JPWO2015115509A1 - 多発性硬化症の治療剤又は予防剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、非ステロイド系の低分子化合物を有効成分とする多発性硬化症の治療剤又は予防剤を提供することを目的としている。本発明は、下記に代表されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、多発性硬化症の治療剤又は予防剤を提供する。

Description

本発明は、多発性硬化症の治療剤又は予防剤に関する。

多発性硬化症は、脳、脊髄、視神経等の神経線維を被う髄鞘が破壊される脱髄を特徴とし、再発と寛解を繰り返しながら障害が進行していく疾患である。症状は病変部位によって異なり、視力障害、四肢の麻痺、感覚障害、歩行障害等の多様な神経症状を示すことが知られている（非特許文献１）。

多発性硬化症の治療薬としては、急性期の治療には副腎皮質ホルモン（ステロイド）が使用され、再発の予防にはインターフェロンβ−１ｂ及びインターフェロンβ−１ａが使用されている（非特許文献２）。

また、多発性硬化症では凝固系が亢進しており、トロンビン阻害剤であるヒルジンが多発性硬化症の病態モデルで症状を改善することが知られている（非特許文献３）。

トロンビン阻害活性を有する低分子化合物としては、特許文献１において報告があるが、多発性硬化症に対する有用性については示されておらず、具体的な薬効データは一切記載されていない。

一方、下記一般式で示されるシクロヘキサン誘導体については、鎮痛薬及び神経因性疼痛治療薬（特許文献２）、線維筋痛症治療薬（特許文献３）、蓄尿障害治療薬（特許文献４）、アルツハイマー病治療薬（特許文献５）並びに神経障害性疼痛治療薬（特許文献６）として有効であることが知られている。
［式中、Ａは、置換又は無置換の、１，５−ジアリール−１Ｈ−ピラゾール−３−イル基又は４，５−ジアリールオキサゾール−２−イル基等を表し、Ｒ^４は、フッ素原子又はヒドロキシル基等を表し、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基又はカルボキシル基等を表す。］

国際公開第２０１１／１２６９０３号 国際公開第２０１０／０５０５７７号 国際公開第２０１１／１２５８３６号 国際公開第２０１１／１２５８３８号 国際公開第２０１１／１３６３１８号 国際公開第２０１２／０１５０２７号

荒浪ら、細胞工学、第３０巻、第１０号、２０１１年、ｐ１０６０−１０６３ 吉良ら、「多発性硬化症治療ガイドライン２０１０」、２０１０年、ｐ．１１−１５ Ｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、第４５１巻、２００８年、ｐ．１０７６−１０８１

しかしながら、多発性硬化症の治療及び予防において、ステロイドを使用すれば急性期症状の緩和が認められるが、その効果は一過性であり、長期的な治療が困難である。また、多発性硬化症の再発予防に用いられるインターフェロンβ−１ｂ及びインターフェロンβ−１ａについては、生物学的製剤であるが故に高価な薬剤であるが、すべての患者に対して治療効果が期待できるものではなく、一部の患者に対しては無効であることも知られている（非特許文献１及び２）。

そこで本発明は、非ステロイド系の低分子化合物を有効成分とする多発性硬化症の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩が、多発性硬化症に対して優れた治療効果及び予防効果を有することを見出すに至った。

すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、多発性硬化症の治療剤又は予防剤を提供する。
［式中、Ａは、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又はシアノ基であり、Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立して、水素原子又はフッ素原子であり、Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］

また本発明は、下記の一般式（Ｉ）で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、多発性硬化症の治療剤又は予防剤を提供する。
［式中、Ａは、一般式（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）で表される置換基であり、
Ｒ１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］

上記のシクロヘキサン誘導体は、Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ^５及びＲ^６が、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、Ｒ^７及びＲ^８が、水素原子であることが好ましい。

上記のシクロヘキサン誘導体は、Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、トリフルオロメチル基、メチル基又はメトキシ基であることがより好ましく、Ｒ^３が水素原子であり、Ｒ^４がヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、Ｒ^５及びＲ^６がそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、メトキシ基、ヒドロキシル基又はアセチルオキシ基（一緒になってオキソ基を形成してもよい）であることがさらに好ましい。

本発明の多発性硬化症の治療剤又は予防剤は、多発性硬化症の症状悪化を顕著に抑制でき、多発性硬化症を効果的に治療又は予防できる。

ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおける、神経症状スコアの上昇に対する化合物３の３０ｍｇ／ｋｇでの抑制効果を示す図である。 ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおける、神経症状スコアの上昇に対する化合物３の３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでの抑制効果を示す図である。 プロテオリピド蛋白質誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおける、神経症状スコアの上昇に対する化合物３の抑制効果を示す図である。 トロンビン活性に対する化合物３の作用を示す図である。

本発明の多発性硬化症の治療剤又は予防剤は、下記の一般式（Ｉ）で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴としている。
［式中、Ａは、下記一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又はシアノ基であり、Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立して、水素原子又はフッ素原子であり、Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］

また本発明の多発性硬化症の治療剤又は予防剤は、下記の一般式（Ｉ）で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴としている。
［式中、Ａは、一般式（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）で表される置換基であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］

「炭素数１〜４のアルキル基」とは、炭素数１〜４の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を表し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。

「炭素数１〜４のアルコキシ基」とは、炭素数１〜４の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル−オキシ基を表し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基又はｔｅｒｔ−ブトキシ基が挙げられる。

「炭素数１〜３のハロアルキル基」とは、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基上の水素原子の一部又は全てがハロゲン原子（ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表す）で置換されている基を表し、例えば、モノクロロメチル基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基又はペンタフルオロエチル基が挙げられる。

「炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基」としては、例えば、アセチルオキシ基、エタノイルオキシ基、プロパノイルオキシ基、イソプロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基又はピバロイルオキシ基が挙げられる。

上記の一般式（Ｉ）において、Ａとしては、一般式（ＩＩａ）が好ましく、Ｙとしては、酸素原子が好ましく、Ｚとしては、メチン基が好ましい。

上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^１としては、水素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基又はイソプロピルオキシ基が好ましく、トリフルオロメチル基、メチル基又はメトキシ基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。

上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^２としては、水素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基又はイソプロピルオキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。

上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^３としては、水素原子が好ましく、Ｒ^４としては、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基が好ましく、ヒドロキシル基がより好ましい。

上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^５としては、水素原子、フッ素原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ヒドロキシル基、アセチルオキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基又はイソブタノイルオキシ基が好ましく、水素原子、ヒドロキシル基又はカルボキシル基がより好ましく、ヒドロキシル基がさらに好ましい。

上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^６としては、水素原子、フッ素原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ヒドロキシル基、アセチルオキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基又はイソブタノイルオキシ基が好ましく、水素原子又はヒドロキシル基がより好ましく、水素原子がさらに好ましい。また、Ｒ^５とＲ^６とが一緒になって、オキソ基を形成してもよい。

また、上記の一般式（Ｉ）において、Ｒ^７及びＲ^８としては、水素原子が好ましい。

上記の一般式（Ｉ）で示されるシクロヘキサン誘導体（以下、シクロヘキサン誘導体（Ｉ））のうち、好ましい具体例を表１−１〜表１−４に示すが、これらは本発明を限定するものではない。

なお、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩に不斉炭素が存在する場合には、全ての鏡像異性体及びそれらの混合物が、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩に含まれる。

さらに、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩に立体異性体が存在する場合には、全ての立体異性体及びそれらの混合物が、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩に含まれる。

「薬理学的に許容される塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩若しくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、グルコン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩若しくはケイ皮酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩若しくはアンモニウム塩等の無機塩基塩又はメチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジニウム塩、トリエタノールアミン塩、エチレンジアミン塩若しくはグアニジン塩等の有機塩基塩が挙げられる。さらに、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、水和物又は溶媒和物を形成してもよく、結晶多形もこれに含まれる。

シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、例えば、公知文献（国際公開第２０１０／０５０５７７号）に記載の方法に従って合成することができる。

シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が多発性硬化症の治療又は予防に有効であることは、病態モデルを用いて評価できる。病態モデルとしては、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、第８４巻、ｐ．１２２５−１２３４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、第９巻、ｐ．１２４３−１２５１）が挙げられる。実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルは、実験動物をミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（以下、ＭＯＧ）又はプロテオリピド蛋白質（以下、ＰＬＰ）若しくはそれらの部分ペプチドで免疫することにより、中枢神経系の脱髄による後肢麻痺等の神経障害が惹起される動物モデルである。その症状及び病理所見のヒトへの類似性から、多発性硬化症の治療剤又は予防剤の薬効検討に広く用いられている。多発性硬化症の治療又は予防に対する有効性は、上記の実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルを用いて、例えば、多発性硬化症の特徴的指標である神経症状スコアの低下を指標に評価することができる。

トロンビン活性に対するシクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を用いて評価できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験としては、例えば、トロンビンのプロテアーゼ活性を測定する方法が挙げられる。トロンビンのプロテアーゼ活性を評価する方法としては、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、トロンビンによる基質の切断を測定する方法が挙げられる（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２０巻、第１８号、２０１０年、ｐ．３１７５−３１８２）。

上記の多発性硬化症の治療剤又は予防剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル又はヒト）に対する優れた多発性硬化症の治療及び予防に有用な医薬品として用いることができる。

上記の多発性硬化症の治療剤又は予防剤の投与形態としては、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩を、そのまま又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与することができる。

シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩を含有する製剤を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、また、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤又は坐剤が挙げられる。また、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも有効である。

シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩を含有する上記の剤形の製剤の調製は、製剤分野で一般的に用いられている公知の製造方法に従って行うことができる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を含有させて製造することができる。

シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩を含有する錠剤の調製は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を含有させて行うことができ、丸剤及び顆粒剤の調製は、賦形剤、結合剤、崩壊剤等を含有させて行うことができる。また、散剤及びカプセル剤の調製は賦形剤等を、シロップ剤の調製は甘味剤等を、乳剤又は懸濁剤の調製は、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を含有させて行うことができる。

上記の賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム又は硫酸カルシウムが挙げられる。

上記の結合剤としては、例えば、デンプンのり液、アラビアゴム液、ゼラチン液、トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液又はグリセリンが挙げられる。

上記の崩壊剤としては、例えば、デンプン又は炭酸カルシウムが挙げられる。

上記の滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又は精製タルクが挙げられる。

上記の甘味剤としては、例えば、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン又は単シロップが挙げられる。

上記の界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル又はステアリン酸ポリオキシル４０が挙げられる。

上記の懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース又はベントナイトが挙げられる。

上記の乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン又はポリソルベート８０が挙げられる。

さらに、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩を含有する製剤を上記の剤形に調製する場合には、製剤分野において一般的に用いられる着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を添加することができる。

上記の製剤の１日あたりの投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、例えば、経口投与する場合には成人（体重約６０ｋｇ）であれば１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で、１〜３回に分けて投与することが好ましく、非経口投与する場合には、注射剤であれば体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇの範囲で静脈注射により投与することが好ましい。

上記の多発性硬化症の治療剤又は予防剤は、他の多発性硬化症の治療剤若しくは予防剤、又は、多発性硬化症患者の痙攣、痙縮等の症状に対する治療剤若しくは予防剤と組み合わせて用いても良い。

他の多発性硬化症の治療剤若しくは予防剤としては、例えば、副腎皮質ステロイド（プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン等）、免疫抑制剤（フィンゴリモド、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロフォスファミド、シクロスポリンＡ、タクロリムス、ミゾリビン、レフルノミド等）、インターフェロン製剤（インターフェロンα、インターフェロンβ−１ｂ、インターフェロンβ−１a等）、コポリマーＩ、免疫グロブリン、ミトキサントロン、酢酸グラチラマー、Ｔ細胞レセプターワクチン、接着分子阻害剤、鎮痛剤（インドメタシン、ジクロフェナック等）又は筋弛緩剤（チザニジン、エペリゾン、アフロクァロン、バクロフェン、ジアゼパム、ダントロレンナトリウム等）が挙げられる。

多発性硬化症患者の痙攣、痙縮等の症状に対する治療剤又は予防剤としては、例えば、抗痙攣剤（カルバマゼピン、フェニトイン、クロナゼパム、アミトリプチン等）が挙げられる。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（ＭＯＧ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおけるシクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の３０ｍｇ／ｋｇでの評価）
ＭＯＧ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの神経症状スコアの上昇に対する、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の作用を評価した。マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、８４巻、ｐ．１２２５−１２３４に記載の方法を一部改変して作製した。

４ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＭＯＧの部分合成ペプチド（ＭＯＧ３５−５５；ＣＳ Ｂｉｏ社）を含むＰＢＳ溶液とＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとを等量混合したＭＯＧ３５−５５投与液を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（雄、７週齢）（日本チャールス・リバー株式会社）の側腹部両側の皮内に計０．１ｍＬ（片側０．０５ｍＬ）接種した。さらに、ＭＯＧ３５−５５投与液の接種当日及び２日後に、１μｇ／ｍＬの濃度に調製した百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ社）をマウス腹腔内に２００μＬ投与した。

被験化合物としては、下記の化学式で示される、１−（１−（４−メトキシフェニル）−５−（ｐ−トリル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）シクロヘキサン−シス−１，４−ジオール（以下、化合物３）を用い、公知文献（国際公開第２０１０／０５０５７７号）に記載の方法に従って合成した。

また、下記の化学式で示される比較対照化合物１は、公知文献（国際公開第２００８／１０５３８３号）に記載の参考例９９（Ｎ−Ｂｏｃ保護体）を、トリフルオロ酢酸等を用いて脱Ｂｏｃ化することによって合成し、下記の化学式で示される比較対照化合物２は、公知文献（国際公開第２０１０／０５０５７７号）に記載の比較例２の合成方法に基づいて合成した。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種３日前から１６日間連日、マウスに化合物３を３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。なお、化合物３は、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。マウスに化合物３を投与した群を、化合物３投与群とした。溶媒投与群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種１３日後に神経症状スコアをスコアリング（０：正常、１：尻尾弛緩又は後肢衰弱、２：尻尾弛緩及び後肢衰弱、３：後肢部分麻痺、４：後肢完全麻痺、５：瀕死状態）した。スコアリング方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ、２０００年、ｐ．１５．１．１−１５．１．２０）に記載された方法を用いた。

結果を図１に示す。縦軸は神経症状スコア（平均値±標準誤差、ｎ＝１０）を示す。横軸の「溶媒」は、ＭＯＧ３５−５５投与液を接種したマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒投与群）を示し、「化合物３」は、ＭＯＧ３５−５５投与液を接種したマウスに化合物３を３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した群（化合物３投与群）を示す。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種により、溶媒投与群の神経症状スコアは２．８まで上昇した。これに対し、化合物３投与群は神経症状スコアの上昇を著しく抑制した。化合物３による神経症状悪化の抑制率は８５．７％であった。

また、比較対照化合物１及び比較対照化合物２についても同様に評価した。すなわち、ＭＯＧ３５−５５投与液の接種３日前から１６日間連日、マウスに０．５％メチルセルロース溶液に懸濁した比較対照化合物１又は比較対照化合物２を３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与し、ＭＯＧ３５−５５投与液の接種１３日後に神経症状スコアをスコアリングした。比較対照化合物１及び比較対照化合物２による神経症状悪化の抑制率は、それぞれ３．３％及び６．５％であった。

この結果から、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、多発性硬化症に対して著しい神経症状抑制効果を示すことが明らかとなった。

（ＭＯＧ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおけるシクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでの評価）
ＭＯＧ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの神経症状スコアの上昇に対する、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の作用を評価した。

４ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＭＯＧの部分合成ペプチド（ＭＯＧ３５−５５；ＣＳ Ｂｉｏ社）を含むＰＢＳ溶液とＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとを等量混合したＭＯＧ３５−５５投与液を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（雄、１０週齢）（日本チャールス・リバー株式会社）の側腹部両側の皮内に計０．１ｍＬ（片側０．０５ｍＬ）接種した。さらに、ＭＯＧ３５−５５投与液の接種当日及び２日後に、１μｇ／ｍＬの濃度に調製した百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ社）をマウス腹腔内に２００μＬ投与した。被験化合物としては、化合物３を用いた。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種２日後から１２日間連日、マウスに化合物３を、それぞれ３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。なお、化合物３は、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。マウスに化合物３を投与した群を、化合物３投与群とした。溶媒投与群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種１４日後に神経症状スコアをスコアリング（０：正常、１：尻尾弛緩又は後肢衰弱、２：尻尾弛緩及び後肢衰弱、３：後肢部分麻痺、４：後肢完全麻痺、５：瀕死状態）した。スコアリング方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ、２０００年、ｐ．１５．１．１−１５．１．２０）に記載された方法を用いた。

結果を図２に示す。縦軸は神経症状スコア（平均値±標準誤差、ｎ＝８）を示す。横軸の「溶媒」は、ＭＯＧ３５−５５投与液を接種したマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒投与群）を示し、「化合物３」は、ＭＯＧ３５−５５投与液を接種したマウスに化合物３を３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した群（化合物３投与群）を示す。

ＭＯＧ３５−５５投与液の接種により、溶媒投与群の神経症状スコアは１．３まで上昇した。これに対し、化合物３の３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与により神経症状スコアの上昇は著しく抑制され、神経症状悪化の抑制率は、それぞれ５３．８％及び６１．５％であった。

この結果から、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、３ｍｇ／ｋｇの用量から、多発性硬化症に対して著しい神経症状抑制効果を示すことが明らかとなった。

（ＰＬＰ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおけるシクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の評価）
ＰＬＰ誘発マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの神経症状スコアの上昇に対する、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の作用を評価した。マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、第９巻、ｐ．１２４３−１２５１に記載の方法を一部改変して作製した。

２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＰＬＰの部分合成ペプチド（ＰＬＰ１３９−１５１；国産化学社）を含むＰＢＳ溶液とＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとを等量混合したＰＬＰ１３９−１５１投与液を、ＳＪＬ系マウス（雌、６週齢）（日本チャールス・リバー株式会社）の側腹部両側の皮内に計０．１ｍＬ（片側０．０５ｍＬ）接種した。さらに、ＰＬＰ１３９−１５１投与液の接種当日及び２日後に、１μｇ／ｍＬの濃度に調製した百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ社）をマウス腹腔内に２００μＬ投与した。被験化合物としては、化合物３を用いた。

ＰＬＰ１３９−１５１投与液の接種２日後から７日間連日、マウスに化合物３を１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した。なお、化合物３は、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。マウスに化合物３を投与した群を、化合物３投与群とした。溶媒投与群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。

ＰＬＰ１３９−１５１投与液の接種９日後に神経症状スコアをスコアリング（０：正常、１：尻尾弛緩又は後肢衰弱、２：尻尾弛緩及び後肢衰弱、３：後肢部分麻痺、４：後肢完全麻痺、５：瀕死状態）した。スコアリング方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ、２０００年、ｐ．１５．１．１−１５．１．２０）に記載された方法を用いた。

結果を図３に示す。縦軸は神経症状スコア（平均値±標準誤差、ｎ＝８）を示す。横軸の「溶媒」は、ＰＬＰ１３９−１５１投与液を接種したマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒投与群）を示し、「化合物３」は、ＰＬＰ１３９−１５１投与液を接種したマウスに化合物３を１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与した群（化合物３投与群）を示す。

ＰＬＰ１３９−１５１投与液の接種により、溶媒投与群の神経症状スコアは１．１まで上昇した。これに対し、化合物３投与群は神経症状スコアの上昇を著しく抑制した。化合物３による神経症状悪化の抑制率は６６．４％であった。

この結果から、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、多発性硬化症に対して著しい神経症状抑制効果を示すことが明らかとなった。

（トロンビン活性に対する効果）
トロンビン活性に対する、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩の作用を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用したＡｎａｓｐｅｃ社のＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標） ５２０トロンビン活性アッセイキットを用いて評価した。

被験化合物はジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）に溶解した後、キット添付のアッセイバッファーでＤＭＳＯ最終濃度が０．５〜１％となるように希釈して使用した。３８４ウェル黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の各ウェルに、被験化合物（最終濃度０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ）、及び、アッセイバッファーで希釈したトロンビン（最終濃度３００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１０分間インキュベーションした。なお、トロンビン非添加かつ被験化合物非添加、及び、トロンビン添加かつ被験化合物非添加のウェルを設けた。さらに、アッセイバッファーで希釈した５−ＦＡＭ／ＱＸＬ ５２０トロンビン基質（最終濃度３００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して、室温で２時間インキュベーションした後、４８５ｎｍで励起したときの５２０ｎｍの蛍光値を測定した。

被験化合物としては、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩に含まれる化合物３を用いた。また、陽性対照として選択的トロンビン阻害剤であるＡｒｇａｔｒｏｂａｎを用いた。

トロンビン活性阻害率（％）を下式１から算出し、シグモイド曲線（可変勾配）に回帰して、被験化合物のトロンビン活性阻害のＩＣ５０値を算出した。
トロンビン活性阻害率（％）＝（１−（（トロンビン添加かつ被験化合物添加時の蛍光値）−（トロンビン非添加時かつ被験化合物非添加の蛍光値））／（（トロンビン添加かつ被験化合物非添加時の蛍光値）−（トロンビン非添加時かつ被験化合物非添加の蛍光値）））×１００ ・・・式１

結果を図４に示す。縦軸はトロンビン活性阻害率（％）（平均値±標準誤差、ｎ＝４）を示す。横軸は被験化合物濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。

その結果、ＡｒｇａｔｒｏｂａｎのＩＣ５０値が３．０ｎｍｏｌ／Ｌであるのに対し、化合物３の最大濃度である３０μｍｏｌ／Ｌにおけるトロンビン活性阻害率は１７．２％であった。

この結果から、シクロヘキサン誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が、トロンビン活性を阻害しないことが明らかとなった。

本発明のシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、多発性硬化症の症状悪化を顕著に抑制することから、多発性硬化症の治療剤又は予防剤として利用できる。

Claims (6)

1. 一般式（Ｉ）
   ［式中、Ａは、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、
   Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又はシアノ基であり、
   Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、
   Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、
   Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立して、水素原子又はフッ素原子であり、
   Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、
   Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］
   で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、多発性硬化症の治療剤又は予防剤。
2. 一般式（Ｉ）
   ［式中、Ａは、一般式（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）で表される置換基であり、
   Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、塩素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
   Ｒ^３は、水素原子又は塩素原子であり、Ｒ^４は、フッ素原子、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基であり、
   Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、炭素数１〜３のハロアルキル基、カルボキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよく、
   Ｙは、酸素原子又は硫黄原子であり、
   Ｚは、窒素原子又はメチン基である。］
   で示されるシクロヘキサン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、多発性硬化症の治療剤又は予防剤。
3. Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、トリフルオロメチル基、メチル基又はメトキシ基である、請求項１又は２記載の多発性硬化症の治療剤又は予防剤。
4. Ｒ^３は、水素原子である、請求項１〜３のいずれか一項記載の多発性硬化症の治療剤又は予防剤。
5. Ｒ^４は、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシル基である、請求項１〜４のいずれか一項記載の多発性硬化症の治療剤又は予防剤。
6. Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、メトキシ基、ヒドロキシル基又はアセチルオキシ基であるか、一緒になってオキソ基を形成してもよい、請求項１〜５のいずれか一項記載の多発性硬化症の治療剤又は予防剤。