JPWO2015125501A1 - タンパク質凍結保存用保護剤 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の発明は主として上記成果及び考察に基づく。
[1]ヒト由来天然変性タンパク質を含む、タンパク質用の凍結保護剤。
[2]二種類以上のヒト由来天然変性タンパク質を含むことを特徴とする、[1]に記載の凍結保護剤。
[3]前記ヒト由来天然変性タンパク質が、ヒトゲノムの遺伝子産物データベースを母集団として、以下の条件(1)及び(2)で検索して同定されたものである、[1]又は[2]に記載の凍結保護剤:
(1)20アミノ酸残基以上、100アミノ酸残基以下の長さである;
(2)全体にわたって天然変性タンパク質領域である。
[4]前記ヒト由来天然変性タンパク質が、ヒトゲノムの遺伝子産物データベースを母集団として、以下の条件(1)及び(2)で検索して同定されたものである、[1]又は[2]に記載の凍結保護剤:
(1)30アミノ酸残基以上、100アミノ酸残基以下の長さである;
(2)全体にわたって天然変性タンパク質領域である。
[5]前記ヒト由来天然変性タンパク質が、配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列又はその連続した一部分からなる、[1]又は[2]に記載の凍結保護剤。
[6]前記一部分が20アミノ酸残基以上の長さである、[5]に記載の凍結保護剤。
[7]前記一部分が配列番号8、10〜14のいずれかのアミノ酸配列からなる、[5]に記載の凍結保護剤。
[8][1]〜[7]のいずれか一項に記載の凍結保護剤が添加された溶液中にタンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体が存在した状態で凍結又は凍結乾燥するステップを含む、タンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体の保存方法。
[9]前記構造体が細胞又は組織である、[8]に記載の保存方法。
[10][1]〜[7]のいずれか一項に記載の凍結保護剤が共存した状態で保存されているタンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体。
[11]タンパク質と、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の凍結保護剤と、を含有したタンパク質製剤。
[12]前記タンパク質が酵素又は抗体である、[11]に記載のタンパク質製剤。
(1)30アミノ酸残基以上、100アミノ酸残基以下の長さである。
(2)全体にわたって天然変性タンパク質領域である。
ヒトに対する安全性(特に免疫原性)を考慮し、ヒトゲノム中に存在するタンパク質の中から凍結保護活性を有するものを探索するという戦略を採用した。従来技術として知られている凍結保護活性を有するタンパク質には、近年研究の進展が著しい「天然変性タンパク質(IDP)」が含まれていることに着目し、ヒトゲノムに関するデータベースHPRD(Human Protein Reference Database)を母集団として、天然変性タンパク質/領域(ディスオーダータンパク質/領域)を予測するプログラムPOODLE(独立行政法人産業技術総合研究所)を利用して凍結保護物質候補を探索した。得られた1000種類以上の候補の中から、(1)遺伝子産物の配列の長さ、及び(2)天然変性領域の割合、の観点で候補物質を絞り込むことにした。(1)は凍結保護活性(活性を示すためにはある程度の長さが必要と予想される)と取り扱いの容易性等に関係し、(2)は凍結保護活性の高さ(天然変性領域が多い程、より高い活性を示すと予想される)に関係する。尚、具体的な条件として以下の(i)及び(ii)を設定し、両者を満たした遺伝子産物を選択することにした。
(i)その遺伝子産物の配列が50アミノ酸残基より短い。
(ii)タンパク質全体の配列又はドメイン全体の配列であって、前者の場合には、POODLE-Wにおいてprobability scoreが0.6よりも大きい、又はPOODLE-Sにおいて配列長に対する天然変性状態の残基数の割合が60%を超え、後者の場合には、POODLE-Sにおいて配列長に対する天然変性状態の残基数の割合が70%を超える。
Npro融合タンパク質発現系(Nat Methods. 2007 Dec;4(12):1037-43)を利用して5種の候補をそれぞれ調製した。Npro発現系を利用すると、目的タンパク質を封入体(IB)に発現させることができる。従って、長いIDPを分解されることなく大腸菌で生産することができる。また、巻き戻すことにより自動的にタグ部分が切断され、ハイスループット化に適することや、N末端にタグ由来配列がつかないといった利点もある。
凍結保護物質候補2種(E1-IDP、D10-IDP)について配列長を短くし、凍結保護活性の変化を調べた。E1-IDPは25アミノ酸残基まで、D10-IDPは15アミノ酸残基まで配列長を短くした。その結果、20アミノ酸残基までは高い凍結保護活性を保持していたが(D10-20aa、E1-34aa、E1-31aa、E1-28aa、E1-25aa)、15アミノ酸残基まで短くするとBSAと同等の凍結保護活性まで低下した(D10-15aa)。
凍結保護物質候補5種がGSTに対しても凍結保護作用を示すか検討した。実験方法は以下の通りとした。液体窒素による凍結(30秒間)及び水浴による融解(水温20℃、5分間)を5回繰り返した後、GST Gene Fusion System Handbook (Amersham Biosciences)を参考にGST活性を測定した。具体的には、上記の凍結融解処理の際に、GST(0.8 μM)と試料(5〜1000μg/mL、BSAおよびセリシンは5〜2000μg/mL)を混合したGST溶液を用意した。凍結融解未処理の際のGST活性を100%とし、凍結融解処理を繰り返した後のGST活性を求め、その値を凍結保護活性とした。結果を図9及び図10に示す。凍結保護物質候補である5種類のタンパク質(B3-IDP、B4-IDP、C1-IDP、D10-IDP、E1-IDP)全てがBSAと同等またそれ以上の凍結保護作用を示した。一方、セリシンの凍結保護作用は凍結保護物質候補及びBSAよりも弱かった。以上の結果は、LDHを使用した実験の結果とほぼ一致するものであり、同定した凍結保護物質候補がLDH以外の酵素の凍結保護にも有用であることを示す。
凍結保護物質候補の汎用性を更に検証するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体である強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)に対する、凍結保護物質候補E1-IDPの凍結保護活性を調べた。実験方法は以下の通りとした。液体窒素による凍結(1分間)および水浴による融解(水温20℃、5分間)を10回繰り返した後、GFPの蛍光強度を活性指標として測定した。上記の凍結融解処理の際に、GFP(2.4μM)と試料(E1-IDP)を混合したGFP溶液を用意した。凍結融解未処理の際のGFP蛍光強度を100%とし、凍結融解処理を繰り返した後のGFP蛍光強度を求め、その値を凍結保護活性とした。結果を図11に示す。E1-IDPはGFPに対してBSA以上の凍結保護作用を示した。この結果は、酵素に限らず、各種タンパク質に対して凍結保護物質候補が凍結保護活性を発揮することを示唆する。
Claims (12)
- ヒト由来天然変性タンパク質を含む、タンパク質用の凍結保護剤。
- 二種類以上のヒト由来天然変性タンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の凍結保護剤。
- 前記ヒト由来天然変性タンパク質が、ヒトゲノムの遺伝子産物データベースを母集団として、以下の条件(1)及び(2)で検索して同定されたものである、請求項1又は2に記載の凍結保護剤:
(1)20アミノ酸残基以上、100アミノ酸残基以下の長さである;
(2)全体にわたって天然変性タンパク質領域である。 - 前記ヒト由来天然変性タンパク質が、ヒトゲノムの遺伝子産物データベースを母集団として、以下の条件(1)及び(2)で検索して同定されたものである、請求項1又は2に記載の凍結保護剤:
(1)30アミノ酸残基以上、100アミノ酸残基以下の長さである;
(2)全体にわたって天然変性タンパク質領域である。 - 前記ヒト由来天然変性タンパク質が、配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列又はその連続した一部分からなる、請求項1又は2に記載の凍結保護剤。
- 前記一部分が20アミノ酸残基以上の長さである、請求項5に記載の凍結保護剤。
- 前記一部分が配列番号8、10〜14のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項5に記載の凍結保護剤。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の凍結保護剤が添加された溶液中にタンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体が存在した状態で凍結又は凍結乾燥するステップを含む、タンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体の保存方法。
- 前記構造体が細胞又は組織である、請求項8に記載の保存方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の凍結保護剤が共存した状態で保存されているタンパク質又はタンパク質を成分として含む構造体。
- タンパク質と、請求項1〜7のいずれか一項に記載の凍結保護剤と、を含有したタンパク質製剤。
- 前記タンパク質が酵素又は抗体である、請求項11に記載のタンパク質製剤。
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