JPWO2015005257A1 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させ、生成された糖化ペプチドに糖化ペプチドオキシダーゼを作用させて、生成された過酸化水素を測定するこの方法は、自動分析装置等により糖化ヘモグロビンの測定以外の測定を同時に行う場合は、糖化ヘモグロビン測定試薬中のプロテアーゼが他試薬に作用し、測定値に影響を及ぼすおそれがある。
(1)試料中の糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
(2)酵素を用いて糖化ヘモグロビンを直接酸化する、(1)記載の測定方法。
(3)生成された物質が過酸化水素である、(1)又は(2)記載の測定方法。
(4)糖化ヘモグロビンがHbA1cである、(1)〜(3)記載の測定方法。
本発明の測定方法は、糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定する。本発明における糖化ヘモグロビンとしては、HbA1cが好ましい。糖化ヘモグロビンを直接酸化する方法としては、糖化ヘモグロビンを直接酸化することができる方法であればいずれでもよいが、酵素を用いて酸化する方法が好ましい。
以下、本発明の測定方法について説明する。
本発明の測定方法に用いられる試料としては、糖化ヘモグロビンを含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましく、全血液、血球等が特に好ましい。なお、全血液には、全血液由来の血球画分に血漿が混合している試料も含まれる。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。
本発明の、試料中の測定すべき糖化ヘモグロビンの測定は、例えば、下記(i)〜(ii)の工程を順次行うことによって行うことができる。
(i)試料中の糖化ヘモグロビンに酵素を作用させて糖化ヘモグロビンを酸化する工程、
(ii)上記工程(i)で生成された物質、又は、消費された物質を測定する工程。
[1]配列番号3〜34のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質(それぞれ、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-21、FPOX-22、FPOX-23、FPOX-24、FPOX-25、FPOX-26、FPOX-27、FPOX-28、FPOX-29、FPOX-30、FPOX-31、FPOX-32、FPOX-33、FPOX-34、FPOX-35、FPOX-36、FPOX-37、FPOX-38、FPOX-39、FPOX-40、FPOX-41、FPOX-42、FPOX-43、FPOX-44、FPOX-45、FPOX-46と称する)、
[2]配列番号3〜34のいずれかで表わされるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性(以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性という)を有する蛋白質等が挙げられる。以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を糖化ヘモグロビンオキシダーゼという。これらの糖化ヘモグロビンオキシダーゼは1種類で用いても、2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0 mol/Lが好ましく、0.005〜1.0 mol/Lがより好ましい。
検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下にて酸化発色型色原体と反応させて色素を生成させ、生成された色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。
フェノール系水素供与体としては、フェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
アニリン系水素供与体としては、N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N−ジメチル−3−メチルアニリン、N,N−ジ(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N'−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N'−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4−フルオロ−3,5−ジメトキシアニリン(F−DAOS)、N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(MASE)、N−エチル−N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(Et−MASE)等が挙げられる。
本発明の方法に用いられる蛋白質である糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法の一例を以下に示す。
寄託番号FERM BP-11026として寄託されている、糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9発現大腸菌株XL1-Blue MRF'株より、市販のプラスミド抽出キットを使用して、配列番号2のアミノ酸配列で表わされる糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9の発現プラスミドpTrc-FPOX-9を抽出する。
pTrc-FPOX-9発現プラスミドをテンプレートDNAとして、標的アミノ酸位置に相当するコドンを、置換するアミノ酸に対応するコドンに入れ替えたプライマー対を用いたPCRにより、部位特異的にアミノ酸置換を導入し、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15の発現プラスミドpTrc-FPOX-15を造成する。
上記と同様の方法により、pTrc-FPOX-15に部位特異的なアミノ酸置換を導入することにより、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18A、配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18B、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18C、配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18D、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-20の各糖化ヘモグロビンオキシダーゼの発現プラスミドを造成する。
上記と同様の方法により、FPOX-19の発現プラスミドpTrc-FPOX-19に部位特異的なアミノ酸置換を導入することにより、配列番号9〜34で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-21〜46の各糖化ヘモグロビンオキシダーゼの発現プラスミドを造成する。
精製酵素の濃度は、該蛋白質の補酵素であるFADに由来する波長452nmの吸光度を測定し、得られた吸光度を、活性が既知の糖化ペプチドオキシダーゼを用いて予め作成した糖化ヘモグロビンオキシダーゼ濃度と吸光度との関係を示す検量線に照らし合わせて決定する。
本発明の測定方法において、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性は、例えば以下の方法で測定することができる。
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液:発色剤
24 mmol/L DA-67のジメチルホルムアミド(DMF)溶液
C液:パーオキシダーゼ溶液
1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液:基質溶液
10 g/Lヘモグロビン水溶液
E液: 変性液
5 g/Lヨウ素酸カリウム及び、50%(v/v)界面活性剤(アンヒトール20N)の水溶液
F液: 酵素液
0.5〜1.0 U/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液
(i)D液40μLにE液4μLを混合し、37℃にて10分間インキュベートする。
(ii)A液 10mLにB液12.6μL、C液 35μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴プレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液 40μL、F液20μLを加えて混合し、全自動マイクロプレートEIA分析装置により、混合直後の溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、次いで、37℃、60〜120分間加温して酵素反応を行い、得られた溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、酵素反応前後の吸光度変化を測定する。また、D液の代わりに蒸留水を用いて同様の測定を行い、酵素反応前後の吸光度変化をブランクとし、D液を用いる測定における、酵素反応前後の吸光度変化からブランクを差し引くことにより、酵素反応における吸光度を測定し、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの活性の指標とすることができる。
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜120分間、好ましくは1〜90分間、特に好ましくは1〜60分間である。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書内に組み入れられる。
リン酸二水素カリウム(和光純薬工業)、リン酸一水素カリウム(和光純薬工業)、DA-67(和光純薬工業社製)、パーオキシダーゼ(東洋紡社製)、MOPS(同仁化学研究所社製)、ジメチルホルムアミド(和光純薬工業社製)、ヨウ素酸カリウム(和光純薬工業社製)、Luria-Bertani miller培地(LB培地)(ベクトンディキンソン社製)、KOD-plus-(DNAポリメラーゼ;東洋紡社製)、Dpn I(制限酵素;ニューイングランドバイオラボ社製)、Competent high DH5α(大腸菌コンピテントセル;東洋紡社製)、ヘモグロビンB-テスト ワコー(ヘモグロビン濃度測定用キット;和光純薬工業社製)。
寄託番号FERM BP-11026として寄託されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9発現大腸菌株XL1-Blue MRF'株を、50mg/L アンピシリンを含有したLB培地 3mLに植菌し、37℃で終夜振盪培養した。培養液を8,000 rpm、2分間遠心分離することにより菌体を集めた。得られた菌体から、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9を発現する、配列番号36で表わされる塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-9を抽出した。
・反応バッファー
・テンプレートDNA 1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー 0.3 μmol/L
・リバースプライマー 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
(PCR条件)
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2〜4の繰り返し(全30サイクル)
6. 68℃ 10分
なお、精製糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける蛋白質濃度を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼが有するFADに基づき、以下の方法により決定した。
酵素として、実施例1で得られたFPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42を用いて、検体として、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法によりHbA1c濃度が決定されているヒト血球由来溶血試料を用いて、以下の試薬及び測定手順により各試料に対する吸光度変化を測定した。なお、ヘモグロビン-SLS法によるヘモグロビン濃度の測定においては、ヘモグロビンB-テスト ワコー(和光純薬工業社製)を使用した。
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液: ヒト血球由来溶血試料[ヘモグロビン濃度が10 mg/mLで、HPLC法(KO500法)とヘモグロビン-SLS法からHbA1c濃度が9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9、23.3 μmol/Lと値付けされているもの。]
E液: 5 g/L ヨウ素酸カリウム及び50%(v/v)アンヒトール20Nの水溶液
F液: 40mg/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼ(FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各変異体)の10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液
(i)D液40 μLにE液4 μLを混合し、37℃にて10分間インキュベートした。
(ii)A液10 mLにB液12.6 μL、C液 35 μLを添加した溶液を、1試料当たり190 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液40μL、F液20μLを加えて混合し、37℃で60分間反応させた。
全自動マイクロプレートEIA分析装置(AP-96、協和メデックス社製)により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs(反応前)及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs(反応後)を測定した。吸光度Abs(反応後)から吸光度Abs(反応前)を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs(反応)とした。
各ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度Δ'Abs(反応)を前記の検量線に照らし合わせることにより、各ヒト血球由来溶血試料におけるHbA1c濃度を決定した。このようにして決定したHbA1c濃度を、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる対照法により決定されたHbA1c濃度と比較した。
配列番号2−人工配列の説明:FPOX-9のアミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明:FPOX-18Aのアミノ酸配列
配列番号4−人工配列の説明:FPOX-18Bのアミノ酸配列
配列番号5−人工配列の説明:FPOX-18Cのアミノ酸配列
配列番号6−人工配列の説明:FPOX-18Dのアミノ酸配列
配列番号7−人工配列の説明:FPOX-19のアミノ酸配列
配列番号8−人工配列の説明:FPOX-20のアミノ酸配列
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Claims (4)
- 試料中の糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
- 酵素を用いて糖化ヘモグロビンを直接酸化する、請求項1に記載の測定方法。
- 生成された物質が過酸化水素である、請求項1又は2に記載の測定方法。
- 糖化ヘモグロビンがヘモグロビンA1cである、請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
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