JPWO2014189071A1 - 移植用幹細胞及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1.概要及び定義
本発明の第1の態様は、移植用幹細胞である。
本発明の移植用幹細胞は、インターロイキン-10を細胞内で過剰に発現することのできる間葉系幹細胞からなる。
本態様の移植用幹細胞によれば、移植後の細胞生存率及び生着率が高く、副作用の低い幹細胞を提供することができる。したがって、本態様の移植用幹細胞を移植細胞として、骨、血管、心筋等の間葉系結合組織、中枢神経系、又は肝臓に移植することによって、移植細胞は、移植組織に生着し、周辺環境に応答して適当な分化誘導を受けることから、組織再構築等の再生医療に適用することができる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、移植用幹細胞の製造方法である。本態様の製造方法は、IL-10発現システムをMSCsに導入して、IL-10を過剰に発現することのできるMSCsを製造することを特徴とする。
本態様の製造方法は、IL-10発現システム導入工程を含む。IL-10発現システム導入工程は、IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを少なくとも一つMSCsに導入する工程をいう。
IL-10遺伝子のクローニングを行う。使用するIL-10遺伝子の由来種は、IL-10発現システムを導入するMSCs内でIL-10としての活性を有する限り、特に制限はしない。好ましくは導入するMSCsと同じ生物種由来のIL-10遺伝子である。例えば、ヒト由来のMSCsにIL-10発現システムを導入する場合、IL-10遺伝子は、配列番号2で示されるヒトIL-10遺伝子が好ましい。IL-10遺伝子のクローニングは、当該分野で公知の方法、例えば、上記Green & Sambrook(2012)に記載の方法に従って行えばよい。例えば、ヒトIL-10遺伝子をクローニングする場合、配列番号2で示される塩基配列から適当な領域を選択し、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成する。化学合成は、ライフサイエンスメーカーの受託合成サービスを利用すればよい。次に、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトのcDNAライブラリーからヒトIL-10遺伝子を当該分野で公知の方法、例えばプラークハイブリダイゼーション法等に基づいて単離する。詳細な遺伝子の単離方法については、上記Green & Sambrook(2012)等を参照すればよい。ヒトcDNAライブラリーは、ライフサイエンスメーカー各社から市販されているので、それを利用することもできる。あるいは、配列番号2で示される塩基配列に基づいてプライマーペアとなるオリゴヌクレオチドを化学合成し、そのプライマーペアを用いて、ヒトのゲノムDNA又はcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法等の核酸増幅法により目的とするヒトIL-10遺伝子を増幅してもよい。核酸増幅を行なう場合には、pfuポリメラーゼのような3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有するフィデリティー(正確性)の高いDNAポリメラーゼを使用することが好ましい。核酸増幅の詳細な条件等ついては、例えば、Innis M. et al (Ed.),1990,Academic Press, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicationsに記載の方法を参照すればよい。単離したヒトIL-10遺伝子を必要に応じて適当なプラスミドに挿入し、大腸菌等の微生物内でクローニングした後、全長塩基配列を公知技術に基づいて確認する。この他、ヒトIL-10のcDNAクローンが市販されていることから、それを購入して用いることもできる。
基本操作は、前記プラスミドベクターの方法に準ずればよい。まず、ウイルスゲノムを当該分野で公知の方法により調製した後、それを適当なクローニングベクター(例えば、大腸菌由来のpBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系)に挿入して組換え体を得る。次に、組換え体に含まれるウイルスゲノム内の所定の部位に上記(1)で説明したIL-10遺伝子を挿入し、クローニングする。続いて、制限酵素によって前記組換え体からIL-10発現システムであるウイルスゲノム領域を切り出せばよい。これによって、目的のウイルスベクターを得ることができる。
本態様の製造方法によれば、MSCsをベースとして、簡便かつ比較的安価に、移植用幹細胞を製造することができる。この方法によって、移植後の生着率が高いMSCsを容易に入手することが可能となる。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、間葉系幹細胞生着増強剤(MSCs生着増強剤)である。本態様のMSCs生着増強剤は、MSCsを細胞生存率及び生着率の高い移植用幹細胞に変換するための薬剤で、移植後のMSCsの生存率及び生着率を劇的に増強させることを特徴とする。
本態様のMSCs生着増強剤は、IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを有効成分とする。このIL-10発現システムは、前記第1態様に記載のIL-10発現システムと同一の構成を有することから、ここではその説明を省略する。本態様のMSCs生着増強剤は、乾燥した固体状態、又はそれを適当なバッファに溶解した液体状態のいずれであってもよい。有効成分であるIL-10発現システムは、核酸で構成されることから、ヌクレアーゼフリーの条件下で、MSCs生着増強剤において分解されずに安定的に保持されるような条件下、例えば、氷点下で保存されることが好ましい。
本態様のMSCs生着増強剤は、有効成分であるIL-10発現システムを移植対象細胞であるMSCs内に導入することで、その目的を達成し得る。IL-10発現システムをMSCs内に導入する方法は、IL-10発現システムの種類によって異なるが、基本的には上記実施例2に記載のIL-10発現システムをMSCs内に導入する方法(MSCsの形質転換方法)に準じて行えばよい。移植対象細胞となるMSCsは、生体から単離し、培養した野生型MSCsのみならず、ルシフェラーゼ発現ベクター等のマーカー遺伝子を予め導入した変異型MSCsであってもよい。
本態様のMSCs生着増強剤によれば、通常のMSCsから容易に細胞生存率及び生着率の高い移植用MSCsを調製することができる。
4−1.概要
本発明の第4の態様は、後天的免疫寛容誘導方法である。本態様の方法は、受容個体の免疫寛容を後天的に誘導し、生体内に導入する細胞や組織等の免疫原に対する免疫応答を抑制することを特徴とする。
本態様の方法は、第1工程及び第2工程を必須の工程として含む。
「第1工程」は、受容個体に免疫原を導入する日前の所定の期間内にMSCs及び該免疫原又はその一部を投与する工程である。
「第2工程」とは、受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日にMSCsを投与する工程をいう。
本態様の後天的免疫寛容誘導方法で処理した受容個体は、前処理で使用した免疫原に対して免疫寛容性が誘導される。したがって、その後、当該分野で公知の方法で免疫原を受容個体に導入することで、受容個体における導入した免疫原への免疫応答を抑制することができる。それ故、免疫原が細胞、組織、又は臓器の場合、それらの移植による受容個体内での免疫応答による拒絶反応を抑制又は回避できることから、移植後の細胞等の生存率を高め、また受容個体への生着率を増強することができる。
<組換えIL-10によるMSCsの生存率の改善効果の検証>
(目的)
組換えマウスIL-10をMSCsと共に筋肉組織内に導入したときの移植細胞の生存率の改善効果を検証する。
1.培養細胞及び培養条件
ラット骨髄由来MSCs(SD-rat MSCs)にルシフェラーゼ発現ベクターpLucを導入して、ルシフェラーゼを安定に発現する細胞株SD-rat MSCs-Lucを樹立した。SD-rat MSCs-Lucを10% FBS(ニチレイ)含有DMED/F-12(1:1)(GIBCO)培地を入れたディッシュに播種して、5% CO2存在下37℃で培養した。以下、本明細書における比較例1〜2及び実施例1〜2に記載の「MSCs」は、実験に使用した「SD-rat MSCs-Luc」を意味する。
培養後のMSCsをトリプシン処理により回収後、細胞数5×106個/100μLとなるようにPBSで調整し、MSCs溶液を調製した。組換えマウスIL-10(PEPROTEC)を0.3μg/10μL生理食塩水(以下、「0.3μgのIL-10」と略称する)及び1.0μg/10μL生理食塩水(以下、「1.0μgのIL-10」と略称する)に調整し、それぞれ前記MSCs溶液と混和して、NOD/Scidマウス(3ヶ月齢、♂)の左下腿に局注投与することによりMSCsを移植した。コントロールには組換えIL-10を含まないMSCs溶液(IL-10(-)MSCs)を右下腿に局注投与した。投与から1及び4日後に同量の組換えマウスIL-10を左下腿に追加投与した。
投与から2、4、9日後に、移植したMSCsのルシフェラーゼ発光活性をマウスの生体外から測定するin vivo生体イメージング解析を行った。2%イソフルラン麻酔下にて15mg/mLのルシフェリン溶液を150mg/kgとなるように、200〜300μLをマウス腹腔内に投与した。20分後のルシフェラーゼ発光量をIVIS(登録商標)Imaging System(PerkinElmer)を用いて測定し、ソフトウェア;Living Image(登録商標)3.2を用いてROI(Region of Interest)として数値化した後、投与後の移植したMSCsの生存率を定量的に解析した。コントロールであるIL-10(-)MSCsにおけるROIを1としたときの、IL-10(+)MSCsにおける発光値の比率を算出した。
図1に結果を示す。Aは、投与2、4日後のマウスのイメージング像(n=2)を、またBは、Aのイメージング像に基づいて算出された定量値を示す。0.3μgのIL-10をMSCsと共に投与した場合、2日後、4日後共にIL-10(-)MSCsと比較して生存率に大きな差は認められなかった。しかし、1.0μgのIL-10をMSCsと共に投与した場合には、投与から2日後には3.2倍、4日後には1.7倍となった。この結果から、IL-10による量依存的な移植MSCsの生存率の改善が確認された。
<IL-10発現AAVベクターの同時投与によるMSCs生存率の改善効果の検証>
(目的)
IL-10発現AAVベクターをMSCsと共に筋肉組織内に同時投与したときのMSCsの生存率の改善効果を検証する。
1.組換えAAVの調製
本比較例では、組換えAAV1(rAAV1)を使用した。rAAV1は、Okadaらの方法(Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20:1013-1021; Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218)に従って調製した。
基本的な方法は、比較例1に記載の方法に準じた。投与4日前にNOD/Scid マウス(5ヶ月齢、♂)の左右下腿に10μMカルジオトキシン(Sigma-Aldrich)100μLを局注投与し、筋傷害を誘発した。AAV1-IL-10及びAAV1-LacZを、5×108 g.c.及び1×109 g.c.に調整し、5×106個/100μL MSCs 溶液と混和して、AAV1-IL-10をマウスの左下腿に及びAAV1-LacZを右下腿に、それぞれ局注投与した。投与から9日後、in vivo生体イメージング解析によりMSCsの生存率を定量的に解析した。
図2に結果を示す。Aは投与9日後のマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値(n=4)示す。AAV1-IL-10を局注投与した場合であっても、投与した量に関わらず移植MSCsの生存率の改善効果は認められなかった。したがって、投与組織内でIL-10を持続的に発現させた場合でも、MSCsの生着はできないことが明らかとなった。
<IL-10を細胞内で過剰発現するMSCsによるMSCs生存率の向上効果の検証>
(目的)
IL-10発現プラスミドによりMSCsにおけるIL-10の細胞内発現量を増加させたときのMSCsの生存率の向上効果、及び血清中のIL-10濃度を検証する。
1.MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入
マウスIL-10発現プラスミドDNA(pW-CAG-mIL-10-WPRE)及びコントロールGFP発現プラスミドDNA(pW-CAG-EGFP-WPRE)を2μg、それぞれ100μLのNucleofection溶液(Human MSC Nucleofector kit、LONZA)/MSCs 5×105個と混ぜ合わせ、Amaxa Nucleofectorシステム(C-17モード)を用いて遺伝子導入を行った。なお、pW-CAG-mIL-10-WPREは、pW-CAG-WPREのBamHI部位に、比較例2で調製した組換えマウスIL-10遺伝子を導入して調製した。また、pW-CAG-EGFP-WPREは、pW-CAG-WPREのBamHI部位に、EGFP遺伝子を導入して調製した(Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218)。詳細は本品添付プロトコルに従った。以下、マウスIL-10発現プラスミドDNAを導入したMSCsをpIL-10(+)MSCs、コントロールのGFP発現プラスミドDNAを導入したMSCsをpIL-10(-)MSCsとする。
基本的には比較例1に記載の方法に準じた。上記「1.MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入」によりMSCsに各遺伝子を導入した直後に、NOD/Scidマウス(6ヶ月齢、♀)の左下腿及び右下腿に、それぞれ7.5×106個/100μLのpIL-10(+)MSCs溶液及びpIL-10(-)MSCs溶液を等量ずつ局注投与した。投与から3、7、10、及び13日後にin vivo生体イメージング解析を行い、MSCsの生存率を定量的に解析した。
MSCs由来のIL-10発現の確認は、上記「1.MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入」において遺伝子導入したMSCsの一部を前述の10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地に播種して、5% CO2存在下37℃で12日間培養後の培養上清を用いて、ELISA法(Mouse IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC)により添付のプロトコルに従って行った。
MSCs投与から13日後にマウス心臓より採血し、血清中のIL-10濃度を、Mouse IL-10 ELISA Kit(Thermo SCIENTIFIC)を用いて定量した。対照として、比較例2においてMSCs移植部位にAAV1-IL-10を局注投与したマウスからも同様に採血し、血清中のIL-10濃度を、同キットを用いて定量した。
図3に結果を示す。Aは、MSCs投与から各日後におけるマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値(n=2)を、そしてCはMSCs由来のIL-10発現量を示す。pIL-10(+)MSCsは、pIL-10(-)MSCsと比較して、投与から7日及び10日後に、それぞれ69倍及び3.4倍もの高い値を示した。一方、投与から12日後には、ルシフェラーゼのシグナル強度が確認できなかった。この結果から、MSCs内でIL-10を過剰発現させることによって、移植後のMSCsの生存率が向上し、従来方法では困難であった投与後10日間でもMSCsの生着が可能であることが示唆された。
<IL-10を過剰発現するMSCsによる生存率及び生着率の向上効果の検証>
(目的)
IL-10発現AAVベクターを用いてMSCsにおけるIL-10の細胞内発現量を増加させたときのMSCsの生存率及び生着率の向上効果を検証する。
1.AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認
組換えAAVの調製は、比較例2に記載の方法に準じた。10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地を入れた24 well-plate(IWAKI)にSD-rat MSCs-Lucを1×105個/wellとなるように播種し、細胞接着後にマウスIL-10発現AAVベクターであるAAV1-IL-10又はGFP発現AAVベクターであるAAV1-CAG-EGFP-WPRE(EW)(以下、「AAV1-GFP」とする)をそれぞれ5.0×1010 g.c.含む未精製培養上清を加えて、SD-rat MSCsへの遺伝子導入を行った。5% CO2存在下37℃で一晩培養後、2日おきに培地交換を行い、遺伝子導入から5〜7日目の2日分の培養液を回収した。遺伝子導入から7日後に、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡(Olympus, IX71)により観察し、遺伝子導入効率を求めた。回収した培養上清中のIL-10発現量をELISA法(Mouse IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC)を用いて定量した。なお、AAV1-GFPは、AAV1-CAG-WPRE(EW)のBamHI部位に、実施例1で調製したEGFP遺伝子を挿入して調製した。
基本的な方法は比較例1に記載の方法に準じた。上記「1.AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認」と同様に、AAV1-IL-10又はコントロールとしてのAAV1-GFPを含む未精製培養上清を用いて、MSCsへの遺伝子導入を行った。6.0×1012 g.c.で各AAVベクターを添加した10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地を1.6×107細胞のMSCsが接着したT225フラスコ(Thermo SCIENTIFIC)に入れて5% CO2存在下37℃で5日間培養後、再度各AAVベクターを1.1×1013 g.c./フラスコで加えて2日間培養を続けて遺伝子導入を行った。以下、本発明の移植用幹細胞に相当するAAV1-IL-10を導入したMSCsを「vIL-10(+)MSCs」とし、またコントロールのAAV1-GFPを導入したMSCsを「vIL-10(-)MSCs」とする。遺伝子導入後のMSCs(1.0×107個)をNOD/Scid マウス(3ヶ月齢、♀5匹、♂1匹)の左下腿(vIL-10(+)MSCs)及び右下腿(vIL-10(-)MSCs)にそれぞれ局注投与し、投与から3、7、18、27、31、34、42、49、54、及び67日後にin vivo生体イメージング解析を行い、MSCsの生存率を定量的に解析した。
1.AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認
図5に結果を示す。AはvIL-10(-)MSCsへの遺伝子導入結果を、またBはvIL-10(+)MSCsでのIL-10の発現結果を示す。
図6にマウスのイメージング像と移植したMSCsの生存率を示す。Aは、MSCs投与から各日後におけるマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値(n=5)である。投与31日後のvIL-10(+)MSCsにおけるルシフェラーゼのシグナル強度は、vIL-10(-)MSCsと比較して9.7倍も高い値を示した。さらに驚くべきことに、投与後67日目でもvIL-10(+)MSCsは、ルシフェラーゼの高いシグナルが維持されており、MSCsの生存率が著しく向上することが確認できた。以上の結果から、AAVベクターを用いてIL-10をMSCs内で持続的に発現させることにより、MSCsが移植した組織内で長期にわたって生存可能となることが立証された。
<IL-10発現AAVベクターを導入したMSCsのイヌへの移植実験における生存率及び生着率改善の検証>
(目的)
マウスにおいて立証されたAAV1-IL-10導入MSCsの生存生着率の向上効果をイヌにおいて検証する。
1.イヌ骨髄由来MSCsの調製
DLA(dog leukocyte antigen)の一致するビーグル犬の雌雄ペアからドナー犬、レシピエント犬を選出した。図8に図示するように、ドナー正常犬の前肢左右上腕より骨髄液2mLを採取した。20U/mL ヘパリン含有2mL RPMI-1640(life technologies)にて培養した。Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich)による密度勾配にて単球を単離した後(1.3×108 個)、増殖能の高いCD271陽性分画(CD271 (LNGFR)-PE & Anti-PE Micro Beads 含有MSC Research Tool Box-CD271 (LNGFR) (Miltenyi Biotec)をイムノ磁気ビーズ(MACS(登録商標)Columns and MACS Separators, Miltenyi Biotec)を用いて濃縮した(CD271陽性細胞=1.4−5×106 個)。詳細な方法は、添付のプロトコルに従った。回収した細胞は6 well plate(IWAKI)に播種し、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)を添加したnonhaematopoietic (NH) Expansion Medium(MiltenyiBiotec)を用いて培養した。3日毎に培地を交換し、4回の継代を経てT225フラスコに10枚分、増殖させた。詳細は、Kasahara, Y., et al., 2012, Mol Ther., 20(1):168-77に従って調製した。CD271+ MSCsにpolybrane(8μg/mL)存在下でルシフェラーゼ発現レンチウイルスベクター(200μL)を感染させて、NH Expansion Medium中にて(T225フラスコ)、32℃で2日間培養し、遺伝子を導入した。続いて、AAV1-GFP又はAAV1-IL-10(それぞれ8.0×1012 g.c.)をNH Expansion Medium中にて(T225フラスコ)37℃で3日間の培養を二度行った。MSCsにおけるルシフェラーゼ発現はルシフェラーゼ活性測定(Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega)により、またIL-10発現はELISA解析(canine IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC)により、確認した。両者とも、測定にはAppliskan (Thermo Scientific)(luminescence, 450nm, shake)を用いた。
移植細胞のレシピエントとしての患犬を作製した、正常ビーグル犬(4歳3ヶ月齢、♂)に筋障害を誘導するため、MSCs移植の5日前に50μMカルジオトキシン1.0 mLを左右前脛骨筋に局注投与して、患犬とした。続いて、上記「1.イヌ骨髄由来MSCsの調製」において遺伝子導入したMSCsをトリプシン処理にて回収後、2.4×107〜2.7×107 cells/2mL PBSに調整して、2%イソフルラン(日本薬局方)麻酔下で患犬の左前脛骨筋にvIL-10(-)MSCsを、及び右前脛骨筋にvIL-10(+)MSCsを局所移植した。この間、免疫抑制剤は使用していない。1ヶ月後、図10のAに示すように移植した左右前脛骨筋組織を生検して4部位に分断後、POLYTRONホモジナイザー(150〜180min-1)を用いて筋抽出液を得た。MSCsの生着を筋抽出液のルシフェラーゼ活性(Bright-Glo Luciferase Assay System)より解析した。測定値は、組織タンパク質量(Pierce(登録商標)BCA Protein Assay Kit, Thermo scientific)で補正した。組織中のIL-10量は、筋抽出液を用いてELISA解析(canine IL-10 ELISA Kit)により算出した。
図9〜11に結果を示す。
<MSCsを利用した後天的免疫寛容誘導の検証(1)>
(目的)
MSCsを用いた前処理により受容個体に導入する免疫原に対して免疫寛容が誘導されることをイヌで検証する。
基本的な方法は、実施例3に記載の方法に準じて行った。
本発明の免疫寛容誘導方法に基づいて、以下の手順で免疫寛容誘導を行った。まず、レシピエントに免疫原としてAAV9を導入することとし、この投与日を基準日として0日目とした。次に、基準日の8日前に免疫寛容誘導方法の第1工程として、MSCsと免疫原であるAAV9を静脈内投与した。対照用として、AAV9のみ又はMSCsのみを静脈内投与した。続いて、基準日の前日に免疫寛容誘導方法の第2工程として、MSCsを静脈内投与した。対照用は、投与なしとした。基準日に、免疫原であるAAV9を局所投与により導入した。導入したAAV9は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する。対照用として、AAV9を含まないPBSバッファのみを導入した。導入4週間後に生検を行った。
基本的な方法は、実施例3に準じた。
本実施例で導入及び投与する免疫原のルシフェラーゼ発現AAVベクター(AAV9-CAG-Luc:本明細書では、しばしば「AAV9-Luc」と表記する)は、比較例2の「1.組換えAAVの調製」に記載の方法に基づいて調製した。
レシピエントには、正常ビーグル犬(同腹の2ヶ月齢、♂又は♀)を用いた。上記「1.免疫寛容誘導手順」に従い、免疫寛容誘導のため、基準日の8日前に4×106cells (1×106 cells/kg B.W.)のMSCsとAAV9-Luc溶液2mLを前脛骨筋に注射器を用いて局所投与した(MSCs+AAV)。また、対照として、AAV9-Lucのみ(Cont-AAV)及びMSCsのみ(Cont-MSCs)を投与した。基準日前日に、MSCs+AAV及びCont-MSCsの個体に1.8×106 cells/kg B.W.でMSCsを投与した。基準日には、MSCs+AAV及びCont-AAVの個体に、AAV9-Lucを1カ所あたり1×1012v.g.(液量2mL)で局所投与にて2か所、またCont-MSCsの個体にはPBSバッファのみを2mLで局所投与にて2か所、注射器を用いて前脛骨筋に導入した。基準日から4週間後に、導入箇所である前脛骨筋を生検した。ルシフェラーゼに対する抗体(rabbit anti-firefly Luciferase 抗体、1:2000希釈、Abcam Plc.)、及び二次抗体としてのAlexa 594-conjugated anti-rabbit IgG antibodies, (1:1000 希釈、life technologies)を用いて免疫組織染色を行い、ルシフェラーゼの発現を蛍光顕微鏡(Olympus, IX71)にて観察した。
図12に結果を示す。AはCont-AAVを、BはMSCs+AAVを、そしてCはCont-MSCsを示す。本発明の免疫寛容誘導方法で処理を行ったMSCs+AAVでは、免疫原のAAV9におけるマーカー遺伝子であるルシフェラーゼの発現が認められた(B)。一方、AAV9のみで前処理し、MSCsによる免疫寛容誘導処理を行っていないCont-AAVでは、ルシフェラーゼの発現は見られなかった(A)。AAV9-Lucを投与又は導入していないCont-MSCsでもルシフェラーゼの発現は見られなかった(C)。
<MSCsを利用した後天的免疫寛容誘導の検証(2)>
(目的)
本発明の後天的免疫寛容誘導方法における免疫原の導入は、静脈内導入であっても局所導入と同様に効果が得られることを検証する。
1.免疫寛容誘導手順
基本的な手順は、実施例4の手順に準じた。なお、本実施例では、免疫原としてAAV9-Luc又はAAV-μDysを導入した。
ヒト由来骨髄由来細胞(JCR Pharmaceuticals)を購入後、拡大培養して用いた。
導入及び投与するAAV9-μDysは、比較例2の「1.組換えAAVの調製」に記載の方法に基づいて調製した。
レシピエントには、11週齢の同腹の、正常ビーグル犬(♂)2頭、又はデュシェンヌ型筋ジストロフィー患犬(♂)(CXMDJ)1頭を用いた。CXMDJは、ゴールデンレトリバーの自然発症デュシェンヌ型筋ジストロフィー患犬(GRMD)の精子を海外から輸入し、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター(日本)でビーグル犬に掛け合わせて繁殖及び維持している雑種である(Shimatsu Y. et al., 2005, Acta Myol vol24(2): 145-54; Yugeta N. et al., 2006, BMC Cardiovasc Disord, 6: 47; Kobayashi M et al., 2009, Muscle Nerve, 40(5): 815-26)。
図13に結果を示す。AはCont-AAVを、BはMSCs+AAV-Lucを、そしてCはDMD/MSCs+AAV-μDysを示す。本発明の免疫寛容誘導方法で処理を行ったMSCs+AAV-Lucでは、実施例4と同様にルシフェラーゼの発現が見られた(B)。一方、AAV9のみで前処理し、MSCsによる免疫寛容誘導処理を行っていないCont-AAVでは、ルシフェラーゼの発現は見られなかった(A)。これらの結果から、免疫寛容誘導処理による免疫原の導入は、局所導入に限らず、静脈内導入のような循環系を介した全身投与であっても同様の効果が得られることが立証された。
<後天的免疫寛容誘導方法による遺伝子治療の検証>
(目的)
本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いて、AAV9-μDysを導入した個体における遺伝子治療効果について検証する。
1、各種イヌの準備
11週齢の同腹の、正常ビーグル犬(Nomal)、筋ジストロフィー患犬(DMD)、及びその患犬に本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いてAAV9-μDysを導入した治療患犬(DMD/MSCs+AAV-μDys)を準備した。DMDは、前述のCXMDJ患犬、またDMD/MSCs+AAV-μDysは、実施例5で作製したAAV9-μDysを導入患犬である。
各イヌを用いて15m走を行わせ、走行タイムを測定した。DMDについては、各週齢の個体5頭について1回のみ測定した。Nomal及びDMD/MSCs+AAV-μDysについては、1個体あたり4回測定し、その平均タイムを算出した。
筋ジストロフィーの病態評価は、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター(日本)で使用されているGrading Score (ver.10)に従った。このGrading Scoreでは、筋ジストロフィーに関する、食事・嚥下、飲水、流涎、嚥下障害、異常発声、横臥位起き直りテスト、playfulness、歩様、後肢歩行テスト、座位姿勢、側頭筋委縮、舌下の腫大、巨舌、及び大腿筋の14項目の病態に関して、各項目中で規定した状態のいずれに該当するかを選択し、その状態に予め割り振られたスコアを合計して、スコアリングした。スコアが大きいほど、症状が重いことを示す。病態評価は、一か月に一度行った。
15m走の結果を図14に、また筋ジストロフィーの病態評価として行ったGrading Scoreの推移を図15に示す。
Claims (11)
- インターロイキン-10(IL-10)を過剰に発現することのできる間葉系幹細胞からなる移植用幹細胞。
- 前記IL-10の過剰発現が外因性のIL-10発現システムによる、請求項1に記載の移植用幹細胞。
- 前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項2に記載の移植用幹細胞。
- 間葉系結合組織、中枢神経系又は肝臓の再構築用である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の移植用幹細胞。
- IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを間葉系幹細胞に導入する工程を含む、移植用幹細胞の製造方法。
- 前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項5に記載の移植用幹細胞の製造方法。
- IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを有効成分とする、間葉系幹細胞生着増強剤。
- 前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項7に記載の間葉系幹細胞生着増強剤。
- 後天的免疫寛容誘導方法であって、
受容個体に免疫原を導入する日の2日前〜14日前の期間内に間葉系幹細胞及び前記免疫原と同一免疫原性を有する免疫原又はその一部を少なくとも1回投与する第1工程、及び
受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日に間葉系幹細胞を投与する第2工程を含む前記方法。 - 前記間葉系幹細胞が請求項1〜4のいずれか一項に記載の移植用幹細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記免疫原がウイルス、細胞、組織又は臓器である、請求項9又は10に記載の方法。
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