JPWO2013140822A1 - 細胞培養基材および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞の培養に適した足場を有する細胞培養基材およびそれを利用した細胞培養方法を提供することである。【解決手段】 細胞培養基材１００は、基板１００と、カーボンナノウォールＣＮＷ１とを有している。基板１１０は、支持基板１１１と、金属層１１２とを有している。カーボンナノウォールＣＮＷ１は、基板１００の板面に交差する向きに配置されている。カーボンナノウォールＣＮＷ１におけるグラフェンシートの先端部Ｅ１は、細胞を培養するための足場部である。先端部Ｅ１の炭素原子のうちの少なくとも一部に結合している化学種については、選ぶことができる。【選択図】図２

Description

本発明は、細胞培養基材および細胞培養方法に関する。さらに詳細には、カーボンを素材とする細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法に関するものである。

従来、細胞を培養するのに、平底フラスコを用いた平面培養が一般的であった。しかし、それでは、細胞が本来備える酵素活性や生合成活性等の性質を十分に発揮しきれないことが分かっている（非特許文献１、２参照）。

ところで、一部の細胞、特にヒト由来の細胞は、何かに接着した状態で培養する必要がある。生体外で浮遊している状態では、長期間にわたって生存することが困難であるからである。つまり、細胞の培養には、その成長の基礎とするための足場が必要である。そのため、細胞が接着するための基材が開発されてきている。例えば、特許文献１には、カーボンナノチューブを利用した細胞培養容器およびその製造方法が開示されている。

特開２００９−１４２２１８号公報

N a t u r e 4 2 4 ,ｐ 8 7 0 ( 2 0 0 3 ) S c i e n c e 3 0 2 ,ｐ 4 6 ( 2 0 0 3 )

カーボンナノチューブを足場にする場合には、細胞は、グラフェンシートのシート面（側面）を足場とすることとなる。そのため、細胞を培養するための好適性は、グラフェンシートの物理的性質および化学的性質に拘束される。したがって、カーボンナノチューブのシート面（側面）に化学修飾や孔を形成する研究がなされてきている。しかしそれでもなお、カーボンナノチューブのシート面（側面）の物理的性質および化学的性質を変化させる自由度は、それほど高くない。つまり、足場の性質を著しく変えるには不十分である。

本発明者らは、鋭意研究の結果、カーボンナノウォールを細胞培養基材とすると好適であることを発見した。ここで、カーボンナノウォールとは、基板の板面に交差する向きに形成されたグラフェンシートのことをいう。実際には、後述するように、各グラフェンシートは、基板に対してほぼ垂直に配置されている。そのため、グラフェンシートの先端部（エッジ）を、細胞の成長の足場とする。この場合には、グラフェンシートの間隔の異なる細胞培養基材を作成することができる。また、グラフェンシートの先端部（エッジ）の炭素原子と結合している原子を置換することにより、その化学的性質を変えることができる。

本発明は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。すなわちその課題とするところは、細胞の培養に適した足場を有する細胞培養基材およびそれを利用した細胞培養方法を提供することである。

第１の態様における細胞培養基材は、基板と、基板に形成されたカーボンナノウォールとを有するものである。そして、カーボンナノウォールのグラフェンシートの先端部が、細胞を培養するための足場部である。

この細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部の化学的性質を制御することができる。親水性から撥水性まで、連続的に変えることができる。また、ウォール間隔等の構造など、足場の物理的性質をも制御することができる。つまり、この細胞培養基材は、培養しようとする細胞に合わせた好適な足場を有している。

第２の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートは、基板の板面に交差する向きに形成されている。

第３の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの平均ウォール間隔は、１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲内である。

第４の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部の少なくとも一部の炭素原子は、炭素原子以外の原子と結合している。これにより、種々の化学種が終端基である細胞培養基材が実現されている。

第５の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部の少なくとも一部の炭素原子は、酸素原子または窒素原子と結合している。この細胞培養基材は、親水性を有している。そのため、親水性の足場で生育した場合の細胞を観察することができる。

第６の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部の少なくとも一部の炭素原子は、フッ素原子と結合している。そのため、撥水性の足場で生育した場合の細胞を観察することができる。

第７の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの平均ウォール間隔は、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内である。この場合に、培養する細胞がよく増殖する。

第８の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの平均ウォール間隔は、８０ｎｍ以上１２０ｎｍ以下の範囲内である。この場合に、培養する細胞がよく増殖する。

第９の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの平均ウォール間隔は、１２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内である。細胞の低侵襲性回収を行うことができる。

第１０の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部の少なくとも一部の炭素原子は、水素原子と結合している。

第１１の態様における細胞培養基材では、足場部での水との接触角が、１°以上１７０°以下の範囲内である。種々の足場の環境で、細胞を培養することができるからである。

第１２の態様における細胞培養基材では、グラフェンシートの先端部をコーティングするコーティング膜を有する。

第１３の態様における細胞培養基材では、コーティング膜は、コラーゲンコート処理がなされたものである。細胞の増殖を促進するとともに、細胞の分化をも促進する。

第１４の態様における細胞培養方法は、細胞培養基材の上に細胞を培養する方法である。そして、細胞培養基材として、基板にカーボンナノウォールが形成されたものを用いる。また、カーボンナノウォールのグラフェンシートの先端部を、細胞を培養するための足場とする。足場の物理的性質および化学的性質を制御した上で、細胞の培養を行うことができる。

第１５の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、グラフェンシートが基板の板面に交差する向きに形成されているものを用いる。

第１６の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、先端部の少なくとも一部の炭素原子は、炭素原子以外の原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いる。

第１７の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、先端部の少なくとも一部の炭素原子が、酸素原子または窒素原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いる。親水性の足場で生育した場合の細胞を観察することができる。

第１８の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、先端部の少なくとも一部の炭素原子が、フッ素原子または水素原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いる。そのため、撥水性の足場で生育した場合の細胞を観察することができる。

第１９の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、足場部での水との接触角が、１°以上１７０°以下の範囲内であるものを用いる。種々の足場の環境で、細胞を培養することができるからである。

第２０の態様における細胞培養方法では、細胞培養基材として、グラフェンシートの先端部をコーティングするコーティング膜を有するものを用いる。

第２１の態様における細胞培養方法では、コーティング膜は、コラーゲンコート処理がなされたものである。細胞の増殖を促進するとともに、細胞の分化をも促進する。

本発明によれば、細胞の培養に適した足場を有する細胞培養基材およびそれを利用した細胞培養方法が提供されている。

実施形態に係る第１の細胞培養基材を示す概略構成図である。 実施形態に係る細胞培養基材におけるカーボンナノウォールを説明するための模式図である。 実施形態に係る第２の細胞培養基材を示す概略構成図である。 実施形態に係る第３の細胞培養基材を示す概略構成図である。 実施形態に係る細胞培養基材を製造する製造装置を説明するための概略構成図である。 実施形態に係る細胞培養基材におけるカーボンナノウォールを上方から見たＳＥＭ写真である。 実施形態に係る細胞培養基材におけるカーボンナノウォールの断面を見たＳＥＭ写真である。 実施形態に係る第１の細胞培養基材の使用時を説明するための斜視図である。 実験ＡにおいてカーボンナノウォールをＣＨ₄ ガスで作成した後に大気圧プラズマ処理を行うことにより製造された細胞培養基材における水との接触角（１０°以下）を示す写真である。 実験ＡにおいてカーボンナノウォールをＣＨ₄ ガスで作成した細胞培養基材における水との接触角（５０°）を示す写真である。 実験ＡにおいてカーボンナノウォールをＣ₂ Ｆ₆ ガスで作成した細胞培養基材における水との接触角（１０５°）を示す写真である。 実験ＡにおいてカーボンナノウォールをＣＨ₄ ガスで作成した後にフッ素処理を行って製造された細胞培養基材における水との接触角（１３５°）を示す写真である。 実験Ｂにおいて接触角１０°以下の細胞培養基材に培養した細胞を示す写真である。 実験Ｂにおいて接触角５０°の細胞培養基材に培養した細胞を示す写真である。 実験Ｂにおいて接触角１０５°の細胞培養基材に培養した細胞を示す写真である。 実験Ｂにおいて接触角１３５°の細胞培養基材に培養した細胞を示す写真である。 実験Ｂにおいて培養を開始してから４日経過後の細胞数を実施形態の細胞培養基材とガラス基板とで比較したグラフである。 実験ＣにおいてＢＣＡ法を用いたタンパク質の吸着量を実施形態の細胞培養基材とガラス基板とで比較したグラフである。 実験Ｄにおいて各培養方法で培養した細胞における未分化細胞に対する活性比を示すグラフ（コラーゲンコート無し）である。 実験Ｄにおいて各培養方法で培養した細胞における未分化細胞に対する活性比を示すグラフ（コラーゲンコート有り）である。 実験Ｅにおいて製造した高密度および中密度および低密度のカーボンナノウォールの製造条件および性質を示す表である。 実験Ｆにおいて測定した水との接触角の密度依存性および化学種依存性を示すグラフである。 実験Ｇにおいて測定した密度に応じたラマンスペクトルを示したグラフである。 実験Ｈにおいて測定したカーボンナノウォールの先端部周辺の化学組成のスペクトルを示すグラフである。 実験Ｉにおいて測定したＨｅＬａ細胞の細胞数における水との接触角依存性および密度依存性を示すグラフである。 実験Ｊにおいて測定したカーボンナノウォールの密度とフッ素原子密度もしくは酸素原子密度との関係を示すグラフである。 実験Ｊにおいて測定したカーボンナノウォールの密度とＨｅＬａ細胞の細胞数との関係を示すグラフである。 実験Ｋにおいて測定したＨｅＬａ細胞の形状の密度依存性および終端基依存性を示す表である。 実験Ｋにおいて測定したＨｅＬａ細胞の伸びを示すグラフである。 実験Ｌにおいて観察したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。 実験Ｌにおいて観察した染色後のＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。

以下、具体的な実施形態について、細胞培養基材および細胞培養方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。

１．細胞培養基材
１−１．第１の細胞培養基材
１−１−１．第１の細胞培養基材の構造
図１は、実施形態に係る第１の細胞培養基材１００を示す概略構成図である。細胞培養基材１００は、動物細胞、特にヒト由来細胞を培養するために使用される細胞培養基材である。図１に示すように、細胞培養基材１００は、基板１１０と、カーボンナノウォールＣＮＷ１と、を有している。

基板１１０は、支持基板１１１と、金属層１１２とを有している。支持基板１１１は、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓなどの半導体基板またはＳｉＯ₂ 、ＴｉＯ₂ 、Ａｌ₂ Ｏ₃ などの酸化物基板である。金属層１１２は、Ｔｉ、Ｔａ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ、Ｗ、Ｆｅ、Ｐｔ、ＴｉＮなどの金属から成る層である。金属層１１２は、カーボンナノウォールの初期成長核を発生させる触媒として作用するものである。そのため、金属層１１２を設けることが好ましい。しかし、必ずしも必要であるわけではない。

カーボンナノウォールＣＮＷ１は、基板１１０の上に形成されている。カーボンナノウォールＣＮＷ１において、基板１１０の側には根元部Ｒ１があり、基板１１０の反対側には、先端部Ｅ１がある。根元部Ｒ１は、基板１１０に固定されている固定部である。先端部Ｅ１は、細胞を培養するための足場となる足場部である。

１−１−２．第１の細胞培養基材の微細構造
図２は、カーボンナノウォールＣＮＷ１の構造を模式的に表した図である。カーボンナノウォールＣＮＷ１において、グラフェンシートは、基板１１０の板面に交差する向きに形成されている。図２では、グラフェンシートと、基板１１０とは、ほぼ垂直である。そのため、グラフェンシートの先端には、先端部Ｅ１がある。先端部Ｅ１は、グラフェンシートの先端に位置する箇所である。そして、前述したように、先端部Ｅ１が細胞を培養するための足場となる。なお、先端部Ｅ１における炭素原子Ｃ１は、水素原子と結合している。つまり、カーボンナノウォールＣＮＷ１の終端基は、水素原子である。そして、この終端基が主に足場部としての役割を担うこととなる。

また、図２に示すように、カーボンナノウォールＣＮＷ１は、グラフェンシートを多数枚積層したものである。実際には、互いのグラフェンシートが平行に延びているわけではない。各々の初期成長核で異なる方向にグラフェンシートが成長するため、実際には、グラフェンシートがランダムに重ね合わせられた形状となっている。詳しくは、後述する。そして、図２に示すように、隣り合うグラフェンシート間の距離をウォール間隔Ｄ１ということとする。ウォール間隔Ｄ１は、細胞の足場部における足場間の距離を決めるものである。また、ウォール間隔Ｄ１を含めたカーボンナノウォールＣＮＷ１の構造を示す数値を表１に示す。ただし、これらの数値はあくまで例示であり、これらの値に限るものではない。

このウォール間隔Ｄ１の平均値である平均ウォール間隔は、カーボンナノウォールＣＮＷ１の密度と関連している。つまり、平均ウォール間隔が広いほど、カーボンナノウォールＣＮＷ１の密度は低い。逆に、平均ウォール間隔が狭いほど、カーボンナノウォールＣＮＷ１の密度は高い。

［表１］
ウォール間隔 １０ｎｍ〜１０００ｎｍ
ウォールの厚さ ０．３ｎｍ〜５０ｎｍ
ウォールの高さ ２０ｎｍ〜３０００ｎｍ

１−２．第２の細胞培養基材
１−２−１．第２の細胞培養基材の構造
図３は、第２の細胞培養基材２００を示す概略構成図である。図３に示すように、細胞培養基材２００は、基板１１０と、カーボンナノウォールＣＮＷ２と、を有している。カーボンナノウォールＣＮＷ２における根本部Ｒ１の反対側には、先端部Ｅ２がある。カーボンナノウォールＣＮＷ２の先端部Ｅ２の側には、置換部ＳＰが形成されている。

置換部ＳＰは、カーボンナノウォールＣＮＷ２の先端部Ｅ２の炭素原子と結合する原子を、別の原子で置き換えたものである。この置換により、カーボンナノウォールＣＮＷ２の先端部Ｅ２の炭素原子は、炭素原子以外の原子と結合している。そして、この置換により、細胞培養基材２００の親水性、疎水性といった性質が変化する。すなわち、細胞を培養するための足場部の化学的性質を選ぶことができる。

置換する原子として、例えば、酸素原子を用いることができる。そのため、カーボンナノウォールＣＮＷ２の先端部Ｅ２の少なくとも一部の炭素原子Ｃ１は、酸素原子と結合する。そして、先端部Ｅ２の残部の炭素原子は、水素原子と結合したままである。そのため、グラフェンシートの先端部Ｅ２の終端基は、酸素原子もしくは水素原子である。これらの置換の度合いは、置換処理の処理時間等、種々の条件により変わる。また、置換する原子として、窒素原子、フッ素原子等種々の原子が挙げられる。

１−３．第３の細胞培養基材
１−３−１．第３の細胞培養基材の構造
図４は、第３の細胞培養基材３００を示す概略構成図である。図４に示すように、細胞培養基材３００は、基板１１０と、カーボンナノウォールＣＮＷ３と、を有している。カーボンナノウォールＣＮＷ３における根元部Ｒ１の反対側には、先端部Ｅ３がある。カーボンナノウォールＣＮＷ３の先端部Ｅ３の側には、コーティング膜ＣＭが形成されている。コーティング膜ＣＭは、グラフェンシートの先端部を細胞と親和性のあるコーティング材でコーティングしたものである。コーティング膜ＣＭの材質として、例えば、コラーゲンが挙げられる。細胞培養基材３００におけるコーティング膜ＣＭを除くその他の構成は、第１の細胞培養基材１００と同様である。また、第２の細胞培養基材２００にコーティング膜ＣＭを形成してもよい。

２．細胞培養基材の製造装置
続いて、細胞培養基材１００を製造する製造装置について説明する。

図５は、製造装置１の構成を示す概略構成図である。製造装置１は、プラズマ生成室４６と、反応室１０とを有している。プラズマ生成室４６は、その内部でプラズマを発生させるとともに、反応室１０に供給するラジカルをも発生させるためのものである。反応室１０は、プラズマ生成室４６で生じたラジカルを利用して、カーボンナノウォールＣＮＷ１を形成するためのものである。

また、製造装置１は、導波路４７と、石英窓４８と、スロットアンテナ４９とを、有している。導波路４７は、マイクロ波３９を導入するためのものである。スロットアンテナ４９は、石英窓４８からプラズマ生成室４６にマイクロ波３９を導入するためのものである。

プラズマ生成室４６は、マイクロ波３９により表面波プラズマ（ＳＷＰ）を発生させるためのものである。プラズマ生成室４６には、ラジカル源導入口４２が設けられている。ラジカル源導入口４２は、プラズマ生成室４６に発生するプラズマ６１の内部にラジカル源となるガスを供給するためのものである。

プラズマ生成室４６と、反応室１０との間には、隔壁４４が設けられている。隔壁４４は、プラズマ生成室４６と、反応室１０とを仕切るためのものである。また、後述するように、電圧を印加するための電極も兼ねている。そして、隔壁４４には、貫通孔が形成されている。プラズマ生成室４６で生成されたラジカルを反応室１０に供給するためである。

反応室１０は、容量結合型プラズマ（ＣＣＰ）を発生させるためのものである。また、基板５０にカーボンナノウォールを形成するためのものでもある。反応室１０は、第２電極２４と、ヒーター２５と、原料導入口１２と、排気口１６とを有している。第２電極２４は、後述するように、第１電極２２との間に電圧を印加するためのものである。ヒーター２５は、基板５０を加熱して、基板５０の温度を制御するためのものである。原料導入口１２は、カーボンナノウォールの原料となる炭素系ガス３２を供給するためのものである。排気口１６は、真空ポンプ等に接続されている。真空ポンプは、反応室１０の内部の圧力を調整するためのものである。

ここで、隔壁４４は、第２電極２４との間に電圧を印加するための第１電極２２を兼ねている。第１電極２２には、電源および回路が接続されている。第１電極２２の電位を時間的に制御するためである。第２電極２４は、第１電極２２との間に電圧を印加するためのものである。そして、第２電極２４は、基板５０を載置するための載置台でもある。第２電極２４は、接地されている。第１電極２２と第２電極２４との間の距離は約５ｃｍである。もちろん、この値に限らない。

３．細胞培養基材の製造方法
３−１．第１の細胞培養基材の製造方法
まず、製造装置１の内部に、カーボンナノウォールＣＮＷ１を形成する前の基板５０をセットする。次に、マイクロ波３９を導波路４７に導入する。マイクロ波３９は、スロットアンテナ４９により、石英窓４８から、プラズマ生成室４６に導入される。これにより、高密度プラズマ６０が発生する。

そして、この高密度プラズマ６０がプラズマ生成室４６の内部で拡散して、プラズマ６１となる。このプラズマ６１は、ラジカル源導入口４２から供給されるラジカル源のイオンを含んでいる。ラジカル源として、水素を用いる。もしくは、酸素、窒素、その他の気体であってもよい。プラズマ６１中の大部分のイオンは、隔壁４４に衝突して中性化して、ラジカルとなる。ラジカル３８は、隔壁４４の貫通孔を通過して、反応室１０に入る。

反応室１０の内部には、ラジカル３８の他に、原料導入口１２から炭素系ガス３２が供給される。炭素系ガス３２とは、例えば、ＣＨ₄ やＣ₂ Ｆ₆ である。もちろん、それ以外のものであってもよい。そして、第１電極２４と、第２電極２２との間に電圧を印加する。これにより、反応室１０の内部にプラズマ３４が発生する。

プラズマ３４の雰囲気中には、原料である炭素系ガス３２と、ラジカル３８とが混在している。そして、このプラズマ３４の雰囲気中で基板５０の表面にカーボンナノウォールが成長する。なお、反応室１０の内部の圧力は、５〜２０００ｍＴｏｒｒ（０．６５Ｐａ〜２６７Ｐａ）の範囲内である。また、基板５０の温度は、１００〜８００℃の範囲内である。もちろん、これらは例示であり、これらの数値範囲に限らない。

３−２．第２の細胞培養基材の製造方法
第２の細胞培養基材２００は、第１の細胞培養基材１００にプラズマ処理を施すことにより製造される。そのため、第１の細胞培養基材１００に、置換しようとする原子を含むガスをプラズマガスとしてプラズマを発生させる。ここでは、まず、チャンバーの内部にプラズマ発生装置を置く。そして、チャンバーの内部をＡｒガスでパージしながら、Ａｒ＋Ｏ₂ ガスをプラズマ化する。これにより、酸素原子に由来するラジカル等がプラズマ発生領域に発生する。そして、発生した酸素原子は、細胞培養基材１００の先端部Ｅ１で反応して、酸素原子の結合した先端部Ｅ２が製造される。先端部Ｅ２の炭素原子にその他の原子を結合させるには、その他のガスを用いればよい。

３−３．第３の細胞培養基材の製造方法
第３の細胞培養基材３００は、第１の細胞培養基材１００にコラーゲンコート処理を施すことにより製造される。そのため、細胞培養基材１００へのコラーゲンのコーティング方法について説明する。まず、コラーゲン酸性溶液の入っている容器に、第１の細胞培養基材１００を入れる。これにより、先端部Ｅ１にコラーゲンの薄い膜が形成される。このとき、細胞培養基材１００は、酸性となる。次に、コラーゲン酸性溶液に浸けた後の細胞培養基材１００を乾燥後、培地に浸す。そのため、細胞培養基材１００は、中性となる。これにより、先端部Ｅ１は、コラーゲンコート処理がなされた先端部Ｅ３となる。以上により、先端部Ｅ３にコーティング膜ＣＭを有する細胞培養基材が作製される。

３−２．製造されたカーボンナノウォール
図６は、上記のように形成されたカーボンナノウォールの構造を先端部の側から見た顕微鏡写真である。図６に示すように、カーボンナノウォールは、ランダムに成長している。ただし、その間隔は、ある程度均一である。図７は、形成されたカーボンナノウォールの構造を基板側面から見た断面を示す顕微鏡写真である。図７に示すように、カーボンナノウォールは、基板に対してほぼ垂直に形成されている。

４．細胞培養基材における細胞培養方法
図８は、細胞培養基材１００を用いて細胞を培養しているところを示す図である。図８に示すように、シャーレ５００の底面に細胞培養基材１００を置く。その向きはもちろん、カーボンナノウォールＣＮＷ１が上となる向きである。したがって、細胞培養基材１００の先端部Ｅ１は、シャーレ５００の底面と接触することはない。そして、細胞培養基材１００を置いたシャーレ５００に、培養液を注ぐ。その培養液としては、細胞の培養に用いられる一般的なものを用いればよい。そして、細胞培養基材１００の先端部Ｅ１に、培養したい細胞を供給する。例えば、ピペットを用いることができる。また、細胞培養基材２００、３００を用いる場合にも、同様に細胞を培養することができる。

５．実験Ａ（親水性および撥水性）
５−１．親水性および撥水性の制御
前述したように、本実施形態の細胞培養基材１００では、先端部Ｅ１の炭素原子Ｃ１と結合している原子もしくは分子を置換することができる。これにより、本実施形態のカーボンナノウォールＣＮＷ１では、親水性または撥水性を備えるようにすることができる。

所望の親水性または撥水性を備えるカーボンナノウォールを形成するには、次の３点が主に重要である。
（Ａ）先端部の炭素原子と結合する化学種
（Ｂ）化学種の置換の度合い
（Ｃ）カーボンナノウォールの構造

ここで、（Ａ）先端部の炭素原子と結合する化学種（例えば、Ｈ、Ｆ等）により、カーボンナノウォールＣＮＷ１の先端部Ｅ１の親水性または撥水性は、もちろん変化する。この制御は、カーボンナノウォールＣＮＷ１を形成後に、ラジカルを供給することにより行うことができる。

カーボンナノウォールＣＮＷ１にプラズマを照射することにより、炭素原子Ｃ１の化学種を置換することができる。例えば、ラジカル源として酸素を導入することで、炭素原子Ｃ１に酸素原子を結合させることができる。これにより、先端部Ｅ２の炭素原子Ｃ１が酸素原子と結合している酸化グラフェンシートを生成することができる。つまり、複数の炭素原子Ｃ１のうちの少なくとも一部は、酸素原子と結合している。ただし、先端部Ｅ２に位置する全ての炭素原子を酸素原子に結合させることは困難である。つまり、終端基のすべてを酸素原子とすることは困難である。水素原子を酸素原子で置換したこのグラフェンシートは、後述するように、親水性を有する。

また、ラジカル源として水素を導入することで、炭素原子Ｃ１により多くの水素を結合させることができる。これにより、先端部Ｅ１の炭素原子Ｃ１が水素と結合しているグラフェンシートを生成することができる。このグラフェンシートは、撥水性を有する。また、ラジカル源としてフッ素を導入することで、先端部Ｅ１の炭素原子Ｃ１がフッ素原子と結合しているグラフェンシートを生成することができる。このグラフェンシートも、撥水性を有する。

そして、その（Ｂ）化学種の置換の度合い（例えば、５０％置換）によっても、親水性または撥水性は、変化する。この制御は、プラズマの照射時間を変えることで、調整することができる。

また、（Ｃ）カーボンナノウォールの構造（例えば、ウォール間隔Ｄ１）によっても、親水性または撥水性は、わずかに変化する。この制御は、反応室１０における基板温度、原料ガス、圧力など、その他の条件を変えることで調整することができる。これら（Ａ）〜（Ｃ）の組み合わせにより、先端部における親水性または撥水性を、ほぼ連続的に変えることができる。なお、これら（Ａ）〜（Ｃ）により、親水性または撥水性といった化学的性質のみならず、細胞の足場となる先端部におけるその他の化学的性質も変化する。

５−２．親水性および撥水性についての実験
続いて、親水性および撥水性について行った実験について説明する。実験条件は次の通りである。マイクロ波３９を発生させるための電力として４００Ｗを用いた。その周波数として２．４５ＧＨｚを用いた。容量結合型プラズマを発生させるための電力として３００Ｗを用いた。その周波数として１００ＭＨｚを用いた。基板温度を５４０℃とした。成長時間を１５分とした。反応室１０の内部の圧力を１Ｐａとした。原料ガスとして、
１）ＣＨ₄ ガス（１００ｓｃｃｍ）、
２）Ｃ₂ Ｈ₆ ／Ｈ₂ ガス（１００ｓｃｃｍ／５０ｓｃｃｍ）
のいずれかを用いた。

図９から図１２に水との接触角を示す。図９は、原料である炭素系ガス３２をＣＨ₄ ガスとしてカーボンナノウォールを作成した後に、大気圧プラズマ処理を行って製造された細胞培養基材における水との接触角を示す写真である。その接触角は１０°以下である。図１０は、カーボンナノウォールをＣＨ₄ ガスで作成した細胞培養基材における水との接触角を示す写真である。その接触角は約５０°である。

図１１は、カーボンナノウォールをＣ₂ Ｆ₆ ガスで作成した細胞培養基材における水との接触角を示す写真である。その接触角はおよそ１０５°である。図１２は、カーボンナノウォールをＣＨ₄ ガスで作成した後にフッ素処理を行って製造された細胞培養基材における水との接触角を示す写真である。このフッ素処理は、プラズマ照射により行った。その際の供給ガスは、フルオロカーボンガスである。その接触角はおよそ１３５°である。なお、このフッ素処理は、フッ化水素（ＨＦ）溶液に浸漬することにより行ってもよい。

以上説明したように、足場部における水との接触角は、１°以上１７０°以下の範囲内である。

５−３．カーボンナノチューブとの比較
以上説明したように、カーボンナノウォールでは、細胞の足場となる先端部の炭素原子に結合する化学種を置換することができる。これに対して、カーボンナノチューブでは、細胞の足場となるのは、グラフェンシートの側面（例えば、図２のＳ１）である。このグラフェンシートの側面には、π電子が存在する。しかし、カーボンナノチューブには、カーボンナノウォールＣＮＷ１のように、先端部Ｅ１が存在するわけではない。したがって、カーボンナノチューブでは、化学種の置換や、格子欠陥の形成による表面構造の変化も可能であるものの、カーボンナノウォールＣＮＷ１におけるウォール間隔Ｄ１の変化量に比べると、その変化の度合いは極めて小さいといえる。

６．実験Ｂ（親水性または撥水性と培養する細胞との関係）
図１３から図１６までに、水との接触角の異なる場合における細胞の顕微鏡写真を示す。これらは、いずれもＨｅＬａ細胞である。そして、培養を開始してから４日経過後の顕微鏡写真である。

図１３は、水との接触角が１０°以下の場合における細胞の顕微鏡写真である。図１４は、水との接触角がおよそ５０°の場合における細胞の顕微鏡写真である。図１５は、水との接触角がおよそ１０５°の場合における細胞の顕微鏡写真である。図１６は、水との接触角がおよそ１３５°の場合における細胞の顕微鏡写真である。これらの結果から、水との接触角が大きくなるほど、細胞は球形に近い形状に変化している。以上、具体例を挙げて示したように、足場部での水との接触角が、１°以上１７０°以下の範囲内の細胞培養基材１００を製造することができる。

図１７は、細胞培養基材の足場における水との接触角と、培養を開始してから４日経過後の細胞数との関係を示すグラフである。培養した細胞はＨｅＬａ細胞である。図１７では、本実施形態の細胞培養基材で培養した細胞数と、ガラス基板で培養した細胞数とを比較している。図１７の横軸は、水との接触角である。図１７の縦軸は、細胞数である。ここで、細胞数が多い細胞培養基材ほど、細胞の培養に適していることを示している。全体的に、本実施形態の細胞培養基材で培養した細胞数は、ガラス基板で培養した細胞数よりも多い。

また、本実施形態の細胞培養基材では、撥水性の強い接触角１３５°であっても細胞を１×１０⁴ 細胞／ｃｍ² 程度は培養できることが明らかとなった。また、接触角１３５°の場合には、細胞の低侵襲性回収を行うことができた。

７．実験Ｃ（タンパク質の吸着量）
図１８は、細胞培養基材の足場における水との接触角と、タンパク質の吸着量との関係を示すグラフである。培養した細胞は、同じくＨｅＬａ細胞である。図１８の横軸は、水との接触角である。図１８の縦軸は、細胞培養基材におけるタンパク質の吸着量である。図１８に示すように、本実施形態の細胞培養基材におけるタンパク質の吸着量は、ガラス基板におけるタンパク質の吸着量の２倍程度である。すなわち、ガラス基板に比べてカーボンナノウォールＣＮＷ１を有する本実施形態の細胞培養基材のほうが、細胞の培養に適している。

８．実験Ｄ（骨芽細胞への分化（アルカリフォスファターゼ活性））
ここで、骨芽細胞への分化について行った実験結果について説明する。本実験では、間葉系幹細胞を用いた。培養に用いた溶液は、ＤＭＥＭにＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを混合した混合溶液である。ＦＢＳの混合比は１０％である。ペニシリン−ストレプトマイシンの混合比は、１％である。培養を開始してから１０日経過後に、その間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化しているか調べた。

本実験では、４種類の方法で培養した細胞に対してアルカリフォスファターゼ活性を測定して比較した。４種類とは、次のようなものである。
Ａ．培養ディッシュ（接触角７０°）
Ｂ．ガラス基板（接触角６０°）
Ｃ．カーボンナノウォール（接触角１０°以下）
Ｄ．カーボンナノウォール（接触角５０°）

図１９は、その結果である。縦軸は、未分化細胞を基準としたアルカリフォスファターゼ活性の測定結果である。未分化細胞に比べて、この測定値が大きいほど、骨芽細胞への分化が進んでいると考えられる。図１９に示すように、測定値はいずれも未分化細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性の測定値の１．１倍程度である。ガラス基板を用いた場合の測定値が他の場合と比べてやや低い。

図２０は、各基板にコラーゲンコートした細胞培養基材を用いて細胞を培養した結果である。カーボンナノウォールを用いた細胞培養基材（コラーゲンコート済）のほうが、培養ディッシュやガラス基板を用いたものに比べて、骨芽細胞への分化が進んでいると考えられる。

９．実験Ｅ（密度制御）
９−１．実験に用いる細胞培養基材の種類
図２１は、圧力、成長時間、ＣＣＰＰｏｗｅｒ、というカーボンナノウォールの製造条件を変えた場合に、どのような性質のカーボンナノウォールが製造されるかを示す表である。図２１に示すように、製造条件を変えることにより、高密度のカーボンナノウォールから低密度のカーボンナノウォールまで製造することができる。なお、図２１に示した条件以外の条件については、実験Ａと同様である。

図２１の（ａ）に、高密度のカーボンナノウォールを示す。（ａ）の高密度のカーボンナノウォールのウォール間隔は、９５ｎｍであった。（ａ）の高密度のカーボンナノウォールを製造するために、製造装置１の内圧を１Ｐａとし、ＣＣＰＰｏｗｅｒを１００Ｗとし、成長時間を８０分とした。

図２１の（ｂ）に、中密度のカーボンナノウォールを示す。（ｂ）の中密度のカーボンナノウォールのウォール間隔は、１３１ｎｍであった。（ｂ）の中密度のカーボンナノウォールを製造するために、製造装置１の内圧を１Ｐａとし、ＣＣＰＰｏｗｅｒを３００Ｗとし、成長時間を１５分とした。

図２１の（ｃ）に、低密度のカーボンナノウォールを示す。（ｃ）の低密度のカーボンナノウォールのウォール間隔は、３１３ｎｍであった。（ｃ）の低密度のカーボンナノウォールを製造するために、製造装置１の内圧を５Ｐａとし、ＣＣＰＰｏｗｅｒを５００Ｗとし、成長時間を８分とした。

このように、これ以降、便宜上、図２１（ａ）に示すものを高密度のカーボンナノウォールと呼ぶこととし、図２１（ｂ）に示すものを中密度のカーボンナノウォールと呼ぶこととし、図２１（ｃ）に示すものを低密度のカーボンナノウォールと呼ぶこととする。これら（ａ）〜（ｃ）の３種類のサンプルに細胞を培養することとして、以下の実験を実施した。

１０．実験Ｆ（水との接触角の密度依存性）
本実験では、（ａ）〜（ｃ）のそれぞれのサンプルに、酸素原子置換、窒素原子置換、水素原子置換、フッ素原子置換を行い、計１２種類のサンプルを得た。そして、それぞれのサンプルで接触角を測定した。図２２にその結果を示す。

図２２に示すように、水との接触角は、先端部Ｅ２で結合する原子の種類に強く依存することが分かった。先端部Ｅ２の原子が酸素原子である場合には、水との接触角は、５°程度である。先端部Ｅ２の原子が窒素原子である場合には、水との接触角は、５°程度である。先端部Ｅ２の原子が水素原子である場合には、水との接触角は、５０°程度である。先端部Ｅ２の原子がフッ素原子である場合には、水との接触角は、およそ１３０°〜１５０°である。

一方、酸素原子置換、窒素原子置換、水素原子置換、フッ素原子置換のいずれを行った場合であっても、水との接触角はカーボンナノウォールのウォール間隔にほとんど依存していなかった。つまり、ウォール間隔を変えても、水との接触角は、ほとんど変わらない。

１１．実験Ｇ（結晶構造）
図２３は、低密度のカーボンナノウォールと、中密度のカーボンナノウォールと、高密度のカーボンナノウォールとで、ラマンシフトを測定した結果を示すグラフである。これらの終端基は、水素の場合である。つまり、終端基の置換を施していない場合の結果である。図２３に示すように、１５９０ｃｍ^-1付近のＧバンドのピークと、１３５０ｃｍ^-1付近のＤバンドのピークと、１６２０ｃｍ^-1付近のＤ’バンドのピークとが観測された。これらのカーボンナノウォールのスペクトルは、互いにやや異なっている。例えば、高密度になるほど、Ｄバンドの成分が大きくなる。

１２．実験Ｈ（化学組成比）
図２４は、中密度のカーボンナノウォールの終端基を変化させた場合における化学組成比を示すものである。図２４の横軸は、結合エネルギーである。図２４の縦軸は、強度である。図２４（ａ）は、グラフェンシートの終端基の一部を酸素原子で置換したものの結果を示す。図２４（ｂ）は、グラフェンシートの終端基の一部を窒素原子で置換したものの結果を示す。図２４（ｃ）は、グラフェンシートの終端基の一部を置換しなかったものの結果を示す。しかし、一部に、Ｃ−Ｏ結合の成分が混じっていることが確認された。図２４（ｄ）は、グラフェンシートの終端基の一部をフッ素原子で置換したものの結果を示す。

１３．実験Ｉ（足場部と細胞数との関係）
図２５は、細胞培養基材の足場部と、その足場部で培養したＨｅＬａ細胞の培養数との関係を示すグラフである。図２５の横軸は、水との接触角である。図２５の縦軸は、ＨｅＬａ細胞の細胞数である。図２５に示すように、初期のＨｅＬａ細胞の細胞数は、１００００細胞／ｃｍ² 程度であった。そして、図２５には、４日後の細胞数をプロットした。なお、比較のために、ガラス基板で培養した細胞数もプロットしてある。

図２５に示すように、中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合の細胞数と、ガラス基板で培養した場合の細胞数とは、ほぼ同程度である。例えば、水との接触角が５５°の中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、４００００細胞／ｃｍ² 程度であり、水との接触角が６０°のガラス基板で培養した場合も、４００００細胞／ｃｍ² 程度であった。水との接触角が５°の中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、３１０００細胞／ｃｍ² 程度であり、水との接触角が１０°のガラス基板で培養した場合には、２５０００細胞／ｃｍ² 程度であった。

また、水との接触角が１３５°の中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、１００００細胞／ｃｍ² 程度であり、水との接触角が１０５°のガラス基板で培養した場合には、１００００細胞／ｃｍ² 程度であった。ただし、これらの場合には、水との接触角が異なっている。なお、ガラス基板では、水との接触角を１０５°程度までしかとることができない。

水との接触角が０°〜１０°程度の領域では、低密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合の細胞数が５５０００細胞／ｃｍ² 程度であり、細胞数が非常に多かった。水との接触角が０°〜１０°程度の領域では、それ以外の場合の細胞数は、２５０００細胞／ｃｍ² 程度から３５０００細胞／ｃｍ² 程度までの間であった。

水との接触角が５０°〜６０°程度の領域では、前述したように、中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合とガラス基板で培養した場合とで、細胞数が４００００細胞／ｃｍ² 程度であった。それ以外の場合には、２５０００細胞／ｃｍ² 程度であった。

水との接触角が１３０°〜１４０°程度の領域では、ウォール間隔の違いに応じて大きな差異が表れた。つまり、高密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、細胞数が６００００細胞／ｃｍ² 程度であり、細胞数が非常に多かった。一方、低密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、細胞数は２５０００細胞／ｃｍ² 程度であった。また、中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合には、細胞数は１００００細胞／ｃｍ² 程度であった。

このように、細胞数という観点からは、水との接触角が大きく、高密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合に、細胞数が多かった。つまり、水との接触角が１２０°以上１５０°以下の範囲内であって、平均ウォール間隔が８０ｎｍ以上１２０ｎｍ以下の範囲内であるとよい。ここで、水との接触角が１２０°以上１５０°以下の範囲内となるのは、グラフェンシートの終端基がフッ素原子の場合である。

また、細胞数という観点からは、水との接触角が小さく、低密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材で培養した場合に、細胞数が多かった。つまり、水との接触角が３°以上１０°以下の範囲内であって、平均ウォール間隔が１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内であるとよい。特に平均ウォール間隔が２００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内であるとよい。ここで、水との接触角が３°以上１０°以下の範囲内となるのは、グラフェンシートの終端基が酸素原子または窒素原子の場合である。

１４．実験Ｊ（化学組成と細胞数）
１４−１．化学組成
図２６は、カーボンナノウォールの密度と、酸素密度もしくはフッ素密度との関係を示すグラフである。ここでは、酸素もしくはフッ素をプラズマガスとして用いて、グラフェンシートの終端基を酸素原子もしくはフッ素原子とした。図２６の横軸は、カーボンナノウォールの密度である。図２６の左側の縦軸は、終端基における炭素原子に対するフッ素原子の割合である。図２６の右側の縦軸は、終端基における炭素原子に対する酸素原子の割合である。

図２６に示すように、低密度では、終端基における炭素原子に対するフッ素原子の割合は、１．０程度である。中密度では、終端基における炭素原子に対するフッ素原子の割合は、１．７程度である。高密度では、終端基における炭素原子に対するフッ素原子の割合は、１．５程度である。

また、低密度では、終端基における炭素原子に対する酸素原子の割合は、０．２２程度である。中密度では、終端基における炭素原子に対する酸素原子の割合は、０．３２程度である。高密度では、終端基における炭素原子に対する酸素原子の割合は、０．１８程度である。

１４−２．細胞数
図２７は、終端基をフッ素原子とした場合におけるカーボンナノウォールの密度と細胞数との関係を示すグラフである。ただし、終端基のすべてがフッ素原子になったわけではなく、図２６に示したような炭素原子に対する割合をもったものである。図２６に示したように、炭素原子に対するフッ素原子の割合は、１．０から１．５までの範囲内である。それに比べて、図２７に示すように、培養後の細胞数には大きな差異がある。中密度と高密度とでは、フッ素原子の割合に差異はほとんどないのに対して、細胞数では６倍程度異なっている。これは、水との接触角と、ウォール間隔とが、培養する細胞の数に大きく影響を与えることを示すとともに、終端基の化学種の影響はそれほど大きくないことを示唆している。

１５．実験Ｋ（細胞の形状）
図２８は、高密度もしくは低密度のカーボンナノウォールと、その終端基の原子との組み合わせと、その組み合わせによる細胞培養基材での細胞の形状を示す顕微鏡写真を対応させたものである。そして、図２８は、細胞を培養して１日後の様子を撮影したものである。図２８に示すように、終端基が水素原子の場合に、ＨｅＬａ細胞の形状がやや円形もしくは球形に近い形状となっている。

図２９は、ＨｅＬａ細胞の伸びを示すグラフである。この値が大きいほど、細胞の一辺の長さが長い。つまり、円形からずれている。逆に、この値が小さいほど、円形に近い。図２９に示すように、終端基が水素原子の場合に、特に値が小さい。すなわち、終端基が水素原子の場合に、ＨｅＬａ細胞の形状は、より円形に近い。

１６．実験Ｌ（細胞の回収）
図３０は、ＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。そして、図３１は、ＨｅＬａ細胞を染色した顕微鏡写真である。光源として、水銀ランプを用いるとともに、フィルターとして、６５２ｎｍのＦＩＴＣを用いた。図３１では、染色されている細胞が生存しているＨｅＬａ細胞である。

そして、これらの写真からは明らかではないが、本実施形態の細胞培養基材から浮遊している細胞が生存していることを確認した。一般に、基板から遊離して浮遊している細胞は、死滅している。これに対して、本実施形態は、生存しているＨｅＬａ細胞を遊離させることができる。そのため、細胞にダメージを与えないで細胞を回収することができる。ただし、遊離しており、かつ、生存している細胞は、水との接触角が１３５°であって、中密度のカーボンナノウォールを有する細胞培養基材についてのみ、発見された。つまり、水との接触角が１２０°以上１５０°以下の範囲内であって、平均ウォール間隔が、１２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内であると、低侵襲性回収を行うことができる。ここで水との接触角が１２０°以上１５０°以下の範囲内となるのは、グラフェンシートの終端基がフッ素原子の場合である。

１７．変形例
１７−１．導電性
また、カーボンナノウォールＣＮＷ１に、金属微粒子を担持させることにより、グラフェンシートの先端部Ｅ１を導電性にすることもできる。また、製造装置１を用いて、形成後のカーボンナノウォールＣＮＷ１に、ラジカルを打ち込むこととしてもよい。これにより、カーボンナノウォールＣＮＷ１を半導体とすることもできる。そして、反応室１０の内部に窒素を導入して窒素雰囲気中でプラズマを発生させることにより、カーボンナノウォールＣＮＷ１をｎ型半導体とすることもできる。

１７−２．コーティング材の種類
本実施形態では、カーボンナノウォールの先端にコラーゲンコートした第３の細胞培養基材３００を用いた。しかし、その他のコーティング材を用いてもよい。例えば、コラーゲン以外のコーティング材として、コラーゲンペプチド、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンなどが挙げられる。

１８．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態に係る細胞培養基材１００では、カーボンナノウォールＣＮＷ１を形成することとした。カーボンナノウォールＣＮＷ１の先端部Ｅ１が、細胞の足場となる。先端部Ｅ１の化学的性質および構造について、細かい調整を行うことが可能である。したがって、細胞を培養するのに好適な細胞培養基材１００、２００、３００が実現されている。また、その細胞培養基材１００、２００、３００を利用することにより、好適に細胞を培養することのできる細胞培養方法が実現されている。

なお、本実施形態は単なる例示にすぎない。したがって当然に、その要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良、変形が可能である。例えば、カーボンナノウォールＣＮＷ１を形成する基板１１０の表面に予め凹凸を形成しておいてもよい。

１…製造装置
１００、２００、３００…細胞培養基材
１１０…基板
１１１…支持基板
１１２…金属層
ＣＮＷ１、ＣＮＷ２、ＣＮＷ３…カーボンナノウォール
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３…先端部
Ｒ１…根元部
Ｃ１…炭素原子
Ｄ１…ウォール間隔

Claims (21)

1. 基板と、
   前記基板に形成されたカーボンナノウォールとを有する細胞培養基材において、
   前記カーボンナノウォールのグラフェンシートの先端部が、
   細胞を培養するための足場部であること
   を特徴とする細胞培養基材。
2. 請求項１に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートは、
   前記基板の板面に交差する向きに形成されていること
   を特徴とする細胞培養基材。
3. 請求項２に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの平均ウォール間隔は、
   １０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲内であること
   を特徴とする細胞培養基材。
4. 請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの前記先端部の少なくとも一部の炭素原子は、
   炭素原子以外の原子と結合していること
   を特徴とする細胞培養基材。
5. 請求項４に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの前記先端部の少なくとも一部の炭素原子は、
   酸素原子または窒素原子と結合していること
   を特徴とする細胞培養基材。
6. 請求項４に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの前記先端部の少なくとも一部の炭素原子は、
   フッ素原子と結合していること
   を特徴とする細胞培養基材。
7. 請求項５に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの平均ウォール間隔は、
   １０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内であること
   を特徴とする細胞培養基材。
8. 請求項６に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの平均ウォール間隔は、
   ８０ｎｍ以上１２０ｎｍ以下の範囲内であること
   を特徴とする細胞培養基材。
9. 請求項６に記載の細胞培養基材において、
   前記グラフェンシートの平均ウォール間隔は、
   １２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内であること
   を特徴とする細胞培養基材。
10. 請求項１から請求項９までのいずれか１項に記載の細胞培養基材において、
    前記グラフェンシートの前記先端部の少なくとも一部の炭素原子は、
    水素原子と結合していること
    を特徴とする細胞培養基材。
11. 請求項１から請求項１０までのいずれか１項に記載の細胞培養基材において、
    前記足場部での水との接触角が、
    １°以上１７０°以下の範囲内であること
    を特徴とする細胞培養基材。
12. 請求項１から請求項１１までのいずれか１項に記載の細胞培養基材において、
    前記グラフェンシートの前記先端部をコーティングするコーティング膜を有すること
    を特徴とする細胞培養基材。
13. 請求項１２に記載の細胞培養基材において、
    前記コーティング膜は、
    コラーゲンコート処理がなされたものであること
    を特徴とする細胞培養基材。
14. 細胞培養基材の上に細胞を培養する細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    基板にカーボンナノウォールが形成されたものを用い、
    前記カーボンナノウォールのグラフェンシートの先端部を、
    細胞を培養するための足場とすること
    を特徴とする細胞培養方法。
15. 請求項１４に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記グラフェンシートが前記基板の板面に交差する向きに形成されているものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
16. 請求項１４または請求項１５に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記先端部の少なくとも一部の炭素原子は、炭素原子以外の原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
17. 請求項１６に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記先端部の少なくとも一部の炭素原子が、酸素原子または窒素原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
18. 請求項１６に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記先端部の少なくとも一部の炭素原子が、フッ素原子または水素原子と結合しているグラフェンシートを有するものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
19. 請求項１４から請求項１８までのいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記足場部での水との接触角が、１°以上１７０°以下の範囲内であるものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
20. 請求項１４から請求項１９までのいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
    前記細胞培養基材として、
    前記グラフェンシートの前記先端部をコーティングするコーティング膜を有するものを用いること
    を特徴とする細胞培養方法。
21. 請求項２０に記載の細胞培養方法において、
    前記コーティング膜は、
    コラーゲンコート処理がなされたものであること
    を特徴とする細胞培養方法。