JPWO2015098963A1 - カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド - Google Patents
カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2015098963A1 JPWO2015098963A1 JP2015554956A JP2015554956A JPWO2015098963A1 JP WO2015098963 A1 JPWO2015098963 A1 JP WO2015098963A1 JP 2015554956 A JP2015554956 A JP 2015554956A JP 2015554956 A JP2015554956 A JP 2015554956A JP WO2015098963 A1 JPWO2015098963 A1 JP WO2015098963A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- calreticulin
- peptide
- expression
- promoting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 354
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 title claims abstract description 282
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 title claims abstract description 281
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 222
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 77
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 187
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 52
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 49
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 39
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 36
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 13
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 13
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 13
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 10
- 102100028624 Cytoskeleton-associated protein 5 Human genes 0.000 description 9
- 101710087041 Cytoskeleton-associated protein 5 Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000020347 spindle assembly Effects 0.000 description 9
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 8
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 8
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102100036180 Centrosomal protein of 164 kDa Human genes 0.000 description 7
- 101710131445 Centrosomal protein of 164 kDa Proteins 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001112162 Homo sapiens Kinetochore protein NDC80 homolog Proteins 0.000 description 6
- 102100039872 Inner centromere protein Human genes 0.000 description 6
- 101710162819 Inner centromere protein Proteins 0.000 description 6
- 102100027629 Kinesin-like protein KIF11 Human genes 0.000 description 6
- 102100023890 Kinetochore protein NDC80 homolog Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100024486 Borealin Human genes 0.000 description 5
- 101710168078 Borealin Proteins 0.000 description 5
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 5
- 229940126553 FtsZ inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 108010089704 Lim Kinases Proteins 0.000 description 5
- 102000008020 Lim Kinases Human genes 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- NGZXDRGWBULKFA-NSOVKSMOSA-N (+)-Bebeerine Chemical compound C([C@@H]1N(C)CCC=2C=C(C(=C(OC3=CC=C(C=C3)C[C@H]3C=4C=C(C(=CC=4CCN3C)OC)O3)C=21)O)OC)C1=CC=C(O)C3=C1 NGZXDRGWBULKFA-NSOVKSMOSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003793 centrosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 2
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710085988 Centrin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037631 Centrin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000880516 Homo sapiens Centrin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 102000018709 Valosin Containing Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010027273 Valosin Containing Protein Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000043427 human CETN2 Human genes 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- -1 t-butyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710104982 Cell division control protein 48 Proteins 0.000 description 1
- 102100037620 Centrin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710085985 Centrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710085980 Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 230000020172 G2/M transition checkpoint Effects 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000040104 IAP family Human genes 0.000 description 1
- 108091069885 IAP family Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- 101710188942 Kinetochore protein ndc80 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108010005705 Ubiquitinated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 108010068032 caltractin Proteins 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091067839 centrin family Proteins 0.000 description 1
- 102000039636 centrin family Human genes 0.000 description 1
- 230000017225 centriole replication Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000037449 immunogenic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000008155 medical solution Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000008880 microtubule cytoskeleton organization Effects 0.000 description 1
- 230000029115 microtubule polymerization Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000012106 negative regulation of microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000012409 spindle disassembly Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
なお、本出願は2013年12月26日に出願された日本国特許出願2013−270470号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
また、近年、カルレティキュリンは、ER内腔以外に、細胞質、細胞表面、細胞外分画等に存在し、細胞接着、細胞の走化性、細胞増殖、獲得免疫における抗原提示といった種々の重要な生物学的過程に関与していることが明らかになってきた(非特許文献1)。例えば、がん細胞や病原体に感染した細胞といったいわゆる異常な細胞において、カルレティキュリンは免疫原性の細胞死を起こす際に該細胞の表面(典型的には細胞膜上)に免疫賦活性タンパク質(いわゆるイートミーシグナル、eat-me signal)として発現促進されることが、非特許文献2、3に報告されている。
また、ER以外の場所(例えば、細胞表面や細胞外)の存在するカルレティキュリンの発現が種々の疾患に関連することが明らかになりつつある。例えば、萎縮性筋硬化症(amyotrophic lateral sclerosis;ALS)、拡張型心筋症、アルツハイマー病および種々の免疫疾患(例えば、炎症性腸疾患やリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーテス等)とER外カルレティキュリンの発現との関係が報告されている(非特許文献1、4、5)。
しかしながら、従来、カルレティキュリンの発現を簡便且つ高効率に促進するする方法、薬剤類は存在しなかった。そこで本発明は、少なくとも一種の真核生物においてカルレティキュリンの発現を促進する方法と、該方法に用いる合成ペプチドを提供することを目的として創出された発明である。さらに、そのようなペプチドを有効成分として含む組成物(薬学的組成物)の提供を他の目的とする。
また、本発明者は、原核生物である細菌に存在し、細菌の細胞分裂に関与するZリングと呼ばれるタンパク質集合体を構成するタンパク質であるフィラメント状温度感受性変異株Z(Filamenting temperature-sensitive mutant Z:FtsZ)タンパク質、或いは、該FtsZタンパク質のC末端側に結合してFtsZタンパク質を細胞膜に繋ぎ止めるアンカーとして機能することが知られているフィラメント状温度感受性変異株A(Filamenting temperature-sensitive mutant A:FtsA)タンパク質の活性(即ち、FtsZタンパク質のGTPアーゼ活性またはFtsAタンパク質のATPアーゼ活性)を阻害するペプチドとして、一般的なファージディスプレー法を採用して単離された幾つかのペプチド(即ちFtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能し得るペプチド)にも着目した。そして、上記FtsZインヒビターまたはFtsAインヒビターとして機能し得るペプチドを含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することも見出した。
また、本発明者は細胞分裂に関連するタンパク質(以後、細胞分裂関連タンパク質ともいう)にも着目した。そして、細胞分裂関連タンパク質の一部のアミノ酸配列、具体的には微小管(詳しくはチューブリン)に結合するタンパク質(microtubule-associated proteins;MAP)の一種であるタウタンパク質(τ protein) の一部のアミノ酸配列、より具体的にはタウタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、タウタンパク質と微小管(チューブリン)との結合に関与する領域のアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列、を含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することも見出した。
さらに、本発明者は、アミロイド前駆体タンパク質(Amyloid Precursor Protein:APP)中のシグナルペプチドにも着目したところ、当該APPのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列を含むように構築した合成ペプチドもまた、カルレティキュリン発現促進活性を有することを見出した。
以上の知見より、本発明者は本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、そのようなペプチドとして、配列番号6〜74のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個、又は2個、又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドを提供する。
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、上記の細胞(腫瘍細胞、幹細胞、神経系細胞)、なかでも、ヒト由来の当該細胞に対して高いカルレティキュリン発現促進活性を奏する。このような合成ペプチドは、医療産業上の利用価値が極めて高い。
このような膜透過性ペプチドを有する上記カルレティキュリン発現促進ペプチドは、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列を高効率に細胞内(細胞膜及び/又は核膜の内側)に移入することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。
KKRTLRKNDRKKR(配列番号1);
を有する。
配列番号1としてここで開示されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、対象細胞のカルレティキュリンの発現を高効率に促進することができる。
このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱い性に優れるため、本発明の実施に特に好適に用いることができる。
従って、かかる態様のペプチドによると、細胞膜上のカルレティキュリン存在量の増大によって、免疫細胞に認識されるeat-me signalとしての作用を向上させることができる。或いはまた、該カルレティキュリンを目印としたカルレティキュリン高発現細胞の分別を実現することができる。
また、典型的には、上記カルレティキュリン発現促進剤は、薬学上許容され得る少なくとも1種の担体(例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも1種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体)を含む。
かかるカルレティキュリン発現促進剤は、単純な構造(直鎖状のペプチド鎖)の合成ペプチドを有効成分として含むため、例えば、対象の細胞(典型的には当該細胞培養物の培地中)に該カルレティキュリン発現促進剤を供給するという簡易な処理を行うことによって、対象細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進することができる。特に、ここに開示されるカルレティキュリン発現促進剤によると、種々の腫瘍細胞、幹細胞および神経系細胞(例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト)、なかでもゲノム不安定な細胞(所謂、異常細胞)におけるカルレティキュリン発現を効果的に促進し得る。また、化学合成(若しくは生合成)によって容易に人為的に製造され得る合成ペプチドを有効成分として含むため、所望量のカルレティキュリン発現促進剤を容易に調製することができる。
かかるインビトロにおけるカルレティキュリン発現促進方法によると、対象細胞(典型的には当該細胞培養物の培地中)に上記のとおり単純な構成の合成ペプチドを供給するという簡易な手法によって、対象細胞におけるカルレティキュリンの発現を促進することができる。特に、種々の腫瘍細胞、幹細胞および神経系細胞(例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト)、なかでもゲノム不安定な細胞(所謂、異常細胞)に対してカルレティキュリンの発現を促進し得る。
従って、本発明によると、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド(即ちカルレティキュリン発現促進剤)を用いてカルレティキュリンを高発現する細胞を含む細胞培養物を製造することができる。換言すれば、本発明は、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進方法を包含することを特徴とする、カルレティキュリン高発現細胞を含む細胞培養物の製造方法を提供する。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね100以下(好ましくは60以下、例えば50以下)のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
本明細書において「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」とは、胎盤などの胚体外組織を除く、一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化することが可能な能力を有し、さらに、未分化状態で自己複製能を有する幹細胞をいう。本明細書において、多能性幹細胞は、ES細胞、iPS細胞、EG細胞であり得るが、上記の能力を有している限り、それらに限定されない。
具体的には、配列番号6、7に示すアミノ酸配列は、それぞれ、ヒトのセントリン2(centrin2)タンパク質のsiRNA関連配列である、合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでセントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、紡錘体形成に重要な役割を担うタンパク質である。また、セントリン2とは、セントリンファミリー(典型的には、セントリン1、セントリン2、セントリン3等)に属するタンパク質のうちの一つである。
配列番号8に示すアミノ酸配列は、細胞骨格関連タンパク質5(Cytoskeleton-associated protein 5;CKAP5)、或いは、大腸及び肝臓癌過剰発現遺伝子タンパク質(Colonic and hepatic tumor overexpressed gene protein;CH−TOG)とも呼ばれるタンパク質のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。ここでCKAP5とは、微小管のプラス端に結合し、微小管の動態および微小管形成等を制御するタンパク質である。また、細胞質微小管の伸長および核形成等を促進するタンパク質であり、紡錘極形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号9に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号10に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号11に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号12に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号13に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号14に示すアミノ酸配列は、CKAP5のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号15に示すアミノ酸配列は、中心体タンパク質164(Centrosomal protein of 164 kDa;CEP164)のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでCEP164とは、微小管形成や一次シリア(一次繊毛)の構造の維持等に関与するタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。また、G2/Mチェックポイントや核分裂、染色体分離においても主要な役割を担うタンパク質である。
配列番号16に示すアミノ酸配列は、CEP164のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号17に示すアミノ酸配列は、CEP164のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号18に示すアミノ酸配列は、CEP164のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号19に示すアミノ酸配列は、動原体タンパク質NDC80(kinetochore protein NDC80、NDC80ともいう)のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでNDC80とは、外部キネトコアプレートにおける安定した微小管結合サイトの形成や動原体の保全等に関与するタンパク質であり、紡錘体の形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号20に示すアミノ酸配列は、NDC80のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号21に示すアミノ酸配列は、NDC80のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号22に示すアミノ酸配列は、NDC80のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号23に示すアミノ酸配列は、細胞分裂制御タンパク質48(Cell devision control protein ;CDC48)のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでCDC48とは、紡錘体の分解やユビキチン化タンパク質の分解等に関与するタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号24に示すアミノ酸配列は、中心体内部タンパク質(Inner centromere protein;INCENP)のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでINCENPとは、染色体パッセンジャー複合体(chromosomal passenger complex;CPC)を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号25に示すアミノ酸配列は、INCENPのsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号26に示すアミノ酸配列は、INCENPのsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号27に示すアミノ酸配列は、INCENPのsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号28に示すアミノ酸配列は、アポトーシス阻害タンパク質ファミリータンパク質(inhibition of apoptosis family protein;IAP family protein)に属するサバイビン(Survivin)(或いは、バキュロウイルスのIAP繰り返し配列含有タンパク質5(Baculoviral IAP repeat containing protein 5;BIRC5)ともいう)のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでBRIC5とは、染色体パッセンジャー複合体(chromosomal passenger complex;CPC)を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号29に示すアミノ酸配列は、BIRC5のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号30に示すアミノ酸配列は、BIRC5のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号31に示すアミノ酸配列は、BIRC5のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号32に示すアミノ酸配列は、BIRC5のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号33に示すアミノ酸配列は、BIRC5のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号34に示すアミノ酸配列は、微小管関連タンパク質215(Microtube-associated protein 215;MAP215)のsiRNA関連配列である合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでMAP215とは、微小管(詳しくはチューブリン)に結合するタンパク質(microtubule-associated proteins;MAP)の一種であり、微小管の安定化や微小管の重合等に関与し、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号35に示すアミノ酸配列は、MAP215のsiRNA関連配列である合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号36に示すアミノ酸配列は、MAP215のsiRNA関連配列である合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号37に示すアミノ酸配列は、カイネシン関連モータータンパク質であるEG5のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでEG5とは、双極紡錘体の形成等に関わるタンパク質であり、紡錘体形成において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号38に示すアミノ酸配列は、EG5のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号39に示すアミノ酸配列は、EG5のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号40に示すアミノ酸配列は、EG5のsiRNA関連配列である合計8アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号41に示すアミノ酸配列は、EG5のsiRNA関連配列である合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号42に示すアミノ酸配列は、細胞分裂周期関連タンパク質8(Cell division cycle-associated protein 8;CDCA8)のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。ここでCDCA8とは、染色体パッセンジャー複合体(chromosomal passenger complex;CPC)を構成するタンパク質の一つであり、微小管の安定化や紡錘体の構築等において重要な役割を担うタンパク質である。
配列番号43に示すアミノ酸配列は、CDCA8のsiRNA関連配列である合計5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号44に示すアミノ酸配列は、CDCA8のsiRNA関連配列である合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
具体的には、配列番号45〜54に示すアミノ酸配列は、FtsZインヒビター或いはFtsAインヒビターとして機能する、合計12アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
また、配列番号55〜66に示すアミノ酸配列は、FtsZインヒビター或いはFtsAインヒビターとして機能する、合計9アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
具体的には、配列番号67に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計15アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号68に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計7アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号69に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号70に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計11アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号71に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計11アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号72に示すアミノ酸配列は、タウタンパク質の一部のアミノ酸配列である、合計6アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
具体的には、配列番号73に示すアミノ酸配列は、マウス由来のAPPのシグナルペプチドを構成する合計17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
配列番号74に示すアミノ酸配列は、ヒト由来のAPPのシグナルペプチドを構成する合計17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
上記膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び/又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、例えばNoLS(核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal)に関連するアミノ酸配列(改変アミノ酸配列を含む)がカルレティキュリン発現促進ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。例えば、配列番号1に示すLIMキナーゼ2(LIM Kinase 2)に含まれるNoLS並びに配列番号2に示すIBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれるNoLSのアミノ酸配列が挙げられる。また、他の膜透過性ペプチド配列の例として、配列番号3〜5に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列(膜透過性を保持しているものに限られる)が挙げられる。配列番号3は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス:Human Immunodeficiency Virus)のTATに含まれる膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列を示している。配列番号4は、上記TATを改変した膜透過性ペプチド配列(PTD4)のアミノ酸配列を示している。配列番号5は、ショウジョウバエ(Drosophila)の変異体であるAntennapediaのANT関連アミノ酸配列を示している。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
なお、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されてもよい。アミノ酸残基(典型的にはペプチド鎖のC末端アミノ酸残基)のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性(例えばプロテアーゼ耐性)を向上させることができる。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にカルレティキュリン発現促進ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション(立体構造)については、使用する環境下(生体外若しくは生体内)でカルレティキュリン発現促進活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、本発明に適用するカルレティキュリン発現促進ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量(典型的には60以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下のアミノ酸残基数)のものが好適である。
なお、本発明のカルレティキュリン発現促進ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がL型アミノ酸であるものが好ましいが、カルレティキュリン発現促進活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がD型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドは、市販のペプチド合成機(例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。)を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のカルレティキュリン発現促進ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ちカルレティキュリン発現促進ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ(生体外、in vitro)合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の(株)セルフリーサイエンスから入手可能なWheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、カルレティキュリン発現促進ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
カルレティキュリン発現促進剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS、即ちリン酸緩衝生理食塩水)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、カルレティキュリン発現促進ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の薬剤(組成物)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴づけるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
例えば、インビトロで培養(継代)している細胞(典型的には培養細胞)対し、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進剤(即ち、カルレティキュリン発現促進ペプチド)の適当量を、培養過程のいずれかの段階(好ましくは培養開始と同時若しくは培養開始後の早い段階)で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、対象細胞の種類や状態、細胞密度(培養開始時の細胞密度)、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のペプチド濃度が概ね0.1μM〜100μMの範囲内、好ましくは0.1μM〜50μMの範囲内、より好ましくは0.5μM〜20μM(例えば1μM〜10μM)の範囲内となるように、1〜複数回添加する(例えば培養開始時並びに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する)ことが好ましい。
なお、ここに開示される細胞培養物中の細胞は上記カルレティキュリン発現促進方法の適応対象細胞であれば特に限定されず、初代培養細胞、継代細胞、細胞株(セルライン)等の各種培養細胞であり得る。また、上記培養物中の細胞は、分子生物学的操作をされた細胞であってもよい。例えば、培養株樹立のためにテロメラーゼ(TERT)遺伝子が導入された細胞等であり得る。
合計12種類のペプチド(サンプル1〜12)を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表1には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
具体的には、サンプル1〜4に係るペプチドは、紡錘体形成関連タンパク質のsiRNA関連配列から成る合成ペプチドである。即ち、それぞれ、サンプル1に係るペプチドは配列番号6に示すヒトのセントリン2タンパク質のsiRNA関連配列、サンプル2に係るペプチドは配列番号8に示すCKAP5CのsiRNA関連配列、サンプル3に係るペプチドは配列番号17に示すCEP164のsiRNA関連配列及びサンプル4に係るペプチドは配列番号28に示すBRIC5のsiRNA関連配列からなる合成ペプチドである。
サンプル5に係るペプチドは配列番号63に示すFtsZインヒビター或いはFtsAインヒビターとして機能するアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。
サンプル6及び7に係るペプチドは、細胞分裂関連タンパク質の一部のアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。即ち、サンプル6及び7に係るペプチドは、配列番号68又は69に示すタウタンパク質のアミノ酸配列の一部の配列から成る合成ペプチドである。
サンプル8に係るペプチドは、配列番号73に示すマウス由来のAPPのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列から成る合成ペプチドである。
具体的には、サンプル9に係るペプチドは、ペプチド鎖のC末端側に配列番号6に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのN末端側に膜透過性ペプチド配列であるLIMキナーゼ2由来のアミノ酸配列(配列番号1)を有する合成ペプチド(配列番号75)である。
サンプル10に係るペプチドは、ペプチド鎖のC末端側に配列番号17に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのN末端側に膜透過性ペプチド配列であるLIMキナーゼ2由来のアミノ酸配列(配列番号1)を有する合成ペプチド(配列番号76)である。
サンプル11に係るペプチドは、ペプチド鎖のC末端側に配列番号63に示すカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有し、そのN末端側に膜透過性ペプチド配列であるLIMキナーゼ2由来のアミノ酸配列(配列番号1)を有する合成ペプチド(配列番号77)である。
なお、サンプル12に係るペプチドは、カルレティキュリン発現促進ペプチドの比較例として、任意の12アミノ酸残基をランダムに組み合わせて構築した合成ペプチド(配列番号78)である。
合成したサンプル1〜12に係るペプチドは、PBS(-)又はDMSOに溶かし、ペプチドストック液を調製した。
上記実施例1で得られたサンプル1〜12に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、ヒト子宮頸癌由来の培養細胞株であるHeLaS3細胞(ATCC CCL2.2)を用いた。上記HeLaS3細胞(ATCC CCL2.2)は、多数の染色体重複が確認される、即ち染色体異常(核型異常)を有するゲノム不安定な培養細胞株として知られる細胞である。評価試験の詳細は以下のとおりである。
具体的には、まず、各試験区の培養容器中の培地を除去し、PBS(−)で洗浄した。次いで、冷メタノールを添加し、氷上に15分静置してHeLaS3細胞を固定した。その後、メタノールを除去し、3%のBSA含有PBS(−)(3%のBSAを含むPBS(−))を添加して室温で1時間のブロッキングを行った。所定時間経過後、3%のBSA含有PBS(−)を除去し、PBS(−)にて洗浄した。
そして、一次抗体として抗カルレティキュリンモノクローナル[FMC75]抗体(マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683、Lot No. GR56669-4)を1%BSA/PBS(−)(1%のBSAを含むPBS(−))で最終濃度:2.5×10−3mg/mLに調製した一次抗体希釈液を上記HeLaS3細胞の培養容器中に添加し、4℃で一晩静置した。かかる抗原抗体反応の所定時間経過後、一次抗体希釈液を除去し、PBS(−)で洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素(Alexa(登録商標)488)で標識した抗マウスIgG抗体(ヤギ:Life Technologies社製品、A11001)を1%BSA/PBS(−)で最終濃度:10×10−3mg/mLに調製した二次抗体希釈液を添加し、室温で2時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、PBS(−)で洗浄した。その後、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)含有封入液(Life Technologies社製)とカバーガラスを用いて封入を行い、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
また、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とを組み合わせて構築したサンプル9〜11に係る合成ペプチドを添加したHeLaS3細胞(図9〜図11)と、当該カルレティキュリン発現促進発現ペプチド配列のみから成るサンプル1、3、または5に係るペプチドを添加したHeLaS3細胞(図1、図3、図5)とをそれぞれ比較すると、サンプル9〜11添加区のHeLaS3細胞は、それぞれサンプル1、3、5添加区のHeLaS3細胞と同等またはそれ以上にカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色することを確認した。即ち、サンプル9〜11に係る合成ペプチドは、それぞれサンプル1、3または5に係る合成ペプチドと比べて同等もしくはそれ以上にHeLaS3細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることを確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド(即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤)が腫瘍細胞(典型的にはHeLa細胞)のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド(組成物)であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
上記実施例1で得られたサンプル1〜12に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、ヒト線維芽細胞から樹立されたiPS細胞(クローン名:201B2、以下単に201B2ともいう)を用いた(出典:Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872(2007))。上記iPS細胞は、京都大学iPS細胞研究所から供与されたものを使用した。
なお、膜透過性ペプチド配列を有するサンプル9〜11に係る合成ペプチドが、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のみからなるサンプル1、3、5と比較して、同等もしくはそれ以上にiPS細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることも確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド(即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤)が幹細胞(典型的にはヒト由来のiPS細胞)のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド(組成物)であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
上記実施例1で得られたサンプル1〜12に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現促進活性を調べた。供試細胞として、マウス由来のES細胞の培養細胞株であるBXM14細胞(以下、単に「BXM14」ともいう)を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
なお、膜透過性ペプチド配列を有するサンプル9〜11に係る合成ペプチドが、カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のみからなるサンプル1、3、5と比較して、同等もしくはそれ以上にES細胞におけるカルレティキュリンの発現量を増大させることも確認した。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチド(即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現促進剤)が幹細胞(典型的にはES細胞)のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド(組成物)であることを示している。また、膜透過性ペプチド配列を有するカルレティキュリン発現促進ペプチドは、膜透過性ペプチド配列によりカルレティキュリン発現促進ペプチド配列が効率よく細胞内へ導入されることで、より高いカルレティキュリン発現促進活性が発揮されることを示している。
上記サンプル1〜11に係る合成ペプチド(カルレティキュリン発現促進ペプチド)50mgと結晶化セルロース50mg及び乳糖400mgとを混合した後、エタノールと水の混合液1mLを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるカルレティキュリン発現促進ペプチドを主成分とする顆粒剤(顆粒状組成物)を得た。
Claims (19)
- 少なくとも一種の真核細胞に対してカルレティキュリンの発現を促進させる方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
前記細胞培養物中に、カルレティキュリン発現促進活性を有する合成ペプチドを少なくとも1回供給すること、および
該ペプチドを少なくとも一回供給した前記細胞培養物を所定時間培養すること
を包含し、
前記合成ペプチドが、配列番号6〜74のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個、又は2個、又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、カルレティキュリン発現促進方法。 - 上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞、幹細胞若しくは神経系細胞である、請求項1に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
- 前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のN末端側若しくはC末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項1又は2に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
- 前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列:
KKRTLRKNDRKKR(配列番号1);
を有する、請求項3に記載のカルレティキュリン発現促進方法。 - 前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が50以下である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
- 前記合成ペプチドが、配列番号6、8、17、28,63、68、69、73のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法。
- カルレティキュリン高発現細胞を含む細胞培養物を製造する方法であって、請求項1〜6のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進方法を包含する製造方法。
- 少なくとも一種の真核細胞のカルレティキュリンの発現を促進させるために用いられるカルレティキュリン発現促進剤であって、
配列番号6〜74のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個、又は2個、又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドを有効成分として含む、カルレティキュリン発現促進剤。 - 上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞若しくは幹細胞である、請求項8に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
- 前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のN末端側若しくはC末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項8又は9に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
- 前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列:
KKRTLRKNDRKKR(配列番号1);
を有する、請求項10に記載のカルレティキュリン発現促進剤。 - 前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が50以下である、請求項8〜11のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
- 前記合成ペプチドが、配列番号6、8、17、28、63、68、69、73のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチドである、請求項8〜12のいずれか一項に記載のカルレティキュリン発現促進剤。
- 少なくとも一種の真核細胞のカルレティキュリンの発現を促進させるために用いられる合成ペプチドであって、
配列番号8〜44のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個、又は2個、又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する合成ペプチド。 - 上記真核細胞が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞若しくは幹細胞である、請求項14に記載の合成ペプチド。
- 前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現促進ペプチド配列のN末端側若しくはC末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項14又は15に記載の合成ペプチド。
- 前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列:
KKRTLRKNDRKKR(配列番号1);
を有する、請求項16に記載の合成ペプチド。 - 前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が50以下である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
- 配列番号8、17、28のうちのいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現促進ペプチド配列を有する、請求項14〜18のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013270470 | 2013-12-26 | ||
JP2013270470 | 2013-12-26 | ||
PCT/JP2014/084145 WO2015098963A1 (ja) | 2013-12-26 | 2014-12-24 | カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015098963A1 true JPWO2015098963A1 (ja) | 2017-03-23 |
JP6654899B2 JP6654899B2 (ja) | 2020-02-26 |
Family
ID=53478813
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015554956A Active JP6654899B2 (ja) | 2013-12-26 | 2014-12-24 | カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10981953B2 (ja) |
JP (1) | JP6654899B2 (ja) |
WO (1) | WO2015098963A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6872713B2 (ja) * | 2015-05-29 | 2021-05-19 | 東亞合成株式会社 | 腫瘍細胞の放射線感受性を増大させる合成ペプチド及びその利用 |
TW202221022A (zh) * | 2020-08-07 | 2022-06-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 用於治療阿茲海默症之tau疫苗 |
WO2023100758A1 (ja) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 国立大学法人京都大学 | ペプチド含有組成物 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010117079A1 (ja) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 東亞合成株式会社 | 神経分化誘導ペプチド及びその利用 |
WO2011152524A1 (ja) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | 東亞合成株式会社 | 細胞増殖促進ペプチド及びその利用 |
WO2013094698A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | 東亞合成株式会社 | 多極化細胞の作製方法 |
WO2013094697A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | 東亞合成株式会社 | 抗腫瘍ペプチド及びその利用 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5232098A (en) | 1975-09-05 | 1977-03-10 | Osaka Soda Co Ltd | Preparation of epichlorohydrin rubber |
DE3790581T1 (ja) | 1986-09-25 | 1988-08-25 | ||
JPH0819111B2 (ja) | 1987-10-22 | 1996-02-28 | ポーラ化成工業株式会社 | 2―ニトロイミダゾール誘導体及びこれを有効成分とする放射線増感剤 |
US7173005B2 (en) * | 1998-09-02 | 2007-02-06 | Antyra Inc. | Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists |
US20100293669A2 (en) * | 1999-05-06 | 2010-11-18 | Jingdong Liu | Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
CN1393461A (zh) * | 2001-06-29 | 2003-01-29 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——甲状腺碘化物转运子-22.88和编码这种多肽的多核苷酸 |
KR20070010046A (ko) * | 2004-04-06 | 2007-01-19 | 제넨테크, 인크. | Dr5 항체 및 그의 용도 |
US7858323B2 (en) * | 2004-06-09 | 2010-12-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Phage microarray profiling of the humoral response to disease |
JP4730584B2 (ja) * | 2004-12-06 | 2011-07-20 | 東亞合成株式会社 | 抗菌ペプチド及びその利用 |
US7875602B2 (en) | 2005-10-21 | 2011-01-25 | Sutter West Bay Hospitals | Camptothecin derivatives as chemoradiosensitizing agents |
US20100227339A1 (en) * | 2005-12-02 | 2010-09-09 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Differential immunoassay for prrs vaccine antibody |
DK1987178T3 (en) * | 2006-02-20 | 2015-04-20 | Phylogica Ltd | Process for the construction and screening of peptide structure libraries |
US20100297758A1 (en) | 2008-01-25 | 2010-11-25 | Toagosei Co., Ltd | Artificial peptide and use thereof |
CA2793800A1 (en) * | 2009-03-20 | 2010-09-23 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptides that inhibit angiotensin converting enzyme and peptides with antioxidant activity purified from ovotransferrin and methods of producing and using the same |
JP5858285B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
JPWO2011078351A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2013-05-09 | キリンホールディングス株式会社 | 分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系 |
US20130288310A1 (en) * | 2010-08-23 | 2013-10-31 | Codexis, Inc | Recombinant lignocellulose degradation enzymes for the production of soluble sugars from cellulosic biomass |
EP3761034A3 (en) * | 2011-01-26 | 2021-02-17 | University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education | Urine biomarkers for prediction of recovery after acute kidney injury: proteomics |
EP2755986A4 (en) * | 2011-09-12 | 2015-05-20 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE |
SG10201912955PA (en) * | 2011-09-19 | 2020-02-27 | Axon Neuroscience Se | Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease |
US9046530B2 (en) * | 2011-12-02 | 2015-06-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for chlamydial antigens as reagents for diagnosis of tubal factor infertility and chlamydial infection |
JP6120090B2 (ja) * | 2011-12-20 | 2017-04-26 | 東亞合成株式会社 | 多極化細胞の作製方法 |
WO2013143026A1 (en) * | 2012-03-31 | 2013-10-03 | Abmart (Shanghai) Co., Ltd | Peptide and antibody libraries and uses thereof |
WO2014061749A1 (ja) * | 2012-10-18 | 2014-04-24 | 東亞合成株式会社 | 2型tnf受容体の発現を抑制する合成ペプチド及びその利用 |
JP6872713B2 (ja) * | 2015-05-29 | 2021-05-19 | 東亞合成株式会社 | 腫瘍細胞の放射線感受性を増大させる合成ペプチド及びその利用 |
-
2014
- 2014-12-24 JP JP2015554956A patent/JP6654899B2/ja active Active
- 2014-12-24 WO PCT/JP2014/084145 patent/WO2015098963A1/ja active Application Filing
- 2014-12-24 US US15/108,349 patent/US10981953B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010117079A1 (ja) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 東亞合成株式会社 | 神経分化誘導ペプチド及びその利用 |
WO2011152524A1 (ja) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | 東亞合成株式会社 | 細胞増殖促進ペプチド及びその利用 |
WO2013094698A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | 東亞合成株式会社 | 多極化細胞の作製方法 |
WO2013094697A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | 東亞合成株式会社 | 抗腫瘍ペプチド及びその利用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"transcriptional regulator, XRE family [Methanocaldococcus infernus ME]", ACCESSION NO. ADG12734, vol. retrieved on 2019.05.17, JPN6019018692, 11 December 2013 (2013-12-11), ISSN: 0004039917 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160318975A1 (en) | 2016-11-03 |
JP6654899B2 (ja) | 2020-02-26 |
WO2015098963A1 (ja) | 2015-07-02 |
US10981953B2 (en) | 2021-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5858285B2 (ja) | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 | |
JP5858283B2 (ja) | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 | |
JP5854283B2 (ja) | 細胞増殖促進ペプチド及びその利用 | |
JP6156698B2 (ja) | 抗腫瘍ペプチド及びその利用 | |
JPWO2009093692A1 (ja) | 人工ペプチド及びその利用 | |
JP6311935B2 (ja) | 2型tnf受容体の発現を抑制する合成ペプチド及びその利用 | |
JP2015128431A (ja) | 細胞増殖促進ペプチド及びその利用 | |
JP2018080147A (ja) | 抗腫瘍ペプチドおよびその利用 | |
JP6654899B2 (ja) | カルレティキュリンの発現促進方法および該方法に用いられる合成ペプチド | |
JP2023019098A (ja) | 核小体移行性キャリアペプチドフラグメントおよびその利用 | |
US10112977B2 (en) | Peptide for inducing multinucleation in cells, and use therefor | |
JP6629725B2 (ja) | 新規合成ペプチドおよびその利用 | |
JP6120089B2 (ja) | 多極化細胞の作製方法 | |
US9365618B2 (en) | Synthetic peptide that induces expression of TNF receptor 2 and use thereof | |
JP6120090B2 (ja) | 多極化細胞の作製方法 | |
WO2022230484A1 (ja) | ペプチドフラグメントおよびその利用 | |
JP6501122B2 (ja) | ネスチン誘導合成ペプチド及びその利用 | |
JP2020019715A (ja) | 抗腫瘍ペプチドおよびその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171020 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181004 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190523 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190716 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200109 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200131 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6654899 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |