BR112016003282B1

BR112016003282B1 - Métodos de produção de líquido de açúcar e de substância química

Info

Publication number: BR112016003282B1
Application number: BR112016003282-9A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Kurihara; Katsushige Yamada; Chiaki Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2022-03-22
Also published as: US10563238B2; BR112016003282A2; WO2015025927A1; US20160208300A1; JPWO2015025927A1; JP6458498B2; CA2921891C; CN105473729B; CN105473729A; BR112016003282B8; CA2921891A1

Abstract

MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE LÍQUIDO DE AÇÚCAR E DE SUBSTÂNCIA QUÍMICA. A presente invenção refere-se a um método de produção de líquido de açúcar que inclui as etapas (1) a (3) a seguir: - etapa (1): etapa de submissão da primeira biomassa que contém celulose ao pré-tratamento; - etapa (2): etapa de adição de uma segunda biomassa que contém celulose em quantidade que varia de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do primeiro produto de pré-tratamento de biomassa que contém celulose da etapa (1) e de realização de hidrólise por celulase derivada de fungo filamentoso; e - etapa (3): etapa de submissão de hidrolisado da etapa (2) à separação sólido-líquido para obter um componente de solução e um resíduo de hidrólise e de filtragem do componente de solução através de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar a celulase derivada de fungo filamentoso como retido e para recuperar um líquido de açúcar como permeado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a métodos de produção de líquido de açúcar a partir de celulose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Devido ao menor consumo de energia e menores impactos ambientais, assim como maior rendimento de açúcar, métodos de hidrólise de biomassa utilizando celulase vêm sendo amplamente estudados nos dias de hoje. Todavia, há uma desvantagem no método de hidrólise de biomassa utilizando celulase, que é o aumento do custo de produção de líquido de açúcar devido ao alto preço da celulase. Para resolver esse problema tecnológico, foram sugeridos métodos de recuperação para reutilizar empregada utilizada na hidrólise, mas a celulase é fortemente absorvida por resíduos de hidrólise gerados quando a biomassa que contém celulose é hidrolisada e, portanto, a reutilização de enzima é baixa, o que é problemático.

[003] Quanto aos métodos de dessorção da celulase absorvida pelo resíduo de hidrólise para aumentar a recuperação de celulase, são descritos um método de lavagem de resíduos de hidrólise com uma solução de hidróxido de sódio aquosa de cerca de pH 8 (Documento não de Patente 1), um método de contato dos resíduos de hidrólise com um tensoativo não iônico (Documento de Patente 1) e similares. Enquanto isso, quanto a métodos de redução da absorção de celulase a resíduos de hidrólise, são conhecidos um método de adição de sais solúveis em água no momento da hidrólise da biomassa que contém celulose para ajustar a condutividade elétrica em 5 a 25 mS/cm (Documento de Patente 2), um método de adição de partículas de carbonato de cálcio em 1 a 10% em peso com base no peso sólido de biomassa que contém celulose (Documento de Patente 3) e similares.

REFERÊNCIAS DO ESTADO DA TÉCNICA

[004] Documentos de Patente.

[005] Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonês Publicado em Aberto N° S63-87994.

[006] Documento de Patente 2: Patente Japonesa N° 4947223.

[007] Documento de Patente 3: Pedido de Patente Japonês Publicado em Aberto N° 2012-100617.

[008] Documentos não de Patente.

[009] Documento não patentário 1: D. E. Otter et al, Elution of Trichoderma reesei Cellulase from Cellulose by pH Adjustment with Sodium Hydroxide, Biotechnology Letters (1984), Vol. 6, N° 6, pp. 369-374.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0010] Conforme mencionado acima, foram realizadas várias tentativas de reduzir o consumo de celulase por meio da recuperação e reutilização da celulase empregada para hidrólise de biomassa que contém celulose; mas o problema não foi solucionado porque a celulase é fortemente adsorvida por resíduos de hidrólise e a recuperação é, portanto, baixa.

[0011] Em vista disso, um objeto da presente invenção é o de fornecer métodos de produção de líquidos de açúcar capazes de reduzir mais efetivamente o consumo de celulase em comparação com métodos convencionais.

[0012] Os presentes inventores estudaram intensamente e descobriram nesse período que, quando um produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose é hidrolisado por celulase derivada de fungo filamentoso, a adição da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento em quantidade que varia de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do produto pré-tratamento mencionado acima possibilita a recuperação de componentes de enzima da celulase derivada de fungo filamentoso em eficiência significativamente alta, o que assim conclui a presente invenção.

[0013] Ou seja, a presente invenção engloba uma estrutura composta de [1] a [8] a seguir: (86) Método de produção de líquido de açúcar que compreende as etapas (1) a (3) a seguir: Etapa (1): etapa de fornecimento de produto pré-tratamento de uma primeira biomassa que contém celulose; Etapa (2): Etapa de adição de segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento em quantidade que varia de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) e realização de hidrólise por uma celulase derivada de fungo filamentoso; e Etapa (3): etapa de submissão de um hidrolisado da etapa (2) à separação sólido-líquido para obter um componente de solução e um resíduo de hidrólise e de filtragem do componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a celulase derivada de fungo filamentoso na forma de retido e para recuperar um líquido de açúcar na forma de permeado; (87) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com [1], em que o produto pré-tratamento da segunda biomassa que contém celulose da etapa (2) é um produto pré-tratamento obtido por meio de submissão da segunda biomassa que contém celulose a um tratamento hidrotérmico e/ou tratamento ácido; (88) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com [1] ou [2], em que a segunda biomassa que contém celulose da etapa (2) é uma casca de grãos; (89) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [3], em que a segunda biomassa que contém celulose da etapa (2) é uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma casca de milho, uma casca de soja e uma casca de trigo; (90) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [4], em que a primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) é uma biomassa herbácea ou uma biomassa arbórea; (91) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [5], em que a primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) é uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em palha de milho, espiga de milho, palha de arroz, palha de trigo, palha de cevada e bagaço; (92) Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [6], em que o produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) é pré-tratado por um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste em tratamento ácido, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico, tratamento de água subcrítica, tratamento de pulverização e tratamento de vaporização; (93) Método de produção de substância química que compreende a etapa de produção de líquido de açúcar por meio do método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [7] e a etapa de cultivo de micro-organismos com o uso do líquido de açúcar obtido na mencionada etapa de produção do líquido de açúcar como matéria-prima de fermentação.

[0014] De acordo com a presente invenção, é possível inibir a adsorção da celulase derivada de fungo filamentoso ao resíduo de hidrólise da biomassa que contém celulose e recuperar e/ou reutilizar, com alta eficiência, um grupo de enzimas que incluem celobio-hidrolase, endoglucanase, β- glucosidase, xilanase e β-xilosidase, que desempenham papel importante, especificamente em reação de hidrólise. Como resultado, é possível reduzir o consumo de celulase em comparação com a técnica convencional e, portanto, reduzir os custos da produção de líquido de açúcar.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0015] A Figura 1 é uma ilustração esquemática que exibe uma realização de condução do método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] Cada uma das etapas da presente invenção será descrita individualmente abaixo.

[0017] Etapa (1): etapa de fornecimento de produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose.

[0018] A primeira biomassa que contém celulose de acordo com a presente invenção refere-se a biorrecursos que contêm um componente de celulose. A primeira biomassa que contém celulose não é particularmente restrita; e seus exemplos específicos incluem biomassa herbácea como bagaço, Panicum virgatum, Pennisetum purpureum, Erianthus, palha de milho, espiga de milho, polpa de beterraba, palha de arroz, palha de trigo ou palha de cevada; biomassa arbórea, como árvores e arbustos ou restos de material de construção; e biomassa derivada de ambiente aquático, como algas ou ervas marinhas. Seus exemplos específicos preferidos incluem biomassa herbácea ou biomassa arbórea, seus exemplos específicos de maior preferência incluem biomassa herbácea e seus exemplos específicos de preferência superior incluem um ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em palha de milho, espiga de milho, palha de arroz, palha de trigo, palha de cevada e bagaço.

[0019] A biomassa que contém celulose contém, além de celulose e hemicelulose (a seguir, o termo “celulose” é utilizado como termo geral de celulose e hemicelulose), polímeros aromáticos como ligninas e, portanto, a eficiência de hidrólise por celulase pode ser aprimorada conduzindo-se pré- tratamento. Exemplos de um método de pré-tratamento incluem um tratamento ácido por ácido sulfúrico, ácido acético ou similares, tratamento alcalino por hidróxido de sódio, amônia ou similares, tratamento hidrotérmico, tratamento de água subcrítica, tratamento de pulverização e tratamento de vaporização. São eficazes na presente invenção tratamento de amônia, tratamento hidrotérmico, tratamento de ácido acético e tratamento de ácido sulfúrico diluído; portanto, estes métodos pré-tratamento são preferidos. Na presente invenção, biomassa que foi submetida a pré-tratamento é denominada produto pré-tratamento de biomassa. Segundo um aspecto da presente invenção, a primeira biomassa que contém celulose é preferencialmente pré-tratada em provisão para a etapa (1). Todavia, na preparação para a etapa (1) da presente invenção, o produto pré-tratamento de biomassa que foi submetido com antecedência a pré- tratamento conforme descrito acima pode ser adquirido; e este aspecto está incluído na presente invenção.

[0020] Além de sólidos derivados da biomassa que contém celulose, componentes de solução que contêm xilose estão contidos no produto pré-tratamento da biomassa que contém celulose, cujos componentes de solução são gerados por meio de hidrólise de parte da hemicelulose contida na biomassa que contém celulose. O produto pré-tratamento de acordo com a presente invenção refere-se ao produto em estado no qual ambos, resíduo sólido e componente de solução, são incluídos e em um estado em que o componente de solução que contém xilose é removido por meio de separação sólido-líquido e/ou lavagem do sólido.

[0021] Etapa (2): etapa de adição da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento em quantidade de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) para realizar hidrólise por celulase derivada de fungo filamentoso.

[0022] A presente invenção é caracterizada porque a segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento é adicionada quando o produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose é hidrolisado. A segunda biomassa que contém celulose, como a primeira biomassa que contém celulose, refere-se a biorrecursos que contêm um componente de celulose. Ela é ainda caracterizada porque suas espécies de planta ou partes de planta são diferentes da primeira biomassa que contém celulose.

[0023] Exemplos específicos preferidos da segunda biomassa que contém celulose incluem cascas de grãos. Grãos refere-se a nozes e sementes com base principalmente em amido, que incluem safras de Poaceae, safras de Fabaceae, nozes e sementes de outras plantas; e seus exemplos específicos podem incluir milho, planta de arroz, cevada e trigo, soja, soba de trigo sarraceno, Amaranthus e quinoa. Todos esses grãos correspondem a uma parte de noz-e-semente, enquanto a casca de grãos refere-se à parte da epiderme mais externa das nozes e sementes. Por exemplo, com relação a plantas de milho, trigo, soja e arroz, a parte da casca de grãos pode ser removida no processo de processamento de alimentos. Isso corresponde à produção de amido com relação ao milho, à produção de farinha de trigo com relação ao trigo, à produção de óleo de soja coem relação à soja, ao processo de polimento de arroz, em que arroz polido é uma parte comestível, com relação às plantas de arroz. Essas cascas de grãos contêm celulose e, portanto, podem ser consideradas biomassa que contém celulose gerada no processo de processamento de grãos mencionado acima. A segunda biomassa que contém celulose de maior preferência de acordo com a presente invenção são cascas de milho, cascas de soja e cascas de trigo.

[0024] Embora a segunda biomassa que contém celulose normalmente exerça efeitos suficientes, prefere-se produto pré-tratamento obtido por meio de submissão da segunda biomassa que contém celulose a tratamento hidrotérmico e/ou tratamento ácido é preferido. O pré-tratamento da segunda biomassa que contém celulose pode aumentar a eficiência de rompimento da segunda biomassa que contém celulose por uma celulase derivada de fungo filamentoso e pode aumentar simultaneamente a quantidade de celulase derivada de fungo filamentoso recuperada na etapa (3).

[0025] A segunda biomassa que contém celulose é adicionada em quantidade que varia de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose da etapa (1). Peso de teor sólido, quando utilizado neste documento, designa peso após o produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose e/ou da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento é seco a 105 °C; e a concentração de sólidos do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose e a segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento pode ser calculada de trás para frente, medindo-se o teor de água com o uso de um medidor de umidade com um sistema de medição de massa de secagem por aquecimento. Por exemplo, em casos em que o teor de água do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose é de 70% e o teor de água da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento é de 10%, a sua concentração de sólido é de 30% e 90%, respectivamente. Quanto ao produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose, peso úmido de 150 g corresponde a teor sólido de 45 g; e, quanto à quantidade da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento adicionada, teor sólido de 0,45 a 22,5 g corresponde, portanto, a peso úmido de 0,5 a 25 g.

[0026] Na presente invenção, o produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose e da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento são hidrolisados com o uso de celulase derivada de fungo filamentoso. Exemplos do fungo filamentoso incluem microorganismos do gênero Trichoderma, gênero Aspergillus, gênero Cellulomonas, gênero Chlostridium, gênero Streptomyces, gênero Humicola, gênero Acremonium, gênero Irpex, gênero Mucor e gênero Talaromyces. Além disso, pode-se utilizar celulase derivada de linhagens mutantes com produtividade aprimorada de celulase ao submeter estes micro-organismos à mutagênese com o uso de mutagênese, irradiação UV ou similares.

[0027] Entre esses fungos filamentosos, o gene Trichoderma é preferencialmente utilizado na presente invenção porque produz grande quantidade de componentes de enzima com alta atividade específica em meio de cultivo na hidrólise de celulose. Exemplos específicos da celulase derivada do gênero Trichoderma incluem celulase derivada de Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 e Trichoderma viride QM9123. Destes, celulase derivada de Trichoderma reesei é de maior preferência.

[0028] Celulase derivada de fungo filamentoso é uma composição de enzimas que possui atividade de hidrólise de celulose e/ou hemicelulose para gerar monossacarídeos como glicose ou xilose; e contém preferencialmente, como componentes de enzima, um ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em: celobio-hidrolase, endoglucanase, β-glucosidase, xilanase e β-xilosidase. Exemplos do componente de enzima da celulase derivada de Trichoderma reesei incluem celobio-hidrolase I, celobio-hidrolase II, endoglucanase I, endoglucanase III, β- glucosidase, xilanase e β-xilosidase; e estes diversos componentes de enzima são preferencialmente utilizados na presente invenção porque pode-se conduzir hidrólise eficiente de celulose e/ou hemicelulose pode ser realizada através de efeitos conjuntos ou efeitos complementares.

[0029] Celobio-hidrolase é um termo geral para enzimas que liberam celobiose por meio de hidrólise de uma cadeia de celulose. O grupo de enzimas pertencentes a celobio-hidrolase é descrito como número de EC: EC3.2.1.91. Celobio-hidrolase I inicia a reação de hidrólise a partir do lado terminal decrescente da cadeia de celulose e celobio-hidrolase II inicia a partir do lado terminal não decrescente.

[0030] Endoglucanase é um termo geral para enzimas caracterizadas por hidrolisarem celulose a partir da porção central de uma cadeia de celulose. O grupo de enzimas que pertencem à endoglucanase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.4.

[0031] β-glucosidase é um termo geral para enzimas caracterizadas por agirem sobre celo-oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas que pertencem à β-glucosidase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.21.

[0032] Xilanase é um termo geral para enzimas caracterizadas por agirem sobre hemicelulose ou, em particular, xilano. O grupo de enzimas que pertencem à xilanase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.8.

[0033] β-xilosidase é um termo geral para enzimas caracterizadas por agirem sobre xilo-oligossacarídeos. O grupo de enzimas que pertence à xilosidase é descrito como o número de EC: EC3.2.1.37.

[0034] Estes componentes de celulase são separados por uma técnica conhecida, como filtragem por gel, troca de íons ou eletroforese bidimensional e identificados por realizarem sequenciamento de aminoácido (análise N-terminal, análise C-terminal, espectrometria de massa) para o componente separado, seguido pela comparação do resultado com uma base de dados.

[0035] Além disso, a atividade enzimática de celulase derivada de fungo filamentoso pode ser avaliada com base em sua atividade hidrolítica com o uso de, como substrato, polissacarídeos tais como celulose cristalina, carboximetilcelulose (CMC), celobiose, xilano ou manana. Uma enzima principal que exibe a atividade cristalcelulolítica é celobio-hidrolase caracterizada por hidrolisar celulose a partir da porção terminal. Uma enzima principal que exibe a atividade de rompimento de celobiose é β-glucosidase. Enzimas principais que exibem a atividade de rompimento de CMC são celobio-hidrolase e endoglucanase. Enzimas principais que exibem a atividade de rompimento de xilano são xilanase e β-xilosidase. Quando utilizado neste documento, o termo “principal” é uma expressão com base no fato que a enzima é conhecida por ser mais envolvida no rompimento e significa que outros componentes de enzima além deste estão envolvidos naquele rompimento.

[0036] Como fungos filamentosos produzem celulase em um meio de cultivo, o meio de cultivo pode ser utilizado como se encontra como agente de enzima bruta; ou o grupo de enzimas pode ser purificado por meio de um método conhecido e formulado para uso como mistura de celulase derivada de fungo filamentoso. No caso em que a celulase derivada de fungo filamentoso é utilizada purificada e formulada, aquela com a adição de substâncias diferentes da enzima como inibidores de protease, dispersantes, promotores de dissolução ou estabilizantes pode ser utilizada como preparação de celulase. Dever-se-á observar que, destes, enzimas brutas são preferencialmente utilizadas na presente invenção. A enzima bruta é derivada do sobrenadante de cultivo do meio em que o fungo filamentoso é cultivado por qualquer período de tempo, em que o meio é preparado de forma que o micro-organismo produza celulase. Os componentes de meio utilizados não são particularmente restritos; e um meio com adição de celulose pode ser geralmente utilizado para promover a produção de celulase. Em seguida, como enzima bruta, é preferencialmente utilizado um líquido de cultivo normal ou o sobrenadante do cultivo obtido apenas ao remover corpo de fungo de Trichoderma.

[0037] A razão em peso de cada componente de enzima na enzima bruta não é particularmente restrita. Por exemplo, um líquido de cultivo derivado de Trichoderma reesei contém de 50 a 95% em peso de celobio- hidrolase; e os componentes restantes incluem endoglucanase, β-glucosidase e similares. Os micro-organismos do gênero Trichoderma produzem fortes componentes de celulase em um meio de cultivo. Por outro lado, com relação à β-glucosidase, a enzima é, em grande parte, mantida no interior da célula ou sobre as camadas de superfície da célula e, portanto, a atividade de β- glucosidase é baixa no meio de cultivo. Em vista disso, β-glucosidase de espécies diferentes ou da mesma espécie pode também ser adicionada à enzima bruta. Como a β-glucosidase de espécies diferentes, β-glucosidase derivada do gene Aspergillus pode ser preferencialmente utilizada. Exemplos da β-glucosidase derivada do gênero Aspergillus incluem Novozyme 188, que é disponível comercialmente por meio da Novozymes A/S. Além disso, pode ser utilizado um meio de cultivo com atividade de β-glucosidase aprimorada, em que o meio de cultivo é obtido por meio de introdução de um gene ao microorganismo do gênero Trichoderma e, em seguida, cultivo do micro-organismo do gênero Trichoderma que é modificado geneticamente para produzir o produto genético no meio de cultivo.

[0038] A concentração de sólido do produto pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose e da segunda biomassa que contém celulose ou seu produto pré-tratamento não é particularmente restrita e encontra-se preferencialmente na faixa de 1 a 30% em peso. Em vista da concentração de açúcares gerados e seu manuseio, é vantajoso estabelecer essa concentração de sólido.

[0039] A temperatura da reação de hidrólise não é particularmente restrita, desde que esteja de acordo com condições de reação preferidas para a celulase derivada de fungo filamentoso e esteja preferencialmente na faixa de 30 a 75 °C. Em particular, em casos onde é utilizada a celulase derivada do gênero Trichoderma, a temperatura também se encontra preferencialmente na faixa de 40 a 60 °C.

[0040] De forma similar, o pH da reação de hidrólise não é particularmente restrito, desde que esteja de acordo com condições de reação preferidas para a celulase derivada de fungo filamentoso; e está preferencialmente na faixa de pH 3,0 a 7,0 e, de maior preferência, na faixa de pH 4,0 a 6,0. Em casos em que a celulase derivada do gênero Trichoderma é utilizada como a celulase derivada de fungo filamentoso, o pH ideal da reação é 5,0. Além disso, como ocorrem mudanças no pH no processo de hidrólise, a reação é preferencialmente realizada com a adição de um tampão a um líquido de reação ou enquanto o pH é mantido constante utilizando-se um ácido ou alcalino.

[0041] Período de tempo para a reação de hidrólise encontra-se preferencialmente na faixa de duas horas a 200 horas. Do ponto de vista de gerar quantidade suficiente de açúcares e evitar que a celulase recuperada perca sua atividade, é vantajoso estabelecer o período de tempo para a reação de hidrólise nessa faixa.

[0042] Etapa (3): etapa de submissão do hidrolisado da etapa (2) à separação sólido-líquido para obter um componente de solução e um resíduo de hidrólise e filtragem do componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar celulase derivada de fungo filamentoso como retido e recuperar um líquido de açúcar como o permeado.

[0043] Um componente de celulase derivado de fungo filamentoso e um componente de açúcar estão contidos em um componente de solução obtido por meio da submissão do hidrolisado obtido na etapa (2) à separação sólido-líquido; e estes podem ser separados por meio de filtragem com uma membrana de ultrafiltração.

[0044] Membrana de ultrafiltração é uma membrana com corte de peso molecular de cerca de 500 a 200.000 e é abreviada como membrana UF ou similar. Além disso, o diâmetro de poro da membrana de ultrafiltração é tão pequeno que é difícil medir o diâmetro de poro fino da superfície da membrana por meio de um microscópio eletrônico ou similar; e um valor denominado corte de peso molecular, em vez de diâmetro de poro fino médio, foi utilizado como índice para o tamanho do diâmetro de poro. O corte de peso molecular refere- se àquele bem conhecido pelo técnico no assunto como índice que representa o desempenho de membrana da membrana de ultrafiltração, conforme descrito como “curva obtida ao plotar-se dados com o peso molecular do soluto ao longo do eixo horizontal e a taxa de bloqueio ao longo do eixo vertical é denominada curva de corte de peso molecular; e o peso molecular no qual a taxa de bloqueio é de 90% é denominado corte de peso molecular da membrana” em The Membrane Society of Japan ed., Membrane Experiment Series, Vol. III, Artificial Membrane, editado por Shoji Kimura, Shin-ichi, Nakao, Haruhiko Ohya e Tsutomu Nakagawa (1993, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.), página 92.

[0045] Na separação entre a celulase derivada de fungo filamentoso e o componente de açúcar com a utilização de uma membrana de ultrafiltração, o corte de peso molecular não é particularmente restrito, desde que permita a passagem de monossacarídeos, nomeadamente glicose (peso molecular 180) e xilose (peso molecular 150), que são os componentes principais de líquido de açúcar e podem bloquear a celulase derivada de fungo filamentoso. Prefere-se que o corte de peso molecular seja de 500 a 100.000. Do ponto de vista de garantir alto rendimento do componente de celulase derivada de fungo filamentoso e de separar substâncias estranhas que exibem ações inibidoras à reação enzimática do componente de celulase derivado de fungo filamentoso, o corte de peso molecular encontra-se preferencialmente na faixa de 5.000 a 50.000, de maior preferência na faixa de 10.000 a 30.000.

[0046] Como materiais da membrana de ultrafiltração, pode-se utilizar poliéter sulfona (PES), polissulfona (PS), poliacrilonitrila (PAN), difluoreto de polivinilideno (PVDF), celulose regenerada, celulose, éster de celulose, polissulfona sulfonatada, poliéter sulfona sulfonatada, poliolefina, álcool polivinílico, polimetilmetacrilato, tetrafluoreto de polietileno e similares. Como celulose regenerada, celulose e éster de celulose são submetidos a rompimento pela celulase derivada de fungo filamentoso, são preferencialmente utilizadas membranas de ultrafiltração com polímeros sintéticos como PES ou PVDF como material.

[0047] Como método de filtragem com membrana de ultrafiltração, estão disponíveis filtragem sem saída e filtragem de fluxo cruzado, em que filtragem de fluxo cruzado é preferida do ponto de vista de inibição da incrustação da membrana. Além disso, para uma forma de membrana da membrana de ultrafiltração utilizada, podem ser utilizadas aquelas em formato apropriado, como tipo de membrana plana, tipo espiral, tipo tubular ou tipo de fibra oca. Seus exemplos específicos incluem tipo G-5, tipo G-10, tipo G-20, tipo G-50, tipo PW e tipo HWSUF, que são disponíveis por meio da DESAL; HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS- U20P e MPS-U20S, que são disponíveis por meio da KOCH; SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50 e SOW30, que são disponíveis por meio da Synder; correspondentes a corte de peso molecular de 3.000 a 10.000 em Microza ® série UF que é fabricada pela Asahi Kasei Corporation; e NTR7410 e NTR7450, que são fabricados pela Nitto Denko Corporation.

[0048] A celulase derivada de fungo filamentoso que é recuperada na etapa (2) como retido de filtragem pela membrana de ultrafiltração pode ser reutilizada na etapa de hidrólise. Na presente invenção, a quantidade de celulase derivada de fungo filamentoso utilizada pode ser reduzida ao reutilizar- se a celulase recuperada para reduzir os custos da produção de líquido de açúcar. Deve-se observar que, em casos em que a biomassa que contém celulose é hidrolisada utilizando a celulase recuperada, celulase derivada de fungo filamentoso não utilizada pode ser novamente adicionada à celulase recuperada. Como aumento da quantidade de celulase derivada de fungo filamentoso recentemente adicionada funciona contra a vantagem em termos de custo, prefere-se adicionar quantidade mínima da celulase não utilizada para alcançar rendimento suficiente de açúcares.

[0049] O líquido de açúcar que é recuperado como o permeado de filtragem pela membrana de ultrafiltração é aquele com monossacarídeos de glicose e xilose como componentes principais. O líquido de açúcar é, mesmo sem nenhum outro tratamento, utilizável como matéria-prima de fermentação na etapa de fermentação descrita posteriormente; mas um tratamento de concentração para aumentar ainda mais a concentração de açúcares pode ser realizado para fins de aumentar a eficiência da etapa de fermentação. Exemplos do tratamento de concentração do líquido de açúcar podem incluir concentração de evaporação, concentração de pressão reduzida e concentração de membrana; e um líquido de açúcar concentrado no qual componentes de açúcar são concentrados pode ser obtido por meio de um método de filtragem por uma membrana de nanofiltragem e/ou membrana de osmose reversa, em que o método requer menor consumo de energia, é capaz de separar inibidores de fermentação obtidos no líquido de açúcar e é descrito em WO 2010/067785.

[0050] Os micro-organismos com capacidade de produzir substâncias químicas com o uso do líquido de açúcar obtido por meio da presente invenção como matéria-prima de fermentação podem ser cultivados para produzir várias substâncias químicas. Cultivar micro-organismos como matéria-prima de fermentação neste documento significa proliferação e crescimento sustentado de micro-organismos com o uso de componentes de açúcar ou fontes de amino contidas no líquido de açúcar como nutrientes do micro-organismo. Essas substâncias químicas são produzidas e acumuladas como substâncias químicas dentro ou fora do organismo no processo de metabolismo utilizando o componente de açúcar no líquido de açúcar como uma de carbono. Exemplos específicos da substância química podem incluir álcoois como etanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol ou glicerol; ácidos orgânicos como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico ou ácido cítrico; nucleosídeos como inosina ou gunosina, nucleotídeos como ácido inosínico ou ácido guanílico e compostos de amina como cadaverina. Além disso, o líquido de açúcar derivado de celulose de acordo com a presente invenção pode ser aplicado à produção de enzimas, antibióticos, proteínas recombinantes ou similares.

EXEMPLOS

[0051] Como forma de exemplos, a presente invenção será descrita mais especificamente abaixo. Todavia, a presente invenção não é limitada a eles.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

[0052] Medição da concentração de proteínas.

[0053] Para a concentração de proteínas, foi utilizado um reagente de medição de concentração de proteínas disponível comercialmente (teste de proteína Quick Start Bradford, fabricado pela Bio-Rad). Para cada 250 μL de reagente de medição da concentração de proteína que foram trazido de volta para a temperatura ambiente, foram adicionados 5 μL de solução de celulase diluída. A mistura foi mantida em repouso à temperatura ambiente por cinco minutos e submetida em seguida à medição de absorção a 595 nm com o uso de um leitor de microplacas (POWERSCAN HT, fabricado pela Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.). Uma solução aquosa de albumina de soro bovino foi utilizada como líquido padrão e a concentração de proteína da solução de celulase foi calculada com referência a uma curva de calibragem.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

[0054] Medição da concentração de açúcares.

[0055] A concentração de glicose e xilose que estavam contidas em um líquido de açúcar foi quantificada em condições HPLC descritas abaixo por meio de concentração com uma amostra padrão: Coluna: Luna NH2 (fabricada pela Phenomenex); Fase móvel: Mili-Q: acetonitrila = 25:75 (velocidade de fluxo de 0,6 mL/min); Método de detecção: RI (índice de refração diferencial); Temperatura: 30 °C.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

[0056] Método de medição de atividades da celulase derivada de fungo filamentoso.

[0057] Para celulases de atividades, as atividades de rompimento de (1) 4-nitrofenil-β-D-lactopiranosida (pNP-Lac) e (2) 4-nitrofenil-β-D- glucopiranosida (pNP-Glc) como as atividades de um grupo de enzimas envolvidas no rompimento de celulose e a atividade de rompimento de (3) 4- nitrofenil-β-D-xilopiranosida (pNP-Xil) como a atividade de enzimas envolvidas no rompimentoo de xilano, que é um componente principal da hemicelulose, são medidas e avaliadas por meio dos métodos exibidos abaixo. Deve-se observar que os substratos (1) a (3) acima são coletivamente denominados pNP-açúcares.

[0058] A 0,9 mL de 55 mM de tampão de ácido acético (pH 5,0) que contém cada substrato sob concentração de 1,1 mM cada, 0,1 mL de líquido de enzima foi adicionado e mantido em reação a 30 °C (a concentração final do substrato foi de 1 mM e a concentração final do tampão foi de 50 mM). O tempo de reação foi definido em 60 minutos quando o substrato era pNP- Lac, 10 minutos para pNP-Glc e 30 minutos para pNP-Xil. A reação foi realizada por um período exato de tempo para cada uma; em seguida, 0,1 mL de 2 M de solução de carbonato de sódio aquosa foi adicionado para encerrar a reação e foi medida a absorção a 405 nm (ODteste). A absorção a 405 nm também foi medida da mesma forma descrita acima para, como padrão, um preparado por meio da adição, na ordem mencionada, de 2 M de solução aquosa de carbonato de sódio e do líquido de enzima à solução de substrato (ODpadrão). A quantidade de enzima que gera 1 μmol de 4-nitrofenol por um minuto é definida como 1 U no sistema de reação acima e valor de atividade (U/mL) foi calculado de acordo com a fórmula a seguir. Deve-se observar que o coeficiente de extinção molecular milimolar de 4-nitrofenol no sistema de reação acima é de 17,2 L/mmol/cm. Atividade de rompimento de pNP-Lac (U/mL) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (mL) x fator de diluição de enzima/razão de diluição} / {17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (mL)}. Atividade de rompimento de pNP-Glc (U/mL) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (mL) x fator de diluição de enzima/razão de diluição} / {17,2 x 10 (minutos) x 0,1 (mL)}. Atividade de rompimento de pNP-Xil (U/mL) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (mL) x fator de diluição de enzima/razão de diluição} / {17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (mL)}.

EXEMPLO COMPARATIVO 1

[0059] Casos em que apenas a primeira biomassa que contém celulose é utilizada.

[0060] Etapa 1: pré-tratamento da primeira biomassa que contém celulose.

[0061] Pré-tratamento 1: tratamento de amônia da primeira biomassa que contém celulose.

[0062] A primeira biomassa que contém celulose (espiga de milho ou palha de arroz) foi colocada em um reator de tamanho pequeno (fabricado pela Taiatsu Techno Corporation, TVS-N2 30 ml) e resfriado com nitrogênio líquido. Gás amônia fluiu nesse reator e amostras foram completamente imersas em amônia líquida. A tampa do reator foi fechada e a amostra foi mantida em repouso à temperatura ambiente por cerca de 15 minutos. O tratamento foi realizado em um banho de óleo a 150 °C por uma hora. Após o tratamento, o reator foi retirado do banho de óleo; o gás amônia foi imediatamente descarregado em um exaustor e, em seguida, o interior do reator foi evacuado a 10 Pa com o uso de uma bomba a vácuo para permitir a secagem da amostra. O produto pré-tratamento da espiga de milho é designado produto pré-tratamento 1 e o produto pré-tratamento da palha de arroz foi designado produto pré-tratamento 2, os quais foram utilizados nos exemplos a seguir.

[0063] Pré-tratamento 2.

[0064] Tratamento hidrotérmico da primeira biomassa que contém celulose.

[0065] A primeira biomassa que contém celulose (espiga de milho) foi imersa em água e submetida, enquanto agitada, a tratamento com autoclave (fabricado pela Nitto Kouatsu) a 180 °C por 20 minutos. A pressão nesse período de tempo foi de 10 MPa. Após o tratamento, o resultante foi submetido à separação sólido-líquido por meio de centrifugação (3.000 G), de forma a obter um componente de solução e um sólido. O sólido foi designado produto pré-tratamento 3 e utilizado nos exemplos a seguir.

[0066] Pré-tratamento 3: tratamento de ácido sulfúrico diluído da primeira biomassa que contém celulose.

[0067]A primeira biomassa que contém celulose (palha de milho, palha de trigo ou de cevada ou bagaço) foi suspensa em uma solução aquosa de ácido sulfúrico A 2% para preparar uma calda com concentração de sólido de 30%. Essa calda foi submetida a tratamento com autoclave (fabricado pela Nitto Kouatsu) a 150 °C por 30 minutos. Após o tratamento, o resultante foi submetido à separação sólido-líquido por meio de centrifugação (3.000 g), de forma a obter um componente de solução e um sólido. O sólido obtido a partir do pré-tratamento de palha de milho foi designado produto pré-tratamento 4; o sólido obtido a partir do pré-tratamento de palha de trigo ou de cevada foi designado produto pré- tratamento 5; e o sólido obtido a partir do pré-tratamento de bagaço foi designado produto pré-tratamento 6, os quais foram utilizados nos exemplos a seguir.

[0068] Etapa 2: hidrólise por celulase derivada de fungo filamentoso.

[0069] Como celulase derivada de fungo filamentoso, utilizou-se um líquido de enzima de celulase disponível comercialmente (“Accellerase DUET”, fabricado pela Genencor). Quando a concentração de proteínas no líquido de enzima de celulase foi medido de acordo com o Exemplo de Referência 1, a concentração foi de 40 g/L.

[0070] Para o produto pré-tratamento 1 ao produto pré-tratamento 6 que foram preparados na etapa 1, 1,0 g (peso de teor de sólido) de cada um foi pesado e suspenso em 7,0 mL de água em um tubo de centrifugação de 50 mL para preparar uma calda. O pH da calda foi ajustado na faixa de 4,7 a 5,3 com ácido sulfúrico diluído ou uma solução de amônia; em seguida, 0,2 mL do líquido de enzima de celulase e água foram adicionados à calda, de forma que o peso total foi de 10 g; portanto, a concentração de sólidos tornou-se 10%. A mistura resultante foi, enquanto girada, misturada a 50 °C por 24 horas com o uso de um girador de hibridização (SN-06BN, fabricado pela Nissinrika), de forma a obter-se um hidrolisado.

[0071] Etapa 3: recuperação de celulase derivada de fungo filamentoso e líquido de açúcar.

[0072] O hidrolisado da etapa 2 foi submetido à separação sólido- líquido por meio de centrifugação (8.000 G, por 10 minutos), de forma a obter 8 g de componente de solução e 2 g de resíduo de hidrólise. O resíduo de hidrólise foi novamente suspenso em 8 mL de água e submetido novamente a centrifugação (8.000 G, por 10 minutos) para recuperar um componente de solução que permaneceu no resíduo de hidrólise. Os componentes de solução recuperados foram combinados e passaram através de uma membrana de microfiltragem (filtro de seringa de 25 mm GD/X, material: PVDF, fabricado pela GE Healthcare Japan Corporation) com tamanho de poro de 0,2 μm para remover partículas finas e, em seguida, filtrado com o uso de uma membrana de ultrafiltração (VIVASPIN20, material: PES, fabricado pela Sartorius Stedim Biotech) com corte de peso molecular de 10.000. A porção retida foi recuperada como líquido de celulase recuperado; e o permeado foi recuperado como líquido de açúcar. Com relação ao líquido de açúcar, a concentração de açúcar foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 2. Com relação ao líquido de celulase recuperado, a atividade enzimática foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3.

[0073] A concentração de açúcares é resumida na Tabela 1; e a razão entre a atividade enzimática do líquido de celulase recuperado e a do líquido de enzima de celulase de entrada, que é considerada razão residual, encontra-se na Tabela 2. TABELA 1

TABELA 2

EXEMPLO 1

[0074] Uso da segunda biomassa que contém celulose

[0075] Ao produto pré-tratamento 1 ou produto pré-tratamento 3 que foi utilizado como a primeira biomassa que contém celulose, qualquer um dos três tipos de casca de milho, casca de soja e casca de trigo (farelo de trigo) foi adicionado como a segunda biomassa que contém celulose na etapa 2 do Exemplo Comparativo 1 em quantidade de 10% com base no peso de teor sólido da primeira biomassa que contém celulose. Como resultado, foi preparada uma calda com concentração de sólido da primeira biomassa que contém celulose de 10% e concentração de sólido da segunda biomassa que contém celulose de 1%. Além do que foi descrito acima, a produção de líquido de açúcar foi realizada da mesma forma conforme descrito no Exemplo Comparativo 1, de forma a obter-se um líquido de açúcar e um líquido de celulase recuperado. Para o líquido de açúcar, a concentração de açúcares foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 2; e, para o líquido de celulase recuperado, a atividade foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3.

EXEMPLO 2

[0076] Uso do produto pré-tratamento da segunda biomassa que contém celulose.

[0077] Como a segunda biomassa que contém celulose, foi utilizado um produto de tratamento hidrotérmico ou um produto de tratamento ácido de três tipos de casca de milho, casca de soja e casca de trigo (farelo de trigo).

[0078] O produto de tratamento hidrotérmico foi obtido submetendo-se uma calda da segunda biomassa que contém celulose com concentração de sólido de 30% para tratamento com um autoclave (fabricado pela Nitto Koatsu) a 150 °C por 30 minutos.

[0079]O produto de tratamento ácido foi obtido submetendo-se uma calda da segunda biomassa que contém celulose com ácido sulfúrico a 0,5% com concentração de sólido de 30% a tratamento com autoclave (fabricado pela Nitto Koatsu) a 150 °C por 30 minutos.

[0080] A produção de um líquido de açúcar foi realizada da mesma forma descrita no Exemplo Comparativo 1, exceto pela adição do produto pré- tratamento da segunda biomassa que contém celulose em quantidade de 10% com base no peso sólido da primeira biomassa que contém celulose na etapa 2 do Exemplo Comparativo 1. Deve ser notado que, em casos em que o produto pré-tratamento 1 ou o produto pré-tratamento 3 foi utilizado como a primeira biomassa que contém celulose, foi empregado o produto de tratamento hidrotérmico ou o produto de tratamento ácido de qualquer uma dentre a segunda biomassa que contém celulose (casca de milho, casca de soja e casca de trigo). Em casos em que o produto pré-tratamento 2, o produto pré-tratamento 4, o produto pré-tratamento 5 ou o produto pré-tratamento 6 foi utilizado como a primeira biomassa que contém celulose, apenas o produto de tratamento ácido de casca de milho foi utilizado como a segunda biomassa que contém celulose. Para o líquido de açúcar e o líquido de celulase recuperado obtidos, a concentração de açúcares foi medida para o líquido de açúcar de acordo com o Exemplo de Referência 2; e, para o líquido de celulase recuperado, a atividade foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3.

[0081]A concentração de açúcares dos Exemplos 1 e 2 é resumida nas Tabelas 3, 4 e 5; e a razão residual da atividade enzimática encontra-se nas Tabelas 6, 7 e 8. A partir dos resultados, o uso da segunda biomassa que contém celulose aprimorou o rendimento de açúcares e a razão residual de atividade entre o líquido de celulase recuperado e a enzima que foi introduzida inicialmente. TABELA 3

TABELA 4

TABELA 5

TABELA 6

TABELA 7

TABELA 8

EXEMPLO 3

[0082] Influência da quantidade adicionada da segunda biomassa que contém celulose.

[0083] O produto de tratamento ácido da casca de milho foi utilizado como a segunda biomassa que contém celulose na etapa 2 do Exemplo Comparativo 1 e adicionado em quantidade de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do produto pré-tratamento 3 da primeira biomassa que contém celulose (a espiga de milho que recebeu tratamento hidrotérmico). Além do que foi descrito acima, a produção de líquido de açúcar foi realizada da mesma forma descrita no Exemplo Comparativo 1 e assim obteve-se um líquido de açúcar e um líquido de celulase recuperado. Para o líquido de açúcar, a concentração de açúcares foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 2; e, para o líquido de celulase recuperado, a atividade foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3. A concentração de açúcares encontra-se resumida na Tabela 9; e a razão residual de atividade enzimática encontra-se na Tabela 3.

[0084] A partir dos resultados, quanto maior a quantidade da segunda biomassa que contém celulose adicionada, mais aumentou o rendimento de açúcar. A razão residual de atividade do líquido de celulase recuperado para a enzima introduzida inicialmente alcançou o máximo quando a segunda biomassa que contém celulose foi adicionada em quantidade de 10% ou mais, com base no peso de teor sólido do primeiro produto pré- tratamento de biomassa que contém celulose. TABELA 9

TABELA 10

EXEMPLO 4

[0085] Produto de fermentação de ácido láctico com o uso de líquido de açúcar derivado de biomassa que contém celulose como matéria- prima de fermentação.

[0086] A linhagem de Lactococcus lactis JCM7638 foi submetida a cultivo estático sob temperatura de 37 °C por 24 horas, utilizando, como materiais de partida de fermentação, o líquido de açúcar produzido no Exemplo Comparativo 1 (líquido de açúcar 1) utilizando o produto pré-tratamento 3 (espiga de milho que recebeu tratamento hidrotérmico) como o primeiro produto pré-tratamento de biomassa que contém celulose e o líquido de açúcar produzido utilizando casca de milho que havia sido submetida a tratamento ácido como a segunda biomassa que contém celulose no Exemplo 2 (líquidon de açúcar 2). A concentração de ácido L-láctico contida no meio de cultivo foi analisada nas condições abaixo.

[0087] Coluna: Shim-Pack SPR-H (fabricado pela Shimadzu Corporation).

[0088] Fase móvel A: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (velocidade de fluxo: 0,8 mL/min).

[0089] Fase móvel B: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico, 20 mM de bis-Tris, 0,1 mM de EDTA^2Na (velocidade de fluxo: 0,8 mL/min).

[0090] Método de detecção: condutividade elétrica.

[0091] Temperatura: 45 °C.

[0092] A partir dos resultados da análise acima, confirmou-se, conforme exibido na Tabela 11, que ácido L-láctico pôde ser produzido por meio de fermentação de ácido láctico com qualquer dos líquidos de açúcar como matéria-prima de fermentação. Descobriu-se que o líquido de açúcar produzido pela presente invenção exibiu excelente rendimento de fermentação de ácido láctico. TABELA 11

[0093] O método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para produzir um líquido de açúcar que funciona como matéria-prima de fermentação a partir de biomassa que contém celulose. Além disso, o líquido de açúcar produzido na presente invenção pode ser utilizado como matéria-prima de fermentação para várias substâncias químicas.

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, caracterizado por compreender as etapas (1) a (3) a seguir: etapa (1): uma etapa de fornecimento de um produto de pré- tratamento de uma primeira biomassa que contém celulose; etapa (2): uma etapa de adição de uma segunda biomassa que contém celulose ou um produto de pré-tratamento do mesmo em uma quantidade que varia de 1 a 50% com base no peso de teor sólido do mencionado primeiro produto de pré-tratamento de biomassa que contém celulose da etapa (1) e de realização de hidrólise por uma celulase derivada de fungo filamentoso; e etapa (3): uma etapa de submissão de um hidrolisado da etapa (2) à separação sólido-líquido para obter um componente de solução e um resíduo de hidrólise e de filtragem do mencionado componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a mencionada celulase derivada de fungo filamentoso como um retido e para recuperar um líquido de açúcar como um permeado em que mencionada segunda biomassa que contém celulose é uma casca de grãos, e em que mencionada primeira biomassa que contém celulose e mencionada segunda biomassa que contém celulose diferem nas espécies de planta ou partes de planta.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo mencionado produto de pré-tratamento da mencionada segunda biomassa que contém celulose da etapa (2) ser um produto de pré-tratamento obtido por meio de submissão da mencionada segunda biomassa que contém celulose a um tratamento hidrotérmico e/ou um tratamento ácido.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela mencionada primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) ser uma biomassa herbácea ou uma biomassa arbórea.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) ser uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em palha de milho, uma espiga de milho, palha de arroz, palha de trigo, palha de cevada e bagaço.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo mencionado produto de pré-tratamento da mencionada primeira biomassa que contém celulose da etapa (1) ser pré- tratado por um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste em um tratamento ácido, um tratamento alcalino, um tratamento hidrotérmico, um tratamento de água subcrítica, um tratamento de pulverização e um tratamento de vaporização.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por mencionada primeira biomassa que contém celulose ser uma biomassa herbácea e em que mencionada segunda biomassa que contém celulose é uma casca de grãos de safra de Poaceae ou safra de Fabaceae.

7. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA SUBSTÂNCIA QUÍMICA, caracterizado por compreender a etapa de produção de um líquido de açúcar por meio do mencionado método de produção de um líquido de açúcar conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e a etapa de cultivo de um micro-organismo utilizando o líquido de açúcar obtido na mencionada etapa de produção do líquido de açúcar como uma matéria-prima de fermentação.