JPWO2015016096A1 - 自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性t細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
被験者由来の試料中に存在する(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体、または(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することを特徴とする自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法、および、リボソームタンパク質L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定する工程、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法。
Description
本発明は、自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性T細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。
関節リウマチは、全身の関節を中心に慢性炎症や組織破壊を引き起こす自己免疫性疾患で、全人口の約1%が罹患する。関節リウマチにおいては、獲得免疫細胞(T細胞やB細胞)による病的な自己免疫反応と、炎症性サイトカインによる慢性炎症が、病態の2つの柱である。炎症性サイトカインについては近年、抗サイトカイン療法によって良好なコントロールが得られるようになった。しかし、そのような場合でも病的な自己免疫反応は是正できていないために、抗サイトカイン療法中止後の疾患の再燃が大きな問題となっている。関節リウマチで起こっている病的な自己免疫反応の中心的な担い手として、CD4陽性T細胞が重要であることが指摘されてきたが、疾患惹起性CD4陽性T細胞の認識する自己抗原は長らく不明であった。そして、そのことが自己免疫反応の抗原特異的なコントロールや、疾患惹起性CD4陽性T細胞の解析を妨げていた。
これまでに、自己免疫性関節炎を引き起こすT細胞が認識する自己抗原は、特殊な免疫を行う必要のある自己免疫性関節炎の系、あるいはB細胞や自己抗体が必須の自己免疫性関節炎の系でのみ知られていた。例えば、DBA/1系統のマウスに、II型コラーゲン100mgをCFA(コンプリートフロインドアジュバント)と共に皮下投与し、さらに20日後にII型コラーゲン100mgをIFA(インコンプリートフロインドアジュバント)と共に皮下投与すると関節炎を発症させることができることが報告されている(II型コラーゲン誘導性関節炎、非特許文献1参照)この系ではCD4陽性T細胞が必要なことは分かっているが、免疫の結果体内に産生されるII型コラーゲンに対する自己抗体も関節炎を起こすことができることが知られており、II型コラーゲン特異的CD4陽性T細胞が、自己抗体非存在下で関節炎を起こすことができるかどうかははっきりしていない。
また、加齢に伴って自己免疫疾患を自然発症するK/BxNマウスでは、糖代謝酵素GPIが標的自己抗原であることが知られている(非特許文献2、3参照)この系では、自己反応性CD4陽性T細胞によるB細胞の活性化の結果GPIに対する自己抗体が産生され、その自己抗体が関節炎を引き起こすことが分かっている。ただし、この系においても、自己反応性CD4陽性T細胞は自己抗体の非存在下で関節炎を引き起こすことができない。
関節リウマチ等の自己免疫性関節炎については未だ不明な点が多く、自己免疫性関節炎を惹起する新規な自己抗原を見出すことは重要な課題である。なかでも、CD4陽性T細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原はこれまでに報告されておらず、このような自己抗原を見出すことができれば、自己免疫性関節炎のメカニズム解析および治療法の開発に繋がることが期待される。
Courtenay JS, Dallman MJ, Dayan AD, Martin A, Mosedale B. Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature 1980;283:666‐8
論文名Kouskoff, V. et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811-822 (1996).
論文名Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C. & Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science 286, 1732-1735 (1999).
本発明は、CD4陽性T細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原を見出すことを課題とする。さらに、そのような自己抗原を用いて自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供すること、およびそのような自己抗原と反応してT細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するCD4陽性T細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために以下の各発明を包含する。
[1]自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の(1)または(2)を検出することを特徴とする判定方法。
(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体
(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞
[2]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[1]に記載の判定方法。
[3]被験者が、抗CCP抗体陰性であることを特徴とする前記[1]または[2]に記載の判定方法。
[4]自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質L23aに対する抗体、またはリボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することを特徴とする使用。
[5]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[4]に記載の使用。
[6]リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[4]に記載の使用。
[7]自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞の活性化状態を測定する工程、該T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
[8]前記T細胞の活性化状態を測定する工程において、該T細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該T細胞の増殖、または該T細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする前記[7]に記載のスクリーニング方法。
[9]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[7]または[8]に記載のスクリーニング方法。
[10]リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[7]または[8]に記載のスクリーニング方法。
[11]リボソームタンパク質L23aのフラグメントであって、配列番号1で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号1で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する5アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
[12]配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[11]に記載のフラグメント。
[1]自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の(1)または(2)を検出することを特徴とする判定方法。
(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体
(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞
[2]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[1]に記載の判定方法。
[3]被験者が、抗CCP抗体陰性であることを特徴とする前記[1]または[2]に記載の判定方法。
[4]自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質L23aに対する抗体、またはリボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することを特徴とする使用。
[5]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[4]に記載の使用。
[6]リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[4]に記載の使用。
[7]自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞の活性化状態を測定する工程、該T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
[8]前記T細胞の活性化状態を測定する工程において、該T細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該T細胞の増殖、または該T細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする前記[7]に記載のスクリーニング方法。
[9]リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記[7]または[8]に記載のスクリーニング方法。
[10]リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[7]または[8]に記載のスクリーニング方法。
[11]リボソームタンパク質L23aのフラグメントであって、配列番号1で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号1で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する5アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
[12]配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする前記[11]に記載のフラグメント。
本発明により、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供することができる。また、T細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するCD4陽性T細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することができる。また、これらの方法や自己免疫性関節炎の研究に好適に用いることができるタンパク質断片を提供することができる。
本発明者らは、関節リウマチに酷似した自己免疫性関節炎を引き起こすSKGマウスを樹立し(特許第3467520号)、解析を進めてきた。SKGマウスは、T細胞シグナル伝達因子ZAP70の点突然変異を持ち、そのために胸腺でのT細胞の選択異常が起こり、関節炎を起こす自己反応性T細胞が末梢に出現して関節炎を引き起こす(Sakaguchi, N. et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature 426, 454-460, doi:10.1038/nature02119 (2003) 、Hirota, K. et al. T cell self-reactivity forms a cytokine milieu for spontaneous development of IL-17+ Th cells that cause autoimmune arthritis. The Journal of experimental medicine 204, 41-47, doi:10.1084/jem.20062259 (2007))。SKGマウスの関節炎は、CD4陽性T細胞依存的である。すなわち、CD4陽性T細胞を免疫不全マウスへ移入することで、レシピエントマウスは関節炎を発症する。
本発明者らは、後段の実施例に示すように、SKGマウスを用いて自己抗体非依存的に関節炎を惹起するCD4陽性T細胞を見出し、当該CD4陽性T細胞の認識抗原を探索した結果、CD4陽性T細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起する自己抗原としてリボソームタンパク質L23aを同定した。さらにこの自己抗原について研究を進めた結果、本願発明を完成させた。
本発明者らは、後段の実施例に示すように、SKGマウスを用いて自己抗体非依存的に関節炎を惹起するCD4陽性T細胞を見出し、当該CD4陽性T細胞の認識抗原を探索した結果、CD4陽性T細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起する自己抗原としてリボソームタンパク質L23aを同定した。さらにこの自己抗原について研究を進めた結果、本願発明を完成させた。
〔自己免疫性関節炎の判定方法〕
本発明は、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供する。本発明の判定方法は、被験者由来の試料中に存在する(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体、または(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することにより行うことができる。
本発明の判定対象である自己免疫性関節炎は、自己抗体または自己反応性T細胞によって発症する関節炎であればどのような関節炎でもよい。例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、膠原病関連関節炎などが挙げられる。好ましくは関節リウマチである。
被験者は特に限定されないが、関節炎を発症している者または関節炎の発症が疑われる者が好ましい。関節炎の発症が疑われる者としては、関節炎の自覚症状が認められる者が挙げられる。また、被験者は抗CCP抗体陰性であることが好ましい。具体的には、関節炎を発症しているが抗CCP抗体陰性の被験者、または関節炎の発症が疑われるが抗CCP抗体陰性の被験者であることが好ましい。
本発明は、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供する。本発明の判定方法は、被験者由来の試料中に存在する(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体、または(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することにより行うことができる。
本発明の判定対象である自己免疫性関節炎は、自己抗体または自己反応性T細胞によって発症する関節炎であればどのような関節炎でもよい。例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、膠原病関連関節炎などが挙げられる。好ましくは関節リウマチである。
被験者は特に限定されないが、関節炎を発症している者または関節炎の発症が疑われる者が好ましい。関節炎の発症が疑われる者としては、関節炎の自覚症状が認められる者が挙げられる。また、被験者は抗CCP抗体陰性であることが好ましい。具体的には、関節炎を発症しているが抗CCP抗体陰性の被験者、または関節炎の発症が疑われるが抗CCP抗体陰性の被験者であることが好ましい。
被験者由来の試料としては、抗体またはT細胞が含まれる試料であれば特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類を好適に用いることができる。
リボソームタンパク質L23a(以下「L23a」と記す)に対する抗体は、L23aに特異的に結合する抗体であればよい。L23aと反応するCD4陽性T細胞は、L23aと特異的に反応して活性化されるCD4陽性T細胞であればよい。
リボソームタンパク質L23a(以下「L23a」と記す)に対する抗体は、L23aに特異的に結合する抗体であればよい。L23aと反応するCD4陽性T細胞は、L23aと特異的に反応して活性化されるCD4陽性T細胞であればよい。
L23aに対する抗体の検出およびL23aと反応するCD4陽性T細胞の検出には、L23aまたはそのフラグメントを用いることができる。用いるL23aの由来は特に限定されないが、哺乳動物のL23aが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。哺乳動物のL23aはよく保存されており、少なくともヒト、アカゲザル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスのL23aのアミノ酸配列は同一である、(配列番号1)。各種動物のL23aのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば表1に示すアクセッション番号で公知のデータベース(DDBJ/GenBank/EMBL等)から取得することができる。
L23aのフラグメントは、L23aの一部からなるものであれば特に限定されないが、哺乳動物のL23aの一部からなるものであることが好ましく、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるL23aの一部であることがより好ましい。L23aのフラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、5残基以上であることが好ましい。上限は特に限定されないが、約140残基以下が好ましく、約120残基以下がより好ましく、約100残基以下がさらに好ましく、約80残基以下がさらに好ましく、約60残基以下がさらに好ましく、約40残基以下がさらに好ましく、約20残基以下が特に好ましい。
また、L23aのフラグメントは、L23aのアミノ酸配列(配列番号1)の第71位〜第90位のアミノ酸配列(LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号3)を含むフラグメントであることが好ましく、より好ましくは配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるフラグメントである。
また、L23aのフラグメントは、L23aのアミノ酸配列(配列番号1)の第71位〜第90位のアミノ酸配列(LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号3)を含むフラグメントであることが好ましく、より好ましくは配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるフラグメントである。
L23aおよびL23aのフラグメントは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、L23aまたはそのフラグメントをコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。また、L23aおよびL23aのフラグメントは、例えばin vitro転写・翻訳系を用いて製造することができる。また、L23aおよびL23aのフラグメントは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法(Fmoc法、Boc法)または液相合成法により製造することができる。
L23aに対する抗体の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に結合する抗体を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ELISA法を好適に用いることができる。ELISA法を用いてL23aに対する抗体の検出を行う場合、L23aまたはそのフラグメントをプレートに固相化し、被験者由来に血清を添加して反応させ、適当な二次抗体を用いて検出することができる。
L23aに対する抗体が陽性であることの判断基準は、例えば、関節炎に関して正常な個体(例えば、関節炎の自覚症状のないヒト)を対照とし、対照のL23aに対する抗体量に基づいて定めることができる。例えば、被験者のL23aに対する抗体を検出するための方法と同じ方法を用いて、複数の対照のL23aに対する抗体量を測定し、平均値および標準偏差(SD)を算出し、対照の平均値+3SDを基準値として、それ以下を正常、それを超えるものを陽性と判定する方法が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。対照の抗体量を背景データとして蓄積し、蓄積データを用いて基準値を算出することもできる。
L23aと反応するCD4陽性T細胞の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に反応するT細胞を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、L23aと反応することにより炎症性サイトカインを分泌する細胞を検出する方法、L23a反応性CD4陽性T細胞の増殖を検出する方法、活性化表面マーカー(CD154など)を検出する方法などを好適に用いることができる。具体的には、例えば、被験者の血液から公知の方法でCD4陽性T細胞を分離し、得られた細胞をL23aまたはそのフラグメントと接触させ、炎症性サイトカインを分泌する細胞をフローサイトメーターで検出する方法などが挙げられる。炎症性サイトカインとしては、IFN−γ、TNF−α、IL−1、IL−6,IL−8、IL−12、IL17、IL−18などが挙げられる。
L23aと反応するCD4陽性T細胞が検出された場合に、当該被験者はL23a反応性CD4陽性T細胞が陽性であると判断できる。
L23aに対する抗体およびL23aと反応するCD4陽性T細胞の少なくとも一方が陽性と判断された場合、被験者は自己免疫性関節炎の発症している、または自己免疫性関節炎を発症する見込みがあると判定することができる。自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できることにより、より早期の効果的な治療介入、あるいはより慎重な経過観察による疾患発症の判定が可能となる。
さらに、抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者血清の過半数にL23aに対する抗体が検出されたことから(実施例参照)、本発明の判定方法は、関節炎を発症しているが抗CCP抗体陰性の者または関節炎の発症が疑われるが抗CCP抗体陰性の者を対象とすることができ、これらの被験者における自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できる点で、非常に有用である。
さらに、抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者血清の過半数にL23aに対する抗体が検出されたことから(実施例参照)、本発明の判定方法は、関節炎を発症しているが抗CCP抗体陰性の者または関節炎の発症が疑われるが抗CCP抗体陰性の者を対象とすることができ、これらの被験者における自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できる点で、非常に有用である。
〔スクリーニング方法〕
本発明は、自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞の活性化状態を測定する工程、該T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。
本発明は、自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞の活性化状態を測定する工程、該T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。
本発明のスクリーニング方法を適用する被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
L23aと反応するT細胞(以下「L23a反応性T細胞」と記す)は、自己免疫性関節炎患者から、上記のL23aと反応するCD4陽性T細胞の検出方法に準じて採取することができる。また、L23a反応性T細胞は、L23aを特異的に認識するT細胞受容体遺伝子を、T細胞受容体を発現していないT細胞株(例えば5KC−73.8.20)に導入することにより、作製することができる(実施例参照)。
L23aと反応するT細胞(以下「L23a反応性T細胞」と記す)は、自己免疫性関節炎患者から、上記のL23aと反応するCD4陽性T細胞の検出方法に準じて採取することができる。また、L23a反応性T細胞は、L23aを特異的に認識するT細胞受容体遺伝子を、T細胞受容体を発現していないT細胞株(例えば5KC−73.8.20)に導入することにより、作製することができる(実施例参照)。
L23a反応性T細胞に被験物質を接触させる工程において、L23a反応性T細胞に被験物質を接触させる方法は、細胞と被験物質とが接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、L23a反応性T細胞を培養している培地に被験物質を添加する方法、L23a反応性T細胞を培養している培地を被験物質を含有する培地と交換する方法などが挙げられる。なお、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
また、L23a反応性T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる工程において、L23a反応性T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる方法も特に限定されず、L23a反応性T細胞を培養している培地にL23aまたはそのフラグメントを添加する方法、L23a反応性T細胞を培養している培地をL23aまたはそのフラグメントを含有する培地と交換する方法などが挙げられる。
また、L23a反応性T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる工程において、L23a反応性T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる方法も特に限定されず、L23a反応性T細胞を培養している培地にL23aまたはそのフラグメントを添加する方法、L23a反応性T細胞を培養している培地をL23aまたはそのフラグメントを含有する培地と交換する方法などが挙げられる。
L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、および、L23a反応性T細胞にL23aまたはそのフラグメントを接触させる工程は、どちらを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。すなわち、L23a反応性T細胞に対して被験物質を接触させた後にL23aまたはそのフラグメントを接触させてもよく、L23a反応性T細胞に対してL23aまたはそのフラグメントを接触させた後に被験物質を接触させてもよく、L23a反応性T細胞に対して被験物質とL23aまたはそのフラグメントを同時に接触させてもよい。
L23a反応性T細胞の活性化状態を測定する工程において、測定対象は、L23a反応性T細胞の活性化状態の指標となるものであれば特に限定されない。例えば、L23a反応性T細胞から分泌される炎症性サイトカインの測定、L23a反応性T細胞の増殖の測定、L23a反応性T細胞の活性化表面マーカーの測定などを好適に用いることができる。
測定対象がL23a反応性T細胞から分泌される炎症性サイトカインである場合、L23a反応性T細胞の活性化状態を測定する工程において、L23a反応性T細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定すればよい。測定対象の炎症性サイトカインは特に限定されず、上記に例示した公知の炎症性サイトカイン中から一種または二種以上を適宜選択すればよい。炎症性サイトカインの測定方法も特に限定されず、測定対象の炎症性サイトカインを測定できる公知の方法(例えば、ウエスタンブロット法、EIA法、ELISA法、RIA法など)から適宜選択すればよい。
また、L23a反応性T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における炎症性サイトカイン分泌量と比較して、被験物質を接触させた場合に炎症性サイトカイン分泌量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が炎症性サイトカイン分泌量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の炎症性サイトカイン分泌量と比較して50%以下にさせる被験物質が好ましく、25%以下にさせる被験物質がより好ましい。
測定対象がL23a反応性T細胞の増殖である場合、L23a反応性T細胞の活性化状態を測定する工程において、L23a反応性T細胞の増殖を測定すればよい。L23a反応性T細胞の増殖を測定する方法は特に限定されず、公知の細胞増殖測定方法のなかから適宜選択して用いることができる。例えば、トリチウム化チミジンの取り込み測定によるもの、CFSEラベルによる分裂の検出などを挙げることができる。
また、L23a反応性T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における細胞増殖量と比較して、被験物質を接触させた場合に細胞増殖量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が細胞増殖量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の細胞増殖量と比較して50%以下にさせる被験物質が好ましく、25%以下にさせる被験物質がより好ましい。
測定対象がL23a反応性T細胞の活性化表面マーカーである場合、L23a反応性T細胞の活性化状態を測定する工程において、L23a反応性T細胞の活性化表面マーカーを測定すればよい。対象となる活性化表面マーカーは特に限定されず、例えばCD154などが挙げられる。表面マーカーを測定する方法は特に限定されず、細胞表面マーカーを測定できる公知の方法(例えば、フローサイトメーターを用いる方法など)から適宜選択すればよい。
また、L23a反応性T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における活性化表面マーカー量と比較して、被験物質を接触させた場合に活性化表面マーカー量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が活性化表面マーカー量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の活性化表面マーカー量と比較して50%以下にさせる被験物質が好ましく、25%以下にさせる被験物質がより好ましい。
〔スクリーニングにより得られた物質を含有する医薬〕
上記、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。したがって、本発明には、L23a反応性T細胞の活性化を抑制する物質を有効成分とする自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬が含まれる。
上記、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。したがって、本発明には、L23a反応性T細胞の活性化を抑制する物質を有効成分とする自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬が含まれる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を、自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬の有効成分として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記L23a反応性T細胞の活性化を抑制する物質またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例えば、エタノール等)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート80、HCO−50等)などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記SIK3の発現または機能を抑制する物質またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
〔フラグメントの利用〕
本発明は、L23aのフラグメントを提供する。本発明のフラグメントは、上記本発明の判定方法において、L23aに対する抗体の検出およびL23aと反応するCD4陽性T細胞の検出に用いることができる。また、本発明のフラグメントは、自己抗体非依存的に関節炎を惹起するCD4陽性T細胞の解析、自己抗体非依存的に関節炎のメカニズム解析等の基礎研究に用いることができる。
本発明は、L23aのフラグメントを提供する。本発明のフラグメントは、上記本発明の判定方法において、L23aに対する抗体の検出およびL23aと反応するCD4陽性T細胞の検出に用いることができる。また、本発明のフラグメントは、自己抗体非依存的に関節炎を惹起するCD4陽性T細胞の解析、自己抗体非依存的に関節炎のメカニズム解析等の基礎研究に用いることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔関節炎を引き起こすT細胞のT細胞受容体のクローニング〕
制御性T細胞の特異的転写因子であるFoxp3とEGFPとの融合蛋白質をコードする融合遺伝子をノックインしたefoxマウスを作製した。efoxマウスは、制御性T細胞をEGFPのシグナルによって簡便に検出することができる。このefoxマウスと、自己免疫性関節炎モデルマウスであるSKGマウスとを掛け合わせて、efoxSKGマウスを作製し、SPF環境下で飼育した。efoxSKGマウスは、約3か月間飼育後に関節炎を自然発症した。
制御性T細胞の特異的転写因子であるFoxp3とEGFPとの融合蛋白質をコードする融合遺伝子をノックインしたefoxマウスを作製した。efoxマウスは、制御性T細胞をEGFPのシグナルによって簡便に検出することができる。このefoxマウスと、自己免疫性関節炎モデルマウスであるSKGマウスとを掛け合わせて、efoxSKGマウスを作製し、SPF環境下で飼育した。efoxSKGマウスは、約3か月間飼育後に関節炎を自然発症した。
関節炎を発症したefoxSKGマウスの関節局所から、エフェクターCD4陽性T細胞を分取した。具体的には、足関節から滑膜組織を分離して、Liberase TM(ロシュ)含有RPMI1640にて37℃1時間分解させた。その組織をナイロンメッシュに通し、単細胞浮遊液を調製した。Moflo cell sorterサイクロン装置を用いて、GFP陰性CD4陽性T細胞を96ウェルPCRプレート上に単一細胞分取した。そのプレートは使用まで−80℃で保存した。
分取したGFP陰性CD4陽性T細胞の単一細胞からT細胞受容体をnested PCR法でクローニングした。具体的には、5μL/ウェルのリアクションミックス[100 mg/ mLゼラチン、0.1 % Triton X-100、4U/ mL RNAsin、125ng OligodT (プロメガ)、0.5mM dNTPs、5U/ mL Multiscribe RT enzyme、1xRT Buffer(High Throughput cDNA kit、アプライドバイオシステムズ)]を添加し、25℃10分間、37℃2時間、85℃5分間反応させて、逆転写を行った。反応液のうち2μLずつをT細胞受容体α鎖、β鎖遺伝子の増幅に用いた。95℃1分後、95℃30秒、50℃1分、72℃30秒を5サイクル、95℃30秒、58℃1分、72℃30秒を30サイクルの後、72℃5分を行った後、より内側のプライマーを使用して同様のPCRをもう一度行った。このクローニングしたT細胞受容体遺伝子を、T細胞受容体発現用レトロウイルスベクター(Lennon, G. P. et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity 31, 643-653, doi:10.1016/j.immuni.2009.07.008 (2009))へサブクローニングした。α鎖はMfeIおよびStuI制限酵素認識部位、β鎖はBamHIおよびXhoI制限酵素認識部位を用いてサブクローニングした。約150個の単一細胞から、それぞれT細胞受容体遺伝子をクローニングした。
作製したレトロウイルスベクターを用いて、レトロジェニックマウスを作製した。このベクタープラスミドを、Plat−E細胞株へFugene 6 transfection reagent (ロシュ)を用いて遺伝子導入した。48時間後、72時間後にレトロウイルスを含んだ上清を回収して、0.45μmフィルターに通してゴミを取り除いた。
T細胞、B細胞を欠損し、SKG変異を有するRAG2ノックアウトマウス(SKGマウスとRAG2ノックアウトマウスを掛け合わせて作製)へ150mg/kgの5−fluorouracilを腹腔内投与した。4日後に骨髄細胞を回収して、赤血球細胞を除いた。その後、IL−3(20ng/mL)、IL−6(40ng/mL)、SCF(50ng/mL)(ペプロテック)の存在下で、20%牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、2−ME添加DMEM溶液で骨髄細胞を2×106個/mLの濃度で培養した。培養2日目、3日目に、前記レトロウイルス含有上清にIL−3(20ng/mL)、IL−6(40ng/mL)、SCF(50ng/mL)およびポリブレン(4μg/mL)を添加した培地に交換した後、700g、32℃、90分間遠心することにより、レトロウイルスを骨髄細胞へ感染させた。培養4日目に、その骨髄細胞を、600rad放射線照射したRAG2ノックアウトマウスへ静脈内注射した。1種類のレトロウイルスをそれぞれ感染させたレトロジェニックマウスを約30種作製した。
T細胞、B細胞を欠損し、SKG変異を有するRAG2ノックアウトマウス(SKGマウスとRAG2ノックアウトマウスを掛け合わせて作製)へ150mg/kgの5−fluorouracilを腹腔内投与した。4日後に骨髄細胞を回収して、赤血球細胞を除いた。その後、IL−3(20ng/mL)、IL−6(40ng/mL)、SCF(50ng/mL)(ペプロテック)の存在下で、20%牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、2−ME添加DMEM溶液で骨髄細胞を2×106個/mLの濃度で培養した。培養2日目、3日目に、前記レトロウイルス含有上清にIL−3(20ng/mL)、IL−6(40ng/mL)、SCF(50ng/mL)およびポリブレン(4μg/mL)を添加した培地に交換した後、700g、32℃、90分間遠心することにより、レトロウイルスを骨髄細胞へ感染させた。培養4日目に、その骨髄細胞を、600rad放射線照射したRAG2ノックアウトマウスへ静脈内注射した。1種類のレトロウイルスをそれぞれ感染させたレトロジェニックマウスを約30種作製した。
作製されたレトロジェニックマウスは、T細胞上のT細胞受容体として、レトロウイルスベクターによって導入、発現された単一ペアのT細胞受容体のみを発現する。各レトロジェニックマウスが関節炎を発症するかどうかを観察することにより、そのレトロジェニックマウスの持つT細胞受容体が関節炎惹起能を持つかどうかを検証することができる。
作製したレトロジェニックマウスをSPF環境下で飼育し、関節炎を自然発症する個体を見出した。関節炎を発症したマウスの写真を図1(A)および(B)に示した。さらに、当該マウスに感染させたレトロウイルスを解析し、関節炎惹起性T細胞受容体のアミノ酸配列を特定した(図2参照)。図2中「14D-3/DV8*03」、「40*01」、「10*01」および「2-1*01」と示された配列は、例えばデータベースIMGT/LIGM−DB(http://www.imgt.org/ligmdb/)から取得することができる。
作製したレトロジェニックマウスをSPF環境下で飼育し、関節炎を自然発症する個体を見出した。関節炎を発症したマウスの写真を図1(A)および(B)に示した。さらに、当該マウスに感染させたレトロウイルスを解析し、関節炎惹起性T細胞受容体のアミノ酸配列を特定した(図2参照)。図2中「14D-3/DV8*03」、「40*01」、「10*01」および「2-1*01」と示された配列は、例えばデータベースIMGT/LIGM−DB(http://www.imgt.org/ligmdb/)から取得することができる。
〔関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原の同定〕
上記により見出した関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原の候補の絞り込みを以下のように行った。
まず、関節炎を起こすことを確認した上記のT細胞受容体遺伝子を、T細胞受容体を発現していない、T細胞株5KC−73.8.20へ、上記のレトロウイルスベクター含有上清を用いて同じ方法で遺伝子導入した。この細胞株は、T細胞受容体からの刺激によってIL−2を産生することが知られている。次に、BALB/cマウスの脾臓細胞から、MACSビーズ(ミルテニー社)により、CD11c+細胞、CD11b+細胞を、MACSシステムで濃縮、回収し、抗原提示細胞(APC)を調製した。
他方、関節炎を発症したSKGマウス関節滑膜細胞の細胞破砕液を調製し、NATIVE−PAGE法を用いて各バンドに分離し、各バンドを切り出してそれぞれに含まれるタンパク質を抽出した。
上記により見出した関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原の候補の絞り込みを以下のように行った。
まず、関節炎を起こすことを確認した上記のT細胞受容体遺伝子を、T細胞受容体を発現していない、T細胞株5KC−73.8.20へ、上記のレトロウイルスベクター含有上清を用いて同じ方法で遺伝子導入した。この細胞株は、T細胞受容体からの刺激によってIL−2を産生することが知られている。次に、BALB/cマウスの脾臓細胞から、MACSビーズ(ミルテニー社)により、CD11c+細胞、CD11b+細胞を、MACSシステムで濃縮、回収し、抗原提示細胞(APC)を調製した。
他方、関節炎を発症したSKGマウス関節滑膜細胞の細胞破砕液を調製し、NATIVE−PAGE法を用いて各バンドに分離し、各バンドを切り出してそれぞれに含まれるタンパク質を抽出した。
上記のT細胞受容体遺伝子を導入したT細胞株(5×104個/ウェル)と上記抗原提示細胞(5×104個/ウェル)を、96ウェルラウンドボトムプレートに播種し、上記各バンドから抽出したタンパク質を加えて共培養した。24時間培養後、上清中のIL−2濃度を、ELISA(ebioscience)を用いて測定した。IL−2濃度が有意に上昇したバンドを候補バンドとして選択した。
候補バンドからの抽出タンパク質を質量分析に供し、その結果から複数の候補タンパク質を絞り込んだ。
候補バンドからの抽出タンパク質を質量分析に供し、その結果から複数の候補タンパク質を絞り込んだ。
候補タンパク質について、それぞれ組み換えタンパク質を作製し、上記のT細胞株と抗原提示細胞の共培養系に添加して、関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原であるか否かをIL−2濃度の上昇を指標に確認した。その結果、L23a(60S ribosomal protein L23a)を添加したときに、IL−2濃度が上昇することを見出した。
〔L23aによる関節炎惹起性T細胞受容体の活性化〕
ヒトL23aをコードするDNA(配列番号2、ACCESSION:NM_000984)のコード領域を発現ベクターpGEX−6P1へ挿入した。この発現ベクターを大腸菌に導入し、LB培地を用いて37℃で培養した。0.1mMのIPTG存在下、25℃で5時間培養することによりタンパク質の発現を誘導した。その後、1%TritonX−100含有PBSを用いて細菌を溶解し、ソニケーションによりタンパク質を溶解させた。得られたタンパク質を、Glutathione−Sepharose fastflow beadsで精製し、組み換えGST−L23aを得た。コントロールとして用いるGSTの組み換えタンパク質は遺伝子導入していないpGEX−6P1ベクターから同様の方法で作製した。
ヒトL23aをコードするDNA(配列番号2、ACCESSION:NM_000984)のコード領域を発現ベクターpGEX−6P1へ挿入した。この発現ベクターを大腸菌に導入し、LB培地を用いて37℃で培養した。0.1mMのIPTG存在下、25℃で5時間培養することによりタンパク質の発現を誘導した。その後、1%TritonX−100含有PBSを用いて細菌を溶解し、ソニケーションによりタンパク質を溶解させた。得られたタンパク質を、Glutathione−Sepharose fastflow beadsで精製し、組み換えGST−L23aを得た。コントロールとして用いるGSTの組み換えタンパク質は遺伝子導入していないpGEX−6P1ベクターから同様の方法で作製した。
上記のT細胞受容体遺伝子を導入したT細胞株、上記の抗原提示細胞(APC)、組み換えGST−L23a、組み換えGSTおよびマウス骨髄腫細胞(B細胞)株P3U1の細胞破砕液(ポジティブコントロール)を用い、以下の表1の試験群を設けた。各細胞を96ウェルラウンドボトムプレートに播種し、試験物質を添加した培地を加えて24時間培養後、上清中のIL−2濃度を、ELISA(ebioscience)を用いて測定した。なお、本発明者は、本実験に先立って、今回クローニングした関節炎惹起性T細胞受容体がP3U1細胞破砕液に反応することを確認していたため、P3U1細胞破砕液をポジティブコントロールとして使用した。細胞破砕液は以下のように調製した。すなわち、1×107個の細胞を1mLのPBSに懸濁し、液体窒素で凍結後融解した。続いて、ソニケーション30秒を3回繰り返し、15000rpmで15分遠心分離し、上清を細胞破砕液として使用した。
結果を図3に示した。図3から明らかなように、GST−L23aは濃度依存的に関節炎惹起性T細胞受容体を活性化することが示された。
結果を図3に示した。図3から明らかなように、GST−L23aは濃度依存的に関節炎惹起性T細胞受容体を活性化することが示された。
〔L23aの抗原フラグメントの同定〕
L23aのアミノ酸配列(配列番号1)に基づいて、約20アミノ酸残基からなる各種ペプチドを定法に従い合成した。上記のT細胞受容体遺伝子を導入したT細胞株、上記の抗原提示細胞(APC)、合成した各種のペプチドおよび上記組み換えGST−L23a(L23a全長)を用いて、上記と同様に、各細胞を96ウェルラウンドボトムプレートに播種し、ペプチドまたはGST−L23aを添加した培地を加えて24時間培養後、上清中のIL−2濃度を、ELISA(ebioscience)を用いて測定した。なお、ペプチドの濃度は50μg/mL、GST−L23aの濃度は100μg/mLとした。
図4に結果を示した。図4から明らかなように、L23a71−90が顕著にIL−2濃度を上昇させた。一方、L23a6−25はIL−2濃度を上昇させなかった。図に示していないが、L23a71−90以外のペプチドは、いずれもL23a6−25と同様の結果であった。この結果から、L23aの第71位〜第90位のアミノ酸配列(LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号3)からなるフラグメントが関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原であることが明らかとなった。
L23aのアミノ酸配列(配列番号1)に基づいて、約20アミノ酸残基からなる各種ペプチドを定法に従い合成した。上記のT細胞受容体遺伝子を導入したT細胞株、上記の抗原提示細胞(APC)、合成した各種のペプチドおよび上記組み換えGST−L23a(L23a全長)を用いて、上記と同様に、各細胞を96ウェルラウンドボトムプレートに播種し、ペプチドまたはGST−L23aを添加した培地を加えて24時間培養後、上清中のIL−2濃度を、ELISA(ebioscience)を用いて測定した。なお、ペプチドの濃度は50μg/mL、GST−L23aの濃度は100μg/mLとした。
図4に結果を示した。図4から明らかなように、L23a71−90が顕著にIL−2濃度を上昇させた。一方、L23a6−25はIL−2濃度を上昇させなかった。図に示していないが、L23a71−90以外のペプチドは、いずれもL23a6−25と同様の結果であった。この結果から、L23aの第71位〜第90位のアミノ酸配列(LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号3)からなるフラグメントが関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原であることが明らかとなった。
〔関節炎惹起性T細胞受容体発現レトロジェニックマウス血清における抗L23a抗体の検出〕
関節炎を発症したレトロジェニックマウス(L23aを認識する関節炎惹起性T細胞受容体発現レトロジェニックマウス)から採血し、血清を得た。
P3U1細胞破砕液、組み換えGST−L23aまたは組み換えGST−ヒストン1.2を2ME含有サンプルバッファーに添加し、95℃で5分間加熱した。15%のポリアクリルアミドゲルを用いて20mA75分間電気泳動し、その後90Vで30分間、Immobilon−P Transfer Membrane(Millipore)に転写した。転写した膜に200倍希釈した血清を反応させ、洗浄後、2次抗体としてHRP標識抗マウスIgG1抗体を2000倍希釈で反応させた。洗浄後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagentを用いて発色させ、LAS−4000miniを用いて検出した。
なお、ヒストンH1.2は、今回クローニングした関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原候補に含まれていたが、反応性がないことが確認されたタンパク質であり、マウスヒストンH1.2をコードするDNA(ACCESSION:NM_015786)のコード領域を発現ベクターpGEX−6P1へ挿入し、GST−L23aと同様の方法でGSTタグを付加した組み換えタンパク質として調製した。
関節炎を発症したレトロジェニックマウス(L23aを認識する関節炎惹起性T細胞受容体発現レトロジェニックマウス)から採血し、血清を得た。
P3U1細胞破砕液、組み換えGST−L23aまたは組み換えGST−ヒストン1.2を2ME含有サンプルバッファーに添加し、95℃で5分間加熱した。15%のポリアクリルアミドゲルを用いて20mA75分間電気泳動し、その後90Vで30分間、Immobilon−P Transfer Membrane(Millipore)に転写した。転写した膜に200倍希釈した血清を反応させ、洗浄後、2次抗体としてHRP標識抗マウスIgG1抗体を2000倍希釈で反応させた。洗浄後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagentを用いて発色させ、LAS−4000miniを用いて検出した。
なお、ヒストンH1.2は、今回クローニングした関節炎惹起性T細胞受容体の認識抗原候補に含まれていたが、反応性がないことが確認されたタンパク質であり、マウスヒストンH1.2をコードするDNA(ACCESSION:NM_015786)のコード領域を発現ベクターpGEX−6P1へ挿入し、GST−L23aと同様の方法でGSTタグを付加した組み換えタンパク質として調製した。
結果を図5に示した。図5中、左側の矢印はGST−L23aのバンドの位置を表し、右側の矢印は血清中の抗体が結合したP3U1細胞破砕液中のタンパク質の位置を表す。GST−ヒストン1.2に結合する抗体が存在しなかったことから、L23aを認識する関節炎惹起性T細胞受容体発現レトロジェニックマウスの血清中に、L23aを認識する抗体が多量に存在することが明らかとなった。
〔関節リウマチ患者血清における抗L23a抗体の検出〕
関節リウマチ患者374例、関節リウマチに罹患していない正常人80例から血液を採取し、血清を得た。
組み換えGST−L23aまたは組み換えGSTをPBSに溶解し、200ng/mLの溶液を調製した。ELISA用ポリソーププレート(商品名、Nunc)のウェルにそれぞれ添加して、4℃で16時間吸着させた。0.05%Tween20含有PBSで5回洗浄後、1%BSA含有PBSで1時間ブロッキングした。その後同様に5回洗浄し、1%BSA含有PBSで500倍に希釈した血清を100μLずつ各ウェルに添加した。室温で2時間放置し、5回洗浄した後、HRP標識抗ヒトIgG(H+L)(1%BSA含有PBSで4000倍に希釈したもの)を添加し1時間室温で放置した。5回洗浄した後、TMBを加えて15分後にOD450nmの値を測定した。GST−L23aのOD値からGSTのOD値を引いた値をL23aに対する抗体のOD値とした。
関節リウマチ患者374例、関節リウマチに罹患していない正常人80例から血液を採取し、血清を得た。
組み換えGST−L23aまたは組み換えGSTをPBSに溶解し、200ng/mLの溶液を調製した。ELISA用ポリソーププレート(商品名、Nunc)のウェルにそれぞれ添加して、4℃で16時間吸着させた。0.05%Tween20含有PBSで5回洗浄後、1%BSA含有PBSで1時間ブロッキングした。その後同様に5回洗浄し、1%BSA含有PBSで500倍に希釈した血清を100μLずつ各ウェルに添加した。室温で2時間放置し、5回洗浄した後、HRP標識抗ヒトIgG(H+L)(1%BSA含有PBSで4000倍に希釈したもの)を添加し1時間室温で放置した。5回洗浄した後、TMBを加えて15分後にOD450nmの値を測定した。GST−L23aのOD値からGSTのOD値を引いた値をL23aに対する抗体のOD値とした。
結果を図6に示した。図中Controlは正常人、RAは関節リウマチ患者を表す。単位(U/mL)は、1例の陽性の血清を基準に任意に設定したものである。正常人の平均値の+3SD以下(図中の破線以下)を正常値と判定し、それを超えるものを陽性と判定した。図6に示したように、正常人は80例中1例のみが陽性であったが、関節リウマチ患者は374例中64例が陽性であった。t検定でp値が0.0012と有意差を持っていた。
〔関節リウマチ患者の関節液中のL23a反応性T細胞の検出〕
関節リウマチ患者1名から関節液を採取した。健常人1名から血液を採取した。それぞれ関節液および血液から単核球を分離した。具体的には、関節液または血液にフィコールを加え、2200rpmで20分間遠心して単核球を分離、回収した。得られた単核球を1×106個/ウェルで96ウェルプレートに播種し、培地に組み換えGSTまたは組み換えGST−L23aを100μg/mL添加して、24時間培養した。培養終了6時間前にBrefeldinAを1μg/mLとなるように加え、サイトカインの分泌を止めた。細胞を回収後、一般的なサイトカイン染色法によりIL−17AおよびIFN−γを染色し、フローサイトメーターで検出した。
関節リウマチ患者1名から関節液を採取した。健常人1名から血液を採取した。それぞれ関節液および血液から単核球を分離した。具体的には、関節液または血液にフィコールを加え、2200rpmで20分間遠心して単核球を分離、回収した。得られた単核球を1×106個/ウェルで96ウェルプレートに播種し、培地に組み換えGSTまたは組み換えGST−L23aを100μg/mL添加して、24時間培養した。培養終了6時間前にBrefeldinAを1μg/mLとなるように加え、サイトカインの分泌を止めた。細胞を回収後、一般的なサイトカイン染色法によりIL−17AおよびIFN−γを染色し、フローサイトメーターで検出した。
結果を図7に示した。関節リウマチ患者の関節液中にはGST−L23aに反応して炎症性サイトカインであるIL−17AやIFN−γを分泌する細胞が検出された(右下)。一方、健常人の血液中にはGST−L23aに反応して炎症性サイトカインを分泌する細胞は検出されなかった。
〔抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者血清における抗L23a抗体の検出〕
抗CCP抗体(抗環状シトルリン化ペプチド抗体)は、関節リウマチ患者において陽性率が90%を超え、非常に感度の高い関節リウマチの診断マーカーとして広く用いられている。しかし、約10%の関節リウマチ患者では陰性であることが知られている。
そこで、抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者59例から血液を採取して血清を得、上記〔関節リウマチ患者血清における抗L23a抗体の検出〕に記載の方法(ELISA法)を用いて、血清中の抗L23a抗体を測定した。
抗CCP抗体(抗環状シトルリン化ペプチド抗体)は、関節リウマチ患者において陽性率が90%を超え、非常に感度の高い関節リウマチの診断マーカーとして広く用いられている。しかし、約10%の関節リウマチ患者では陰性であることが知られている。
そこで、抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者59例から血液を採取して血清を得、上記〔関節リウマチ患者血清における抗L23a抗体の検出〕に記載の方法(ELISA法)を用いて、血清中の抗L23a抗体を測定した。
結果を図8に示した。正常値の上限は上記〔関節リウマチ患者血清における抗L23a抗体の検出〕において設定した数値を採用した。図8に示したように、59例中32例(54%)が陽性であった。抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者の過半数において抗L23a抗体が検出されたことから、本発明の判定方法の有用性が示された。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (12)
- 自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の(1)または(2)を検出することを特徴とする判定方法。
(1)リボソームタンパク質L23aに対する抗体
(2)リボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞 - リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項1に記載の判定方法。
- 被験者が、抗CCP抗体陰性であることを特徴とする請求項1または2に記載の判定方法。
- 自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質L23aに対する抗体、またはリボソームタンパク質L23aと反応するCD4陽性T細胞を検出することを特徴とする使用。
- リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項4に記載の使用。
- リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする請求項4に記載の使用。
- 自己免疫性関節炎惹起性T細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質L23aと反応するT細胞に被験物質を接触させる工程、該T細胞にリボソームタンパク質L23aまたはそのフラグメントを接触させる工程、該T細胞の活性化状態を測定する工程、該T細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
- 前記T細胞の活性化状態を測定する工程において、該T細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該T細胞の増殖、または該T細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする請求項7に記載のスクリーニング方法。
- リボソームタンパク質L23aが配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項7または8に記載のスクリーニング方法。
- リボソームタンパク質L23aのフラグメントが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする請求項7または8に記載のスクリーニング方法。
- リボソームタンパク質L23aのフラグメントであって、配列番号1で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号1で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する5アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の第71位〜第90位を含むことを特徴とする請求項11に記載のフラグメント。
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