JPWO2015025927A1 - 糖液の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法に関する：工程（１）：第１のセルロース含有バイオマスを前処理する工程、工程（２）：工程（１）の第１のセルロース含有バイオマス前処理物の固形分重量に対し１〜５０％の範囲の量の第２のセルロース含有バイオマスを添加して、糸状菌由来セルラーゼによる加水分解を行う工程、工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残さとに固液分離し、溶液成分を限外ろ過膜に通じてろ過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程。

Description

本発明は、セルロースから糖液を製造する方法に関する。

近年、エネルギー使用量および環境負荷が少なく、かつ糖収量が多いため、セルラーゼを使用したバイオマスの加水分解方法が広く検討されている。しかしながら、セルラーゼを使用する糖液の製造方法の欠点は、セルラーゼの価格が高いため糖液製造コストが増大するという点である。こうした技術課題を解決するために加水分解に使用したセルラーゼを回収再利用する方法が提案されているが、セルロース含有バイオマスを加水分解する際に生じる加水分解残さにセルラーゼが強く吸着するため、酵素の再利用性が低いということが課題となっている。

加水分解残さに吸着したセルラーゼを脱着し、セルラーゼの回収率を高める方法としては、加水分解残さをｐＨ８程度の水酸化ナトリウム水溶液で洗浄する方法（非特許文献１）、加水分解残さにノニオン性界面活性剤を接触させる方法（特許文献１）などが開示されている。一方、セルラーゼの加水分解残さへの吸着を低減する方法としては、セルロース含有バイオマスの加水分解時、水溶性塩類を添加して電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍに調整する方法（特許文献２）、セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して１〜１０重量％の炭酸カルシウム粒子を添加する方法（特許文献３）などが知られている。

特開昭６３−８７９９４号公報 特許第４９４７２２３号公報 特開２０１２−１００６１７号公報

D. E. Otterら、"Elution of Trichoderma reesei Cellulase from Cellulose by pH Adjustment with Sodium Hydroxide" Biotechnology Letters (1984) Vol. 6、No. 6、369-374

上述の通り、セルロース含有バイオマスの加水分解に用いたセルラーゼを回収し、再利用することによりセルラーゼの使用量を削減する試みが種々なされているが、セルラーゼが加水分解残さに強く吸着するためその回収率は低く、問題の解決には至っていない。
そこで本発明では、従来の方法でのセルラーゼ使用量の削減効果を上回る糖液の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、今般、鋭意検討した結果、第１のセルロース含有バイオマスの前処理物を糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する際、前記前処理物の固形分重量に対し１〜５０％範囲の量の第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を添加したところ、糸状菌由来セルラーゼの酵素成分を顕著に高い効率で回収することができるということを見出し、発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］の構成を包含する。
［１］以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法：
工程（１）：第１のセルロース含有バイオマスの前処理物を準備する工程、
工程（２）：工程（１）の第１のセルロース含有バイオマス前処理物の固形分重量に対し１〜５０％の範囲の量の第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を添加して、糸状菌由来セルラーゼによる加水分解を行う工程、
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残さとに固液分離し、溶液成分を限外ろ過膜に通じてろ過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程。
［２］工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスの前処理物が、第２のセルロース含有バイオマスを水熱処理および／または酸処理した前処理物である、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスが穀物外皮である、［１］または［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスが、トウモロコシ外皮、大豆外皮および小麦外皮よりなる群から選ばれる１以上のバイオマスである、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５］工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスが草本系バイオマスまたは木質系バイオマスである、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスがコーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらおよびバガスよりなる群から選択される１以上のバイオマスである、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［７］工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスの前処理物が、酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理および蒸煮処理よりなる群から選択される１以上の方法により前処理されたものである［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［８］［１］から［７］のいずれかに記載の糖液の製造方法により糖液を製造する工程、および該工程で得られた糖液を発酵原料として微生物を培養する工程を含む、化学品の製造方法。

本発明によれば、セルロース含有バイオマスの加水分解残さへの糸状菌由来セルラーゼの吸着を抑制することができ、特に加水分解反応において重要な役割を果たすセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼといった酵素群を高い効率で回収および／または再利用することができる。その結果、従来技術に比べセルラーゼの使用量を削減し、糖液製造コストを低く抑えることができる。

図１は、本発明の糖液の製造方法の実施の一形態を示した略図である。

発明の具体的説明

以下、本発明について工程ごとに説明する。

工程（１）：第１のセルロース含有バイオマスの前処理物を準備する工程
本発明の第１のセルロース含有バイオマスとは、セルロース成分を含む生物資源のことを指す。第１のセルロース含有バイオマスに特に制限はないが、具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、ビートパルプ、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、樹木、廃建材などの木質系バイオマス、あるいは藻類、海草など水生環境由来のバイオマスが挙げられ、好ましい具体例としては草本系バイオマスまたは木質系バイオマス、より好ましい具体例としては草本系バイオマス、さらに好ましい具体例としては、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらおよびバガスからなる群から選択される１種または２種以上が挙げられる。

セルロース含有バイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース（以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。）の他に芳香族高分子であるリグニン等を含有しているため、前処理を施すことによりセルラーゼによる加水分解効率を向上させることができる。前処理の方法としては、硫酸、酢酸などによる酸処理、苛性ソーダ、アンモニアなどによるアルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理、蒸煮処理が挙げられるが、本発明において効果的なのはアンモニア処理、水熱処理、酢酸処理または希硫酸処理であり、これらの前処理方法が好ましい。本発明では、前処理を行ったバイオマスのことを、バイオマス前処理物という。本発明の一つの態様によれば、工程（１）の準備にあっては、第１のセルロース含有バイオマスを前処理することが好ましい。しかしながら、本発明工程（１）の準備にあっては、予め上述のような前処理が行われたバイオマス前処理物を購入して用いてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。

セルロース含有バイオマスの前処理物には、セルロース含有バイオマス由来の固形物のほか、セルロース含有バイオマスに含まれるヘミセルロースの一部が加水分解して生じたキシロースを含む溶液成分が含まれる。本発明における前処理物とは、固形物と溶液成分の両方を含む状態、あるいは固液分離および／または固形物の洗浄によりキシロースを含む溶液成分を取り除いた状態の両方を指す。

工程（２）：工程（１）の第１のセルロース含有バイオマス前処理物の固形分重量に対し１〜５０％の範囲の量の第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を添加して、糸状菌由来セルラーゼによる加水分解を行う工程
本発明は、第１のセルロース含有バイオマス前処理物を加水分解する際、第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を添加することを特徴とする。第２のセルロース含有バイオマスとは、第１のセルロース含有バイオマスと同じくセルロース成分を含む生物資源のことであるが、第１のセルロース含有バイオマスとは植物種または植物部位が異なっていることを特徴とする。

第２のセルロース含有バイオマスの好ましい具体例としては、穀物外皮が挙げられる。穀物とは、イネ科作物、マメ科作物、あるいはその他植物の種実を含む、デンプン質を主体とする種実のことを指し、具体的には、トウモロコシ、稲、麦、大豆、ソバ、アマランサス、キヌアなどを例示することができる。こうした穀物は、いずれも種実に相当する部分であるが、穀物外皮とは、種実の一番外側の表皮部分のことを指す。例えば、トウモロコシ、小麦、大豆、稲に関しては、食品加工の過程において、穀物外皮の部分を除去する場合がある。トウモロコシに関しては、澱粉製造において、小麦に関しては、小麦粉製造において、大豆に関しては、大豆油製造において、稲に関しては、食用部分である精米の過程においてなどがこれらにあたる。こうした穀物外皮は、セルロースを含むことから、前述穀物加工の過程で発生するセルロース含有バイオマスであると言える。本発明の第２のセルロース含有バイオマスとして最も好ましいものは、トウモロコシ外皮、大豆外皮、小麦外皮である。

第２のセルロース含有バイオマスは、そのままでも十分な効果を発揮するが、水熱処理および／または酸処理した前処理物であることが好ましい。第２のセルロース含有バイオマスを前処理することで、第２のセルロース含有バイオマスの糸状菌由来セルラーゼによる分解効率を高めるとともに、工程（３）における糸状菌由来セルラーゼの回収量を増大させることができる。

第２のセルロース含有バイオマスは、工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスの前処理物の固形分重量に対して１〜５０％の範囲の量を添加する。ここでいう固形分重量とは、第１のセルロース含有バイオマスの前処理物および／または第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を１０５℃で乾燥させた後の重量を指し、加熱乾燥・質量測定方式の水分計を用いて含水率を測定することにより、第１のセルロース含有バイオマスの前処理物および／または第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物の固形分濃度を逆算することができる。例えば、第１のセルロース含有バイオマスの前処理物の含水率が７０％、第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物の含水率が１０％であった場合、その固形分濃度はそれぞれ３０％、９０％である。第１のセルロース含有バイオマスの前処理物の湿重量１５０ｇは固形分４５ｇに相当し、第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物の添加量は固形分０．４５〜２２．５ｇ、すなわち、湿重量０．５〜２５ｇに相当する。

本発明では、糸状菌由来セルラーゼを用いて第１のセルロース含有バイオマスの前処理物および第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を加水分解する。糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。また、これら微生物に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。

糸状菌の中でもトリコデルマ属は、セルロースの加水分解において比活性の高い酵素成分を培養液中に大量に生産するため本発明において好ましく使用することができる。トリコデルマ属由来セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＲｕｔＣ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＱＭ９１２３）由来のセルラーゼが挙げられるが、中でもトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼがより好ましい。

糸状菌由来セルラーゼは、セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解してグルコースやキシロースなどの単糖を生成する活性を有する酵素組成物であり、酵素成分としてセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群から選択される１種以上を含むことが好ましい。例えばトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの酵素成分としては、セロビオハイドラーゼＩ、セロビオハイドラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、などが例示され、こうした複数の酵素成分の協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を実施することができるため、本発明において好ましく使用される。

セロビオハイドラーゼは、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを放出する酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。セロビオハイドラーゼＩはセルロース鎖の還元末端側から、セロビオハイドラーゼＩＩは非還元末端側から加水分解反応を開始する。

エンドグルカナーゼは、セルロース鎖の中央部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

β−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することをと特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβ−グルコシダーゼに帰属する酵素群が記載されている。

キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

β−キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。

こうしたセルラーゼ成分は、ゲルろ過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列（Ｎ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析）を行い、データベースとの比較により同定することができる。

また、糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セロビオース、キシラン、マンナンなどといった多糖を基質とし、その加水分解活性によって評価することができる。結晶セルロース分解活性を示す主たる酵素は、セルロース末端部分から加水分解する特徴を有するセロビオハイドラーゼである。セロビオース分解活性を示す主たる酵素は、β−グルコシダーゼである。ＣＭＣ分解活性に関与する主たる酵素は、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼである。キシラン分解活性を示す主たる酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼである。ここで“主たる”という意味は、最も分解に関与することが知られていることからの表現であり、これ以外の酵素成分もその分解に関与していることを意味している。

糸状菌は培養液中にセルラーゼを産生するため、その培養液を粗酵素剤としてそのまま使用してもよいし、公知の方法で酵素群を精製し、製剤化したものを糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌由来セルラーゼを精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものをセルラーゼ製剤として使用してもよい。なお、本発明ではこれらの中でも粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌がセルラーゼを産生するよう調製した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するためにセルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいはトリコデルマ菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。

粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、β−グルコシダーゼに関しては、その多くを細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβ−グルコシダーゼ活性は低い。そこで、粗酵素物に、さらに異種または同種のβ−グルコシダーゼを添加してもよい。異種のβ−グルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。また、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組み換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、β−グルコシダーゼ活性の向上した培養液を用いてもよい。

第１のセルロース含有バイオマスの前処理物および第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物の固形分濃度は特に限定されないが、１〜３０重量％の範囲が好ましい。かかる固形物濃度に設定することは、生成する糖濃度およびハンドリングを勘案すれば有利である。

加水分解反応の温度は、糸状菌由来セルラーゼの好ましい反応条件に準じていれば特に限定されないが、３０〜７５℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、４０〜６０℃の範囲であることがさらに好ましい。

加水分解反応のｐＨも同様に糸状菌由来セルラーゼの好ましい反応条件に準じていれば特に限定されないが、ｐＨ３．０〜７．０の範囲が好ましく、ｐＨ４．０〜６．０の範囲であることがさらに好ましい。糸状菌由来セルラーゼとしてトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。

加水分解反応の時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。加水分解反応の時間をかかる範囲に設定することは、十分な糖を生成することおよび回収セルラーゼの失活を防ぐ上で有利である。

工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残さに固液分離し、溶液成分を限外ろ過膜に通じてろ過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
工程（２）で得られた加水分解物を固液分離して得られる溶液成分には糸状菌由来セルラーゼ成分および糖成分が含まれ、これらは限外ろ過膜を用いたろ過によって分離することができる。

限外ろ過膜とは、分画分子量が５００〜２００，０００となる膜のことであり、ウルトラフィルトレーション、ＵＦ膜などと略称されるものである。また、限外ろ過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡等で計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編 膜学実験シリーズ 第ＩＩＩ巻 人工膜編 編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（１９９３年、共立出版） Ｐ９２に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外ろ過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。

限外ろ過膜を用いた糸状菌由来セルラーゼと糖成分の分離においては、その分画分子量は糖液の主成分の単糖であるグルコース（分子量１８０）やキシロース（分子量１５０）を透過し、糸状菌由来セルラーゼを阻止できるものであれば特に限定されないが、分画分子量５００〜１００，０００が好ましく、糸状菌由来セルラーゼ成分の収率を担保し、また酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を糸状菌由来セルラーゼ成分と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。

限外ろ過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルは糸状菌由来セルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外ろ過膜を使用することが好ましい。

限外ろ過膜のろ過方式として、デッドエンドろ過、クロスフローろ過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフローろ過であることが好ましい。また使用する限外ろ過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。

限外ろ過膜によるろ過の非透過液として回収される糸状菌由来セルラーゼは、工程（２）の加水分解工程に再利用することができる。本発明では、回収セルラーゼを再利用することにより糸状菌由来セルラーゼの使用量が減り、糖液製造コストを削減することができる。なお、回収セルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスの加水分解を行う場合、回収セルラーゼに未使用の糸状菌由来セルラーゼを新たに添加してもよい。新たに添加する糸状菌由来セルラーゼの量が増加するとコスト面で不利になるため、十分な糖収量を得るために必要最低限の未使用セルラーゼを添加することが好ましい。

限外ろ過膜によるろ過の透過液として回収される糖液は単糖であるグルコースおよびキシロースを主成分とするものであり、そのままでも後述の発酵工程での発酵原料として使用可能であるが、発酵工程の効率を高めるためにさらに糖濃度を高める濃縮処理をおこなってもよい。糖液の濃縮処理としては、蒸発濃縮、減圧濃縮、膜濃縮などを例示することができるが、エネルギー使用量が少なく、糖液に含まれる発酵阻害物質を分離することが可能なＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する方法により、糖成分が濃縮された濃縮糖液を得ることができる。

本発明により得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を培養することで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を成育させるとは、糖液に含まれる糖成分あるいはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産される。化学品の具体例としては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明のセルロース由来糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

（参考例１）タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ ＨＴ、大日本住友製薬株式会社製）で測定した。牛血清アルブミン水溶液を標準液とし、検量線に照らし合わせてセルラーゼ溶液のタンパク質濃度を算出した。

（参考例２）糖濃度の測定
糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ_２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。

（参考例３）糸状菌由来セルラーゼの活性測定方法
セルラーゼ活性は、セルロースの分解に関与する酵素群の活性として（１）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｌａｃ）および（２）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−Ｇｌｃ）の分解活性を、ヘミセルロースの主成分であるキシランの分解に関与する酵素群の活性として（３）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘｙｌ）の分解活性を以下に示す方法で測定評価した。なお、上記（１）〜（３）の基質をまとめてｐＮＰ−糖という。

各基質をそれぞれ１．１ｍＭの濃度で含む５５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０） ０．９ｍＬに酵素液を０．１ｍＬ加え、３０℃で反応させた（基質の終濃度１ｍＭ、緩衝液の終濃度５０ｍＭ）。反応時間は、基質がｐＮＰ−Ｌａｃの場合６０分間、ｐＮＰ−Ｇｌｃの場合１０分間、ｐＮＰ−Ｘｙｌの場合３０分間とし、それぞれの時間正確に反応させた後、０．１ｍＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｔｅｓｔ）。ブランクとして、基質溶液に２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、酵素液の順に添加したものについても同様に４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｂｌａｎｋ）。上記反応系で１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。なお、上記反応系における４−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数は１７．２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍである。
ｐＮＰ−Ｌａｃ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×６０（分間）×０．１（ｍＬ）｝
ｐＮＰ−Ｇｌｃ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×１０（分間）×０．１（ｍＬ）｝
ｐＮＰ−Ｘｙｌ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×６０（分間）×０．１（ｍＬ）｝。

（比較例１）第１のセルロース含有バイオマスのみを使用する場合
（工程１：第１のセルロース含有バイオマスの前処理）
（前処理１）第１のセルロース含有バイオマスのアンモニア処理
第１のセルロース含有バイオマス（コーンコブまたは稲わら）を小型反応器（耐圧硝子工業製、ＴＶＳ−Ｎ２ ３０ｍｌ）に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器にアンモニアガスを流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分ほど放置した。次いで、１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし乾燥させた。コーンコブの前処理物を前処理物１、稲わらの前処理物を前処理物２とし、以下の実施例に使用した。

（前処理２）第１のセルロース含有バイオマスの水熱処理
第１のセルロース含有バイオマス（コーンコブ）を水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後は遠心分離（３，０００Ｇ）により溶液成分と固形物に固液分離した固形物を前処理物３とし、以下の実施例に使用した。

（前処理３）第１のセルロース含有バイオマスの希硫酸処理
硫酸２％水溶液に第１のセルロース含有バイオマス（コーンストーバー、麦わらまたはバガス）を懸濁し、固形分濃度３０％のスラリーを調製した。該スラリーを１５０℃で３０分間、オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。処理後は遠心分離（３，０００ｇ）により溶液成分と固形物に固液分離し、コーンストーバーの前処理により得られた固形物を前処理物４、麦わらの前処理により得られた固形物を前処理物５、バガスの前処理により得られた固形物を前処理物６として以下の実施例に使用した。

（工程２：糸状菌由来セルラーゼによる加水分解）
糸状菌由来セルラーゼとして、市販のセルラーゼ酵素液（“アクセルレースデュエット”、ジェネンコア製）を使用した。参考例１に従ってセルラーゼ酵素液のタンパク質濃度を測定したところ、その濃度は４０ｇ／Ｌであった。
工程１で調製した前処理物１から前処理物６をそれぞれ１．０ｇ（固形分重量）秤量し、５０ｍＬ遠沈管の中で７．０ｍＬの水に懸濁し、スラリーを調製した。希硫酸もしくはアンモニア水を用いてスラリーのｐＨを４．７〜５．３の範囲内に調整した後、総重量が１０ｇになるようセルラーゼ酵素液０．２ｍＬおよび水を添加し、固形分濃度１０％とした。５０℃で２４時間、ハイブリダイゼーションローテーター（日伸理化株式会社製 ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて回転混和し、加水分解物を得た。

（工程３：糸状菌由来セルラーゼと糖液の回収）
工程２の加水分解物を遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）にて固液分離し、溶液成分８ｇと加水分解残さ２ｇを得た。加水分解残さを８ｍＬの水で再懸濁し、再度遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）を行うことで、加水分解残さに残った溶液成分を回収した。回収した溶液成分を合一し、ポアサイズ０．２μｍの精密ろ過膜（２５ｍｍ ＧＤ／Ｘシリンジフィルター 材質：ＰＶＤＦ、ＧＥヘルスケア・ジャパン製）に通じて微粒子を除いた後、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０ 材質：ＰＥＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いてろ過した。非透過側を回収セルラーゼ液として回収し、透過液を糖液として回収した。糖液については、参考例２に従って糖濃度を測定した。回収セルラーゼ液については、参考例３に従って酵素活性測定を行った。
糖濃度を表１に、投入したセルラーゼ酵素液の酵素活性に対する回収セルラーゼ液の酵素活性の割合を残存率として表２にまとめた。

（実施例１）第２のセルロース含有バイオマスの使用
第１のセルロース含有バイオマスとして前処理物１または前処理物３を使用し、比較例１の工程２での第２のセルロース含有バイオマスとしてトウモロコシ外皮、大豆外皮、小麦外皮（ふすま）の３種のいずれかを第１のセルロース含有バイオマスの固形分重量に対し１０％量添加した。その結果、第１のセルロース含有バイオマスの固形分濃度が１０％、第２のセルロース含有バイオマスの固形分濃度が１％のスラリーが調製された。その他は比較例１と同様に糖液の製造を行い、糖液と回収セルラーゼ液を得た。糖液は参考例２に従って糖濃度を測定し、回収セルラーゼ液は参考例３に従って活性測定を行った。

（実施例２）第２のセルロース含有バイオマスの前処理物の使用
第２のセルロース含有バイオマスとしてトウモロコシ外皮、大豆外皮、小麦外皮（ふすま）の３種の水熱処理物あるいは酸処理物を使用した。

水熱処理物は、固形分濃度３０％の第２のセルロース含有バイオマスのスラリーを１５０℃で３０分間、オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）して得た。

酸処理物は、硫酸０．５％、固形分濃度３０％の第２のセルロース含有バイオマスのスラリーを１５０℃で３０分間、オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）して得た。

比較例１の工程２において、第２のセルロース含有バイオマスの前処理物を第１のセルロース含有バイオマスの固形物重量に対し１０％量添加する他は比較例１と同様に糖液の製造を行った。ただし、第１のセルロース含有バイオマスとして前処理物１または前処理物３を使用する場合には第２のセルロース含有バイオマス（トウモロコシ外皮、大豆外皮、小麦外皮）のいずれかの熱水処理物または酸処理物を、第１のセルロース含有バイオマスとして前処理物２、前処理物４，前処理物５または前処理物６を使用する場合には第２のセルロース含有バイオマスとしてはトウモロコシ外皮の酸処理物のみを使用した。得られた糖液と回収セルラーゼ液について、糖液は参考例２に従って糖濃度を測定し、回収セルラーゼ液は参考例３に従って活性測定を行った。

実施例１および実施例２の糖濃度を表３、表４および表５に、酵素活性の残存率を表６、表７および表８にまとめた。その結果、第２のセルロース含有バイオマスを使用することにより、糖収量および回収セルラーゼ液の初期投入酵素に対する活性残存率が向上した。

（実施例３）第２のセルロース含有バイオマスの添加量の影響
比較例１の工程２における第２のセルロース含有バイオマスとしてトウモロコシ外皮の酸処理物を使用し、第１のセルロース含有バイオマスの前処理物３（水熱処理コーンコブ）の固形分重量に対し１〜５０％量を添加した。その他は比較例１と同様に糖液の製造を行い、糖液と回収セルラーゼ液を得た。糖液は参考例２に従って糖濃度を測定し、回収セルラーゼ液は参考例３に従って活性測定を行った。糖濃度を表９に、酵素活性の残存率を表１０にまとめた。

その結果、第２のセルロース含有バイオマスの添加量が多いほど糖収量は増大した。回収セルラーゼ液の初期投入酵素に対する活性残存率は、第２のセルロース含有バイオマスを第１のセルロース含有バイオマス前処理物の固形分重量に対して１０％以上添加した場合に最大となった。

（実施例４）セルロース含有バイオマス由来糖液を発酵原料とする乳酸発酵生産
第１のセルロース含有バイオマス前処理物として前処理物３（水熱処理コーンコブ）を使用し、比較例１で製造した糖液（糖液１）および、実施例２において第２のセルロース含有バイオマスとして酸処理したトウモロコシ外皮を用いて製造した糖液（糖液２）を発酵原料として使用して、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ７６３８株を２４時間、３７℃の温度で静置培養した。培養液に含まれるＬ−乳酸濃度を以下条件で分析した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相Ａ：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
移動相Ｂ：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

上記分析の結果、表１１に示されるようにいずれの糖液を発酵原料とした乳酸発酵においてもＬ−乳酸が生産できることが確認されたが、本発明により製造した糖液が乳酸発酵の収率において優れる結果となった。

本発明における糖液の製造方法は、セルロースを含むバイオマスから発酵原料となる糖液を製造することに使用できる。また本発明で製造した糖液は、各種化学品の発酵原料として使用することができる。

Claims (8)

1. 以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法：
   工程（１）：第１のセルロース含有バイオマスの前処理物を準備する工程、
   工程（２）：工程（１）の第１のセルロース含有バイオマス前処理物の固形分重量に対し１〜５０％の範囲の量の第２のセルロース含有バイオマスまたはその前処理物を添加して、糸状菌由来セルラーゼによる加水分解を行う工程、
   工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残さとに固液分離し、溶液成分を限外ろ過膜に通じてろ過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程。
2. 工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスの前処理物が、第２のセルロース含有バイオマスを水熱処理および／または酸処理した前処理物である、請求項１に記載の糖液の製造方法。
3. 工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスが穀物外皮である、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
4. 工程（２）の第２のセルロース含有バイオマスが、トウモロコシ外皮、大豆外皮および小麦外皮よりなる群から選ばれる１以上のバイオマスである、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
5. 工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスが草本系バイオマスまたは木質系バイオマスである、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
6. 工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスがコーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらおよびバガスよりなる群から選択される１以上のバイオマスである、請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法。
7. 工程（１）の第１のセルロース含有バイオマスの前処理物が、酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理および蒸煮処理よりなる群から選択される１以上の方法で前処理されたものである、請求項１から６のいずれかに記載の糖液の製造方法。
8. 請求項１から７のいずれかに記載の糖液の製造方法により糖液を製造する工程、および該工程で得られた糖液を発酵原料として微生物を培養する工程を含む、化学品の製造方法。