TW201309727A - 兩單元抗原呈現組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種抗原呈現組合物，包含複數個兩單元第一型主要組織相容性複合體及一載體。本發明亦提供一種活化抗原特異性CD8+ T細胞的方法，包含將初始CD8+ T細胞與該抗原呈現組合物進行培養。本發明進一步提供一種引發抗原特異性CD8+ T細胞增生的方法，包含將初始CD8+ T細胞與該抗原呈現組合物進行培養。

Description

兩單元抗原呈現組合物及其用途

本發明係關於一種抗原呈現組合物。特定而言，本發明係關於一種包含兩單元第一型主要組織相容性複合體的抗原呈現組合物、一種以其活化CD8⁺ T細胞的方法及一種以其引發CD8⁺ T細胞增生的方法。

人類白血球抗原

人類白血球抗原(human leukocyte antigens，HLAs)亦稱為人類主要組織相容性複合體分子(human major histocompatibility complex(hMHC) molecules)，其係由人類第6條染色體(21.31 p)上位於連續區域內的一群MHC基因所編碼。HLA蛋白質的主要功能為免疫系統中細胞與細胞間的辨識與自體及異體辨別(self-non-self discrimination)。HLA主要可分為兩個群組：第一型HLA及第二型HLA。第一型HLA分子表現在多數有核細胞表面，並將胜肽呈現給CD8⁺ T細胞以刺激其功能；其中，上述胜肽多產生自內在路徑(endogenous route)，但有時亦來自外在路徑(exogenous route)。受刺激的CD8⁺ T細胞可辨識受感染的細胞或腫瘤細胞並藉由細胞毒性直接殺死他們。除了呈現胜肽供T細胞辨識外，第一型主要組織相容性複合體分子可藉由與NK細胞表面的抑制性受體(例如：KIR-2DL及KIR-3DL)交互作用而抑制NK細胞的活性。

以第二型主要組織相容性複合體分子而言，它們僅能持續的表現在抗原呈現細胞(antigen presenting cells，APCs)(例如：B細胞及樹狀細胞)表面，並將外來的抗原呈現給CD4⁺輔助型T細胞。受刺激的CD4⁺ T細胞可幫助細胞媒介免疫反應(cell-mediated immunity)或抗體生成。

一般來說，一個第一型主要組織相容性複合體分子包含三個單元：一個45 kDa的重鏈、一個12 kDa的β₂微球蛋白(β₂-microglobulin，β₂m)及一段長度為8至10個胺基酸的胜肽。重鏈中包含三個胞外區段(即α₁、α₂與α₃)、一個疏水性穿膜區段及一個親水性胞質區段。在一個完整的第一型HLA分子中，重鏈的α₁與α₂區段形成供胜肽結合的空間，而α₃區段則與β₂m結合並提供CD8結合的物種特異性。

抗原呈現系統(antigen processing machinery，APM)

第一型主要組織相容性複合體分子的組裝依賴多種伴隨蛋白(chaperone protein)，這些伴隨蛋白位於內質網中並統稱為抗原呈現系統的單元。由第一型主要組織相容性複合體分子所呈現的胜肽可為內生性蛋白，這些內生性蛋白由存活在受感染細胞內的病毒或由腫瘤細胞所產生。在細胞質中，該些內生性蛋白被泛蛋白所標誌並被細胞中的蛋白酶體及/或免疫蛋白酶體切割成短胜肽。經切割的胜肽會與抗原處理相關轉運蛋白(TAP，其為一種由70 kDa TAP1及74 kDa TAP2組成的ABC運送蛋白(ATP-binding-cassette transpoter)複合體)連結並被轉運到內質網中。在內質網腔室中，第一型主要組織相容性複合體的重鏈一開始會與伴隨蛋白(鈣連接蛋白(calnexin)及BiP)進行部分折疊。接著，第一型主要組織相容性複合體重鏈會與β₂m進行組裝並由鈣網蛋白(calreticulin)及ERp57使其穩定，然後經由TAP相關醣蛋白(tapasin)連接至TAP。一旦來自TAP的適當胜肽連結至第一型主要組織相容性複合體分子後，鈣網蛋白、ERp57、TAP相關醣蛋白及TAP會自第一型主要組織相容性複合體分子脫離。最後，完整的第一型主要組織相容性複合體分子離開內質網並由內膜系統運輸至細胞膜供CD8⁺ T細胞辨識。

重組第一型主要組織相容性複合體分子

建構由大腸桿菌(E. coli)系統產生的重組第一型主要組織相容性複合體分子的方法是在1992年時發展出來的。隨後即有研究團隊發表了重組第一型主要組織相容性複合體分子的結構。如同前文所述，一個完整的第一型主要組織相容性複合體分子包含三個單元：一個重鏈、一個β₂m及一段長度為8至10個胺基酸的胜肽。這三個單元非共價地相互結合。為了建構完整的主要組織相容性複合體，要在大腸桿菌系統中分別產生重鏈及β₂m，短胜肽則需要以人工方式合成，而人工合成方法成本高、產量低且十分耗時。

活化的CD8⁺ T細胞可消滅被特異辨識到的目標細胞。CD8⁺ T細胞辨識由目標細胞上的第一型主要組織相容性複合體所呈現的抗原，並因此而由細胞毒素(例如穿孔蛋白(perforin))、顆粒溶解酶(granzyme)及顆粒溶解素(granulysin)造成目標細胞摧毀。從CD8⁺ T細胞的功能看來，若可利用特定刺激分子刺激特定群體的CD8⁺ T細胞，則該刺激分子不僅可做為有用的工具，亦有做為疫苗或治療平台的潛力。

至現今為止，已有許多CD8⁺ T細胞特異刺激分子被研究與發展出來。在這些刺激分子當中有許多為完整或部分的抗原，這些刺激分子與如油乳化液及氫氧化鋁一般的佐劑一起施用以增強免疫反應。然而，佐劑的功效應該逐一分別進行測試。此外，前述的T細胞特異刺激分子並非一直都是有效的，而其中的原因則需要大量的實驗才能釐清。更甚者，由傳統方法所投予的抗原須經過APM組成分子參與的抗原處理及呈現過程。此過程不僅複雜且充滿了變數。為了規避抗原處理過程及其中的變數，本發明提供一種易於操作且與傳統策略相較之下可更為直接地刺激CD8⁺ T細胞的平台。

本發明之抗原呈現組合物有多種用途，例如：測定末梢血液單核細胞(PBMCs)中的抗源特異性CD8⁺ T細胞比率、在活體內或外刺激抗源特異性CD8⁺ T細胞及測試T細胞受體(TCR)與相對應第一型主要組織相容性複合體/胜肽複合物間的親和力。

本發明之抗原呈現組合物的第一型主要組織相容性複合體係以兩單元(2C)建構方式建構而成。在此方法中，抗原胜肽係由一段富含甘胺酸/絲胺酸且具有彈性的連接子胜肽連接至β₂m的N端。此方法係在2001年時為設計疫苗而研發(S. Tafuro et al.2001. Eur. J. Immunology 31:440)。研究顯示，與三單元第一型主要組織相容性複合體相較，兩單元第一型主要組織相容性複合體四聚體對特異性TCR的親和力及對於特異性T細胞反應的刺激能力皆較佳。因此，對建立以第一型主要組織相容性複合體為主的T細胞刺激平台而言，兩單元複合體或許較三單元複合體更具潛力。

為了增加刺激效率，需要建立一種大型的第一型主要組織相容性複合體聚合體。在本揭露文件中，藉由利用與多聚組胺酸融合的重鏈將複數個第一型主要組織相容性複合體聚集至Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠上。由此而生成的大型刺激分子即為一種人工胜肽呈現體(artificial peptide presentosomes，APPs)。

本文中，術語「人工胜肽呈現體」代表一種由一載體與複數個與其相附著的抗原呈現複合體所組成的聚合物。該抗原呈現複合體可為但不限於，例如：第一型主要組織相容性複合體。該載體與抗原呈現複合體間的附著可經由但不限於，例如：多聚組胺酸標誌與鎳離子的結合力而達成。該人工胜肽呈現體可呈現抗原，進而引發抗原特異性T細胞的活化與增生，其優點為可控制抗原之來源及T細胞反應之強度。

本文中，術語「載體」代表任何可提供表面使第一型主要組織相容性複合體與其相接附的物質。該載體可為一種由例如但不限於金屬或塑膠所製成的固態粒子。該載體之實例包括但不限於瓊脂珠、瓊脂糖樹脂珠及磁珠。

本文中，術語「鎳離子修飾」代表一種金屬鎳離子(Ni²⁺)被塗覆於一物體表面之狀態。塗覆方法之實例為包括但不限於將螯合基團固定在該物體表面上，再將金屬鎳離子結合至該螯合基團所構成之基質。

本文中，術語「輔助刺激分子」代表任合可提供T細胞或B細胞輔助刺激訊號之分子。

本文中，術語「單元(component)」代表組成第一型主要組織相容性複合體的元件。舉例來說，一個由三單元方法所建構的第一型主要組織相容性複合體包含三個元件：一個重鏈、一個β₂m及一段長度為8至10個胺基酸的胜肽。一個由兩單元方法所建構的第一型主要組織相容性複合體包含兩個元件：一個重鏈及一個與胜肽融合之β₂m。

本文中，術語「複數個」係用以描述本發明之元件或單元之數量。此用語除非明確另有所指，否則應理解為兩個以上。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。

本文中的用語「或」其意同「及/或」。

因此，本發明提供一種抗原呈現組合物，包含複數個兩單元第一型主要組織相容性複合體及一載體；其中該兩單元第一型主要組織相容性複合體包含一附著至該載體之α重鏈及一與胜肽融合之β₂m單元。

在一具體實施例中，當該載體係經鎳離子(Ni²⁺)修飾時，則該α重鏈在其C端以多聚組胺酸標誌。在另一具體實施例中，其中該載體係以Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠或Ni²⁺磁珠製成。

在一具體實施例中，其中該與胜肽融合之β₂m單元包含一胜肽及一β₂m單元。在另一具體實施例中，其中該胜肽係以一連接子連結至β₂m單元之N端。在尚有另一具體實施例中，其中該連接子之胺基酸序列為SEQ ID NO: 15。在另一具體實施例中，其中該胜肽係衍生自一抗原。

在一具體實施例中，該抗原呈現組合物進一步包含一輔助刺激分子。在另一具體實施例中，該輔助刺激分子包含重組B7、整合蛋白及ICAM-1。

本發明亦提供一種活化抗原特異性CD8⁺ T細胞的方法，包含將初始CD8⁺ T細胞與本發明之抗原呈現組合物進行培養。

在一具體實施例中，該抗原呈現組合物具有一與胜肽融合之β₂m單元，其中該胜肽係衍生自該抗原特異性CD8⁺ T細胞之抗原。

本發明更進一步提供一種引發抗原特異性CD8⁺T細胞增生的方法，包含將初始CD8⁺T細胞與本發明之抗原呈現組合物進行培養。

在一具體實施例中，其中該抗原呈現組合物具有一與胜肽融合之β₂m單元，其中該胜肽係衍生自該抗原特異性CD8⁺ T細胞之抗原。

以下實例提供一些本發明之解釋性具體實施例。

本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。

實例1 選擇用以建構HLA-A*0201及HLA-A*1101兩單元複合體的特異性抗原

發明人選擇最常見的兩種第一型HLA，分別為HLA-A*0201及HLA-A*1101。選用於HLA-A*0201及HLA-A*1101的各個胜肽顯示於表一中。這些胜肽(即M1_58-66、LMP2_340-349與HER2/neu_369-377)係為習知且具有高親和力的胜肽。除了上述習知的胜肽外，發明人亦利用一生物資訊程式預測得到一可能做為抗原的胜肽，其係衍生自A型流感病毒H5N1血球凝集素(HA)。該預測得到的胜肽序列為AIDGVTNKV(HA_540-548)，其係為H5N1病毒株間恆定的序列。

實施例二 藉由連續PCR放大編碼胜肽融合β₂m及HLA-A*0201及HLA-A*1101重鏈胞外區段的DNA

β₂m係一由357 bp編碼序列所編碼的12 kDa蛋白質。表二列出PCR中所使用的引子對，利用這些引子對可產生編碼長度為15個胺基酸的彈性連接子以及接附至β₂m N端的特異抗原性胜肽的DNA。後續藉由瓊脂凝膠電泳及核苷酸定序確認PCR所放大出來的DNA長度與正確性。結果如圖3中所示，由連續PCR與上述引子對可得到正確大小的編碼連接子融合β₂m(linker-fused β₂m，342 bp)及各個特異性胜肽融合連接子β₂m(specific peptide-fused linker-β₂m，372 bp)的DNA。表二中亦列舉出用於產生HLA-A*0201重鏈胞外區段的編碼DNA片段的引子對。為了產生HLA-A*1101重鏈的胞外區段編碼DNA，基於Expasy Proteomics Severs中TMHMM Servers 2.0對訊息胜肽切割位及穿膜區段的預測而設計引子對。如圖3B中所示，經上述實驗可得HLA-A*0201及HLA-A*1101的編碼DNA。藉由核苷酸定序分析確認胜肽融合β₂m及第一型HLA重鏈之編碼DNA的核苷酸序列。

實施例三 利用大腸桿菌系統製造HLA-A*0201及HLA-A*1101的胞外區段與胜肽融合β₂m並接著利用Ni²⁺親和力管柱層析法進行純化 方法： 大腸桿菌表現系統的質體及大腸桿菌株

選用包含一個強T7噬菌體轉錄啟動子及乳糖操縱子的pET28a⁺及pET23a⁺載體(Merck KGaA，Darmstadt，德國)在大腸桿菌表現系統中表現目標基因。這些載體係在大腸桿菌株DH5α中增殖，而BL21(DE3)菌株則係用來表現目標基因的宿主大腸桿菌。上述兩種菌株皆係自益生生技開發股份有限公司(台北，台灣)購得。

利用大腸桿菌系統產製重組蛋白

藉由PCR選殖製備pET28a⁺-HLA-A*0201、pET28a⁺-HLA-A*1101、pET28a⁺-HA_540-548-linker-β₂m、pET28a⁺-M1_58-66-linker-β₂m、pET23a⁺-HER2/neu_369-377-linker-β₂m及pET23a⁺-LMP2_340-349-linker-β₂m等六個構築體，並分別用以轉型BL21(DE3)大腸桿菌。挑選出對抗生素具有抗性的單顆群落並在37℃培養。當轉型BL21(DE3)大腸桿菌培養物的O.D.600到達0.3之後，加入異丙基-β-D-1硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至最終濃度為1 mM以引發蛋白質表現。各種蛋白質的表現係在不同的培養條件下被引發。例如：利用在37℃震盪(200 rpm)8小時的培養條件表現HLA-A*0201；利用在37℃震盪(200 rpm)12小時的培養條件表現HLA-A*1101；而其他重組胜肽融合β₂m蛋白質的表現則係利用在37℃震盪(200 rpm)16小時的培養條件而引發。

重組蛋白的變性與純化

收集大腸桿菌培養物並將其再懸浮在裂解液(50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1.4 mM β-巰乙醇(βME)、1倍不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物III(Calbiochem，La Jolla，CA)中，在冰上培養30分鐘，然後藉由高壓均質器Emulsiflex-C5(Avestin Inc.)將其均質化。為了收集包涵體(inclusion body)，將均質化的樣本在12000 rpm離心20分鐘。移除上清液並在4℃利用溶解化液(50 ml/L培養物，50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1.4 mM βME與6 M尿素)將包涵體沉澱物溶解(需2小時)。將溶解後的樣本以12000 rpm離心20分鐘以去除不溶的細胞碎屑。

為了純化重組蛋白質，將溶解後的樣本以1 ml/min的速率裝載至His-trap親和力管柱上(GE Healthcare Bio-Science AB)。以清洗緩衝液(50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1.4 βME、6 M尿素及20 mM咪唑)洗滌管柱並以溶析緩衝液(50 mMTris-HCl、100 mM NaCl、1.4 βME、6 M尿素及300 mM咪唑)進行溶析。逐份收集溶析液(1 ml/份)。

考馬思亮藍(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色

藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE，重組重鏈使用10%凝膠，而重組β₂m使用12%凝膠)分析確認上述實驗所得之多聚組胺酸標誌重組蛋白質的純度。各列填載的樣本體積如下：24 μl上清液，30 μL粗濾液(flow through)，3 μl清洗液，及2 μl的溶析液。將經SDS-PAGE分離的樣本以考馬思亮藍R-250染液(3 mM考馬思亮藍R-250、45%甲醇、10%冰醋酸)進行染色30分鐘，然後以退染緩衝液(20%甲醇、10%冰醋酸)進行退染。

結果：

利用pET系統製備重鏈與胜肽融合β₂m，該系統可在大腸桿菌BL21(DE3)中藉由加入IPTG而誘發表現。由pET系統製備而成的蛋白質在其C端具有一多聚組胺酸標誌(His₆-tag)。

在本實施例中，所有的重組蛋白質皆位於包涵體內。利用6 M尿素緩衝液將包涵體溶解及變性。該變性後的蛋白質係經流過Ni²⁺ His-Trap管柱而純化。為了確認重組蛋白質的純度，自粗濾液、清洗液及各份溶析液收集樣本。以SDS-PAGE分析樣本並以考馬思亮藍R-250染液進行染色。如圖4中所示，上述純化步驟可排除無用的蛋白質。此外，重組蛋白主要集中在第2至第5份溶析液中。

實例四 藉由直接ELISA及競爭型ELISA分析再折疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m及HLA-A*1101/胜肽融合β₂m複合體的構形 方法： 活體外再折疊兩單元第一型主要組織相容性複合體

藉由對PBS進行透析而去除純化重組蛋白質溶液中的尿素。尿素的最終濃度小於0.3 nM，僅為原始濃度的1/10⁹。將重組蛋白質(重鏈及β₂m各為1.7 mg)在4℃於攪拌的同時以針筒用力的注射到50 mL再摺疊緩衝液中(400mM L-精胺酸、100mM Tris、2mM EDTA、5mM還原態L-麩胺硫、0.5mM氧化態L-麩胺硫，pH值為8.3)，該注入點近可能的靠近攪拌子。之後每14小時再追加注入1.7 mg的重鏈重組蛋白質至正在攪拌的再摺疊緩衝液中，共追加兩次。最後一次注射的14個小時之後，將再摺疊緩衝液自50 ml濃縮到3-4 ml。利用Bio-Rad蛋白質濃度分析套組定量重組蛋白質的濃度。

直接型與競爭型酵素免疫測定法(ELISA)分析法

為了進行直接型ELISA，將各種重組兩單元第一型主要組織相容性複合體以遞增濃度塗覆至培養盤上，該塗覆係利用塗覆緩衝液(44 mM NaHCO₃、6 mM Na₂CO₃，pH值為9.6)在4℃進行14小時。接著以0.05% Tween 20/PBS清洗培養皿兩次、以PBS清洗一次並以1% BSA/PBS進行阻斷1小時。阻斷完成後，再次清洗培養皿，然後將其與100 μl單株抗體CR11-351(1 μg/ml)(Russo,C. et al. 1983. Immunogenetics 18:23)或單株抗體LGIII 147.4.1(1 μg/ml)(Wang,X. et al. 2003. Tissue Antigens 62: 139)一起培養，分別用以偵測HLA-A*0201或HLA-A*1101複合體。進行該培養1小時後，清洗該培養盤並將其與1:1000稀釋度的抗β₂m兔多株抗體FL119(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)一起培養1小時。接著，清洗該培養盤並將其與1:10000稀釋度的山葵過氧化酶標記(horseradish peroxidase-conjugated)山羊抗兔抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)一起培養1小時。培養結束後，清洗培養盤並加入3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)受質(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.)，於黑暗中培養1小時以呈色。以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)測量呈色結果在450 nm波長的OD值。

競爭型ELISA則係於4℃在培養盤的各孔洞中進行塗覆單株抗體CR11-351(2 μg/ml)14小時。以前述方法清洗培養盤，接著以不同濃度(0 μg至20 μg)的重組蛋白質或以做為對照組的2 μg BSA培養1小時。在加至培養盤之前，預先將重組蛋白質與單株抗體CR11-351(1μg)在4℃培養14小時。培養1小時後，清洗培養盤，接著再以山葵過氧化酶標記山羊抗小鼠抗體培養1小時。再次清洗培養盤後，將培養盤與TMB受質在黑暗中進行培養以充分呈色。以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)測量呈色結果在450 nm波長的OD值。利用下列公式計算抑制百分比：

結果：

將純化且變性的蛋白質對PBS進行透析並以氧化態及還原態的麩胺硫再折疊。為了測定再折疊後第一型主要組織相容性複合體的構型是否正確，發明人利用兩種ELISA分析法對構型進行分析。

在直接型ELISA中，利用HLA-A*0201重鏈構型特異性單株抗體CR11-351捕捉完整的HLA-A*0201複合體並利用HLA-A構型特異性單株抗體LG III 147.4.1捕捉完整的HLA-A*1101複合體。完整的第一型主要組織相容性複合體則以FL119(兔抗人類β₂m多株抗體)辨認並以山葵過氧化酶標記山羊抗兔多株抗體偵測。如圖5所示，在450 nm的吸光值與重組蛋白質濃度呈現正相關。更甚者，四種複合體中有兩種(HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m及HLA-A*1101/LMP2_340-349融合β₂m)在4 nC_M達到飽和吸光值。此結果顯示，上述兩種複合體在僅僅4 nC_M時即可使塗覆的單株抗體CR11-351或單株抗體LG III 147.4.1達到飽和。

在競爭型ELISA中，將單株抗體CR11-351預先與不同濃度的重組HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體蛋白質進行培養。如此一來，若這兩種蛋白質間可相互辨識，則以HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體處理過的單株抗體CR11-351即無法結合至預先塗覆在培養盤上的HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體蛋白質。未被占據的單株抗體CR11-351辨識預先塗覆的HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體蛋白質，接著以山葵過氧化酶標記山羊抗小鼠抗體標記，與TMB受質反應並測量O.D.450.而分析。抑制百分比與O.D.450.呈正相關。如圖6所示，抑制百分比隨著預先培養的重組HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體蛋白質濃度而增加。選用的三種重組HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體(HLA-A*0201/HA_540-548融合β₂m、HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m及HLA-A*0201/HER2/neu_369-377融合β₂m)的50%抑制百分比(IC₅₀)分別為4.08 nC_M、0.1 nM及0.1 nC_M。

實例五 藉由免疫沉澱分析法分析HLA-A^*0201/胜肽融合β₂m及HLA-A*1101/胜肽融合β₂m複合體的構形 方法： 1.　免疫沉澱

利用免疫沉澱分析再折疊第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體的構型。將各種再折疊抗體(IP-input，40 μg)與40 μl 50%蛋白質A/G瓊脂(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行培養，在4℃以1 mL PBS清洗3次共2小時，然後以10000 rpm轉速離心1小時。收集上清液(稱為pre-clean lysate)並與β₂m特異性單株抗體L368(Lampson,L. A. et al. 1983. J. Immunol. 30: 2471)培養14小時，同時和緩的進行上下反轉。接著，將混合物與40 μl預清的(pre-cleaned)50%蛋白質A/G瓊脂於4℃培養2小時，並以50000 rpm轉速離心2小時以分離成沉澱物(IP-bound)及上清液(IP-unbound)兩部分。將沉澱物樣本以1 ml PBS清洗3次。

2.　西方墨點法

將沉澱物(IP-bound)樣本及抗體對照組(IP-input，10μg)溶解於40μl PBS中並與16μl的樣本緩衝液進行混合(100 mM Tris-HCl、pH值為6.8、5% βME)、4% SDS、0.2%溴酚藍與20%甘油)。將該些樣本在95℃加熱15分鐘並藉由還原SDS-PAGE進行分離。將該些進行還原SDS-PAGE的膠體、經甲醇活化的聚二氟亞乙烯(PDVF)薄膜(Millipore,Billerica,MA)及濾紙(Sartourius Stedim Biotech S.A.,Goettingen,German)浸泡在轉漬液中(12 mM Tris-HCl、96 mM甘胺酸及20%甲醇)10分鐘。利用半乾式電泳轉漬槽(BioRad)將膠體上的蛋白質轉漬到PVDF薄膜上45分鐘。

將該轉漬完成的PVDF薄膜在含有2% BSA及5%奶粉的PBS中進行阻斷30分鐘。阻斷完成後，將該薄膜與單株抗體TP25.99(10μg/ml)(Desai,S. A,et al. 2000. J. Immunol. 165:3275)及單株抗體L368(5μg/ml)在4℃進行培養14小時，同時輕微的搖晃。接著，依序以含有0.05% Tween 20的PBS及PBS洗滌該薄膜，然後將其與山葵過氧化酶標記的山羊抗小鼠抗體培養30分鐘。洗滌該薄膜、將其與ECL受質(PerkinElmer,Waltham,MA)進行培養並進行底片(GE Heathcare Bioscience,Piscataway,NJ)曝光。

結果：

藉由免疫沉澱分析法(IP assay)進一步確認再摺疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m及HLA-A*1101/胜肽融合β₂m複合體的構型是否正確。利用β₂m特異性的單株抗體L368捕捉複合體。藉由單株抗體L368及HLA第一型重鏈特異性單株抗體TP25.99以西方墨點法分析捕捉到的蛋白質。如圖7所示，在所有單株抗體L368捕捉到的再摺疊複合體中皆可偵測到重鏈及β₂m。此結果暗示了HLA第一型重鏈在再摺疊過程中仍與β₂m相連結。綜合圖5、6及7的結果，可得知體外兩單元MHC第一型複合體的摺疊不僅有效而且正確。

實例六 藉由偵測分泌自與裝載HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m之APP共培養的HLA配對淋巴球的IFN-γ而分析再折疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體的功能 方法： 1.　自人類全血分離淋巴球

Ficoll-Plaque PLUS(GE Healthcare Bioscience)係一種無菌的密度梯度介質，其含有蔗糖與環氧氯丙烷的聚合物、泛酸鈉及乙二胺四乙酸鈣二鈉，可用於自全血中分離淋巴球，作用原理係以BΦyum所發展的方法學為基礎。自健康的捐贈者抽取血液，並將其收集在塗覆有肝素的真空收集管中(BD Biosciences,San Jose,CA)。為了分離淋巴球，將經過抗凝集處理的血液以PBS進行1:1稀釋，並小心地將其以2:1比例鋪蓋在裝於50 ml離心管中的Ficoll-Plaque介質上方而不使兩者發生混合。在室溫下以2500 rpm轉速短暫離心30分鐘，接著從Ficoll-Plaque層與血清層交界處收集淋巴球及單核球。將血清層移除並將中間相小心地移至新的15 ml離心管中。將收集得到的PBMCs在10 ml PBS中以1200 rpm轉速離心10分鐘以洗滌該些PBMCs及移除血小板。將PBMCs再懸浮於含有10%小牛血清的RPMI-1460(HyClone,Thermo Fisher Scientific Inc. Pittsburgh,PA)中，並在37℃、5%CO₂中培養14小時。收集懸浮細胞(即周邊血液淋巴球)以供進一步實驗使用。

2.　偵測IFN-γ的分泌

自HLA-A11^-、HLA-A2^-、HLA-A2⁺及HLA-A11⁺的健康捐贈者取得PBLs。為了刺激特異性CD8⁺ T細胞的活性，將PBLs(2×10⁵/100μl/試驗)以三重複方式培養於多種不同的條件下：(1)具有30μl PBS；(2)在30μl PBS中具有1μl Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠；(3)在30μl PBS中具有1μg兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體單體；(4)在30μl PBS中具有預塗覆的1μg抗CD28單株抗體(BioLegend,San Diego,CA)及1μg兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體單體；(5)在30μl PBS中具有裝載兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體的APPs(1μg兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體與1μl Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠於4℃混合14小時)；(6)具有預塗覆的1μg抗CD28單株抗體及裝載兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體的APPs；及(7)具有預塗覆的1μg抗CD28單株抗體及作為陽性對照組的抗CD3單株抗體(BioLegend)。

三天後，離心PBL-APP混合物以收集上清液，並以該上清液利用人類IFN-γELISA滴定套組(eBioscience Inc.,San Diego,CA)分析IFN-γ分泌的情形。簡單的說，在微孔盤中預先塗覆IFN-γ特異性抗體，並在各孔槽中加入30μl上清液及50μl另一種生物素醯化的IFN-γ特異性抗體，然後將各孔槽與卵白素共軛HRP在室溫培養30分鐘。接著，在洗滌各孔槽後，將其與TMB受質培養30分鐘並在450 nm波長測量吸光值。各控制及實驗組的平均450 nm波長吸光值及代表該組的IFN-γ分泌量。

結果：

先前的實驗結果顯示，兩單元第一型MHC/胜肽融合β₂m複合體可在體外有效且正確地進行再摺疊。為了強化再折疊兩單元複合體的功能，將各再折疊複合體與Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠混合以形成一個巨大的兩單元複合體聚合物，該聚合物即為APPs。如圖8所示，該Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠(平均直徑為34μm)大於正常T細胞(平均直徑為5μm)。為了分析APPs是否能夠刺激抗原特異性CD8⁺ T細胞，將各種APPs在體外與得自表現相符對偶基因捐贈者(實驗組)或不相符對偶基因捐贈者(對照組)的PBLs共同培養。三天後，利用IFN-γ特異性ELISA滴定套組測試IFN-γ分泌量。其中，IFN-γ分泌量係用來作為T細胞活化的指標。如圖9所示，APPs在裝載HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m及裝載HLA-A*0201/HA_540-548融合β₂m兩種情況下，皆可刺激顯著的第一型HLA限定T細胞反應(p＜0.01)。值得注意的是，裝載HLA-A*0201/HA_540-548融合β₂m的APPs即使在缺乏CD28共刺激分子訊號的情況下，亦可激起顯著的T細胞反應。因此，有強烈的證據可證明APPs能夠刺激第一型HLA限定的抗原特異性T細胞反應。

實例七 藉由將APPs與HLA配對的淋巴球一起共培養並偵測抗原特異性CD8⁺ T細胞的增生而分析再折疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體的功能 方法： 1.　流式細胞儀分析

自HLA-A2⁺的健康捐贈者取得PBLs。首先，將HLA-A2M1_58-66融合β₂m複合體(5μg)與5μl的預洗Ni²⁺磁性瓊脂糖樹脂珠在4℃混合14小時。接著，將該些瓊脂糖樹脂珠與前述的PBLs(8×10⁵細胞/500μl)在24孔槽微孔盤中共培養5天，培養條件為37℃、5% CO₂。將與未裝載的瓊脂糖樹脂珠共培養的PBLs作為控制組。經過五天的培養後，利用磁鐵除去裝載的及未裝載的瓊脂糖樹脂珠並分離PBLs。接著，以兩單元HLA-A2/M1_58-66融合β₂m複合體四聚體標記該些PBLs，該標記步驟需避光，並於反應1小時後以1% BSA/PBS洗滌三次。其中，上述兩單元HLA-A2/M1_58-66融合β₂m複合體四聚體係以抗組胺酸小鼠單株抗體(BioVision,Mountain View,CA)及山羊抗小鼠Fc抗體的R-PE(藻紅蛋白(phycoerthrin))共軛F(ab’)₂片段(1:200稀釋)連接HLA-A2/M1_58-66融合β₂m複合體而形成。接下來，將經四聚體標記的PBLs以FITC共軛抗CD8單株抗體(每次試驗0.2μl)(BD Bioscience)在黑暗中標記30分鐘、以1% BSA/PBS清洗三次後重新懸浮於PBS中。將細胞在室溫以0.5%三聚甲醛/PBS固定20分鐘後，藉由FACSCalibur(BD Bioscience)以Cellquest軟體(BD Bioscience)進行分析。分析結果以點狀圖呈現，以比較實驗組及對照組之間的雙陽性細胞群頻率。

結果：

如圖10所示，與那些和未裝載Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠共培養的PBLs相較之下，和裝載HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m的瓊脂糖樹脂珠共培養的PBLs，其出現雙陽性細胞的頻率提高約5倍。因此，APPs的確能夠引發抗原特異性CD8⁺ T細胞的增生。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之水膠及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

<110>　國立清華大學

<120>　兩單元抗原呈現組合物及其用途

<130>　1534-NTHU-TW

<160>　15

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　9

<212>　PRT

<213>　流感病毒

<220>

<221>　胜肽

<222>　(1)..(9)

<400>　1

<210>　2

<211>　9

<212>　PRT

<213>　流感病毒

<220>

<221>　胜肽

<222>　(1)..(9)

<400>　2

<210>　3

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人類

<220>

<221>　胜肽

<222>　(1)..(9)

<400>　3

<210>　4

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人庖疹病毒4

<220>

<221>　胜肽

<222>　(1)(10)

<400>　4

<210>　5

<211>　66

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　連接子-b2m順向引子

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(66)

<400>　5

<210>　6

<211>　56

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　HA540-548-連接子順向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(56)

<400>　6

<210>　7

<211>　56

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　M1 58-66-連接子順向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(56)

<400>　7

<210>　8

<211>　57

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　HER/neu 369-377-連接子順向引子

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(57)

<400>　8

<210>　9

<211>　60

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　LMP 340-349-連接子順向引子

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(60)

<400>　9

<210>　10

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工序列

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<223>　b2m反向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(30)

<400>　10

<210>　11

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工序列

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<223>　HLA-A2順向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(28)

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<212>　DNA

<213>　人工序列

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<223>　HLA-A2反向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(28)

<400>　12

<210>　13

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<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　HLA-A11順向引子

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<221>　misc_feature

<222>　(1)..(27)

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<211>　27

<212>　DNA

<213>　人工序列

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<223>　HLA-A11反向引子

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(27)

<400>　14

<210>　15

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人工序列

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<223>　連接子

<220>

<221>　胜肽

<222>　(1)..(15)

<400>　15

圖1顯示(A)三單元(3-component，3C)建構方法與(B)由三單元建構方法所形成的複合體結構；及(C)兩單元(2-component，2C)建構方法與(D)由兩單元建構方法所形成的複合體結構。

圖2顯示人工胜肽呈現體(artificial peptide presentosomes，APPs)的作用模式。

圖3顯示(A)藉由連續聚合酶連鎖反應(sequential-PCR)放大特定胜肽連接子融合β₂m編碼DNA的結果；及(B)藉由聚合酶連鎖反應(PCR)放大HLA-A*0201及HLA-A*1101重鏈之胞外區段編碼DNA的結果。

圖4顯示藉由Ni²⁺親和性管柱層析法純化HLA-A*0201重鏈及HLA-A*1101重鏈之胞外區段與胜肽融合β₂m的結果；(A)HLA-A2；(B)HA_540-548融合β2m；(C)M1_58-66融合β2m；(D)HLA融合A11(E)LMP_340-349融合β2m；(F)HER2/neu_369-377融合β2m。

圖5顯示藉由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)測試再折疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體及HLA-A*1101/胜肽融合β₂m複合體之構型的(A)實驗設計與(B)結果。

圖6顯示藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive-ELISA)測試再折疊HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體之構型的(A)實驗設計與(B)結果。

圖7顯示HLA-A*0201重鏈及HLA-A*1101重鏈分別與胜肽融合β₂m進行免疫沉澱分析的結果，其反應出兩分子間的連結。

圖8顯示HLA-A*0201特異的CD⁸⁺ T細胞結合並聚集至裝備有HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體的Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠。將上述裝載有兩單元HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體的Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠與來自(A)HLA-A*0201⁺個體及(B)非HLA-A*0201個體的T細胞共培養。

圖9顯示HLA-A*0201特異、抗原特異T細胞經裝載HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體APPs刺激後的反應。將HLA-A*0201⁺與非HLA-A*0201淋巴球與(A)裝載了HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m或(B)HLA-A*0201/HA_540-548融合β₂m的APPs共培養並測量IFN-γ的分泌量。**p<0.01

圖10顯示受裝載兩單元HLA-A*0201/胜肽融合β₂m複合體APPs刺激之CD8⁺ T細胞的增生。將HLA-A*0201⁺ CD8⁺ T細胞與(A)未裝載或(B)裝載HLA-A*0201/M1_58-66融合β₂m的APPs在IL-2存在下共培養並分析。

Claims (12)

1. 一種抗原呈現組合物，包含複數個兩單元第一型主要組織相容性複合體及一載體；其中該兩單元第一型主要組織相容性複合體包含一附著至該載體之α重鏈及一與胜肽融合之β₂m單元。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抗原呈現組合物，其中當該載體係經鎳離子(Ni²⁺)修飾時，則該α重鏈在其C端以多聚組胺酸標誌。
3. 如申請專利範圍第2項所述之抗原呈現組合物，其中該載體係以Ni²⁺瓊脂糖樹脂珠或Ni²⁺磁珠製成。
4. 如申請專利範圍第1項所述之抗原呈現組合物，其中該與胜肽融合之β₂m單元包含一胜肽及一β₂m單元；其中該胜肽係以一連接子連結至β₂m單元之N端。
5. 如申請專利範圍第4項所述之抗原呈現組合物，其中該連接子之胺基酸序列為SEQ ID NO: 15。
6. 如申請專利範圍第1項所述之抗原呈現組合物，其中該胜肽係衍生自一抗原。
7. 如申請專利範圍第1項所述之抗原呈現組合物，其進一步包含一輔助刺激分子。
8. 如申請專利範圍第7項所述之抗原呈現組合物，其中該輔助刺激分子包含重組B7、整合蛋白及ICAM-1。
9. 一種活化抗原特異性CD8⁺ T細胞的方法，包含將初始CD8⁺ T細胞與申請專利範圍第1項之抗原呈現組合物進行培養。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該抗原呈現組合物具有一與胜肽融合之β₂m單元，其中該胜肽係衍生自該抗原特異性CD8⁺ T細胞之抗原。
11. 一種引發抗原特異性CD8⁺ T細胞增生的方法，包含將初始CD8⁺ T細胞與申請專利範圍第1項之抗原呈現組合物進行培養。
12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該抗原呈現組合物具有一與胜肽融合之β₂m單元，其中該胜肽係衍生自該抗原特異性CD8⁺ T細胞之抗原。