JPWO2014129560A1 - 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 - Google Patents
植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2014129560A1 JPWO2014129560A1 JP2015501506A JP2015501506A JPWO2014129560A1 JP WO2014129560 A1 JPWO2014129560 A1 JP WO2014129560A1 JP 2015501506 A JP2015501506 A JP 2015501506A JP 2015501506 A JP2015501506 A JP 2015501506A JP WO2014129560 A1 JPWO2014129560 A1 JP WO2014129560A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- sequence
- nucleic acid
- genome
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 220
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 74
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 234
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 110
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 101150084101 RNA2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101100353432 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 69
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 claims description 39
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 claims description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 30
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 16
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 14
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 3
- 241001270273 Cucumber mosaic virus RNA2 Species 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 48
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 41
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 26
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 11
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 11
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 11
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 10
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 8
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 6
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 6
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 3
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 3
- 241000218632 Strawberry vein banding virus Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000701513 Badnavirus Species 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 102220611360 Magnesium transporter MRS2 homolog, mitochondrial_P35S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241001457070 Mirabilis mosaic virus Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 2
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 2
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 2
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 2
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 2
- 235000010726 Vigna sinensis Nutrition 0.000 description 2
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 101150001666 2a gene Proteins 0.000 description 1
- GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 4'-Methylacetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C=C1 GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 241000702449 African cassava mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000003840 Amygdalus nana Nutrition 0.000 description 1
- 244000296825 Amygdalus nana Species 0.000 description 1
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100351298 Arabidopsis thaliana PDF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241001533462 Bromoviridae Species 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 241000209202 Bromus secalinus Species 0.000 description 1
- 240000001548 Camellia japonica Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 240000004270 Colocasia esculenta var. antiquorum Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000208296 Datura Species 0.000 description 1
- 240000001879 Digitalis lutea Species 0.000 description 1
- 235000002723 Dioscorea alata Nutrition 0.000 description 1
- 235000007056 Dioscorea composita Nutrition 0.000 description 1
- 235000009723 Dioscorea convolvulacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000005362 Dioscorea floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 235000004868 Dioscorea macrostachya Nutrition 0.000 description 1
- 235000005361 Dioscorea nummularia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005360 Dioscorea spiculiflora Nutrition 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 244000307700 Fragaria vesca Species 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000043261 Hevea brasiliensis Species 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000006350 Ipomoea batatas var. batatas Nutrition 0.000 description 1
- 240000001549 Ipomoea eriocarpa Species 0.000 description 1
- 235000005146 Ipomoea eriocarpa Nutrition 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219730 Lathyrus aphaca Species 0.000 description 1
- 240000006568 Lathyrus odoratus Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 244000108452 Litchi chinensis Species 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102100039143 Magnesium transporter MRS2 homolog, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000121629 Majorana Species 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000213996 Melilotus Species 0.000 description 1
- 235000000839 Melilotus officinalis subsp suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000015742 Nephelium litchi Nutrition 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 description 1
- 241000223785 Paramecium Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000003421 Plantago ovata Nutrition 0.000 description 1
- 244000134552 Plantago ovata Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 101710189610 Protein 2b Proteins 0.000 description 1
- 235000011432 Prunus Nutrition 0.000 description 1
- 241001290151 Prunus avium subsp. avium Species 0.000 description 1
- 239000009223 Psyllium Substances 0.000 description 1
- 241000218206 Ranunculus Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 235000002357 Ribes grossularia Nutrition 0.000 description 1
- 244000171263 Ribes grossularia Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 101710149950 Suppressor of silencing 2b Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000219995 Wisteria Species 0.000 description 1
- 241000269959 Xiphias gladius Species 0.000 description 1
- XJLATMLVMSFZBN-VYDXJSESSA-N actinonin Chemical compound CCCCC[C@H](CC(=O)NO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1CO XJLATMLVMSFZBN-VYDXJSESSA-N 0.000 description 1
- XJLATMLVMSFZBN-UHFFFAOYSA-N actinonine Natural products CCCCCC(CC(=O)NO)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N1CCCC1CO XJLATMLVMSFZBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 244000193174 agave Species 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013614 black pepper Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 235000018597 common camellia Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 235000021332 kidney beans Nutrition 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001931 piper nigrum l. white Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 235000014774 prunus Nutrition 0.000 description 1
- 229940070687 psyllium Drugs 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000021335 sword fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
(1)植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子であって、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、2bタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が前記外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルスのRNA2ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子。
(2)前記キュウリモザイクウイルスRNA2ゲノムに相当する配列と前記アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB配列)との間に、前記植物内で機能するターミネーター配列を有する、(1)の核酸分子。
(3)T−DNAベクターの形態である、(1)又は(2)の核酸分子。
(4)前記植物が、キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノム、ならびにキュウリモザイクウイルスの2bタンパク質をそれぞれ機能的に発現している植物である、(1)〜(3)の核酸分子。
(5)植物において外来遺伝子を発現させるための方法であって、植物においてキュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノム、並びにキュウリモザイクウイルスの2bタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程、(1)〜(3)の核酸分子を前記植物に導入する工程、及び、前記核酸分子が導入された植物を栽培して前記核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程を含む方法。
(6)キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノムの発現が、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノムに相当する配列、前記植物内で機能するターミネーター配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子、並びに、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのRNA3ゲノムに相当する配列、前記植物内で機能するターミネーター配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子を、それぞれ植物に導入することによって行われる、(5)の方法。
(7)核酸分子の植物への導入が、核酸分子を含む溶液の植物への浸透又は注入により行われる、(5)又は(6)の方法。
まず、本発明の前提となるアグロバクテリウム及びキュウリモザイクウイルスについて説明する。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)は、グラム陰性菌に属する土壌細菌であるリゾビウム属(Rhizobium)のうち、植物に対する病原性を有するものの総称である。アグロバクテリウムの例としては、根頭癌腫病に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacients)が挙げられる。
キュウリモザイクウイルス(cucumber mosaic virus:以降適宜「CMV」と表記する。)は、ブロモウイルス科に属する植物病原性ウイルスであって、3つの1本鎖RNA(RNA1、RNA2、RNA3)からなるゲノムを有する。RNA1、2、3はそれぞれpCY1、pCY2、pCY3としてプラスミド化されている(Suzuki, M., et al., Virology, (1991), 183:106-113)。
本発明の第一の観点によれば、植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子が提供される(なお、この核酸分子を、以降適宜「本発明の核酸分子」と表記する。また、本発明の核酸分子を用いて外来遺伝子を発現させる対象となる植物を、以降適宜「対象植物」と表記する。)。
(a)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)。
(b)対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
(c)CMVのRNA2ゲノムに相当する配列であって、その2bタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が、対象植物に発現させる外来遺伝子に置換された配列(以降適宜「外来遺伝子含有CMV RNA2相当配列」と表記する。)。
(d)対象植物内で機能するターミネーター配列。
(e)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)。
本発明の第二の観点によれば、上述の本発明の核酸分子を用いて、植物において外来遺伝子を発現させるための方法が提供される(なお、この方法を、以降適宜「本発明の方法」と表記する。)。
(i)対象植物において、CMVのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノム並びにCMVの2bタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程。
(ii)本発明の核酸分子を対象植物に導入する工程。
(iii)本発明の核酸分子が導入された対象植物を栽培して、本発明の核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程。
好ましい植物としては、イネ科、キク科、ナス科、バラ科の植物が挙げられる。
なお、工程(i)では、これらの配列の一部又は全部を既に有する組み換え植物等の既存の植物を用い、必要に応じて更に残る配列を導入した上で、その後の工程(ii)に使用してもよい。また、工程(i)におけるこれらの配列の一部又は全部の対象植物への導入を、工程(ii)の本発明の核酸分子の対象植物への導入と同時に行ってもよい。
(a)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)。
(b)対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
(c’)CMVのRNA1ゲノムに相当する配列。
(d)対象植物内で機能するターミネーター配列。
(e)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)。
(a)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)。
(b)対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
(c”)CMVのRNA2ゲノムの2b領域(2bタンパク質をコードする遺伝子)に相当する配列。
(d)対象植物内で機能するターミネーター配列。
(e)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)。
(a)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)。
(b)対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
(c''')CMVのRNA3ゲノムに相当する配列。
(d)対象植物内で機能するターミネーター配列。
(e)アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)。
導入の手法は限定されないが、例えば、本発明の核酸分子を含む溶液を調製し、当該溶液を各種の物理的手法、例えば注入や浸透等の手法で、植物組織内に導入することが好ましい。
以上の手法を用いて、本発明の核酸分子を、対象植物の全組織に一様に行き渡らせることが好ましい。
以上説明した本発明の核酸分子は、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)及び左境界配列(LB)の作用により、植物細胞に対して強い感染能を有する。即ち、高い効率で植物細胞のゲノムへのランダム組み込みを生じ、右境界配列(RB)と左境界配列(LB)との間に介在する配列(即ち上記の本発明の発現カセット等)が、植物ゲノム内に導入され、植物内で発現することになる。よって、本発明によれば、植物体の全身に物理的手法(注入や浸透等)で普く移行させて感染させれば、植物の全組織の細胞内でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。
CMV2bタンパク質の植物発現ベクターの構築
ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有する植物発現用バイナリーベクター(pGPTV−HPT)に挿入済みのウイルス由来プロモーター内部配列の下流に、CMV2b遺伝子を挿入した。2b遺伝子の両末端に設計したCMV−2b−F1(配列番号1:5’−ATGGAATTGAACGTAGGTGCAATG−3’)及びCMV−2b−R1(配列番号2:5’−TCAGAAAGCACCTTCCGCC−3’)プライマーを用いてCMVのRNA2ゲノムを鋳型にPCRを行い、333bp長の増幅産物を得た。TAクローニングを行って制限酵素配列を付与したXbaI−2b遺伝子−SacI断片を得た。植物発現用ベクターpGPTV−HPTベクターを制限酵素XbaI及びSacIで切断して線状化し、XbaI−2b遺伝子−SacI断片をライゲーションして、pGPTV−HPT−2b(核酸分子B)を構築した。このcDNAクローンの配列に対して、制限酵素部位の確認及びABI PRISM Big Dye Terminator(Applied Niosystems, USA)を用いたシーケンシングを行い、ミスが無いことを確認した。CMV2b遺伝子の植物発現ベクターの構造を図1に模式的に示す。
植物発現用ベクターのアグロバクテリウムへの形質転換方法
アグロバクテリウム(LBA4404)への植物バイナリーベクターの形質転換には、液体窒素による凍結融解(Freeze thaw)法(Holsters M. et. al, (1978), Mol. Gen. Genet., 163(2):181-7)を使用した。得られた形質転換アグロバクテリウム菌体(LBA4404)を、100mg/lリファンピシン、300mg/lストレプトマイシン、50mg/lカナマイシンを添加したLB培地中で、28℃で一晩振盪培養することにより、菌体液を得た。
2b形質転換植物体の作出
タバコ(Nicotiana benthamiana)への形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacients)を用い、リーフディスク法(Horsch RB. et al., (1984), Science, 223:496-498)により実施した。タバコの葉から直径約1cmのリーフディスクを切り出し、pGPTV−HPT−2bを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacients)LBA4404株の菌液に浸して、2日間MS(Murashige-Skoog)寒天培地上で共存培養を行った。共存培養したリーフディスクは、3日後に付着アグロバクテリウムを洗浄し、15mg/lハイグロマイシン及び500mg/lカルベニシリンを添加した再分化用MS培地上で培養(23℃、16時間明期、8時間暗期)し、二週間毎に継代を行った。再分化して得られたシュートは、15mg/lハイグロマイシン及び500mg/lカルベニシリンを添加した発根用MS培地で発根を誘導した後、培養個体を組換温室内で馴化して土耕栽培による育成を行い、次世代種子(T1個体)を得た。
2b形質転換体の2bタンパク質発現解析
再分化した培養個体(T0個体)から、葉を採取して液体窒素を用いて粉砕した後、SDS−PAGE泳動用バッファーを加えて磨砕した。磨砕液は遠心分離(4℃、12000rpm、10分)を行い、上清をSDS−PAGEに供した。トランスファーには、PVDF膜を用い、抗2b抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。再分化した個体の中から2bタンパク質を発現している形質転換タバコを選抜し、後述の[実験6]の接種試験に使用した。ウエスタンブロットの解析結果を示す写真を図2に示す。
CMVの分節ゲノムを挿入した目的遺伝子発現用バイナリーベクターの構築
鈴木匡の博士論文(「キュウリモザイクウイルス遺伝子の機能に関する研究」、1997年、東京大学博士論文、国会図書館、書誌ID:000000343707)に記載された方法に従い、CMVの分節ゲノムの全長cDNAを植物発現用バイナリーベクターpBI121に挿入したプラスミドpBI−CR1,2,3を構築した。具体的には、CMVの有する分節ゲノム:RNA1、RNA2、RNA3(ウイルスゲノム)を各々鋳型としてcDNAを増幅し、In−fusionキット(タカラバイオ株式会社)を用いてCMV35Sプロモーター(P35S)とノパリンシンターゼのターミネーター(Tnos)と間に各々組み込み、pBI121に挿入して、pBI−CR1,2,3を得た。さらに、目的遺伝子の挿入可能なベクターを構築するため、マーカー遺伝子としても利用されるオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein:GFP)遺伝子を、pBI−CR2の2b遺伝子領域と置換したpBI−CR2Δ2b−GFPの作出を行った。まずCMVベクターの一部であるpUC118をバックボーンとするpCY2−H1の制限酵素サイトStuI及びSpeI間にGFP遺伝子を挿入したpCY2−H1−GFPを鋳型として、このベクターの2a遺伝子内の制限酵素サイトSalIからRNA2ウイルスゲノム3’末端のSacIまでの領域を増幅するプライマーFW2a−Sal(配列番号3:5’−TAGTTACGGTGTCGACACTCCC−3’)及びRVCS−pBI(配列番号4:5’−GATCGGGGAAATTCGAGCTCACCGCGGTGGCGG−3’)を用いたPCRにより増幅した。これにより約3290bpのcDNAを得た。一方、先に構築したベクターpBI−CR2を制限酵素SalI及びSacIで消化して線状化した。In−fusionキット(TaKaRa)を用いて線状化したベクターとPCRで増幅した約3290bpのインサートとのライゲーションを行った後、コンピテントセル(HB101)に形質転換してpBI−CR2Δ2b−GFPのクローンを得た。このcDNAクローンの配列は、制限酵素サイトの確認と、シーケンシングによりミスが無いことを確認した。以上の手順により、CMVゲノム1を含むベクター(核酸分子A)、CMVゲノム2を含むと共に2b遺伝子領域を目的遺伝子たるGFPに置換したベクター(本発明の核酸分子)、及び、CMVゲノム3を含むベクター(核酸分子C)を作製した。本発明では、CMVの3本の分節ゲノムを基として利用しているため、植物体内でRNA1、RNA2(目的遺伝子挿入済み)、RNA3という3本のウイルスゲノムを同時かつ同一空間に発現させる必要がある。このため、これら3分子種のベクターを1セットとして利用する。これらの植物発現用バイナリーベクターの構成を図3(a)〜(d)に模式的に示す。図3(a)は、CMVゲノム1を含むベクター(核酸分子A)、図3(b)は、CMVゲノム2を含むベクター、図3(c)は、CMVゲノム2を含むベクターの2b遺伝子領域を目的遺伝子たるGFPに置換したベクター(本発明の核酸分子)、図3(d)は、CMVゲノム3を含むベクター(核酸分子C)を示す。
アグロインフィルトレーション法
アグロインフィルトレーション法は、Grimsley N. et. al, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3282-3286を改変して使用した。CMVの分節ゲノム及びGFP遺伝子を挿入したバイナリーベクターpBI−CR1、pBI−CR2Δ2b−GFP及びpBI−CR3をそれぞれ保有するアグロバクテリウムを、[実験2]の方法で形質転換を行い、組換アグロバクテリウム菌体液を得た。それぞれ遠心分離(20℃、4800rpm、15分)を行い、得られた菌体ペレットをMESバッファー(最終濃度10mM MES、10mM MgCl2、150μM アセトシリンゴン、pH5.7)にOD600=0.2〜0.8になるように懸濁した。これらの菌体溶液を各々単独で使用する場合には、OD600=0.2〜0.6値の懸濁液に調製し、複数の菌体溶液を混合して使用する場合には、各々の菌体を等量ずつ混合して、最終の懸濁液の菌体量をOD600=0.3〜1.2値に調製した。菌体溶液のニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。この操作には、[実験1]及び[実験2]の方法で得た、2b遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌体も混合して使用した。これらの接種ベクターの組み合わせを表1に示す。
菌体接種植物体の育成及び目的タンパク質の検出
アグロインフィルトレーション法により、形質転換アグロバクテリウムを接種したニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)又は組換植物体(形質転換植物体)を、人工気象器もしくは照明付植物育成用インキュベーター中で23℃、16時間明期、8時間暗期で栽培した。接種後の植物体で、目的遺伝子(GFP)が発現していることを確かめるため、GFPを可視化可能な波長域の青色光を照射し、3〜14日栽培した植物体でGFPの蛍光を確認した。[実験6]の方法で、表1に記載した接種植物体及び接種アグロバクテリウム菌体(保有ベクター)の組み合わせで、アグロインフィルトレーションを実施した結果、2bタンパク質もしくは2b遺伝子が植物体に存在しない場合には、GFPは殆どが葉脈に局在する。一方、植物体から2bタンパク質を供給した場合、又は、2b遺伝子を有するアグロバクテリウム菌体からアグロインフィルトレーションにより2bタンパク質を一過的に供給した場合では、何れにおいても2bタンパク質の存在下で、GFPが葉全体(葉脈+葉肉組織)で発現していることが確認できた。
CMVの分節ゲノムRNA1又はRNA3を有する形質転換植物体の作出
CMVのタンパク質の一部又は(2aを除く)全部を植物体に発現させるため、まずCMVの分節ゲノムRNA1又はRNA3を有する形質転換植物体の作出を行った。[実験5]で構築したpBI−CR1又はpBI−CR3を、それぞれ保有するアグロバクテリウムLBA4404株を[実験2]の方法で形質転換を行って組換アグロバクテリウム菌体液を得た。その後、抗生物質をハイグロマイシンからカナマイシンに変更した他は[実験3]と同様の手順で、リーフディスク法(Horsch RB. et al., Science, (1984), 223:496-498)によるニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)への形質転換を実施した。タバコの葉から直径約1cmのリーフディスクを切り出し、pBI−CR1又はpBI−CR3を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacients)LBA4404株の菌液に浸して、MS(Murashige-Skoog)寒天培地上で2日間共存培養を行った。共存培養したリーフディスクは、3日後に付着アグロバクテリウムを洗浄し、50mg/lカナマイシン及び500mg/lカルベニシリンを添加した再分化用MS培地上で培養(23℃、16時間明期、8時間暗期)し、二週間毎に継代を行った。再分化して得られたシュートは、50mg/lカナマイシン及び500mg/lカルベニシリンを添加した発根用MS培地で発根を誘導した後、培養個体を組換温室内で馴化して土耕栽培による育成を行い、次世代種子(T1個体)を得た。
CMVゲノムRNA1又はRNA3形質転換体の接種用植物体としての機能解析
CMVゲノムRNA1又はRNA3形質転換体の次世代種子(T1個体)を、125mg/lカナマイシンを添加した培地に無菌播種し、カナマイシン耐性が付与されたT1個体を選抜した。この芽生えを土耕栽培して温室内で育成を行った。播種後、約2ヶ月栽培した植物体に、[実験6]の方法で、アグロインフィルトレーションを実施した。CMVゲノムRNA1形質転換体のT1個体には、pBI−CR2Δ2b−GFPとpBI−CR3を有する2種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をOD600=0.6値に調製した。また、CMVゲノムRNA3形質転換体のT1個体には、pBI−CR1とpBI−CR2Δ2b−GFPを有する2種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1に等量混合した懸濁液の菌体量を最終濃度OD600=0.6値に調製した。いずれも、組換植物体への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。さらに本発明において必須である、2b遺伝子をこれらの形質転換植物体に供給するため、アグロインフィルトレーション法による一過性発現を実施した。CMVゲノムRNA1形質転換体(CR1−Tg)のT1個体には、pBI−CR2Δ2b−GFPとpB−CR3及びpGPTV−HPT−2bを有する3種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1:1に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をOD600=0.9値に調製した。また、CMVゲノムRNA3形質転換体(CR−3Tg)のT1個体には、pBI−CR1とpBI−CR2Δ2b−GFP及びpGPTV−HPT−2bを有する3種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1:1に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をOD600=0.9値に調製し、植物体への強制注入を行った。アグロインフィルトレーションによる接種後、[実験7]の方法で、5〜7日間栽培を行った。
CMVゲノムRNA1+2b遺伝子又はRNA3+2b遺伝子を有する形質転換体の接種用植物体の作出
CMVの2bタンパク質の存在下で、目的遺伝子のGFPが葉全体(葉脈+葉肉組織)で発現していることが[実験7]で確認できたことから、この2bタンパク質をコードする遺伝子と共にCMVのゲノムRNA1又はRNA3を発現する形質転換体(Nicotiana benthamiana)を作出するため、[実験8]の方法で作出した形質転換体のT1個体を温室出育成し、受粉前の花の雌しべに、[実験3]の方法で作出した2b形質転換体の花粉を人工授粉させた。得られた種子は、125mg/lカナマイシン及び15mg/lハイグロマイシンを添加したMS培地に無菌播種を行い、カナマイシン及びハイグロマイシンの両方に耐性が付与された植物体を選抜した後、芽生えを移植して温室内で土耕栽培による育成を行った。これらの個体の葉からゲノムDNAを抽出して、ゲノミックPCR解析を実施し、CR1+2b形質転換体は、pBI−CR1と2b遺伝子の両方を有する形質転換植物体であること、CR3+2b形質転換体は、pBI−CR3と2b遺伝子の両方を有する形質転換植物体であることも確認済みである。
CMVゲノムRNA1+2b遺伝子又はRNA3+2b遺伝子を有する形質転換体の接種用植物体としての機能解析
125mg/lカナマイシン及び15mg/lハイグロマイシンを添加したMS培地に無菌播種を行い、カナマイシン及びハイグロマイシンの両方に耐性が付与された植物体を選抜した後、芽生えを土耕栽培して温室内で育成を行った。播種後、約2ヶ月栽培した植物体に、[実験6]の方法で、アグロインフィルトレーションを実施した。CR1+2b形質転換体には、pBI−CR2Δ2b−GFPとpBI−CR3を有する2種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をOD600=0.6値に調整した。また、CR3+2b形質転換体のT1個体には、pBI−CR1とpBI−CR2Δ2b−GFPを有する2種類のアグロバクテリウム菌体溶液を1:1に等量混合した懸濁液の菌体量を最終濃度OD600=0.6値に調整した。いずれも、組換植物体への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。アグロインフィルトレーションによる接種後、[実験7]の方法で、5〜7日間栽培を行った。その結果を以下の表3に示す。
Claims (7)
- 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子であって、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、2bタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が前記外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルスのRNA2ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子。
- 前記キュウリモザイクウイルスRNA2ゲノムに相当する配列と前記アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)との間に、前記植物内で機能するターミネーター配列を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- T−DNAベクターの形態である、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- 前記植物が、キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノム、ならびにキュウリモザイクウイルスの2bタンパク質をそれぞれ機能的に発現している植物である、請求項1〜3の何れか一項に記載の核酸分子。
- 植物において外来遺伝子を発現させるための方法であって、植物においてキュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノム、並びにキュウリモザイクウイルスの2bタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程、請求項1〜3の何れか一項に記載の核酸分子を前記植物に導入する工程、及び、前記核酸分子が導入された植物を栽培して前記核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程を含む方法。
- キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノム及びRNA3ゲノムの発現が、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのRNA1ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子、並びに、アグロバクテリウムのT−DNA配列由来の右境界配列(RB)、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのRNA3ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのT−DNA配列由来の左境界配列(LB)をこの順序で有する核酸分子を、それぞれ植物に導入することによって行われる、請求項5に記載の方法。
- 核酸分子の植物への導入が、核酸分子を含む溶液の植物への浸透又は注入により行われる、請求項5又は6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013031355 | 2013-02-20 | ||
JP2013031355 | 2013-02-20 | ||
PCT/JP2014/054083 WO2014129560A1 (ja) | 2013-02-20 | 2014-02-20 | 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2014129560A1 true JPWO2014129560A1 (ja) | 2017-02-02 |
JP6350995B2 JP6350995B2 (ja) | 2018-07-04 |
Family
ID=51391341
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015501506A Active JP6350995B2 (ja) | 2013-02-20 | 2014-02-20 | 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160002654A1 (ja) |
EP (1) | EP2960331A4 (ja) |
JP (1) | JP6350995B2 (ja) |
WO (1) | WO2014129560A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030112863A1 (en) | 2001-07-12 | 2003-06-19 | Demos Gary A. | Method and system for improving compressed image chroma information |
EP3828274A4 (en) | 2018-07-25 | 2022-04-13 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | METHODS FOR SUPPRESSING METHYLATION OF TARGET DNA IN PLANTS |
CN114867857A (zh) | 2019-12-26 | 2022-08-05 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | 植物中的目标dna的甲基化的抑制方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005013164A (ja) * | 2003-06-27 | 2005-01-20 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 植物ウイルスベクター |
JP2007510423A (ja) * | 2003-11-10 | 2007-04-26 | アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト | Rnaウイルス由来植物発現システム |
JP2010502203A (ja) * | 2006-09-06 | 2010-01-28 | アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー | ポテクスウイルスに由来するレプリコン |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4669508A (en) | 1985-10-31 | 1987-06-02 | The Gates Rubber Company | Formable and curve shape retentive hose |
EP1686176A1 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-02 | Icon Genetics AG | Production of antibodies in plants with plus-sense single-stranded viral RNA vectors |
-
2014
- 2014-02-20 US US14/769,055 patent/US20160002654A1/en not_active Abandoned
- 2014-02-20 EP EP14754539.6A patent/EP2960331A4/en not_active Withdrawn
- 2014-02-20 JP JP2015501506A patent/JP6350995B2/ja active Active
- 2014-02-20 WO PCT/JP2014/054083 patent/WO2014129560A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005013164A (ja) * | 2003-06-27 | 2005-01-20 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 植物ウイルスベクター |
JP2007510423A (ja) * | 2003-11-10 | 2007-04-26 | アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト | Rnaウイルス由来植物発現システム |
JP2010502203A (ja) * | 2006-09-06 | 2010-01-28 | アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー | ポテクスウイルスに由来するレプリコン |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FUJIKI M.ET AL.: "Development of a new cucumber mosaic virus-based plant expression vector with truncated 3a movement", VIROLOGY,2008 NOV 10,381(1),P.136-42, JPN6014013392, ISSN: 0003671981 * |
PLANTA, 2007, VOL.225, P.277-286, JPN6017025995, ISSN: 0003671980 * |
TAKESHITA M.ET AL.: "Infection dynamics in viral spread and interference under the synergism between Cucumber mosaic viru", MOL.PLANT-MICROBE INTERACT.,2012 JAN,25(1),P.18-27, JPN6014013391, ISSN: 0003671982 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2960331A4 (en) | 2016-11-23 |
JP6350995B2 (ja) | 2018-07-04 |
WO2014129560A1 (ja) | 2014-08-28 |
US20160002654A1 (en) | 2016-01-07 |
EP2960331A1 (en) | 2015-12-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Marillonnet et al. | Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants | |
US9315818B2 (en) | Plant expression constructs and methods of utilizing same | |
JP5096743B2 (ja) | Rnaウイルス由来植物発現システム | |
Lorence et al. | Gene transfer and expression in plants | |
JP6850041B2 (ja) | 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用 | |
CN111424022B (zh) | 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 | |
JP7491517B2 (ja) | 植物から目的タンパク質を大量生産する方法 | |
WO2018151155A1 (ja) | 植物ウイルスベクターを利用したゲノム編集植物の生産方法 | |
Zhou et al. | Virus-induced gene silencing (VIGS) in Chinese narcissus and its use in functional analysis of NtMYB3 | |
JP6350995B2 (ja) | 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 | |
Kuriyama et al. | Improvement of Agrobacterium-mediated transformation for tannin-producing sorghum | |
KR101554678B1 (ko) | 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도 | |
Yang et al. | A simple and effective system for foreign gene expression in plants via root absorption of agrobacterial suspension | |
CN113652447B (zh) | 基于vigs的高效桃叶片基因沉默方法 | |
WO2020071528A1 (ja) | 植物のゲノム編集に用いられるdna構築物 | |
CN106434742B (zh) | 利用大豆表达犬瘟热蛋白的方法 | |
US20190062767A1 (en) | Method and system for expressing foreign gene in a plant | |
Das et al. | A direct method for genetically transforming rice seeds modelled with FHVB2, a suppressor of RNAi | |
EP1507009B1 (en) | Vector for gene silencing and gene silencing method using the same | |
JP7266226B2 (ja) | イチイ属の毛状根の製造方法 | |
Fan et al. | Transient expression of acidic fibroblast growth factor in pea (Pisum sativum L.) plants | |
Shi et al. | Improved production of transgenic Dioscorea zingiberensis (Dioscoreaceae) by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation | |
KR101962902B1 (ko) | 칠리잎말림바이러스를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 | |
Singh et al. | Development of Transgenic Plants against Biotic Stress through Agrobacterium Mediated Gene Transfer Method | |
KR20240066511A (ko) | 바이러스 감염의 시각적 추적을 위해 형광 표지를 장착한 재조합 오이모자이크바이러스 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170906 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170913 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171031 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171228 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180508 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180528 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6350995 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |