활성 성분, 비경구 조제물, 안약, 비강 스프레이 등)을 사용하는 멸균을 위한 약제학적 생성물을 시험하는 것은 0.45 마이크론 기공 크기 막을 통해 여과되며, 막은 적절한 시험 배지(FTM 및 TSB)에 옮겨지고 14일 동안 배양된다. 미생물이 배양물 내에서 성장한다면, 약제학적 생성물은 멸균이 아니고 미생물 확인을 위해 샘플이 취해질 수 있다. 인큐베이션을 위해, 그리고 또한 배양물 내에서 성장하는 유기물의 미생물적 확인을 위해 많은 양의 시간이 필요로 되는 것은 불리하며, 약제학적 생성물의 그것이 필요한 환자에서의 이용가능성을 제한할 수 있다. 예를 들어, 의학 위기의 시대에, 14일 인큐베이션 기간을 필요로 하는 현재 멸균 시험은 위기를 감소시키거나 끝낼 수 있는 약품 또는 백신의 이용가능성을 지연시킬 수 있다. 따라서, 속성 멸균 시험 방법에 대한 필요가 존재한다.
본 발명은 a) 여과가능한 약제학적 조성물을 제공하는 단계; b) 약제학적 조성물을 여과하여 약제학적 조성물 잔류물이 침전되는 적어도 3개의 필터 막을 제공하는 단계; c) 적어도 3개의 필터 막을 고체 배양물 배지에 두어 적어도 3개의 잔류 배양물을 생성하는 단계; d) i) 적어도 하나의 잔류 배양물을 20 내지 25℃에서 호기성 조건 하에서 배양하고; ii) 적어도 하나의 잔류 배양물을 30 내지 35℃의 호기성 조건 하에서 배양하고; 및 iii) 적어도 하나의 잔류 배양물을 30 내지 35℃의 혐기성 조건 하에서 배양하는 단계, 단, 잔류 배양물은 약 13일 이상의 기간동안 배양되지 않는다, 및 e) 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니를 검출하는 단계(막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니의 존재가 약제학적 조성물의 살아있는 미생물의 존재를 나타낸다)를 포함하는 검출 방법에 관한 것이다.
본 방법은 약제학적 조성물이 여과된 후 세척 용액을 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 막은 폴리비닐리덴플루오라이드 막, 유리섬유 막, 폴리카르보네이트 막, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막, 혼합된 셀룰로오스 에스테르(셀룰로오스 아세테이트 및 셀룰로오스 니트레이트), 포스포셀룰로오스 막, DEAE 막, 나일론 메시 막, 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 막이다. 바람직하게는, 막은 약 0.45 μm의 기공 크기를 가진다.
고체 배양물 배지는 FTM-A (1.075% 한천 (최종 농도)을 함유하는 유동성 티오글리콜레이트 배지), BHI (뇌심장 침출액 한천), Difco brewer 혐기성 한천, R2A 한천, Schaedler 혈액 한천, Caso-한천 ICR (tryptic soy agar), Columbia 한천 5% 혈액, 및 CDC 혐기성 혈액 한천으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 방법은 약 2 내지 약 7일의 기간 동안 잔류 배양물을 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니는 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니에 의해 생성된 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 검출하는 생물발광 분석과 같은 발광분석을 사용하여 검출된다. 발광 분석은 루시퍼라아제 분석을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발광 분석은 미생물에 내인성인 프로브와 핵산 사이에 형성되는 핵산 혼성화를 검출한다. 발광 분석은 퍼옥시다아제 반응을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발광은 전하결합소자 카메라(charge coupled device camera) 및 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 살아있는 세포, 살아있는 미생물 마이크로-콜로니 또는 살아있는 미생물 콜로니들의 수가 정량되고 열거된다.
일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 액체 조성물이다. 액체 조성물은 비경구 조성물, 경구 조성물, 비강 조성물, 눈 조성물, 또는 백신일 수있다.
본 발명은 또한 a) 여과성의 약제학적 조성물을 제공하는 단계; b) 약제학적 조성물을 여과하여 약제학적 조성물 잔류물이 침전되는 적어도 3개의 필터 막을 제공하는 단계; c) 적어도 3개의 필터 막을 고체 배양물 배지에 두어 적어도 3개의 잔류 배양물을 생성하는 단계; d) i) 호기성 조건 하에 20-25℃에서 적어도 하나의 잔류 배양물을 배양하고; ii) 호기성 조건 하에 30-35℃에서 적어도 하나의 잔류 배양물을 배양하고; 및 iii) 혐기성 조건 하에 30-35℃에서 적어도 하나의 잔류 배양물을 배양하는 단계, 단, 잔류 배양물은 약 13일 이상의 기간 동안 배양된다; 및 e) 막에서 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 검출하는 단계(막 상의 ATP의 존재는 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물의 존재를 나타낸다)를 포함하는 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 시간에 따른 모락셀라 오슬로엔시스(M. osloensis)의 UV-처리의 결과를 예시하는 그래프이다. 4일의 인큐베이션 후 존재하는 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 나타낸다. 그래프는 4분(3회 실행) 후 CFU의 50% 이상의 감소를 나타낸다.
도 2는 시간에 따른 E. coli의 열처리 결과를 예시하는 그래프이다. 3일의 배양 후 콜로니 형성 단위의 수를 나타낸다. 그래프는 3분 후(3회 실행) CFU의 50% 이상의 감소를 나타낸다.
도 3은 시간에 따른 비경구 약물 생성물 치료의 결과를 예시하는 그래프이다. 5일의 인큐베이션 후 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 나타낸다. 그래프는 2분 후(3회 실행) CFU의 50% 이상의 감소를 나타낸다.
도 4a는 3분 동안 70℃에서 열 처리된 마이크로코커스 루테우스(M. luteus ) 세포의 현미경사진이다. 도 4b는 30-35℃에서 3일의 인큐베이션 후 Tryptic Soy Agar에 플레이팅한 미처리 마이크로코커스 루테우스(M. luteus ) 세포의 현미경사진이다.
도 5는 미처리된 E. coli 배양물에 대한 광학 밀도 데이터를 예시하는 그래프이며, 열 처리된 E. coli, UV-처리된 E. coli 및 볼타렌-처리된 E. coli이다.
도 6은 미처리된 E. coli 배양물, 열처리된 E. coli, UV-처리된 E. coli 및 볼타렌-처리된 E. coli에 대한 광학 밀도 데이터를 예시하는 그래프이다.
도 7은 미처리된 E. coli 성장 곡선과 열-처리된 E. coli의 비교를 나타내는 그래프이다. 3시간의 과정을 걸쳐, E. coli 배양물이 0.2313의 기울기를 가지면, 미처리된 배양물의 정상 기울기로 다시 증가한다.
도 8은 미처리된 스클레오파게스 아우레우스(S. aureus) 성장 곡선과 열처리된 스클레오파게스 아우레우스(S. aureus)의 비교를 나타내는 그래프이다. 4시간의 과정에 걸쳐, 스트레스가 가해진 스클레오파게스 아우레우스(S. aureus) 배양물이 0.1070의 기울기를 가지면, 이것은 미처리된 배양물의 정상 기울기로 다시 증가한다(4시간 후, 0.4034).
도 9는 미처리된 칸디다 알비칸스(C. albicans) 성장 곡선과 열처리된 칸디다 알비칸스(C. albicans)의 비교를 나타내는 그래프이다. 8시간 이상의 과정에 걸쳐, 스트레스가 가해진 칸디다 알비칸스(C. albicans) 배양물은 0.0419의 기울기를 가진다.
도 10은 미처리된 바실러스 푸밀러스 (B. pumilus) 성장 곡선과 영양결핍 바실러스 푸밀러스 (B. pumilus)의 비교를 나타내는 그래프이다. 세포들은 2-8℃에서 7일 동안 영양소 결핍을 경험하였다. 5시간의 과정에 걸쳐, 스트레스가 가해진 바실러스 푸밀러스 (B. pumilus) 배양물이 -0.0056의 기울기를 가지면, 이것은 미처리된 배양물의 정상 기울기로 다시 올라간다.
도 11은 Schaedler 혈액 한천의 배경 시험의 결과를 나타내는 현미경사진이다. MILLIFLEX Rapid 막 MXHVWP124를 MILLIFLEX 카세트 내 Schaedler 혈액 한천에서 5일 동안 30-35℃에서 인큐베이팅하였다. FIG. 11a는 MILLIFLEX Rapid 이미지를 나타내고, 이 경우에 막은 100ml 유체 A로 린스 하였다. 도 11b는 100ml 유체 D로 린스한 막을 나타낸다.
본 발명은 14일의 인큐베이션 기간을 필요로 하는 통상적인 시험보다 더 속성인 멸균 시험을 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 여과성 액체 조성물, 예컨대 액체 약제학적 조성물(예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼, 비경구 조성물, 경구 조성물, 비강 조성물, 눈 조성물, 백신)의 속성 멸균 시험을 위해 특히 잘 적합화 되어 있다. 일반적으로, 본 방법은 필터 막을 통해 약제학적 조성물을 여과하는 단계를 포함하며, 이어서 필터 막은 고체 배양물 배지에 전달되고 아데노신 트리포스페이트와 같은 생분자의 충분한 양을 증식하거나 생성하기 위한 막에서 살아 있는 미생물을 허용하고, 미생물의 검출을 허용하기에 충분한 시간 동안(예를 들어, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일) 적합한 성장 조건 하에서 배양된다.
한 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법이다. 본 방법은 필터 막을 통해 약제학적 조성물(예를 들어, 액체 약제학적 조성물)을 여과하여 약제학적 조성물 잔류물, 및 약제학적 조성물 내에 있을 수 있는 어떤 살아있는 미생물이 석출되는 하나 이상의(적어도 3개) 필터 막을 제공하는 단계를 포함한다. 원한다면, 세척 용액은 여과된 다음에, 예를 들어 성장 억제제, 대사 억제제 또는 검출 억제제를 막으로부터 세척하고, 이에 따라 잔류물 내 미생물의 검출을 가능하게 할 수 있다. 잔류물을 함유하는 필터 막을 고체 배양물 배지에 두어서 적어도 3개의 잔류 배양물을 생성한다. 그 다음에 잔류 배양물을 3가지의 다른 조건들: 20-25℃에서 호기성 조건, 30-35℃에서 호기성 조건 및 30-35℃에서 혐기성 조건하에 필터 막 상의 살아 있는 미생물을 허용하기에 충분한 배양 기간 동안 배양하여 아데노신 트리포스페이트와 같은 생분자의 충분한 양을 증식 또는 생성하고, 미생물의 검출을 허용한다. 일반적으로, 잔류 배양물을 약 13일의 기간 동안 배양하였고, 바람직하게는 실질적으로 13일보다 짧은 기간 동안 배양하였다. 그 다음에, 잔류 배양물을 어떤 적당한 방법을 사용하여 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니의 존재에 대해 평가한다. 필터 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니의 존재는 약제학적 조성물의 살아있는 미생물의 존재를 나타낸다.
본 발명의 한 양태에서, 여과가능한 약제학적 조성물을 제공하는 단계, 조성물을 여과하여 잔류물이 침전된 적어도 3개의 필터 막에서 제공하는 단계, 고체 배양물 배지에 3개의 막을 두어서 3가지의 잔류 배양물을 생성하는 단계, 약 13일 이하의 배양 기간 동안 호기성 조건 하에 20-25℃에서 제1 잔류 배양물을 배양하는 단계, 호기성 조건 하에 30-35℃에서 제2 잔류 배양물을 배양하는 단계 및 혐기성 조건 하에 30-35℃에서 제2 잔류 배양물을 배양하는 단계, 및 막 상의 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 검출하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법이 제공된다. 필터 막 상의 ATP의 존재는 약제학적 조성물 내 살아있는 미생물의 존재를 나타낸다.
넓은 범위의 미생물이 본 발명을 사용하여 검출될 수 있다(예를 들어, 효모 및 곰팡이, 그램 양성 아포형성 박테리아, 그램 음성 박테리아, 그램 양성 구균(cocci) 및 그램 양성 간균(rods)(호기성과 혐기성 미생물 둘 다)). 본 방법은 ATCC(American Type Culture Collection) 균주를 검출하기 위해, 또한 제조 시설을 오염시킬 수 있는 환경 미생물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는, 본 방법은 아스페르질루스 브라질리엔시스(Aspergillus brasiliensis) ATCC 16404 (앞서 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)로서 알려짐), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231, 클로스트리듐 스포로젠스(Clostridium sporogenes) ATCC 11437, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ATCC 8739, 아시네토박터 이우피(Acinetobacter Iwoffi), 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 이드리엔시스(Bacillus idriensis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 코리네박테리움 아페르멘탄스(Corynebacterium afermentans); 코쿠리아 스페즈(Kocuria spez .), 코쿠리아 리조필리아(Kocuria rhizophilia)(이전에 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)로서 알려짐), 모락셀라 오슬로엔시스(Moraxella osloensis), 페니실리움 스페즈(Penicillium spez .), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 카피티스(Staphyloccus capitis), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) 및 스타필로코커스 와르네리( Staphylococcus warneri)를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 약제학적 조성물(예를 들어, 액체 약제학적 조성물)은 진공 또는 정압을 사용하는 것과 같은 압력하에서 멸균 또는 무균성 기술을 사용하여 멸균 필터 막을 통해 여과된다. 임의의 적당한 필터 막 및 여과 장치가 사용될 수 있다. 적당한 필터 막의 예는, 예를 들어, 폴리비닐리덴플루오라이드 막, 유리섬유 막, 폴리카르보네이트 막, 폴리에틸렌 트레프탈레이트 막, 혼합된 셀룰로오스 에스테르(셀룰로오스 아세테이트 및 셀룰로오스 니트레이트), 포스포셀룰로오스 막, DEAE 막, 나일론 메시 막 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 막을 포함한다. 청구된 발명에서 사용에 적당한 필터 막은 약제학적 조성물에서 존재할 수 있는 미생물을 보유하기에 충분히 작은 기공 크기, 예컨대, 약 0.1 마이크론(μm) 내지 약 20 마이크론, 약 0.1 마이크론 내지 약 15 마이크론, 0.1 마이크론 내지 약 12 마이크론, 0.1 마이크론 내지 약 10 마이크론, 0.1 마이크론 내지 약 8 마이크론, 0.1 마이크론 내지 약 6 마이크론, 0.1 마이크론 내지 약 5 마이크론, 0.4 마이크론 - 12 마이크론, 0.4 마이크론 - 10 마이크론, 0.4 마이크론 - 8 마이크론, 0.4 마이크론 - 6 마이크론, 약 0.22 마이크론, 또는 약 0.45 마이크론을 가진다. 바람직하게는, 막 필터는 약 0.45 마이크론의 기공 크기를 가진다.
일반적으로 잔류물을 함유하는 적어도 3개의 필터 막이 제조된다. 이는 3개의 분리 필터 막을 통해 약제학적 조성물의 3개의 개별 샘플을 여과함으로써 수행될 수 있다. 이는 또한 약제학적 조성물을 함유하는 하나의 필터 막을 제조하고, 멸균 또는 무균 기술을 사용하여 필터를 3 부분으로(예를 들어, 거의 동일 크기의 3부분) 절단 또는 분리함으로써 수행될 수 있다. 약제학적 조성물 잔류물을 함유하는 필터 막은 그 다음에 적당한 고체 배양물 배지로 대체되어 잔류 배양물을 생성한다.
적당한 고체 배양물 배지 및 배양물 조건은 검출되어야 하는 원하는 미생물의 성장 및/또는 대사를 지지하도록 선택될 수 있다. 이는, 예를 들어 본원에서 설명되고 예시된 바와 같은 배양물 배지를 스크리닝 함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본 방법에서 사용되는 고체 배양물 배지는 호기성 및 혐기성 배양 조건하에서 넓은 범위의 미생물의 성장을 지지할 것이다. 원한다면, 하나 이상의 고체 배양물 배지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 배양물 배지는 효모, 곰팡이 및 호기성 박테리아의 성장을 위한 액체 Tryptic Soy Broth와 동등하거나 더 양호하게 사용될 수 있고; 제2 고체 배양물 배지는 혐기성 미생물의 성장을 위한 유동성 티오글리콜레이트 배지의 혐기성 상과 동일하거나 더 양호하게 선택될 수 있고, 제3 고체 배양물은 호기성 미생물의 성장을 위한 유동성 티오글리콜레이트 배지의 호기성 상과 동일하게 또는 더 양호하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 단일 고체 배양물 배지는 호기성 및 혐기성 조건 하에서 사용된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적당한 고체 배양물 배지는, 예를 들어, FTM-A (1.075% 한천 (최종 농도)을 함유하는 유동성 티오글리콜레이트 배지), BHI (뇌심장 침출액 한천), Difco Brewer 혐기성 한천, R2A 한천, Schaedler 혈액 한천, Caso-Agar ICR (Tryptic Soy Agar), Columbia 한천 5% 혈액 또는 CDC 혐기성 혈액 한천을 포함한다. Schaedler 혈액 한천은 본 방법에서 사용을 위한 고체 배양물 배치에 특히 바람직하다.
바람직한 고체 배양물 배지는 본원에서 설명되는 바와 같은 "스트레스를 가한" 및 "스트레스를 가하지 않은" 미생물의 성장 및/또는 대사작용에 적합하다. 이는 약제학적 조성물의 제조 동안과 같은 화학 공정 동안 미생물이 스트레스, 예를 들어, 저장성 또는 고장성 스트레스, 조사(예컨대, UV-광, 감마-조사, 마이크로웨이브), 초음파, 열, 저온 또는 화학적 스트레스(예를 들어, 염소 또는 약제학적 약물 생성물에 의해 유발됨)를 경험할 수 있기 때문에 바람직하다. 잔류 배양물을 마이크로-콜로니 또는 콜로니를 생성하거나, 아데노신 트리포스페이트와 같은 생분자의 충분한 양을 생성하기 위해 증식하는 막 상에 있는 살아 있는 미생물을 허용하고, 미생물의 검출을 허용하는 충분한 시간 기간 동안 적합한 성장 조건 하에서 인큐베이팅(즉, 배양) 한다. 일반적으로 제1 잔류 배양물은 호기성 조건 하에 30-35℃에서 인큐베이팅되고, 제2 잔류 배양물은 혐기성 조건 하에 30-35℃에서 인큐베이팅되고, 제3 잔류 배양물은 호기성 조건 하에 20-25℃에서 인큐베이팅된다.
일부 구체예에서, 잔류 배양물은 살아있는 미생물을 허용하기에 충분한 시간 기간 동안 배양되어 검출가능한 양의 ATP, 예컨대, 적어도 약 200 아토몰의 ATP, 적어도 약 200 펨토몰의 ATP, 적어도 약 200 피코몰의 ATP, 또는 적어도 약 200 나노몰의 ATP를 생성한다. 배양 기간은 약 2 내지 약 7일, 약 2 내지 약 8일, 약 2 내지 약 9일, 약 2 내지 약 10일, 약 2 내지 약 11일, 약 2 내지 약 12일, 약 2 내지 약 13일, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 또는 약 6일일 수 있다. 각 개개의 잔류 배양물에 대한 인큐베이션 기간은 적절하게 다양할 수 있고, 모든 잔류 배양물이 동일한 양에 대해 배양되어야 할 필요는 없다. 바람직한 인큐베이션 시간은 검출되어야 하는 미생물을 기초로 다양할 것이다.
잔류 배양물의 인큐베이션 후 필터 막 상에 존재하는 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니는 외관 검사와 같은 임의의 적당한 방법을 사용하여 또는 바람직하게는 적당한 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 발광 분석(예를 들어, 루시퍼라아제 분석)이 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 적당한 방법 또는 시스템이 발광, 예컨대 전하결합소자 카메라, 영상 처리장치 및 영상분석 소프트웨어를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 유리하게는, 영상 분석 소프트웨어는 살아있는 미생물 세포, 살아있는 미생물 마이크로-콜로니 또는 살아있는 미생물 콜로니의 수를 정량하기 위해 또는 열거하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 루시퍼라아제 분석과 같은 발광 분석이 필터 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니에 의해 생성되는 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 검출하기 위해 사용된다. 예를 들어, ATP 방출 시약 및 생물 발광제(예를 들어, 루시퍼라아제 및 루시페린을 함유하는 약제)가 필터 막에 적용되고 생존 세포가 ATP를 생성한다면 발광이 일어난다. 발광에 의해 ATP를 검출하는데 적당한 시약은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, MILLIFLEX 속성 시약 키트; Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts).
예를 들어, 미생물에 내인성인 핵산을 혼성화할 프로브의 혼성화를 검출하는 발광 분석을 사용하여, 잔류 배양물의 인큐베이션 후 필터 막에 존재하는 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니가 또한 검출될 수 있다. 발광 분석은 퍼옥시다아제 반응 또는 다른 적당한 반응을 포함할 수 있다. 퍼옥시다아제 및 다른 효소의 활성을 통해 발광을 생성하는데 적당한 시약은 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.
분석 및 검출 시스템은 약 10-100개의 효모 세포 또는 약 1000개의 박테리아 세포가 검출되도록 사용될 수 있다. 바람직하게는, 분석 및 검출 시스템은 단일 세포 또는 단지 약 100개의 세포가 검출되도록 사용된다. 이는 예를 들어, 미생물에 의해 생성되는 ATP를 검출함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 ATP 생물발광 분석은, 상업적으로 이용가능한 전하결합소자카메라, 영상 처리장치 및 영상분석 소프트웨어(MILLIFLEX 속성 마이크로생물 검출 및 열거 시스템; Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts)와 결합하여 사용될 때, 약 1개의 효모 또는 곰팡이 세포 또는 약 100개의 박테리아 세포와 동일한 약 200 아토몰의 ATP를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 검출 방법은 액체 약제학적 조성물과 같은 여과성 조성물의 멸균을 평가하기 위해 잘 적합화된다. 액체 조성물은 수성 조성물, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 액체 약제학적 조성물은, 예를 들어, 비경구 조성물, 경구 조성물, 비강 조성물, 또는 눈 조성물을 포함하는, 약제학적 사용에 적합한 임의의 액체일 수 있다. 액체 조성물은 백신일 수 있다.
적당한 백신은, 예를 들어, 안트락스 백신(ANT), 바실 칼메트-게랭(Bacile Calmette-Guerin) 결핵 백신(BCG), 보렐리아증 백신 외부 표면 단백질 A 백신(BORospA), 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 백신(DT), 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 백신(DTP), 소아용의 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 백신(DTPa), 성인용의 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해(DrTPar), 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 및 헤모필러스 인플루엔자 b형 콘쥬게이트 백신(DTPa-HIB), 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 및 헤모필러스 인플루엔자 b형 콘쥬게이트 및 폴리오바이러스 불활성화 백신(DTPa-HIB-IPV), A형 간염 바이러스 백신(HAV), A형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스 백신(HAV-HBV), B형 간염 바이러스 백신(HBV), 헬리코박터 파일로리 백신(HEL), 헤모필러스 인플루엔자 b형 백신(HIB), 헤모필러스 인플루엔자 b형 콘쥬게이트 백신(HIBcn), 헤모필러스 인플루엔자 b형 다당류 백신(HIBps), 헤모필러스 인플루엔자 b형 백신(디프테리아 CRRM 197 단백질 콘쥬게이트, 디프테리아 CRM 197 독소 단백질에 콘쥬게이트된 올리고당; HIB-HbOC)), 조류 인플루엔자(예를 들어, H5N1, H5N3) 및 돼지인플루엔자(예를 들어, H1N1)에 대한 백신, 인플루엔자 바이러스 약독생균백신(INFa), 인플루엔자 바이러스 약독생균비강백신(INFan), 인플루엔자 바이러스 불활성화된 백신(INFi), 인플루엔자 바이러스 불활성화된 백신 스플리트 비리온(INFs), 인플루엔자 바이러스 불활성화된 백신 스플리트 비리온 A 및 B형 3가 (INFs-AB3), 인플루엔자 바이러스 백신 전 비리온(INFw)을 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신(INF), 폴리오바이러스 불활성화된 백신(IPV), 뇌척수막염균(네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)) 백신(MEN), 뇌척수막염균(네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)) 콘쥬게이트 백신(MENcn), 뇌척수막염균(네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)) 콘쥬게이트 백신 혈청형 A,C(MENcn-AC), 뇌척수막염균(네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)) 콘쥬게이트 다당류 백신 혈청형 A, C, Y, W-135 (MENps-ASYW), 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 풍진 바이러스 백신(MMR), 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 풍진 바이러스 및 수두 바이러스 백신(MMR-VAR), 폴리오바이러스 약독 생균 경구 3가 백신(OPV), 폐구균(스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)) 백신(PNU), 폐구균(스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)) 콘쥬게이트 백신 7-가(PNUcn-7), 폐구균(스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)) 다당류 23-가 백신(PNUps-23), 폴리오바이러스 백신(POL), 광견병 백신 인간 2배체 세포 배양물(RAB-HDCV), 광견병 백신 정제된 계태아세포 배양물(RAB-PCEC), 호흡기세포융합 바이러스 백신(RSV), 천연두 백신(SMA), 천연두(우두 바이러스) 백신(SMAvac), 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드(성인에 대해 감소된 항원 양) 백신(Td), 톡소플라스마증(기생충 톡소포자충(Toxoplasm gondii)) 백신(TOX), 장티푸스(살모넬라 티피(Salmonella typhi)) 백신(TPD), 장티푸스(살모넬라 티피(Salmonella typhi) 백신 약독 생균 경구 Ty21a 균주(TPDa), 열 및 페놀 불활성화 건조된 장티푸스(살모넬라 티피(Salmonella typhi)) 백신(TPD-HP), 장티푸스(살모넬라 티피(Salmonella typhi)) 백신 Vi 협막다당(TPD-Vi), 결핵(미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 백신, not BCG (TUB), 수두(치킨팍스, 바리셀라 조스터 바이러스(chickenpox, varicella zoaster virus)) 백신(VAR)을 포함한다.
적당한 비경구 조성물은, 예를 들어, 아데노신, 알프로스타딜, 아미카신 술페이트, 아지트로마이신, 블레오마이신, 세프트리악손, 시프로플록사신, 시스플라틴, 다카르바진, 다우노루비신 HCl, 데페록사민 메실레이트, 데스모프레신 아세테이트, 딜티아젬, 디피리다몰, 독소루비신, 에날라프릴라트, 에피루비신, 에포프로스테놀 나트륨, 플루코나졸, 플루다라빈 포스페이트, 플루다라빈 포스페이트, 플루마제닐, 그라니세트론 HCl, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 이리노테칸 HCl, 류코보린 칼슘, 류프롤라이드 아세테이트, 류보카르니틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메스나, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메토클로프라미드, 미토크산트론, 날부핀 HCl, 노르에피네프린 비타르트레이트, 옥트레오타이드 아세테이트, 온단세트론, 옥살리플라틴, 옥시토신, 파클리탁셀, 파미드로네이트 2나트륨, 판크로늄 브로마이드, 페닐에프린 브로마이드, 페닐에프린 HCl, 프로메타진 HCl, 프로포폴, 로쿠로늄 브로마이드, 술파메톡사졸, 수마트리프탄 숙시네이트, 테부탈린 술페이트, 테스토스테론 시피오네이트, 토브라마이신, 베쿠로늄 브로마이드, 빈크리스틴 술페이트, 빈오렐빈 타르트레이트, 및 스트렙토조신 멸균 분말을 포함한다.
적당한 경구 조성물은, 예를 들어, 아세트아미노펜 및 코데인 포스페이트 정제, 아세트아미노펜 아세트아졸아미드 정제, 아시클로비르 캡슐, 아밀로라이드 HCl, 아미노다론 HCl, 암로디핀 베실레이트 및 베나제프릴 캡슐, 암로디핀 베실레이트 정제, 암목실린 및 클라불라네이트 칼륨, 암목실린, 아나그렐라이드, 데소게스트렐 및 에티닐 에스트라디올 정제, 아스프린, 아테놀롤, 레보노르게스트렐 및 에티닐 에스트라디올 정제, 아지트로마이신, 바클로펜, 레보노르게스트렐 및 에티닐 에스트라디올 정제, 아지트로마이신, 바클로펜, 베나제프릴 HCl, 벤조나테이트, 벤즈트로핀 메실레이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타네콜 클로라이드, 비칼우타마이드, 비소프로롤 푸마레이트, 부프로프리온 HCl, 부데소나이드 흡입 현탁액, 부메타니드, 부프로피온 HCl, 카베르골린, 칼카르브 600, 칼시트리올, 칼슘 시트레이트 정제, 노르에틴드론 정제, 캅토프릴 및 히드로클로로티아지드 정제, 캅토프릴, 카르바마제핀, 카르베딜올, 세파클로르, 세파드록실, 세프디니르, 세프프로질, 세팔렉신, 세르타겐, 세르티리진 HCl, 클로르디아제폭시드 HCl, 클로르페니르아민 말리에이트, 클로르족사존, 클로리노이드, 실로스타졸, 시메티딘 HCl, 시메틴, 시프로플록사신, 시탈로프람, 이소트레티노인, 클라리트로마이신, 클레마스틴 푸마레이트, 클린다마이신, 클로미펜 시트레이트, 클로미프라민 HCl, 클로나제팜, 클로트리마졸, 클로자핀, 크로몰린 나트륨, 시클로벤즈아프린 HCl, 시클로스포린, 시프로헵타딘 HCl, 다나졸, 데메클로시클린 HCl, 데스모프레신 아세테이트, 덱스메틸페니데이트 HCl, 덱스트로암페타민 술페이트, 디아제팜, 디클로페낙 칼륨, 디클록사실린, 디다노신, 디티아젬 HCl, 디펜히드라민 HCl, 디피리다몰, 디이소피라미드 포스페이트, 디발프로엑스 나트륨, 도르졸아미드 HCl, 독사조신 메실레이트, 엔알라프릴 말리에이트, 카르바마제핀, 에스타졸람, 에스트라디올, 에스트로피페이트, 에탐부톨 HCl, 에토숙시미드, 에토돌락, 팜시클로비르, 파모티딘, 황화제1철, 황산제1철, 펙소페나딘 HCl, 피나스테라이드, 플레카이니드 아세테이트, 플루코나졸, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루옥시이노나이드, 플루옥세틴, 플루르비프로펜, 플루타마이드, 플루복사민, 포시노프릴 나트륨, 푸로세마이드, 가바펜틴, 갈란타민 히드로브로마이드, 겜피브로질, 글리메피라이드, 글리피자이드, 글루코사민 술페이트, 글리부라이드, 할로페리돌, 히드랄라진 HCl, 히드로클로로티아지드, 히드로콘돈 비타르트레이트, 히드록시클로로퀸 술페이트, 히드록시우레아, 히드록시진 HCl, 히드록시진 파모에이트, 인도메타신, 이소니아지드, 케토코나졸, 케토프로펜, 케토롤락 트로메타민, 라베탈올 HCl, 라모트리진, 란소프라졸, 레플루노마이드, 류코보린 칼슘, 레베티르아세탐, 리도카인 HCl, 리시노프릴, 로페르아미드 HCl, 로라제팜, 로사르탐 포타슘로바스타틴, 메벤다졸, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜록시캄, 메페리딘 HCl, 머캅토퓨린, 메살라민, 메트포르민 HCl, 메토트렉세이트, 메틸도파, 메틸프레드니솔론, 메토클로프라미드, 메토프롤롤 타르트레이트, 메트로니다졸, 메트로니다졸, 멕시레틴, 미노사이클린 HCl, 미르타자핀, 미소프로스톨, 모에이프릴 HCl, 무피로신, 미코페놀레이트 모페틸, 나부메톤, 나돌롤, 날트렉손 HCl, 나프록센, 네파존 HCl, 네오마이신 술페이트, 니아신, 니페디핀, 니모디핀, 니자티딘, 노르에틴드론 아세테이트, 노르트립틸린 HCl, 니스타틴, 오플록사신, 오메프라졸, 온단세트론 HCl, 옥사프로진, 옥사제팜, 옥시부티닌 클로라이드, 옥시코돈, 옥시코돈 HCl, 판토프라졸 나트륨, 파록세틴, 페니실린 V 칼륨, 펜톡시필린, 페닐게식, 피록시캄, 프라미펙솔, 디히드로클로라이드, 프라바스타틴 나트륨, 프라조신 HCl, 프레드니솔론, 프로클로르페라진 말리에이트, 프로파페논 HCl, 프로폭시펜 HCl, 프로프라놀롤 HCl, 프로트리프틸린 HCl, 퀴나프릴, 퀴니딘 술페이트, 라미프릴, 라니티딘 HCl, 리바비린, 리스페리돈, 로피니롤 HCl, 세나-S, 세나겐, 질산은, 심바스타틴, 소탈롤 HCl, 수크랄페이트, 타목시펜 시트레이트, 탐술로신 HCl, 테르조신 HCl, 테르비나핀 HCl, 테트라사이클린 HCl, 테오필린, 티클로피딘 HCl, 톨메틴 나트륨, 토피라메이트, 토르세마이드, 트라마돌 HCl, 트란돌라프릴, 트라조돈 HCl, 트레티노인, 우르소디올, 발프론산, 벤라팍신 HCl, 베라파밀 HCl, 와파린 나트륨, 잘레프론 및 졸피뎀 타르트레이트를 포함한다.
적당한 비강 조성물은, 예를 들어, 비강 스프레이, 항두통약물, 펩티드 약물(호르몬 치료), 마취, 제토제, 진정제, 아젤라스틴 히드로클로라이드, 옥시메타졸린 히드로클로라이드, 페닐에프린 히드로클로라이드, 식염수용액, 모메타손 푸로에이트, 부데소나이드, 이프라트로퓸 브로마이드, 및 크로몰린 나트륨 비강 스프레이를 포함한다.
적당한 눈 조성물은, 예를 들어, 리도카인, 프로파라카인, 테트라카인, 케토롤락 트로메타민 점안 용액, 케토롤락 트로메타민, 나파졸린 오프탈민, 브리모니딘, 아지트로마이신, 베포타스틴 베실레이트, 베세프플록사신, 베탁손, 코솝, 디플루프레데이트, 로테막스, 라니비주맙, 비마토프로스트, 페갑타닙, 오플록사신, 데사메타손, 레보플록사신, 우노프로스톤 이소프로필 옵탈믹 용액, 시클로스포린 옵탈믹 에멀젼, 살라겐, 트라보프로스트 옵탈믹 용액, 발간시클로비르 HCl, 비롭틱, 시도포비르, 베르테포르핀, 비트라세트, 비트라벤, 및 케토티펜 푸마레이트 옵탈믹 용액을 포함한다.
본원에서 설명되는 방법은 임의의 적당한 장비 또는 장치를 사용하여 수행될 수 있고, 이는 수동 또는 자동화될 수 있다. 한 바람직한 양태에서, 본 방법은 시료 조합대, 자동 분사대, 검출 탑, 영상 분석기, CCD 카메라 및 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 포함하는 상업적으로 이용가능한 MILLIFLEX 속성 미생물 검출 시스템(Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts)을 사용하여 수행된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명되는 방법을 사용하여 살아있는 미생물에 대해 스크리닝된 멸균 약제학적 조성물(예를 들어, 백신, 눈 조성물, 비강 조성물, 경구 조성물, 비경구 조성물)이다.
실시예
생성 자리로부터 ATCC 균주 및 환경 균주의 동결-수집물의 생성(표면 또는 생성 개인 접촉 플레이트, 바이오버든( bioburden ) 및 멸균 시험으로부터 오염)
동결건조한 배양물(ATCC 균주)로부터 또는 플레이트(환경 분리물)로부터 직접 생긴 미생물을 액체 Tryptic Soy Broth 또는 고체 배지(예를 들어, Sabouraud Dextrose Agar) 중 하나에서 적당한 시간 기간에 걸쳐 배양하였다. 각 균주의 유전자형 확인을 MicroSeq System, Applied Biosystems을 사용하여 수행하였다. 그 다음에 배양물을 20 내지 30분 동안 800 x G에서 원심분리하였고 펠렛을 보호 배지(15% 글리세린을 함유하는 Oxoid-CM67)에서 재현탁하였다. 배양물을 희석하였고, CFU (콜로니 형성 단위)를 고체 배지 상에서 확인하였고 2ml Nunc CryotubeTM 바이알에 채우고 -80℃에서 저장하였다. 표 1은 사용한 미생물의 완전한 열거를 보여준다.
(표 1)
Figure 112011089966408-pct00001
A. 스트레스 인자 연구
UV-광(240-250μW/cm2), 열(물 욕 중에서 50-70℃) 중의 하나의 적용에 의해 또는 각각 1-10분 동안 비경구 약물 생성물의 일련의 희석으로 미생물을 인큐베이팅함으로써 스트레스를 유발하고, 매 분 알리쿼트를 취하였다. 스트레스를 100 CFU 하의 범위 내에서 시험한 미생물의 유체 현탁액에 직접 적용하였다. 스트레스의 효과를 평판계수 방법 및 OD-측정으로 결정한 CFU의 감소에 의해 모니터링 하였다.
평판계수: 스트레스가 가해진 미생물을 각각의 분의 알리쿼트를 플레이팅 함으로써 다른 효과의 스트레스(1-10분 동안 스트레스가 가해짐, 매 분 알리쿼트를 취함)를 모니터링 하면서 Tryptic Soy Agar에 플레이팅 하였다. 결과를 2-7일 후 카운팅하였다(균주, 예를 들어, E. coli 및 A. niger는 처음 2일 후 카운팅하였고, P. acnes는 인큐베이션의 6일보다 빨리 카운팅할 수 없었다). 처음에 접종된 50% 이상의 CFU의 감소를 야기하기에 충분한 정확한 시간을 측정하였다.
OD-측정 (λ=600 nm): 밤새- 시험한 미생물의 배양물을 우선 스트레스를 가하였고(≥ 50% 감소 연구로 결정한 스트레스 변수를 사용하였다), Tryptic Soy Broth 또는 유동성 티오글리콜레이트 배지(Fluid Thioglycollate Medium)를 접종하였고 (대략 3-4 x 106 CFU/ ml) 8시간 이하의 시간에 걸쳐 분석하였다(알리쿼트를 취하여 각 시간의 광학 밀도를 측정한다). 인큐베이션은 진탕 테이블에서(호기성 균주만) 일어났다. 스트레스가 가해진 배양물을 스트레스가 가해지지 않은 배양물과 비교하였다.
결과 스트레스 인자 연구 50% 감소
22가지 균주 외의 모든 미생물에 대해, 3가지 스트레스-변수를 시험하였다. 처음에 접종한 50% 이상의 CFU의 양의 감소를 유발하는데 필요한 각 스트레스 인자의 정확한 변수(1 내지 10분)를 측정하였다. 시험한 3가지의 스트레스 변수는 UV-광, 열 및 비경구 용도를 위한 비경구 약물 생성물에서 미생물의 인큐베이션이었다. 예를 들어, 열은 세포질막 상의 손상을 야기하며, RNA는 변성되고 이는 일부 세포의 사멸을 유발한다. UV-조사는 돌연변이와 DNA 복제의 중단을 야기한다(M. Strus, Rocz Panstw Zakl Hig ., 48 (3): 263-268 (1997)).
비경구 약물 생성물의 적용은 미생물 세포 내 화학적 스트레스를 유발하며- 비경구 약물 생성물의 항균 특성은 오랜 기간 동안 알려져 왔다. 도 1-3은 모락셀라 오슬로엔시스(Moraxella osloensis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 아시네토박터 이우피(Acinetobacter Iwoffi)에 대해 획득한 데이터의 예를 제공한다. 각각 22가지의 미생물의 균주에 대해, ≥ 50%으로써 처음의 접종을 감소시키는데 필요한 스트레스 변수를 발견하였다.
일부 경우에 변형된 콜로니 형태(콜로니는 느리게 성장하지만, 나중에 정상 콜로니 크기로 되돌아온다)가 관찰되었다. 예를 들어, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)는 콜로니 크기의 감소를 나타내었다[도 4a 및 4b].
속성 멸균 시험의 배양물 배지 평가를 위해, 광범위한 미생물의 사용뿐 아니라, 스트레스가 가해진 상태에서 이들 미생물을 사용하는 것은 중요하다. 비경구 약물 생성물에 의해 유발된 화학적 스트레스 및 UV-광의 적용에 의해 유발된 방사선 스트레스와 같은 일부 스트레스 인자는 접종한 미생물의 양을 심하게 훼손시킨다. 대조적으로, 열 처리는 일부 시험 미생물에서 처음에 감소된 성장 속도를 유발하였다. 열-손상된 세포는 회복되기 위해 3 내지 4시간이 걸리는 것으로 이미 보고되었고- 이것은 이 연구에서 확인하였다(M. Warseck, Appl . Microbiol ., 26: 919-922 (1973)). 열 스트레스는 아포형성 박테리아에 대해 유용하지 않고, 또한 아포형성 박테리아가 스트레스에 대해 큰 저항을 나타내기 때문에 다른 스트레스 변수는 실현가능 하지 않다(P. Setlow, J. Appl . Microbiol . 101 (3): 514-525 Review (2006)). 예를 들어, B. pumilus는 방사선 지시기 박테리아로서 사용된다(J. Wong, PDA J Pharm Sci Technol ., 58(1):6-14 (2004)). 아포형성 박테리아의 경우에, 다른 "스트레스" 인자가 사용되고- 이것들은 영양소 결핍으로써 스트레스가 가해졌고 따라서 높은 아포 함량을 유발하였다.
이후의 양료 배지 평가 및 통계 분석은 Schaedler 혈액 한천이 멸균 시험에서 사용을 위한 최상의 고체 배지이었음을 나타내었다. 20-25℃ 내지 30-35℃에서 호기성 인큐베이션의 차이점을 분석하기 위한 t-테스트는 온도 간 상당한 차이가 있다는 것을 나타내었다. 차이점은 40가지 중 11가지에서 중요하기 때문에, 속성 멸균 시험에서 배양 온도를 둘 다 입증할 필요가 있다.
OD -측정
≥ 50% 감소 연구에서 결정한 스트레스 변수를 시험한 각 균주에 적용하였다. 스트레스를 가한 접종물을 스트레스를 가하지 않은 접종물과 항상 비교하였다. 미생물(초기 접종물로서 대략 3-4 x 106 CFU/ml)을 Tryptic Soy Broth 또는 Fluid Thioglycollate Medium 중에서 배양하였고 30-35℃에서(호기성 균주만) 진탕 테이블 상에서 인큐베이팅하였다. 알리쿼트를 각 시간 동안 취하였고 광학 밀도(λ=600nm)를 측정하였다. 다르게 처리한(미처리, 열처리, 비경구 약물 중에서 희석된 UV-광으로 처리, 50% 감소 실험으로부터 사용된 시간/변수) 접종물에 대해 얻은 데이터는 OD-측정된 데이터의 정상 플롯에서 약간 다른 성장 곡선을 나타내었다[도5].
데이터를 로그로 플롯팅하는 것은[도 6]은 E. coli의 성장 곡선에서 열-처리의 영향을 나타내고 접종물의 양과 독립한 데이터를 만든다. 이것을 정확하게 조절하는 것이 쉽지 않기 때문에, 로그 플롯은 이것을 이점으로 가진다. 박테리아 배양물이 UV-광 또는 비경구 약물 생성물-처리에 의해 스트레스가 가해질 때(50% 감소 실험에서 결정된 변수로) 관찰된 성장에 실질적인 차이점은 없다.
기울기의 비교는(50% 감소 실험에서 결정되는 바와 같은 변수) 열처리만 미생물의 성장 속도에 영향을 미치고 미생물은 실제 스트레스를 나타내었음을 보여주었다. 비경구 약물 생성물("살해 인자(kill factor)"와 "스트레스 인자"가 아닌 것 둘다)에서 UV-광 및 희석을 배양물 배지 평가 동안 사용하지 않았다. 성장 속도에서 스트레스는 직선을 사용하고 기울기를 비교하여 가장 상세하게 나타낸다. 감소되는 성장 기울기는 선택 범위에서 모든 미생물 균주를 나타내었다. 본원에서 예시되는 예는 E. coli , S. aureus , C. albicans 및 B. pumilus이다. E. coli의 경우에, 성장 기울기는 대략 3시간 동안 감소되며, 이 미생물이 소생을 위해 약 3시간을 필요로 한다는 것을 의미한다[도.7].
S. aureus는 4시간의 시간에 걸쳐 감소된 성장 기울기를 나타낸다[도 8].
효모 C. albicans는 훨씬 더 긴 오래가는 스트레스를 나타내었다. 성장 기울기는 8시간 이상 동안 감소된 채로 유지되었고, 밤새 스트레스가 가해진 배양물은 정상 성장 기울기로 되돌아왔다[도.9].
그램양성 아포형성 박테리아에 대해 열 스트레스는 실현가능하지 않다. 다른 스트레스 인자 UV-광 및 비경구 약물 생성물의 희석이 미생물에서 스트레스 효과를 나타내기 때문에, 아포형성 박테리아에 대해 다른 스트레스가 발견되었다. 바실리(bacilli) 및 클로스트리디아(Clostridia)에 대해, 박테리아 현탁액 내 더 높은 아포 함량을 유발하였고 OD-측정을 수행하였다[도 10]. 이 아포형성을 영양소 결핍에 의해 달성하였고, 2-8℃에서 6일 이상 동안 성장시킨 미생물 배양물을 저장하였다.
모든 미생물을 설명한 방식으로 시험하였다. 곤란한 점은 단지 3경우에 관찰되었다. 곰팡이 페니실리움(Penicillium) 및 아스페르길러스(Aspergillus)는 액체 배지에서 균사체로서 성장하며, 따라서 정확한 OD 측정은 가능하지 않다. 데이터를 C. albicans 및 모든 시험 미생물에 대해 이용가능하기 때문에, 페니실리움(Penicillium)과 아스페르길러스(Aspergillus)는 동일한 방식으로 행동한다는 것을 단지 추정할 수 있다. 따라서 시험한 변수를 배양물 배지 평가를 위해 취한다. 다른 경우에, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해(이 균주는 FTM에서 더 양호하게 성장한다), 평판계수에 의해 결정된 ≥ 50% 감소에 대한 변수를 OD-측정 실험에서 재생할 수 없었다. 성장의 시간 지연은 단지 ≥ 50% 감소 실험의 변수와 비교하여 연장된 시간 동안 스트레스가 생략되었을 때 관찰되었다. P. acnes는 더 높은 산소 스트레스에 기인하는 OD-측정에서 다른 결과를 나타낸다. OD-측정에 대해, 알리쿼트를 매 시간 취하였고, P. acnes에 대한 특정 산소 스트레스를 유발하였다. 스트레스 인자 연구의 결과 데이터를 표 2에서 요약한다.
Figure 112011089966408-pct00002
따라서, 스트레스 변수 열 및 영양소 결핍을 배양물 배지 평가에서 사용하였다. 선택한 스트레스 인자는 멸균 약물 생성물의 생성 과정에 가능하게 존재하는 스트레스와 유사하다.
B. 성장 촉진 연구
시험되어야 하는 배양물 배지를 대략 10-100 CFU 양으로 미생물(스트레스를 가한 상태와 스트레스를 가하지 않은 상태)로 접종하였다. 실험을 각 배양 변수에 대해 5가지의 복제물을 사용하여 수행하였다(인큐베이션 변수는 20-25℃ 및 30-35℃ 호기성 인큐베이션 30-35℃ 혐기성 인큐베이션). 결과를 2-7일의 인큐베이션 후 시각적으로 카운팅하였다. 결과 원 데이터(raw data)를 각 미생물에 대해 6개의 군으로 그룹화하였다:
1. 20-25℃ 호기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해진 미생물,
2. 20-25℃ 호기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해지지 않은 미생물,
3. 30-35℃ 호기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해진 미생물,
4. 30-35℃ 호기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해지지 않은 미생물,
5. 30-35℃ 혐기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해진 미생물,
6. 30-35℃ 혐기성 인큐베이션 - 스트레스가 가해지지 않은 미생물.
시험한 양료 배지를 하위 그룹에서 함께 그룹화하였다.
사전선택을 위한 고체 양료 배지의 열거(10가지의 균주로 성장 프로모션 시험, 스트레스를 가하지 않음)
● FTM-A (추가 10g/L 한천을 함유하는 유동성 티오글리콜레이트 배지, 1.075% 한천의 최종 농도를 유발함), Amimed, Allschwil, 스위스
● BHI (뇌심장 침출액 한천), γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● Difco Brewer 혐기성 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● R2A 한천, Oxoid, 영국
● Schaedler 혈액 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● Caso-Agar ICR (Tryptic Soy Agar), γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● Columbia 한천 5% 혈액, BioMerieux, 프랑스
● CDC 혐기성 혈액 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
최종 연구를 위한 고체 양료 배지의 열거(22가지 균주로 성장 프로모션 시험, 스트레스가 가해지지 않은 상태와 스트레스가 가해진 상태)
● Difco Brewer 혐기성 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● Schaedler 혈액 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● Caso-Agar ICR (Tryptic Soy Agar), γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
● CDC 혐기성 혈액 한천, γ-조사됨, heipha, Eppelheim, 독일
모든 γ-조사된 배지를 조사 과정을 지속하기 위한 것에 따라 보충하였다.
양료 배지 평가
양료 배지 평가 연구를 2부분으로 행하였다: 제 1 사전 선택 (10가지의 균주로 성장 촉진, 스트레스를 가하지 않음, 8가지의 한천에서 시험)은 4가지의 배지로 감소를 유발하였고, 이는 단지 이들 배지가 더 밀접한 사항으로 작용되는 것을 의미한다. FTM-A 한천, 뇌심장 침출액 한천, R2A 한천 및 Columbia 한천 5% 혈액을 이 사전선택에서 제외하였다.
양료 배지 평가에서 하기 4가지의 배지를 상세하게 시험하였다: Tryptic Soy 한천, CDC 혐기성 혈액 한천, Schaedler 혈액 한천 및 Difco Brewer 혐가성 한천. 스트레스를 가한 상태와 스트레스를 가하지 않은 상태 둘 다에 접종한 각각 22가지의 균주에 대한 결과 데이터를 그룹화하였고 ANOVA를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 3가지의 인큐베이션 변수 20-25℃ 및 30-35℃ 호기성 인큐베이션 및 30-35℃ 혐기성 인큐베이션 및 각 미생물에 대한 2가지의 다른 스트레스 상태(스트레스가 가해진 상태와 스트레스가 가해지지 않은 상태)는 각 미생물(22가지 균주에 의해 다양화됨)에 대해 6개 군의 형성을 유발한다. 각각의 이들 군의 ANOVA를 수행하였고, 양호한 성장 촉진 특성을 위한 크레디트(credit)를 각 한천에 대한 22가지의 미생물에 대해 요약하였다. 가장 높은 카운트가 달성되면, 1 크레디트가 군/한천에 대해 주어진다. 이 가장 높은 카운트 한천에 대한 유의한 차이가 없는 군/한천이 또한 1 크레디트를 얻었다.
30 크레디트를 얻은 20-25℃ 호기성 인큐베이션-군 Schaedler 혈액 한천에서, CDC Anaerobic 혈액 한천은 크레디트 27, Tryptic Soy Agar은 24를 얻었고 Difco Brewer 혐기성 한천은 17을 얻었다[표 3A 및 3B]. P. acnes 및 Cl . sporogenes는 그것들이 호기적으로 성장하지 않기 때문에 크레디트가 없다. 스트레스가 가해진 A. niger, B. pumilis , B. sphaericus 및 B. idriensis는 모든 시험 한천에서 낮은 카운트 때문에 0 크레디트를 얻었다(0-5 CFU).
(표 3A)
Figure 112011089966408-pct00003
(표 3B)
Figure 112011089966408-pct00004
30-35℃ 호기성 인큐베이션-군에서, Schaedler 혈액 한천은 28 크레디트, CDC 혐기성 혈액 한천 27 크레디트 및 Difco Brewer 혐기성 한천 24 [표 4A 및 4B]를 얻었다. P. acnes 및 Cl . sporogenes는 그것들이 호기적으로 성장하지 않기 때문에 얻은 크레디트가 없다. 스트레스가 가해진 B. idriensis 및 M.osloensis는 낮은 카운트 때문에 0 크레디트를 얻었다(0-5 CFU).
(표 4A)
Figure 112011089966408-pct00005
(표 4B)
Figure 112011089966408-pct00006
30-35℃ 혐기성 인큐베이션 군에서 CDC 혐기성 혈액 한천은 25 크레디트를 얻었고, Tryptic Soy Agar는 21이고 Difco Brewer 혐기성 한천은 17 크레디트를 얻었다[표 5A 및 5B]. 스트레스가 가해진 B. idriensis는 낮은 카운트 때문에 0 크레디트를 얻었다(0-5 CFU).
(표 5A)
Figure 112011089966408-pct00007

(표 5B)
Figure 112011089966408-pct00008
데이터는 Schaedler 혈액 한천이 호기성 조건에 대해 최고의 성장 촉진 특성을 가진다는 것을 보여주며, 혐기성 조건에서 CDC 혐기성 혈액 한천과 동일한 양의 크레디트를 얻었다. 따라서 Schaedler 혈액 한천을 22가지의 시험 균주 및 3개의 시험 인큐베이션 변수에 대해 적당한 한천으로서 선택하였다. Schaedler 혈액 한천 (13) (heipha에 의해 변형됨, Eppelheim, 독일)의 조성물은 다음과 같다: 카제인 펩톤 1Og, 대두분말 펩톤 1g, 고기 펩톤 2g, 고기 추출물 1g, 효모 추출물 5g, 글루코오스 2g, NaCl 5g, 인산수소이칼륨 2.5g, 한천 세균 등급 14g, 양 혈액 50ml, 아미노산, 버퍼, 헤민, 비타민 K, 감마-조사된: 9-2OkGy.
20-25℃ 및 30-35℃에서 호기성 인큐베이션 사이의 차이점
t-테스트를 양료 배지 평가로부터 데이터를 사용하여 수행하여 인큐베이션 온도 20-25℃ 및 30-35℃ (호기성 인큐베이션) 사이에 유의한 차이가 있는지 여부를 나타내었다.
t-테스트를 스트레스가 가해진 상태와 스트레스가 가해지지 않은 상태 둘 다에서 모든 호기성 미생물(Cl . sporugeloes 및 P. acnes은 제외)로 구성되는 40개의 군에서 행하였다. 40개의 군 중 11개의 군에서 유의한 차이가 생겼다. 5회 인큐베이션 변수 30-35℃는 20-25℃ 군과 비교하여 더 높은 양의 콜로니 형성 단위(동일 접종물로부터 유래)를 나타내었다. 20-25℃ 군은 6가지 경우에 더 높은 값을 만들었다. t-테스트는 온도 간에 유의한 차이가 있음을 나타내었다. 40가지 경우 중 11가지에서 차이가 유의했기 때문에 속성 멸균 시험에서 두 배양 온도를 입증하는데 필요하다. 이들 결과는 전통적인 멸균 시험 뿐만 아니라 속성 멸균 시험에서 인큐베이션 온도의 중요성을 나타낸다.
데이터의 통계적 분석
원 데이터의 통계적 분석을 위해, Minitab® Release 14.20 통계 소프트웨어로 시행되는 하기 방법을 사용하였다.
ANOVA (분산 분석)를 평균과 비교한다. 반응 변수와 하나 이상의 독립 변수 사이의(군들 사이의) 관계를 조사하고 모델링하는데 사용하기 때문에, ANOVA는 회귀 분석과 유사하다. 이것은 가설 시험을 사용하며, 귀무가설이 시험되는 것을 의미한다. ANOVA는 p-값을 초래한다. p-값은 제1종 오류를 만들 가능성, 또는 그것이 참일 때 귀무가설을 기각할 가능성을 상징한다. 판정기준치는 0.05이고- 95%의 신뢰한계에 대응하는 p-값이 0.05 이하일 때, 귀무가설은 기각된다.
ANOVA 분석을 사용하기 위한 전제조건은:
- 4개의 하위군의 정상 분포(양료 배지), p-값 ≥ 0.05
- Bartlett's Test을 사용하는 동일 분산에 대한 시험: p-값 ≥ 0.05 및
- Levene's Test: p-값 ≥ 0.05.
ANOVA'S p-값 ≥ 0.05은 하위군/한천 사이에 유의한 차이가 없다는 것을 의미하고, p-값 <0.05은 하위군/한천 사이에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다. 가장 큰 평균 값에 대해 유의차가 없음을 나타낸 모든 한천(가장 큰 평균 값을 가지는 것을 포함)을 1 크레디트로 평가하였다. 가장 큰 평균값에 유의한 차이를 나타낸 한천은 크레디트를 얻지 못했다. 이상점 분석을 Dixon's Test를 사용하여 수행하였다(W. J. Dixon, Ann . Math . Statist ., 21 :488-506 (1950); W. J. Dixon, Biometrics. 9:74-89 (1953); USP <1010> "Analytical data-interpretation and treatment," Pharmacopeial Forum. USP 30-NF through Second Supplement The United States Pharmacopeial Convention , Inc .). 이것에 대해 시험 하 관찰 세트를 포함하는 N 값을 오름차순으로 배열하였다: X1 < X2 <...< XN. 그 다음에 통계 실험의 Q-값(Qexp)을 계산하였다. 이것은 의심 값과 그것의 가장 근접한 값의 차이를 값의 범위로 나눈 것으로 정의되는 비율이다(Q: 기각 몫(rejection quotient)). 따라서, x1 또는 XN (가능한 이상점으로서)을 시험하기 위해 하기 Qexp 값을 사용하였다:
얻은 Qexp 값을 표에서 발견한 임계 Q-값 (Qcrit)과 비교하였다. Qexp > Qcrit이라면, 의심 값은 이상점을 특징으로 할 수 있고, 이는 기각될 수 있다. 그렇지 않다면, 의심 값은 유지되어야하고 모든 이후 계산에서 사용된다. ANOVA를 수행할 수 있는 다른 방법은 하기와 같다: 정상분포를 따르지 않고 다른 하위군보다 상당히 더 낮은 하위군(군 내의 4가지의 양료 배지)은 배제되는데, 그것들이 ANOVA에 부적합하기 때문이다. 군 내부의 하위군의 CFU-값이 너무 낮다면(0-5 CFU), 4회의 최종 결과는 0 크레디트가 주어진다. 모든 다른 경우에, 재시험이 수행되어야 한다. t-테스트(또한 Minitab® Release 14.20 통계 소프트웨어를 사용)를 2가지 샘플의 평균을 비교하기 위해 사용하고; t-테스트를 데이터의 분산에 대해 2가지의 평균 사이의 실제 차이를 비교한다(평균 사이의 차이의 표준 편차로서 표시).
C. Millipore Milliflex ® 속성 미생물 검출 시스템의 일반적 설명
검정 하에서 샘플은(막 상의 미생물의 적합한 분포를 보장하기 위해 100ml의 린스액으로 희석) Mifliflex® PLUS 펌프를 사용하는 Milliflex@ 속성 필터로 여과할 것이고, 가능한 오염물은 필터 막(기공 크기: 0.45㎛)에서 모아질 것이다.
여과 후 필터를 Milliflex® 시스템을 사용하는 고체 양료 배지에 사용할 것이고, 이때 멸균 Milliflex® 필터는 Milliflex® 카세트를 클릭하고 깔대기를 분리한다. 이 Milliflex® 시스템이 양료 배지로 막을 전달하기 때문에, 막 조절을 통해 제2 오염물의 위험이 낮거나 없을 것이다. 카세트가 단단하게 폐쇄되기 때문에 인큐베이션 동안 제2 오염물에 대한 위험은 낮다. Milliflex® 카세트 상의 필터를 인큐베이팅함으로써, 마이크로-콜로니에 대한 잠재적 오염물(들)의 성장이 일어날 수 있다. 인큐베이션 시간의 마지막에, 필터를 Milliflex® 카세트로부터 분리할 것이고, 라미나 플로우 후드 내부의 Autospray Station에 사용된다. 인큐베이션 후 단계들은 제2 오염물에 관한 중요한 단계가 아닌데, 마이크로-콜로니들이 Milliflex® Rapid에서 검출을 위한 특정 크기(대략: 10-100개의 효모 세포, 1000개 박테리아 세포)를 가져야 하기 때문이다. 환경적 또는 오퍼레이터-유래된 미생물이 인큐베이션 후 단계 동안 막에 첨가된다면, 인큐베이션의 부족 및 그에 따른 검출에 필요한 특정 양의 ATP의 부족 때문에 검출되지 않을 것이다.
AutoSpray Station은 ATP 방출 약제를 분사하고 그 후에 생물발광 시약을 막으로 분사한다.
여기에 나타낸 반응 화학은 Milliflex® Rapid 검출을 기반으로 한다(W.D. McElroy, Adv . Enzymol . Relat . Areas . Mol . Biol . 25:119-166 (1963)):
루시페란 + ATP 루시퍼라아제 , Mg 2 + → 옥시루시페린 + AMP + hν (λ=562nm)
(Mg2 +는 마그네슘, ATP는 아데노신 트리포스페이트, AMP는 아데노신 모노포스페이트, hν는 방출된 광자, λ는 파장을 의미한다)
Autospray Station으로부터 Milliflex® Rapid Detection Tower로 분사된 막의 빠른 전달은 방출된 광자의 최대값을 얻기 위해서 필요하다. 가능한 광 신호는 CCD-카메라로 검출되고(전하결합장치) Milliflex®, Rapid 소프트웨어의 알고리즘은 마이크로-콜로니의 양을 계산한다.
Milliflex ® Rapid 검출의 생물발광이 아닌 배경
Schaedler 혈액 한천이 Milliflex® Rapid Microbiology 검출 시스템에서 사용될 것이기 때문에, 이 배지가 생물발광 배경을 야기하는지 여부를 결정하기 위해 시험을 수행하였다. 이를 위해, 배지 카세트를 100ml의 유체 A 또는 유체 D 중 하나로 린스한 MXHVWP 124 막(폴리비닐리덴플루오라이드 막, 기공 크기 0.45μm)으로 인큐베이팅 하였다. 인큐베이션 온도는 30-35℃이었고 5일 동안 인큐베이팅하였다. 도 11은 Schaedler 혈액 한천으로부터 나온 생물발광 배경이 없다는 것을 나타내며, 이는 감마-조사된 양료배지에 방해하는 ATP가 남아있지 않다는 것을 의미한다. Schaedler 혈액 한천은 Milliflex® Rapid System에서 사용에 적당하다.
본원에서 인용되는 모든 문헌의 전체 교시는 본원에서 참고로써 여기에 포함된다.

Claims (21)

  1. a) 여과가능한 약제학적 조성물을 제공하는 단계;
    b) 약제학적 조성물을 여과하여 약제학적 조성물 잔류물이 침전되는 적어도 3개의 필터 막을 제공하는 단계;
    c) 적어도 3개의 필터 막을 고체 배양물 배지에 두어 적어도 3개의 잔류 배양물을 생성하는 단계;
    d) i) 적어도 하나의 잔류 배양물을 20 내지 25℃에서 호기성 조건 하에서 배양하고; ii) 적어도 하나의 잔류 배양물을 30 내지 35℃의 호기성 조건 하에서 배양하고; 및 iii) 적어도 하나의 잔류 배양물을 30 내지 35℃의 혐기성 조건 하에서 배양하는 단계, 단, 잔류 배양물은 13일 이상의 기간 동안 배양되지 않는다; 및
    e) 필터 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니를 검출하는 단계
    를 포함하는 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법으로서,
    여기서, 필터 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니의 존재가 약제학적 조성물의 살아있는 미생물의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물에서 살아있는 미생물을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, b) 약제학적 조성물이 여과된 후 세척 용액을 여과하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 필터 막은 폴리비닐리덴플루오라이드 막, 유리섬유막, 폴리카르보네이트 막, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막, 혼합된 셀룰로오스 에스테르(셀룰로오스 아세테이트 및 셀룰로오스 니트레이트), 포스포셀룰로오스 막, DEAE 막, 나일론 메시 막, 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 막인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 필터 막은 0.45 μm의 기공 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 고체 배양물 배지는 FTM-A (1.075% 한천 (최종 농도)을 함유하는 유동성 티오글리콜레이트 배지), BHI (뇌심장 침출액 한천), Difco brewer 혐기성 한천, R2A 한천, Schaedler 혈액 한천, Caso-한천 ICR (tryptic soy agar), Columbia 한천 5% 혈액, 및 CDC 혐기성 혈액 한천으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, d) 잔류 배양물은 검출가능한 양의 ATP의 생성에 충분한 시간 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 잔류 배양물은 2 내지 7일의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, e) 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니는 발광 분석을 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 발광 분석은 필터 막 상의 살아있는 미생물 세포, 마이크로-콜로니 또는 콜로니에 의해 생성된 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 발광 분석은 루시퍼라아제 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 발광 분석은 미생물에 내인성인 프로브와 핵산 사이에서 형성되는 핵산 혼성화 생성물을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 발광 분석은 퍼옥시다아제 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 발광은 전하결합소자 카메라 및 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 살아있는 미생물 세포, 살아있는 미생물 마이크로-콜로니 또는 살아있는 미생물 콜로니가 열거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 약제학적 조성물은 액체 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 액체 조성물은 비경구 조성물, 경구 조성물, 비강 조성물, 또는 눈 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 액체 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 백신은 안트락스 백신; 결핵 백신; 보렐리아증 백신; 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 백신; 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 백신; 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 백신; 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 및 헤모필러스 인플루엔자 b형 콘쥬게이트 백신; 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드 및 백일해 및 헤모필러스 인플루엔자 b형 콘쥬게이트 및 폴리오바이러스 불활성화 백신; A형 간염 바이러스 백신; A형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스 백신; B형 간염 바이러스 백신; 헬리코박터 파일로리 백신; 헤모필러스 인플루엔자 b형 백신; 인플루엔자 바이러스 백신; 폴리오바이러스 백신; 뇌척수막염균(네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides)) 백신; 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 풍진 바이러스 백신; 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 풍진 바이러스 및 수두 바이러스 백신; 폐구균(스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)) 백신(PNU); 광견병 백신; 호흡기세포융합 바이러스 백신; 천연두 백신; 톡소플라스마증(기생충 톡소포자충(Toxoplasm gondii)) 백신; 장티푸스(살모넬라 티피(Salmonella typhi)) 백신; 결핵(미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 백신 및 수두(치킨팍스, 바리셀라 조스터 바이러스(chickenpox, varicella zoaster virus)) 백신을 포함으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 백신은 조류 인플루엔자 백신 또는 돼지인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
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