JPWO2014129599A1

JPWO2014129599A1 - 免疫賦活剤

Info

Publication number: JPWO2014129599A1
Application number: JP2015501526A
Authority: JP
Inventors: 憲二山本; 千秋松崎; 景子久
Original assignee: Nitto Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Nitto Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2034-02-21
Also published as: EP2960327A1; US9572844B2; EP2960327A4; JP6347075B2; CN105229142A; WO2014129599A1; ES2658082T3; DK2960327T3; US20150374762A1; EP2960327B1; CN105229142B

Abstract

本発明は、受託番号NITE BP-1519で寄託されている、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物、該菌株又はその菌体処理物を含む乳酸菌製剤、免疫（特に腸管免疫）賦活剤を提供する。

Description

本発明は、新たに単離したロイコノストック（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、当該乳酸菌又はその菌体処理物を含む免疫賦活剤、特に腸管免疫賦活剤等に関する。より詳細には、IgA産生促進能を有する、受託番号NITE BP-1519で寄託されたロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NTM048株又はその菌体処理物等に関する。

腸管の免疫器官は腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphatic tissue, GALT）と総称され、主にパイエル板（Peyer’s patch）、腸間膜リンパ節、腸管上皮から構成される。腸管内に侵入した病原体等の異物（抗原）は、パイエル板のM細胞に取り込まれ、パイエル板に存在する樹状細胞等の抗原提示細胞によりT細胞に提示される。同時に、B細胞も当該抗原を認識し、IgM⁺ B細胞からサイトカイン刺激によりIgA⁺ B細胞にクラススイッチされ、最終的に免疫グロブリンA（以下、「IgA」という）を分泌する形質細胞となる。

腸管固有のIgA産生細胞数は、全身に存在する形質細胞の約70〜80%を占め、当該形質細胞から分泌されるIgAが、病原体の粘膜上皮細胞への付着を阻害する、あるいは、病原体から生産される毒素や酵素にIgAが結合して中和する等の感染防御を行うため、IgA産生による腸管免疫の活性化を行い、免疫のバランスを保つことは非常に重要である。

近年、アレルギー疾患を有する患者が急増しているが、これらの患者は腸管粘膜免疫が低下傾向にあるため、腸管粘膜免疫を増強（発達）させることは、その予防に繋がる可能性が高いと考えられている。

そして、IgA産生促進能を有し、腸管免疫の増強力を有する菌として、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) AYA株（特許文献１）、ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)株（特許文献２）等が報告されている。

また、生野菜や漬物等、様々な植物から乳酸菌が単離され、プロバイオティクスとして食品や飲料等に添加されているが、IgA産生促進能を有し、腸管免疫を活性化することのできる乳酸菌の報告は、上記の文献などに限られているため、IgA産生促進能の高い新たな乳酸菌の提供が望まれている。

特開2008-201708号公報特開2010-130954号公報

本発明の目的は、IgA産生促進能を有する新規な乳酸菌を単離し、当該菌株又はその菌体処理物を含む腸管免疫賦活剤等を提供することである。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行なった結果、様々な生野菜及び漬物より単離した約200株の乳酸菌の中から、IgAの産生促進能に優れた菌株（NTM048）を見出し、当該菌株がロイコノストック（Leuconostoc）属に属する新たな乳酸菌であることを同定した。さらに、本発明者らは、当該菌株の投与により脾臓におけるヘルパーT細胞数が増加することを見出し、当該菌株は腸管免疫のみならず、全身免疫系の賦活効果をも奏することを確認して、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］受託番号NITE BP-1519で寄託されている、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物。
［２］［１］に記載の菌株又はその菌体処理物を含む、乳酸菌製剤。
［３］免疫賦活剤である、［２］に記載の剤。
［４］腸管免疫賦活剤である、［２］に記載の剤。
［５］さらに、他の乳酸菌もしくはその菌体処理物、及び／又は乳酸菌以外の微生物もしくはその菌体処理物を含む、［２］−［４］いずれかに記載の剤。
［６］他の乳酸菌が、ラクトバチルス(Lactobacillus)属菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、エンテロコッカス(Enterococcus)属菌及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌から選択される少なくとも１種である、［５］に記載の剤。
［７］乳酸菌以外の微生物が、酵母、バチルス(Bacillus）属菌、酪酸菌（Clostridium butyricum）及び真菌から選択される少なくとも１種である、［５］又は［６］に記載の剤。
［８］腸管免疫に関連する疾患の予防又は改善に使用される［２］−［７］のいずれかに記載の剤。
［９］腸管免疫に関連する疾患が、アレルギー性疾患、感染症、炎症性腸疾患、自己免疫疾患からなる群から選択される、［８］に記載の剤。
［１０］食品もしくは食品添加物である、［２］−［９］のいずれかに記載の剤。
［１１］医薬品である、［２］−［９］のいずれかに記載の剤。
［１２］飼料もしくは飼料添加物である、［２］−［９］のいずれかに記載の剤。
［１３］温血動物における免疫賦活方法であって、有効量のロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物を、該哺乳動物に投与することを含む、方法。
［１４］免疫賦活剤として使用するための、ロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物。
［１５］免疫賦活剤の製造のための、ロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物の使用。

本発明において、えんどう豆から新たに単離した乳酸菌NTM048株が、IgA産生促進能及びヘルパーT細胞の増大作用を有することを明らかにした。本発明は、当該乳酸菌もしくはその変異株又はその菌体処理物を含む乳酸菌製剤、免疫（特に腸管免疫）賦活剤）を提供することができる。これらは、飲食品、医薬品、飼料等、様々な分野において使用し得ることから、本発明は産業上極めて有用である。

本発明で単離した乳酸菌NTM048株のIgA産生誘導能の結果を示す。図中、縦軸は培養上清中のTotal IgA (ng/mL)を示す。salineは陰性対照(生理食塩水のみ添加)、LPSは陽性対照(LPS添加)を示す。データは６個の異なる個々の実験の平均値±標準誤差（SE）を示す。^**P<0.01 (vs saline) NTM048株と、他のLeuconostoc mesenteroides菌株（JCM16943株及びJCM6124株）とのIgA産生誘導活性を比較した結果を示す。図中、縦軸は培養上清中のTotal IgA (ng/mL)を示す。salineは陰性対照(生理食塩水のみ添加)を示す。データは６個の異なる個々の実験の平均値±標準誤差（SE）を示す。^*P<0.05、^**P<0.01 (vs saline) 種々の組成（各グラフ上の数値は、NTM048菌末濃度を示す）でNTM048株を含む餌をマウスに経口投与した場合のIgA産生誘導活性を示す。図中、縦軸は糞抽出液中のTotal IgA (ng/mL)を示す。横軸は投与日数を示す。データは試験区５匹毎の実験の平均値±標準誤差（SE）を示す。 NTM048株とJCM6124株との、in vivoでの腸管粘膜におけるIgA産生誘導活性を比較した結果を示す。図中、縦軸は1日分の糞中IgA量（μg/day）、横軸は投与日数を、それぞれ示す。controlは、陰性対照（分散媒のみ(0.05%(w/w))を含むAIN-76を投与）を示す。^*P<0.05 (vs JCM6124)、^**P<0.01 (vs control) NTM048株とJCM6124株との、全身免疫賦活効果を比較した結果を示す。上パネルは、コントロール群（左）、NTM048投与群（中）及びJCM6124投与群（右）のマウスの脾臓Tリンパ球におけるCD4、CD8の発現を示す。各図中、左上のボックス内がCD4陽性細胞を、右下のボックス内がCD8陽性細胞をそれぞれ示す。下パネルは、各群におけるCD4陽性・CD3陽性細胞の割合（%）を示す。データは平均値±標準誤差（SE）で示す。

以下、本発明の詳細を説明する。本発明は、新たに単離した乳酸菌（NTM048株）もしくはその変異株又はその菌体処理物、これらのいずれかを含む乳酸菌製剤、免疫（特に腸管免疫）賦活剤等を提供する。

本発明では以下の方法で、えんどう豆から新たな乳酸菌（NTM048株）を単離した。スクリーニング方法及びNTM048株の菌学的性質は以下のとおりである。
１．スクリーニング
（１）起源
えんどう豆
（２）スクリーニング方法
マウスパイエル板細胞を用いて、IgA産生促進を指標としてスクリーニングを実施した。具体的な実験手順は後述の実施例に示すとおりである。
２．乳酸菌の同定
（１）ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides） NTM048株
（２）肉眼的特徴
（２−１）MRS寒天培地上において、円形で白色の集落。
（２−２）顕微鏡的特徴：球菌で運動性はなし、芽胞は形成しない。

（３）生育温度
３０〜３７℃で良好に発育する。
（４）生理学的、生化学的特徴
グラム染色性：陽性
糖資化性を表１に示す。

さらに、化学分類学的性質として、16S rRNAの約1.5kbを配列番号１に示す。

以上の諸性質から、バージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）に照らし、本菌株をロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）に属する新規菌株と同定し、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NTM048と命名した。NTM048株は、２０１３年１月２５日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。受託番号は、NITE BP-1519である。

本発明の菌株には、上記NTM048株のみならず、当該菌株の変異体であって、少なくとも哺乳動物の腸管関連リンパ組織において、NTM048株と同等以上のIgA産生促進作用を示すものも含まれる。当該変異体は、他の臓器・組織（例えば、肺、気管支肺胞、血漿等）におけるIgA産生促進作用、脾臓、骨髄、血液等におけるヘルパーT細胞の増大作用が、NTM048株における当該作用と同等以上であることがより好ましい。変異の導入法としては、ニトロソ化合物（ニトロソアミン、ニトロソグアニジン等）、アルキル化剤（EMS；ethyl methanesulfonate）のような化学物質処理による方法、紫外線照射、放射線照射等が挙げられるが、これらに限定されない。得られた変異株が腸管関連リンパ組織において、NTM048株と同等以上のIgA産生促進作用を示すか否かは、上記NTM048のスクリーニングに用いたのと同様の方法により、当該変異株のIgA産生促進活性を測定し、これをNTM048株における活性と比較することにより検定することができる。

本発明において、NTM048株又はその変異体は、上述のMRS培地等、乳酸菌培養用の培地（固形培地、又は液体培地等）を用いて培養することができる。

当該培地には、必要に応じて、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE等、又はこれらの誘導体も含む）、各種アミノ酸（天然アミノ酸又は合成アミノ酸も含む）、核酸塩基（プリン、ピリミジン）、無機塩類（MgSO₄、MnSO₄、FeSO₄、NaCl等）等を添加することができる。

本発明の菌株は、培養温度として、３０〜３７℃、より好ましくは３５〜３７℃、培養期間は、１６時間〜３日間、より好ましくは１〜２日間、pHは３〜８、より好ましくはpH４〜７で培養し、調製することができる。

本発明の菌体処理物としては、上述の方法で得られる培養液、及び／又は、当該培養液を、自体公知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、磁性分離等の方法により処理した湿菌体又はその洗浄物（滅菌水、PBS等により洗浄することができる）、これらの凍結乾燥粉末、加熱死菌体、乾燥死菌体、薬品処理による死菌体、菌体壁等の菌体破砕物、抽出物等が含まれる。

あるいは、NTMO48株又はその変異株自体を使用し、乳製品、穀物、又は加工食品等に当該菌株を接種して得られる発酵物も、本発明の菌体処理物に含まれる。

本発明において、「免疫賦活」とは、少なくとも腸管免疫を含む任意の免疫機能を活性化する作用を意味する。特に本発明における免疫賦活作用は、腸管関連リンパ組織をはじめとして、種々の臓器・組織・体液（例えば、肺、気管支肺胞、血漿等）におけるIgA産生を促進する作用により特徴づけられる。場合によっては、IgA産生の制御も本発明における免疫賦活の概念に含まれる。さらに、本発明の菌株又はその菌体処理物が有する免疫賦活作用して、全身免疫系における獲得免疫の活性化が含まれる。全身免疫系における獲得免疫の賦活化は、脾臓、骨髄、血液等におけるヘルパーT細胞の増大作用により特徴づけられる。

NTM048菌株（上記変異体も含む）又はその菌体処理物は、免疫（特に腸管免疫）賦活作用を有するので、そのまま、あるいは適当な添加物とともに製剤化して（乳酸菌製剤）、免疫（特に腸管免疫）賦活剤として、ヒト又は他の哺乳動物に適用することができる。ここで、乳酸菌製剤は、NTM048菌株（上記変異体も含む）又はその菌体処理物単独で使用することができるが、１種以上の他の乳酸菌もしくはその菌体処理物、及び／又は、１種以上の乳酸菌以外の微生物もしくはその菌体処理物と併用して使用することもできる。ここで「菌体処理物」とは、上記と同義である。

他の乳酸菌としては、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属等に属する乳酸菌が挙げられるが、これらに限定されない。

乳酸菌以外の微生物としては、酵母、バチルス(Bacillus）属、酪酸菌（Clostridium butyricum）、麹菌等の真菌等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のNTM048菌株（変異体も含む）又はその菌体処理物は、これらを有効成分とし、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を添加して製剤化し、乳酸菌製剤、免疫（特に腸管免疫）賦活剤とすることができる。

製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、D−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン等の崩壊剤、タルク、水素添加植物油、ロウ類、軽質無水ケイ酸等の天然物由来及びその誘導体等、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム等の滑沢剤等を挙げることができる。

上記製剤は、さらに、甘味料、着色料、pH調整剤、香料、各種アミノ酸等を添加することもできる。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。液体製剤であれば、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。

上記製剤に含まれるNTM048株の菌数としては、１日あたりの摂取量が10⁴コロニー形成ユニット（以下、cfuという）以上10¹²cfu以下、好ましくは10⁶cfu以上10⁹cfu以下である。

上述の免疫（特に腸管免疫）賦活剤は、腸管免疫に関連する疾患に適用することができる。腸管免疫に関連する疾患とは、例えば、食物（そば、米、小麦、卵、牛乳、落花生、オレンジ、りんご、キウイフルーツ等の果物、えび、カニ等の甲殻類、魚介類等）アレルギー、花粉（スギ、イネ、ブタクサ、セイタカアワダチソウ、ヨモギ、シラカンバ、オオアワガエリ、カモガヤ等）アレルギー、ハウスダスト、化学物質、金属等のアレルギー、感染症（黄色ブドウ球菌、サルモネラ、コレラ菌、病原性大腸菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、クロストリジウム、赤痢菌等の細菌感染、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ヘルペスウイルス等のウイルス感染、寄生虫、原虫感染等）、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、自己免疫疾患（臓器特異性自己免疫疾患及び全身性自己免疫疾患）、ストレスによる腸管免疫の機能低下等、が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤は、ヒト、又はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ニワトリ、インコ、九官鳥、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）に投与し、腸管免疫に関連する疾患を予防又は改善するために、使用することができる。

さらに、本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤は、例えば、食品、医薬品、飼料等として、あるいはそれらに配合して使用することができる。

本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤を食品もしくは食品添加物として使用する場合、当該食品は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、乳製品（ヨーグルト、バター、チーズ、アイスクリーム等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。

上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。

本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤を医薬品もしくは医薬品添加物として使用する場合、当該医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注入剤、坐剤等が用いられる。注入剤の調製方法としては、例えば、本発明の菌株又はその菌体処理物を、通常注入剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に懸濁または乳化することによって調製できる。注入用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられる。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明の菌株又はその菌体処理物を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製され得る。
さらに、医薬品として使用する場合、本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤は、対象疾患に応じて、他の薬剤、例えば、抗炎症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗毒素、抗アレルギー薬などと併用してもよい。本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤および上記薬剤は、同時または異なった時間に、対象に投与すればよい。
本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤の好ましい併用薬の例として、該免疫（特に腸管免疫）賦活剤に含有される乳酸菌の増殖及び／又は代謝を促進する物質（プレバイオティクス）が挙げられる。これらのプレバイオティクスは、本発明の菌株とともに本発明の免疫（特に腸管免疫）賦活剤に配合することもできるし、別個の製剤として、同時または異なった時間に、対象に投与してもよい。

注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。

本発明の腸管保護剤を飼料もしくは飼料添加物として使用する場合、当該飼料としては、ペットフード、動物又は水産養殖飼料添加物等が挙げられる。

本発明において、IgA産生は自体公知の方法で、測定することができる。例えば、パイエル板を後述の実施例に示すコラゲナーゼを使用する方法等により調製して、当該パイエル板を乳酸菌存在下で培養し、培養上清を回収する。当該培養上清中に含まれるIgAの量をELISA法（市販のIgA測定キット等）等、自体公知の方法により測定する。そして、対照群（例えば、陰性対照であれば生理食塩水、陽性対照であればLPS等）と比較して、IgA量の変化を確認する。

パイエル板は、マウス、ラット、ヒト等種を問わず、調製法も上記方法に限定されず、当業者は必要に応じて適宜選択することができる。あるいは、in vivoでのIgA産生誘導活性を測定するためには、個体（マウス、ラット、ヒト等種を問わず）から生物学的試料（血液、糞等）を採取し、当該試料中のIgA量の変化を確認することができる。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

試薬及び菌株
RPMI-10培地：RPMI 1640培地（Gibco社製）に10％牛胎児血清を追加、MRS培地（Difco社製）、コラゲナーゼ（Sigma社製）、DNase（Takara社製）
NTM048株：えんどう豆から単離（受託番号：NITE BP-1519、寄託日：2013年1月25日）
JCM16943（Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris）、JCM6124（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）：独立行政法人理化学研究所筑波研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（JCM）より購入

参考例１コラゲナーゼ調製法によるパイエル板細胞の調製
7週齢のBALB/cA マウスより小腸パイエル板細胞を摘出した。当該細胞をRPMI-10培地で洗浄し、5 mL のIEC-dissociating solution(25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 1 mM DTT in RPMI-10)の入った滅菌ディッシュに移し、CO₂インキュベーター内で、37℃で45分インキュベートした。よくピペッティングした後、5 mL のEDTA solution (5 mM EDTA in RPMI-10)の入った滅菌ディッシュに移し、CO₂インキュベーター内で、37℃で5分インキュベートした。さらによくピペッティングした後、パイエル板を、5 mLのdigestion solution （400 U/mL コラゲナーゼ, 30 U/mL DNase in RPMI-10）とスターラーバーを入れた50 mL チューブに移し、37℃で30分攪拌しながらインキュベートした。酵素分解終了後、パイエル板細胞は培地中に懸濁されているため濁っており、遠心(1400 rpm, 7分, 4℃)後、4 mLの上清を吸引除去した。当該パイエル板細胞の懸濁液(1 mL)を40μmのセルストレーナーに通し、遠心(1400 rpm, 7分, 4℃)後、上清を吸引除去し 1 mLのRPMI-10培地に懸濁した。細胞数をカウントした後、免疫機能活性の測定に用いた。

実施例１ IgA産生量の測定
様々な生野菜及び漬物から単離した約200株の乳酸菌について、マウス小腸パイエル板細胞を用いたIgA産生促進能を検討した。

上述のコラゲナーゼ調製法により得られたパイエル板細胞の濃度を2.5 ×10⁵ cells/mLになるよう、CD3抗体コート96穴プレート（BD Biosciences社製）に調整した。当該パイエル板細胞懸濁液に、MRS培地にて液体培養後、生理食塩水にて10 μg/mLに菌体濃度を調整した乳酸菌を等量加え、37℃、5% CO₂嫌気条件下で5日間反応後、産生した総IgA量をMouse IgA ELISA Quantitation Set (BETHYL社製)を用いて測定した。有意に高いIgA産生能を有する乳酸菌2株（NTM047、NTM048）を選出した。乳酸菌NTM048株についての結果を図１に示す。

NTM047、NTM048両株について70℃、30分熱処理し、得られた死菌体について同様にパイエル板細胞を用いたIgA産生能を調べたところ、両株ともに生菌体と同様のIgA産生促進能が確認された。当該結果からNTM047株およびNTM048株によるIgA産生誘導物質は菌体壁または菌体外成分であることが示唆された。さらに16S rDNA配列解析により菌種同定を試みたところ、これら2株は同一菌株であることが明らかになった。

実施例２ Type strainとの比較
実施例１と同様の方法で、パイエル板を用いたin vitroにおけるIgA産生誘導活性について、NTM048株と、JCM16943及びJCM6124とで比較を行った。結果を図２に示す。

NTM048株は、Leuconostoc mesenteroides の他の菌株に比べて、IgA産生を高く誘導することが確認された。

実施例３ in vivo でのIgA産生誘導活性の確認
６週齢のオスBALB/cマウスに、２週間予備飼育（乳酸菌フリーの餌；AIN-76）を行った後、各試験区５匹ずつに、0、0.05、0.5、5％の乳酸菌NTM048を含むAIN-76を２週間投与し、0、7、14日目の糞を採取してIgA量を確認した。糞を採取後、６時間凍結乾燥し、糞重量10 mg/200 μLの割合でProtease Inhibitor Cocktail（Roche社製）を含む抽出用緩衝液（PBS）に懸濁した。当該懸濁液を、ボルテックスにて撹拌して30分氷冷した後、遠心（15000 rpm, 10分, 4℃)し、上清中に抽出された総IgA量を上述のとおりELISA法で測定した。

表２に餌の組成を、IgA産生誘導の結果を図３に示す。

14日目にすべての菌体投与区においてIgA量の増加がみられ、0.5％及び5％NTM048株投与マウスにおいて有意差（P<0.01、P<0.05）が認められた。

実施例４ in vivo IgA産生誘導活性のType strainとの比較
６週齢のオスBALB/cマウスに、２週間予備飼育（乳酸菌フリーの餌；AIN-76）を行った後、各試験区６匹ずつに、凍結乾燥菌体換算で0.0038%（w/w）のNTM048株又はJCM6124株を含むAIN-76を２週間投与し、0、7、14日目に24時間分の糞を採取、凍結乾燥後の重量を測定し、1日分の糞量を求めた。糞を乳鉢を用いて粉砕、再度凍結乾燥後、50 mgをエッペンドルフチューブに分取し、糞重量10 mg/200 μLの割合でProtease Inhibitor Cocktail（Roche社製）を含む抽出用緩衝液（PBS）に懸濁した。ボルテックスにて攪拌後、10分ごとに再度ボルテックスで攪拌しながら氷上に置き、30分後に4℃、15000 rpmで10分間遠心分離し、上清を回収した。上清中のIgA濃度を上述のとおりELISA法で測定し、得られたIgA濃度と24時間分の糞重より、1日分の糞中IgA量を求めた。結果を図４に示す。

NTM048株は、in vivoでも、JCM6124株に比べて腸管粘膜におけるIgA産生を高く誘導することが確認された。

実施例５マウス脾臓細胞におけるT細胞サブタイプ解析
NTM048株投与による全身免疫系への影響を調べるため、脾臓細胞におけるT細胞サブタイプを比較した。
NTM048株又はJCM6124株を３週間マウスに投与した後に、脾臓を摘出した。脾臓細胞懸濁液の調製は、注射針を用いて物理的に採取した脾臓細胞を、RPMI 10培地に懸濁し、溶血バッファー（0.83% NH₄Cl, 0.1% KHCO3, 0.0037% EDTA2Na）にて５分間処理した後、RPMI 10培地で洗浄、70 μmのセルストレーナーに通すことにより行った。脾臓細胞を1×10⁶cells用いて、T細胞のCD4、CD8サブタイプ解析を行った。Mouse T Lymphocyte Subset Antibody Cocktail (BD Biosciences)を用い、製品プロトコールに従い、PE-Cy^TM7標識抗CD3e抗体、PE標識抗CD4抗体及びAPC標識抗CD8a抗体にて細胞を標識した後、フローサイトメーター(BD FACSAria) にて、CD3陽性細胞（T細胞）、CD4陽性細胞（ヘルパーT細胞）、CD8陽性細胞（キラーT細胞）とを測定した。結果を図５に示す。

CD8陽性・CD3陽性細胞の割合は、いずれの乳酸菌投与群及びコントロール群の間でも有意差は認められなかったが（図５上）、CD4陽性・CD3陽性細胞の割合は、コントロール群（p=0.06）、JCM6124投与群に比べて、増加傾向が認められた（図５上・下）。これらの結果から、NTM048株の免疫賦活効果が全身免疫（特に獲得免疫）系においても期待できることが示唆された。

本発明は、新たに単離、同定した乳酸菌（NTM048株）が、高いIgA産生促進能を有することを明らかにした。当該菌株若しくはその菌体処理物等は、高いIgA産生促進能を有し、医薬品、食品、飼料等様々な分野へ適用可能であるため、本発明は産業上極めて有用である。

本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

本出願は、2013年2月22日付で日本国に出願された特願2013-033072号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims

受託番号NITE BP-1519で寄託されている、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物。
請求項１に記載の菌株又はその菌体処理物を含む、乳酸菌製剤。
免疫賦活剤である、請求項２に記載の剤。
腸管免疫賦活剤である、請求項２に記載の剤。
さらに、他の乳酸菌もしくはその菌体処理物、及び／又は乳酸菌以外の微生物もしくはその菌体処理物を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の剤。
他の乳酸菌が、ラクトバチルス(Lactobacillus)属菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、エンテロコッカス(Enterococcus)属菌及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の剤。
乳酸菌以外の微生物が、酵母、バチルス(Bacillus）属菌、酪酸菌（Clostridium butyricum）及び真菌から選択される少なくとも１種である、請求項５又は６に記載の剤。
腸管免疫に関連する疾患の予防又は改善に使用される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の剤。
腸管免疫に関連する疾患が、アレルギー性疾患、感染症、炎症性腸疾患、自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項８に記載の剤。
食品もしくは食品添加物である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の剤。
医薬品である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の剤。
飼料もしくは飼料添加物である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の剤。
温血動物における免疫賦活方法であって、有効量のロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物を、該哺乳動物に投与することを含む、方法。
免疫賦活剤として使用するための、ロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物。
免疫賦活剤の製造のための、ロイコノストックメセンテロイデスNTM048株もしくはその変異株又はその菌体処理物の使用。