JPWO2017006756A1 - 色素測定装置および色素測定方法 - Google Patents

Abstract

この色素測定装置（１）は、３以上の色素により染色された標本Ｏに照明光を照射する照明部（４）と、該照明部（４）により照射された照明光の標本（Ｏ）における透過光を撮影して画像信号を取得する撮像部（５）と、照明部（４）または撮像部（５）に配置され、異なる２以上の波長帯域内にそれぞれ含まれる複数の異なる狭帯域の光を切り替えて生成する狭帯域光生成部（３）と、該狭帯域光生成部（３）により生成された狭帯域の光が撮像部（５）によって撮影されることにより取得された４以上の画像信号を用いて、アンミキシング処理により色素の存在割合を決定する画像処理部（６）とを備えている。

Description

本発明は、色素測定装置および色素測定方法に関するものである。

従来、病理診断を行うために、透過照明を用いたヘマトキシリン＆イオシン（Ｈ＆Ｅ）染色標本の観察が行われている。また、Ｈ＆Ｅ染色だけでは分からない病気のサブ分類を明らかにするために、ＩＨＣ染色でタンパクを染色したり、ＩＳＨ染色で遺伝子を染色したりすることが行われる。さらに、同一の標本から多くの情報を得るために、タンパクを多重染色することも行われている（例えば、特許文献１から特許文献３参照。）。

米国特許第６４０３３３２号明細書 米国特許第６０２５６０１号明細書 特公平７−５００３１号公報

複数の色素を用いて同一の標本に多重染色を行う場合には、色素のスペクトルが重なっているため、標本の分光像を取得して、真の色素の像を取得することが求められる。
しかしながら、通常のモノクロのカメラによって分光像の撮影を行うと、撮影に時間がかかるという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で短時間に標本の分光像を取得して、真の色素の像を得ることができる色素測定装置および色素測定方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、３以上の色素により染色された標本に照明光を照射する照明部と、該照明部により照射された前記照明光の前記標本における透過光を撮影して画像信号を取得する撮像部と、前記照明部または前記撮像部に配置され、異なる２以上の波長帯域内にそれぞれ含まれる複数の異なる狭帯域の光を切り替えて生成する狭帯域光生成部と、該狭帯域光生成部により生成された狭帯域の光が前記撮像部によって撮影されることにより取得された４以上の前記画像信号を用いて、アンミキシング処理により前記色素の存在割合を決定する画像処理部とを備える色素測定装置を提供する。

本態様によれば、３以上の色素により染色された標本に照明部から照明光を照射し、標本における透過光を撮像部において撮影して画像信号を取得し、取得された画像信号を画像処理部において処理することにより、色素の存在割合が決定される。すなわち、狭帯域光生成部が照明部に設けられている場合には、異なる２以上の波長帯域内にそれぞれ含まれる複数の狭帯域の光を狭帯域光生成部において切り替えて生成して標本に照射することにより、４以上の狭帯域の透過光が撮像部により撮影され４以上の画像信号が取得される。

一方、狭帯域光生成部が撮像部に設けられている場合には、２以上の波長帯域を含む広帯域の光を照射することにより得られた透過光から４以上の狭帯域の光を切り出して撮影することにより、４以上の狭帯域の透過光が撮像部により撮影され４以上の画像信号が取得される。
そして、取得された４以上の画像信号に基づけば、アンミキシング処理によって３以上の色素の存在割合を画素毎に決定することができる。これにより、簡易な構成で短時間に標本の分光像を取得して、真の色素の像を得ることができる。

本発明の第２の態様は、３以上の色素により染色された標本に第１照明光を照射する第１照明ステップと、該第１照明ステップにおいて照射された前記第１照明光の前記標本における透過光を撮影して画像信号を取得する第１撮像ステップと、前記標本に第２照明光を照射する第２照明ステップと、該第２照明ステップにおいて照射された前記第２照明光の前記標本における透過光の内、前記第１撮像ステップとは異なる波長の透過光を撮影して前記画像信号を取得する第２撮像ステップと、前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップにおいて取得された４以上の前記画像信号を用いてアンミキシング処理により前記色素の存在割合を決定する画像処理ステップとを含む色素測定方法を提供する。

本態様によれば、第１照明ステップにおいて第１照明光を照射して第１撮像ステップにより第１照明光の標本における透過光が撮影して画像信号が取得され、第２照明ステップにおいて第２照明光を照射して第２撮像ステップにより第２照明光の標本における透過光が撮影して画像信号が取得される。第２撮像ステップにおいて撮影される透過光の波長は第１撮像ステップにおいて撮影される透過光の波長とは異なるので、２回の撮影によって４以上の画像信号を簡易に取得できる。そして、画像処理ステップにおいてアンミキシング処理を行うことにより、簡易に色素の存在割合を画素毎に決定することができる。

上記態様においては、前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップでは、２以上の異なる波長帯域に感度を有するセンサにより透過光を撮影し、前記第１照明光が、各前記波長帯域にそれぞれ含まれる２以上の狭帯域の光を含み、前記第２照明光が、各前記波長帯域にそれぞれ含まれる、前記第１照明光とは波長の異なる１以上の狭帯域の光を含んでいてもよい。

このようにすることで、第１照明ステップにおいて、２以上の狭帯域の光が標本に照射され、第１撮像ステップにおいて、各狭帯域の光の透過光が撮影されて画像信号が生成される。また、第２照明ステップにおいては、第１照明ステップとは異なる１以上の狭帯域の光が標本に照射され、第２撮像ステップにおいて、各狭帯域の光の透過光が撮影されて画像信号が生成される。これにより、２回の撮影によって４以上の画像信号を簡易に取得でき、画像処理ステップにおいて簡易に色素の存在割合を画素毎に決定することができる。

また、上記態様においては、前記第１照明光および前記第２照明光が、合計で４以上の狭帯域の光を含み、前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップでは、２以上の異なる波長帯域に感度を有するセンサにより、撮影する透過光の波長を切り替えて、合計で４以上の狭帯域の光を撮影してもよい。

このようにすることで、合計で４以上の異なる狭帯域の光が第１照明ステップおよび第２照明ステップの２回に分けて標本に照射され、撮影する透過光の波長が切り替えられて２以上の異なる波長帯域に感度を有するセンサにより、合計で４以上の狭帯域の光が撮影される。これにより、２回の撮影によって４以上の画像信号を簡易に取得でき、画像処理ステップにおいて簡易に色素の存在割合を画素毎に決定することができる。

また、上記態様においては、前記画像処理ステップでは、４以上の前記画像信号から分光画像を生成する分光画像生成ステップと、生成された分光画像に基づいて、前記標本の透過光スペクトルを画素毎に生成するスペクトル生成ステップと、生成された透過光スペクトルおよび予め記憶された各色素の吸収スペクトルを用いてアンミキシング処理を行うアンミキシングステップが行われてもよい。

また、上記態様においては、前記画像処理ステップでは、前記分光画像生成ステップにおいて生成された分光画像に基づいて対象領域を選択させる領域選択ステップが行われ、前記スペクトル生成ステップおよび前記アンミキシングステップが、前記領域選択ステップにおいて選択された対象領域について実施されてもよい。

このようにすることで、領域選択ステップにおいて選択された対象領域のみについてスペクトル生成ステップおよびアンミキシングステップが実施され、処理時間が短縮されるとともに、不要な領域の信号をアンミキシング処理に含めることによるノイズの発生を防止することができる。

本発明によれば、簡易な構成で短時間に標本の分光像を取得して、真の色素の像を得ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る色素測定装置を示す全体構成図である。 図１の色素測定装置に備えられるカラー撮像素子の感度特性を示す図である。 図１の色素測定装置に備えられる光源部の照明光強度特性を示す図である。 図１の色素測定装置に備えられる光源部による（ａ）第１照明光、（ｂ）第２照明光の光強度特性を示す図である。 図１の色素測定装置により取得された透過光スペクトルの一例を示す図である。 本発明の一実施形態に係る色素測定方法を示すフローチャートである。 図１の色素測定装置の第１の変形例を示す全体構成図である。 図１の色素測定装置の第２の変形例を示す全体構成図である。

本発明の一実施形態に係る色素測定装置１および色素測定方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る色素測定装置１は、図１に示されるように、標本Ｏを搭載するステージ２と、照明光を発生する光源部（狭帯域光生成部）３と、該光源部３からの照明光をステージ２の下方から標本Ｏに照射する照明光学系（照明部）４と、ステージ２の上方において標本Ｏを透過した光を撮影する撮像光学系（撮像部）５と、該撮像光学系５により取得された画像信号を処理する画像処理部６と、制御部７と、モニタ８とを備えている。

ステージ２は、標本Ｏ、例えば、スライドガラス標本を搭載し、下方の照明光学系４からの光を透過可能な材質または透孔が形成された載置部９と、該載置部９を照明光学系４の光軸Ｓに直交する２方向に移動させるＸＹ駆動機構１０とを備えている。ＸＹ駆動機構１０は、例えば、２対のモータ１１およびボールネジ１２を備える直動機構である。

光源部３は、異なる波長の照明光を射出する６個のＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６と、各ＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６から発せられた照明光を合波するダイクロイックミラー１３とを備えている。
照明光学系４は、光源部３のダイクロイックミラー１３により合波された照明光を集光するカップリングレンズ１４と、該カップリングレンズ１４により集光された照明光を導光する光ファイバ１５と、該光ファイバ１５により導光された照明光を標本Ｏの所定範囲に集光させる集光レンズ１６とを備えている。

撮像光学系５は、標本Ｏを透過した照明光の透過光を標本Ｏの上方において集光する対物レンズ１７と、該対物レンズ１７により集光された透過光を結像させる結像レンズ１８と、該結像レンズ１８により結像された標本Ｏの像を撮影するカラー撮像素子１９とを備えている。

カラー撮像素子１９は、図２に示される感度特性を有している。すなわち、カラー撮像素子１９は、Ｒ、Ｇ、Ｂの波長帯域に相当する光を透過可能なカラーフィルタを各画素に配列してなる、いわゆるベイヤ配列の撮像素子である。Ｒ、Ｇ、Ｂの波長帯域にそれぞれ対応する各カラーフィルタが備えられた画素の信号を別々に取得することにより、標本ＯのＲ画像、Ｇ画像およびＢ画像をそれぞれ取得することができるようになっている。

また、本実施形態においては、光源部３の６個のＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６は、図３に示されるスペクトルを備えている。すなわち、６個のＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６を２個ずつ３組に分け、各組の２個のＬＥＤは、それぞれカラー撮像素子１９のＲ、Ｇ、Ｂの波長帯域内にスペクトルを有している。

制御部７は、光源部３を制御して、６個のＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６を、図４に示されるように、各組から１つずつ選択された３個のＬＥＤが同時に点灯または消灯させられるように動作させる。図４に示される例では、制御部７は、（ａ）に示される波長λ１，λ３，λ５のＬＥＤ２１，２３，２５を同時に点灯させ、その後に（ｂ）に示される波長λ２，λ４，λ６のＬＥＤ２２，２４，２６を同時に点灯させるようになっている。制御部７は、同じＲ、Ｇ、Ｂの波長帯域内の一方のＬＥＤを点灯させるときには，他方のＬＥＤは消灯させるようになっている。

これにより、最初の撮影時には、ＬＥＤ２１，２３，２５が同時に点灯されて、これらのＬＥＤ２１，２３，２５から波長λ１，λ３，λ５の照明光が同時に標本Ｏに照射され、標本Ｏを透過した波長λ１，λ３，λ５の透過光がカラー撮像素子１９によって一度に撮影される。カラー撮像素子１９は、波長λ１，λ３，λ５をそれぞれ１つずつ含むＲ、Ｇ、Ｂの波長帯域の透過光を透過させるカラーフィルタを配列しているので、同種のカラーフィルタが配置された画素の信号を集めることにより、波長λ１，λ３，λ５の３種類の画像信号を同時に分離して取得することができるようになっている。

同様に、次の撮影時には、ＬＥＤ２２，２４，２６が同時に点灯されて、これらのＬＥＤ２２，２４，２６から波長λ２，λ４，λ６の照明光が同時に標本Ｏに照射され、標本Ｏを透過した波長λ２，λ４，λ６の透過光がカラー撮像素子１９によって一度に撮影される。カラー撮像素子１９は、波長λ２，λ４，λ６をそれぞれ１つずつ含むＲ、Ｇ、Ｂの波長帯域の透過光を透過させるカラーフィルタを配列しているので、波長λ２，λ４，λ６の３種類の画像信号を同時に分離して取得することができるようになっている。

画像処理部６は、標本Ｏを染色する色素の吸収スペクトルを記憶している。本実施形態においては、例えば、３つの色素によって標本Ｏが多重染色されており、画像処理部６は３つの色素の吸収スペクトルを記憶している。

また、画像処理部６は、撮像光学系５による２回の撮影により取得された６種類の画像信号に基づいて、標本Ｏの透過光スペクトルを画素毎に生成するようになっている。透過光スペクトルは、図５に示されるように、各画素について取得された６種類の信号の強度を、横軸に波長をとってプロットすることにより簡易に生成することができる。

そして、画像処理部６は、記憶している３つの色素の吸収スペクトルと、生成された標本Ｏの透過光スペクトルとに基づいて、公知のアンミキシング処理を実施し、各色素の存在割合を画素毎に算出するようになっている。
これにより、各色素について存在割合の分布を示す画像を取得することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る色素測定装置１を用いた色素測定方法について以下に説明する。
色素測定に先立って、標準標本をステージ２に載置し、６個のＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６を同時に点灯したときに撮像光学系５により取得された画像のスペクトルに基づいて、各ＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６から発せられる照明光の強度を調節する。これにより、適正な白色照明光を射出できるように各ＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６の強度バランスを設定する。

本実施形態に係る色素測定方法は、図６に示されるように、３つの色素により標本Ｏを染色し（ステップＳ１）、染色された標本Ｏをステージ２に載置し（ステップＳ２）、ＬＥＤ２１，２３，２５を点灯して波長λ１，λ３，λ５の照明光（第１照明光）を標本Ｏに照射し（第１照明ステップＳ３）、標本Ｏを透過した透過光を撮像光学系５により撮影して画像信号を取得する（第１撮像ステップＳ４）。

次いで点灯するＬＥＤをＬＥＤ２２，２４，２６に切り替えて波長、λ２，λ４，λ６の照明光（第２照明光）を標本Ｏに照射し（第２照明ステップＳ５）、標本Ｏを透過した透過光を撮像光学系５により撮影して画像信号を取得する（第２撮像ステップＳ６）。
この後に、取得された６つの画像信号を用いて色素の存在割合を決定する（画像処理ステップ）。具体的には、取得された６個の画像信号を用いて分光画像を生成し（分光画像生成ステップ）、画像処理部６により、生成された分光画像に基づいて透過光スペクトルを画素毎に生成し（スペクトル生成ステップＳ７）、生成された透過光スペクトルと、記憶しておいた色素の吸収スペクトルとに基づいて、アンミキシング処理により色素の存在割合を決定する（アンミキシングステップＳ８）。
これにより、各色素について存在割合の分布を示す画像を取得することができる。

すなわち、本実施形態に係る色素測定装置１および色素測定方法によれば、２回の撮影によって６種類の画像信号を得て、３以上５以下の色素の分布画像を取得することができるという利点がある。その結果、簡易な構成で短時間に標本Ｏの分光像を取得して、真の色素の像を得ることができ、標本Ｏにおける病変のサブ分類を検出することが可能となる。

なお、本実施形態に係る色素測定装置１および色素測定方法においては、Ｒ，Ｇ，Ｂの３つの波長帯域内に２つずつ異なる波長の照明光をＬＥＤの切替によって照射することとしたが、アンミキシング処理により３つの色素の存在割合を測定するには、４以上の異なる波長の照明光を照射すればよい。したがって、例えば、第１照明光として波長λ１，λ３の照明光を照射し、第２照明光として波長λ２，λ４の照明光を照射するというように、２つの波長帯域内の２つの異なる波長の照明光をＬＥＤの切替によって照射することにしてもよい。また、第１照明光として波長λ１，λ３，λ５の照明光を照射し、第２照明光として波長λ２の照明光を照射するというように、合計して４つの異なる波長の照明光を照射することにしてもよい。

また、本実施形態においては、取得された画像の全体について、色素の存在割合を算出することとしたが、これに代えて、取得された画像内の一部の領域を選択させ（領域選択ステップ）、選択された領域についてのみ、透過光スペクトルの生成およびアンミキシング処理を実施することにしてもよい。このようにすることで、処理に要する時間を短縮することができるとともに、色素の存在割合の分布の測定が不要な画素を処理に含めることによるノイズの発生を防止することができるという利点がある。

また、６以上の異なる色素により多重染色された標本Ｏにおける色素の存在割合を測定するには、Ｒ，Ｇ，Ｂの３つの波長帯域内において３以上の異なる波長の照明光を切り替えて発生させることにしてもよい。また、Ｒ，Ｇ，Ｂの３色に、エメラルド色のような他の波長帯域を加えることにより、同時に照明光を射出可能なＬＥＤの数を増やすことにしてもよい。

また、本実施形態においては、ＬＥＤ２１，２２，２３，２４，２５，２６の点灯切替によって、２回の撮影で６色の画像信号を取得することとしたが、これに代えて、図７に示されるように、光源として単一の白色光源２７を採用し、ターレット２８によって切替可能なフィルタ２９を用いて、標本Ｏに照射する照明光の波長を図４（ａ），（ｂ）のように切り替えることにしてもよい。また、図８に示されるように、ターレット２８を撮像光学系５側に配置して、標本Ｏを透過した照明光の内からカラー撮像素子１９によって撮影される透過光の波長を切り替えることにしてもよい。

また、３つの色素Ａ，Ｂ，Ｃの内、２つの色素Ａ，Ｂを異なるタンパクの発現を示すための色素とし、他の１つの色素Ｃを、細胞核を検出するための色素とすることにより、色素Ｃの像によって細胞核の範囲を検出し、色素Ａ，Ｂの像によって、細胞核内に発現しているタンパクの量を測定することができる。これにより、細胞核毎に２種類のタンパクの発現量のクラス判定を行うことができる。

また、アンミキシング処理としては、スペクトルアンミキシング法の他、スペクトルブラインドアンミキシング法を用いることにしてもよい。

１ 色素測定装置
３ 光源部（狭帯域光生成部）
４ 照明光学系（照明部）
５ 撮像光学系（撮像部）
６ 画像処理部
Ｓ３ 第１照明ステップ
Ｓ４ 第１撮像ステップ
Ｓ５ 第２照明ステップ
Ｓ６ 第２撮像ステップ
Ｓ７ スペクトル生成ステップ
Ｓ８ アンミキシングステップ
Ｏ 標本

Claims (6)

1. ３以上の色素により染色された標本に照明光を照射する照明部と、
   該照明部により照射された前記照明光の前記標本における透過光を撮影して画像信号を取得する撮像部と、
   前記照明部または前記撮像部に配置され、異なる２以上の波長帯域内にそれぞれ含まれる複数の異なる狭帯域の光を切り替えて生成する狭帯域光生成部と、
   該狭帯域光生成部により生成された狭帯域の光が前記撮像部によって撮影されることにより取得された４以上の前記画像信号を用いて、アンミキシング処理により前記色素の存在割合を決定する画像処理部とを備える色素測定装置。
2. ３以上の色素により染色された標本に第１照明光を照射する第１照明ステップと、
   該第１照明ステップにおいて照射された前記第１照明光の前記標本における透過光を撮影して画像信号を取得する第１撮像ステップと、
   前記標本に第２照明光を照射する第２照明ステップと、
   該第２照明ステップにおいて照射された前記第２照明光の前記標本における透過光の内、前記第１撮像ステップとは異なる波長の透過光を撮影して前記画像信号を取得する第２撮像ステップと、
   前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップにおいて取得された４以上の前記画像信号を用いてアンミキシング処理により前記色素の存在割合を決定する画像処理ステップとを含む色素測定方法。
3. 前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップでは、２以上の異なる波長帯域に感度を有するセンサにより透過光を撮影し、
   前記第１照明光が、各前記波長帯域にそれぞれ含まれる２以上の狭帯域の光を含み、
   前記第２照明光が、各前記波長帯域にそれぞれ含まれる、前記第１照明光とは波長の異なる１以上の狭帯域の光を含む請求項２に記載の色素測定方法。
4. 前記第１照明光および前記第２照明光が、合計で４以上の狭帯域の光を含み、
   前記第１撮像ステップおよび前記第２撮像ステップでは、２以上の異なる波長帯域に感度を有するセンサにより、撮影する透過光の波長を切り替えて、合計で４以上の狭帯域の光を撮影する請求項２に記載の色素測定方法。
5. 前記画像処理ステップでは、４以上の前記画像信号から分光画像を生成する分光画像生成ステップと、生成された分光画像に基づいて、前記標本の透過光スペクトルを画素毎に生成するスペクトル生成ステップと、生成された透過光スペクトルおよび予め記憶された各色素の吸収スペクトルを用いてアンミキシング処理を行うアンミキシングステップとが行われる請求項２から請求項４のいずれかに記載の色素測定方法。
6. 前記画像処理ステップでは、前記分光画像生成ステップにおいて生成された分光画像に基づいて対象領域を選択させる領域選択ステップが行われ、
   前記スペクトル生成ステップおよび前記アンミキシングステップが、前記領域選択ステップにおいて選択された対象領域について実施される請求項５に記載の色素測定方法。

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