KR20240066511A - 바이러스 감염의 시각적 추적을 위해 형광 표지를 장착한 재조합 오이모자이크바이러스 - Google Patents

Abstract

본 개시는 바이러스 감염의 시각적 추적을 위해 형광 표지를 장착한 재조합 오이모자이크바이러스 및 이를 이용한 식물에서의 바이러스 감염의 시각적 추적 방법에 관한 것이다. 본 개시의 iLOV 형광 표지를 장착한 CMV(CMV-iLOV)는 접종 식물체에서 4주 이상 안정적으로 게놈 상에 iLOV 유전자를 유지하며 감염 세포에서 형광을 발현하며, 기계적 접종을 통한 식물 간 연속 계대 후에도 안정적으로 형광을 발현한다. 본 개시의 CMV-iLOV를 이용하여 식물체에서의 CMV 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적하여 감염 역학을 효과적으로 조사할 수 있으며, 바이러스의 증식 정도를 매우 신속하고 간단하게 정량적으로 분석할 수 있다.

Description

바이러스 감염의 시각적 추적을 위해 형광 표지를 장착한 재조합 오이모자이크바이러스{Fluorescently tagged recombinant cucumber mosaic virus for visual tracking of virus infection}

본 개시는 바이러스 감염의 시각적 추적을 위해 형광 표지를 장착한 재조합 오이모자이크바이러스 및 이를 이용한 식물에서의 바이러스 감염의 시각적 추적 방법에 관한 것이다.

오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus;　CMV)는 1916년 처음으로 보고되었다. CMV는 매우 넓은 기주 범위를 갖는 식물 바이러스로 오이, 토마토, 고추, 담배, 박과류 등 다양한 작물을 감염시켜 잎에 모자이크 증상을 나타낸다. CMV는 국내에서 특히 고추에서 가장 큰 피해를 일으키는 치명적인 바이러스이다. CMV는 직경 28-30nm인 공모양 3분절 게놈의 다입자성 바이러스이다.

CMV는 모델 RNA 바이러스이며, 바이러스 복제, 유전자 기능, 진화, 바이러스 입자 구조 및 병원성을 이해하기 위해 CMV에 대한 많은 연구가 수행되었다. CMV의 유전체는 3개의 양성 센스 단일 가닥(positive-sense single-stranded) RNA들(RNA1, RNA2 및 RNA3)과 RNA3으로부터 파생된 RNA4가 있다. RNA1 및 RNA2는 병원성을 지니고 있고, 바이러스 복제와 관련된 각각 1a 및 2a 단백질을 코딩하고 있다. RNA3은 3a 단백질과 코트 단백질(coat protein;　CP)을 코딩하고 있다. 3a 단백질은 세포 대 세포 이동 기능과 관련되어 있다. 코트 단백질은 RNA3으로부터 전사된 서브게놈(subgenome) RNA(RNA4)로부터 번역된다.

CMV에 감염된 과실은 작아지고 기형이 되어 수확량은 물론 상품가치가 크게 떨어진다. 이에 따라, CMV에 대한 저항성 품종 개발 및 바이러스 방제약제 개발이 지속적으로 이루어지고 있다. 저항성 품종 개발 및 바이러스 억제제 개발 시 바이러스 증식 및 식물체 부위별 감염 정도를 정량적으로 평가한다. CMV 감염 정도 평가의 경우, 현재까지 바이러스 유전자 증폭에 기반하는 quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 등을 이용하고 있다. 그러나, qRT-PCR을 이용하는 경우, 실험의 복잡성 및 긴 시간 소요 등의 어려움이 따른다.

바이러스 감염의 시각적 추적이 가능한 리포터 표지를 안정적으로 장착한 재조합 CMV는 아직까지 개발되지 않아, CMV의 식물체 내 이동 및 감염 역학 연구에는 어려움이 따르는 실정이다. 다른 여러 식물 바이러스의 경우, 녹색형광단백질(green fluorescence protein; GFP)과 같은 형광 단백질 유전자를 바이러스 게놈에 삽입하여 발현하도록 하여 바이러스 감염 및 이동을 시각적으로 관찰할 수 있었다. 그러나, CMV의 경우, 바이러스 게놈 크기의 엄격한 제한으로 GFP 유전자 삽입 시 바이러스 복제 과정 중 GFP 유전자가 제거되는 불안정성을 보인 바 있다.

본 개시가 해결하고자 하는 과제는 식물체에서 CMV의 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적하여 감염 역학을 조사할 수 있는 재조합 CMV 감염성 클론을 제공하는 것이다.

또한, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 상기 재조합 CMV 감염성 클론을 이용하여 식물에서의 바이러스 감염을 시각적으로 추적하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 GFP를 대체할 수 있는 식물 청색광 수용체의 LOV(light, oxygen or voltage-sensing) 도메인을 변형한 iLOV 유전자(375bp)를 CMV RNA2 게놈에 삽입함으로써, iLOV 형광 표지를 장착한 재조합 CMV 발현 벡터(CMV-iLOV)를 성공적으로 제작하였다. 본 발명자들은 CMV-iLOV가 접종된 식물체에서 4주 이상 안정적으로 게놈 상에 iLOV 유전자를 유지하며, 감염된 세포에서 형광을 발현하고 기계적 접종을 통한 식물간 연속 계대 후에도 안정적으로 형광을 발현함을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 CMV-iLOV를 이용해 식물체에서의 CMV의 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적하여 감염 역학을 성공적으로 조사할 수 있음을 발견하였다.

본 개시는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)의 RNA1을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA1); iLOV 유전자가 삽입된 CMV의 RNA2를 포함하는 벡터(pCMV-RNA2-iLOV); 및 CMV의 RNA3을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA3)로 이루어진 재조합 CMV 발현 벡터(CMV-iLOV)를 제공한다. 상기 CMV-iLOV는 식물체 내에서 CMV의 이동을 추적하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 CMV-iLOV는 아그로박테리움 매개 접종법을 이용하여 식물체를 감염시키고, 식물체 내에서 CMV의 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

본 개시의 한 측면에서, 상기 pCMV-GTN-RNA1는 서열번호 1의 유전자 서열을 가지며, 상기 pCMV-RNA2-iLOV는 서열번호 2의 유전자 서열을 가지며, 상기 pCMV-GTN-RNA3은 서열번호 3의 유전자 서열을 가지며, 상기 iLOV 유전자는 서열번호 4의 유전자 서열을 가진다. 또한, iLOV가 삽입되지 않은 pCMV-GTN-RNA2는 서열번호 5의 유전자 서열을 가진다. 또한, pCass-Rz 벡터 서열을 제외한 CMV의 RNA1은 서열번호 6의 유전자 서열을 가지며, RNA2는 서열번호 7의 유전자 서열을 가지며, RNA3은 서열번호 8의 유전자 서열을 가진다.

본 개시의 한 측면에서, 상기 iLOV 유전자는 CMV RNA2의 2b의 C말단에 삽입된다. 상기 iLOV 유전자의 상기 2b의 리딩 프레임(reading frame)이 유지되도록 삽입된다. 또한, 본 개시의 한 측면에서, 상기 iLOV 유전자는 CMV RNA2의 3' 부분에 위치한 PmlI 및 AvrII 제한 효소 부위를 이용하여 CMV RNA2의 2b의 C말단에 삽입된다. 본 발명자들은 상기 특정한 제한 효소를 사용함으로써, iLOV 유전자를 CMV RNA2의 2b의 C말단에 특이적 및 효율적으로 삽입할 수 있었다. 이에 따라, pCMV-RNA2-iLOV는 게놈(genomic) RNA2로부터 온전한 2a 단백질을 발현하며, 또한 RNA2의 서브게놈(subgenomic) RNA4A로부터 2b의 N말단과 iLOV 단백질이 융합된 형태인 2bN-iLOV 단백질을 발현한다.

본 개시에서의 "벡터"라는 용어는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 개시에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시의 한 측면에서, 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선발표지를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 또는 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역은 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

본 개시의 한 측면에서, 발현 벡터는 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하며, 이러한 MCS 영역은　HEcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI등의 제한효소 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 개시의 한 측면에서, 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유전자의 종류에 따라 유용한 프로모터의 종류가 달라지며, 작물 종에 따라 선발표지의 종류로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있으므로 프로모터 및 선발표지의 교환이 용이한 벡터는 매우 유용하다.

본 개시의 한 측면에서, "프로모터"라는 용어는 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결되는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

상기 선발표지(selective marker, 또는 선택 마커)는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 개시의 한 측면에서, 본 개시는 도 1의 모식도로 표현되는 CMV의 RNA1을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA1); iLOV 유전자가 삽입된 CMV의 RNA2를 포함하는 벡터(pCMV-RNA2-iLOV); 및 CMV의 RNA3을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA3)로 이루어진 재조합 CMV 발현 벡터(CMV-iLOV)를 제공한다.

또한, 본 개시는 상기 재조합 CMV 발현 벡터(CMV-iLOV)를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체 내에서 CMV의 이동을 추적하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 아그로박테리움 매개 접종법을 통해 CMV-iLOV를 식물체에 감염시키고, 식물체 내에서 CMV의 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적할 수 있다.

본 발명자들은 상기 CMV-iLOV 벡터를 아그로박테리움 매개 접종법으로 식물체에 도입한 후 시간 경과에 따라 iLOV 형광 발현을 관찰하여, 감염된 식물체의 잎에서 시간 경과에 따른 바이러스의 이동 과정을 관찰하였다.

본 개시의 한 측면에서, 상기 CMV-iLOV가 도입되는 식물체는 오이, 토마토, 고추, 담배, 또는 박과류 등일 수 있다.

본 개시의 한 측면에서, 발현 벡터를 식물체로 도입하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 기계적 접종(mechanical inoculation), 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method), 또는 아그로박테리움 인필트레이션(infiltration) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게, 본 개시의 벡터는 아그로박테리움 인필트레이션을 통해 CMV-iLOV의 식물체 내 전신감염을 유도하여 형질전환될 수 있다.

또한, 본 개시는 상기 방법으로 CMV-iLOV가 도입되어 형질전환된 식물체를 제공한다. 바람직하게, 상기 식물체는 오이, 토마토, 고추, 담배, 또는 박과류 등일 수 있다. 이러한 형질전환 식물체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 또한, 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함한다.

본 개시의 iLOV 형광 표지를 장착한 CMV(CMV-iLOV)는 접종 식물체에서 4주 이상 안정적으로 게놈 상에 iLOV 유전자를 유지하며 감염 세포에서 형광을 발현하며, 기계적 접종을 통한 식물 간 연속 계대 후에도 안정적으로 형광을 발현한다.

본 개시의 CMV-iLOV를 이용하여 식물체에서의 CMV 이동을 시간 경과에 따라 시각적으로 추적하여 감염 역학을 효과적으로 조사할 수 있다.

본 개시의 CMV-iLOV를 이용하여 바이러스 접종 부위의 형광 발현을 측정함으로써 매우 신속하고 간단하게 바이러스의 증식 정도를 정량적으로 분석할 수 있다.

본 개시의 CMV-iLOV를 이용하여 식물체 전반에 걸쳐 바이러스의 이동 속도를 시각적으로 비교함으로써, CMV에 대한 주요 작물의 품종별 저항성 평가 및 CMV 방제약제의 효과 평가에 활용할 수 있다.

도 1은 오이모자이크바이러스 GTN 계통(CMV-GTN)의 감염성 cDNA 클론 및 iLOV 형광 표지를 장착한 RNA2 클론의 모식도를 나타낸다.
도 2는 iLOV 형광 표지를 장착한 CMV(CMV-iLOV)의 감염성을 나타내는, 식물체에서 iLOV 형광단백질 발현의 검출 결과를 나타낸다.
도 3은 식물체에서 계대 접종 실험을 통해 CMV-iLOV의 안정성을 검증한 결과이다(A: CMV-iLOV 계대 접종에 따른 형광 발현 검출, B: CMV-iLOV 계대 접종시 CMV 게놈에 삽입된 iLOV 유전자의 유지 여부를 확인하기 위한 RT-PCR 검증, C: CMV-iLOV 안정성 검증을 위한 RT-PCR에 사용한 프라이머의 위치 및 증폭산물의 크기에 대한 모식도).
도 4는 CMV-iLOV를 이용한 시간 경과에 따른 CMV 감염 역학 관찰 결과이다(A: CMV-iLOV 접종 후 11일차에 촬영한 담배 식물 이미지이며, 잎의 위치를 숫자로 표기함, B: A에 숫자로 표기된 잎의 위치별 CMV-iLOV의 시간 경과에 따른 감염 역학을 형광 검출을 통해 추적한 결과이다).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예: iLOV 형광 표지를 장착한 재조합 CMV 감염성 cDNA 클론(CMV-iLOV) 제작

iLOV 형광 표지를 장착한 재조합 CMV 감염성 cDNA 클론을 제작하기 위해, 본 발명자들이 선행연구를 통해 기 개발한 CMV-GTN 계통의 감염성 cDNA 클론(논문정보 doi.org/10.1093/ve/veaa070)을 이용하였다(도 1). CMV-GTN의 감염성 cDNA 클론의 제작에는 바이너리 벡터인 pCass-Rz 벡터를 이용하였다.

pCass-Rz 벡터는 T-DNA의 left border, CaMV의 double 35S promoter, multiple cloning site (MCS; StuI, KpnI, XbaI, BamHI), cis-cleaving ribozyme sequence (Rz), 35S terminator (T), 및 T-DNA의 right border를 순서대로 포함하고 있어, 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환하여 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통해 식물에 원하는 유전자를 전달할 수 있다. 또한 pCassRz 벡터는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 있으므로, 대장균과 아그로박테리움에 형질 전환 시 선택 배양할 수 있다.

CMV의 게놈은 세 가닥의 양성-센스 단일가닥 RNA(positive-sense single-stranded RNA) 절편, 즉 RNA1, RNA2, RNA3로 이루어져 있다. 이들 각각의 RNA에 대한 cDNA를 pCass-RZ 벡터의 MCS에 삽입하여 감염성 cDNA 클론으로 제작하였으며, 각각 pCMV-GTN-RNA1(서열번호 1), pCMV-GTN-RNA2(서열번호 2), pCMV-GTN-RNA3(서열번호 3)라 명명하였다.

세 가닥의 절편 중 RNA2는 두 개의 Open reading frame (ORF)을 인코딩하고 있으며, 게놈(genomic) RNA2로부터 2a 단백질을 발현하여, RNA2의 서브게놈(subgenomic) RNA인 RNA4A로부터 2b 단백질을 발현한다. 이러한 CMV의 특징을 이용해 RNA2로부터 iLOV를 발현하고자 기 개발한 CMV RNA2 감염성 cDNA 클론을 이용해, 2b ORF의 C말단을 제거하고 그 위치에 2b 리딩 프레임(reading frame)이 유지되도록 iLOV 유전자(서열번호 4)를 삽입하였다. 이렇게 제작된 재조합 RNA2 클론을 pCMV-RNA2-iLOV라 명명하였다(도 1).

구체적으로, pCMV-GTN-RNA2 클론의 3' 부분에 위치한 PmlI과 AvrII를 이용하여, 해당 부위와 iLOV 유전자를 포함한 서열(아래 표 1 참조, 서열번호 9)을 합성한 후, PmlI과 AvrII로 해당 부위를 자른 후 교체해 넣는 방법으로 pCMV-RNA2-iLOV 클론을 제작하였다.

CACGTGAACGTGGCGGAATTGTCCGAGTCTGAGATGATCGAAAAGAATTTCGTCATCACCGATCCACGACTTCCAGATAACCCCATTATATTCGCATCTGATGGTTTTCTCGAACTTACTGAATACAGTAGGGAAGAAATACTTGGTAGAAATGCTCGTTTTCTCCAAGGACCAGAGACAGATCAGGCAACTGTGCAAAAGATAAGGGACGCAATTAGAGACCAGCGGGAGACTACCGTACAACTTATTAATTACACAAAGTCTGGCAAAAAGTTCTGGAATCTCCTGCACCTGCAGCCTGTCAGAGATCAGAAAGGCGAGTTGCAGTATTTTATTGGAGTCCAGTTGGACGGGAGTGACCATGTCTCCGGTGGTGGAGGCTCAGATTATAAGGATGATGATGATAAGTGAACCCCTCCTTCCTTTCTCCCTCCAGTTTTCTGAGGCGGGAGCTGAGTTGGCAGTATTGCTACAAACTGTCTGAAGTCACTAAACGTTTTACGGTGAACGGGTTGTCCATCCAGCTAACGGCTAAAATGGTCAGTCGCGGAGAAATCCACGCCGGAGATTTACAAGTCTCTGAGGCACCTTTGAAACCATCTCCTAGG (상기 서열 중 PmlI과 AvrII 서열은 밑줄로 표시하였으며, iLOV 서열은 볼드체로 표시함)

pCMV-RNA2-iLOV는 게놈 RNA2로부터 온전한 2a 단백질을 발현하며, 또한 서브게놈 RNA4A로부터 2b N말단과 iLOV 단백질이 융합(fusion)된 형태인 2bN-iLOV 단백질을 발현하게 된다.

실험예 1: CMV-iLOV의 안정성 검증

제작한 pCMV-RNA2-iLOV 클론 및 pCMV-GTN-RNA1 클론과 pCMV-GTN-RNA3 클론의 플라스미드 DNA를 아그로박테리움 균주 EHA105에 각각 형질 전환하였다. 형질 전환된 아그로박테리아(Agrobacteria)를 5ml의 YEP 액체 배지(100mg/ml의 카나마이신 및 50mg/ml의 리팜피신 포함)에서 30℃의 조건에서 24시간 동안 진탕배양하였다. 이후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지(50mg/ml의 카나마이신, 50mg/ml의 리팜피신 및 20uM의 아세토시린곤(acetosyringon) 포함)에 접종하여 30℃의 조건에서 12시간 동안 진탕배양하였다. 배양액을 4800G에서 10분간 원심분리하여 아그로박테리아를 침전시키고 MMA 인필트레이션 버퍼(MS salts, 10mM MES, pH5.6, 200uM acetosyringon)에 600nm의 파장에서 O.D. 0.7의 농도로 다시 현탁시켰다. 그 다음 현탁액을 30℃의 조건에서 4시간 동안 진탕배양하였다. pCMV-RNA2-iLOV, pCMV-GTN-RNA1, 또는 pCMV-GTN-RNA3로 각각 형질 전환된 아그로박테리움 배양액을 같은 비율로 혼합 후 담배(Nicotiana benthamiana) 잎의 배축면에 1ml 주사기를 이용하여 압력으로 인필트레이션 접종 하였다. CMV의 게놈은 세 가닥의 RNA인 RNA1, RNA2, RNA3로 구성된 바, pCMV-GTN-RNA1, pCMV-RNA2-iLOV, pCMV-GTN-RNA3로 조합되는 구성을 CMV-iLOV라 명명하였다.

접종 후 시간 경과에 따라, 형광 이미징 장비(FOBI, ㈜셀젠텍)를 이용하여 접종 식물을 관찰하였다. CMV-iLOV 접종 후 20일 이상 관찰한 결과, 접종 식물의 생장을 따라 CMV의 감염이 확산되는 조직에서 iLOV 형광이 발현되는 것을 확인하였다(도 2).

CMV 게놈에 삽입된 iLOV 유전자의 안정성을 평가하기 위해 CMV-iLOV 바이러스의 식물체간 계대 접종 실험을 수행하였다. 접종 후 10일차에 계대 접종한 식물에서의 iLOV 형광 발현을 관찰하고, 게놈 상의 iLOV 유전자의 유지 여부를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 상기 RT-PCR에서 사용된 프라이머의 서열은 아래 표 2와 같다.

프라이머	서열
Fw primer	5'-TGACAAACGTCGAACTCCAACT-3'(서열번호 10)
Rv primer	5'-AGCAATACTGCCAACTCAGCT-3'(서열번호 11)

아그로박테리움을 통해 최초 접종한 식물체에서 분리한 바이러스를 3번의 계대 접종을 통해 확인한 결과 CMV-iLOV는 높은 안정성 가지고 있으며, 지속적으로 iLOV 형광을 발현하였다(도 3).

실험예 2: CMV-iLOV의 형광 검출을 통한 바이러스 감염의 시각적 추적

CMV의 식물체 감염 역학을 시각적으로 추적하고자 담배 식물체에 CMV-iLOV를 아그로인필트레이션으로 접종한 후, 시간 경과에 따라 iLOV 형광 발현을 관찰하였다. 감염 식물체의 잎의 위치별 바이러스의 시간 경과에 따른 이동 과정을 성공적으로 관찰할 수 있었다(도 4).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)의 RNA1을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA1);
   iLOV 유전자가 삽입된 CMV의 RNA2를 포함하는 벡터(pCMV-RNA2-iLOV); 및
   CMV의 RNA3을 포함하는 벡터(pCMV-GTN-RNA3)로 이루어진 재조합 CMV 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 iLOV 유전자는 CMV의 RNA2의 2b의 C말단에 삽입되는 재조합 CMV 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 iLOV 유전자는 CMV RNA2의 3' 부분에 위치한 PmlI 및 AvrII 제한 효소 부위를 이용하여 CMV RNA2의 2b의 C말단에 삽입되는 재조합 CMV 발현 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 식물체 내에서 CMV의 이동을 추적하기 위한 용도로 사용되는 재조합 CMV 발현 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 pCMV-GTN-RNA1는 서열번호 1의 유전자 서열을 가지며,
   상기 pCMV-RNA2-iLOV는 서열번호 2의 유전자 서열을 가지며,
   상기 pCMV-GTN-RNA3은 서열번호 3의 유전자 서열을 갖는 재조합 CMV 발현 벡터.
6. 제1항의 재조합 CMV 발현 벡터(CMV-iLOV)를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체 내에서 CMV의 이동을 추적하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 오이, 토마토, 고추, 담배, 또는 박과류인 식물체 내에서 CMV의 이동을 추적하는 방법.