JPWO2013133450A1 - がん治療用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、VEGFやEGFという増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、VEGFに結合し、VEGF受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。
アービタックスは、EGF受容体に結合し、EGFによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させるのが狙いである。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害(ADCC、Antibody―Dependent Cellular Cytotoxicity)によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。
さらに、抗体医薬品が効果を発揮する機序としては、抗体分子が腫瘍に蓄積するというEPR(Enhanced Permeability and Retention)効果が挙げられる。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため、高分子や微粒子が血管より流出しやすく、また、リンパ系が発達していないため、腫瘍組織に到達した物質は蓄積する。腫瘍組織ではこのような特性を持つために、抗体を含めた40kDa以上の分子は腫瘍に蓄積しやすく、効果を発揮しやすいことが知られており、EPR効果と呼ばれている(非特許文献1)。この作用は、腫瘍に効果的に薬剤を運搬させるドラッグデリバリー開発の基本となっている。
抗体医薬品に加え、近年では細胞に二本鎖RNAを導入し、標的遺伝子(mRNA)を破壊することで発現を抑制するというRNA干渉(RNA Interference)を用いた治療薬の開発も進められている。RNA干渉は、がん細胞の増殖や転移に関与するターゲットの発現を抑制して、がんを治療する方法の一つであり、実用化を目指した開発が進められている。
一方で、分子標的薬は、正常細胞にも影響を及ぼすため致命的な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている(非特許文献2)。さらに、ハーセプチンはHer2を標的とした抗体医薬品であるため、Her2を発現している患者にしか奏効性を示さない。
大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である(非特許文献3)。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する(非特許文献4)。また、EGFR下流のシグナル変化(例えばK−ras変異)によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。
以上のようにがんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、副作用が少なく、がん特異的な分子標的及び医薬品の新たな開発が求められていた。
そこで、本発明者らは、大腸がん細胞において特異的に発現が亢進している遺伝子を絞り込み、がん細胞に特異的に発現している膜タンパク質分子として、SLC6A6(Solute carrier family 6 (neurotransmitter transpoter,taurine),member 6)に着目した。
SLC6A6は、620アミノ酸からなる12回膜貫通型の膜タンパク質であり、NCBI(米国生物工学情報センター)にReference Sequences [RefSeq] ID:NM_003043、NP_003034.2として登録されている(配列番号1:塩基配列、配列番号2:アミノ酸配列)。SLC6A6はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。
SLC6A6遺伝子は、正常組織に対し結腸がん組織において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている(特許文献1)。特許文献1では、10種類の原発結腸腫瘍と、10種類の正常結腸を用いて、DNAマイクロアレイにより、slc6a6を含む、結腸がん組織と正常組織との間で発現に差がある30個以上の遺伝子が同定さており、開示された全ての遺伝子について、抗体、抗体によるポリペプチドの検出方法、がんの診断方法、抗体を含む医薬組成物への適用が示唆されている。しかしながら、slc6a6に対する抗体の作製例はなく、診断または治療目的における、タンパク質レベルでの適正、実用性又は実施可能性についても実証されていない。また、特許文献1では、SLC6A6タンパク質のがん細胞における増殖や転移への関与について何も検証されていない。さらに、特許文献1には、定量PCR法による詳細な発現パターンの解析結果が記載されているが、発現比にばらつきがあり、正常組織において結腸がん組織よりも高い発現を示す場合がある(表7)。また、定量PCRに使用されたプライマー(表6)はタンパク質のコード領域外である。治療薬として用いるには、タンパク質を検出する抗体が必要であり、かつ生きたがん細胞に抗体が結合するためには細胞膜領域に結合する抗体が必要である。抗体医薬品としての利用を行う場合には、特異的なアミノ酸配列と立体構造を認識するモノクローナル抗体が不可欠であり、治療薬への有用性を詳細に検討しなければならない。また、RNA干渉による医薬品を開発する際には、SLC6A6発現を抑制しうる配列を明らかにし、かつ、SLC6A6の発現を抑制することにより、がん細胞の増殖や転移への影響について有用性を詳細に検討しなければならない。
SLC6A6に対する抗体として、HPA015028(ATLAS社)、sc−166640(SantaCruz社)等複数の抗体が公知である。抗体医薬品として開発するためには、キメラ化やヒト化を行う必要があるため、モノクローナル抗体でなければならならない。HPA015028はアミノ酸残基143〜216(配列番号3(塩基配列)、配列番号4(アミノ酸配列))を含む細胞外領域を認識する抗体であるがポリクローナル抗体である。公知の抗体の中ではsc−166640のみがモノクローナル抗体である。しかしこの抗体は、SLC6A6のアミノ酸残基397〜424の領域に結合する。この領域は膜貫通領域から細胞内にわたっているため、この抗体は生きたがん細胞と結合することが出来ず、治療薬として利用することができない。
以上の理由から、これらの従来の抗体は、抗体医薬品として利用できる抗体として十分ではなかった。また、SLC6A6の発現を抑制することが、がん細胞にどのような影響を与えるか、解析されていなかった。
本発明は、膜タンパク質であるSLC6A6が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、診断及び処置の対象として有用なマーカーであるという発見に基づいている。本発明は、大腸がん特異的に発現するSLC6A6と結合し、がんの治療薬として安定して供給し得るモノクローナル抗体及びその断片を有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。また、SLC6A6の発現を抑制できる物質として、siRNA、shRNAまたはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、SLC6A6の細胞外領域であるアミノ酸残基143〜216を認識するモノクローナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体を用いたがんの治療用抗体を開発することに成功し、本発明を完成させた。また、SLC6A6を過剰発現する細胞を用い、発現を抑制できるRNAi用の核酸配列を複数同定することで、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)ネイティブなSLC6A6を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はRNA干渉によりSLC6A6の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。
(2)SLC6A6の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
(3)細胞外領域のポリペプチドが、以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも1つに示されるものである前記(2)に記載の医薬組成物。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列に70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド
(4)受託番号がFERM BP−11413又はFERM BP−11414であるハイブリドーマにより産生される、SLC6A6に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
(5)前記(4)に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、SLC6A6に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
(6)モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の医薬組成物。
(7)モノクローナル抗体が融合されたものである、前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の医薬組成物。
(8)大腸癌を治療するための、前記(1)〜(7)のいずれか1項に記載の医薬組成物。
本発明により、ヒト化、キメラおよびヒト抗SLC6A6モノクローナル抗体並びにそのフラグメント、並びに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを含む医薬組成物、特に大腸癌治療用医薬組成物が提供される。本発明の抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは、単独、あるいは少なくとも1種類の治療薬に結合させる、あるいは他の治療様式と組み合わせて用いることができる。また、SLC6A6の発現を抑制することが出来る物質は、既存のドラッグデリバリーシステムを用いて標的の臓器へ輸送し、がん細胞の増殖、浸潤、移動を抑制することで、治療薬として利用することが出来る。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2012年3月6日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2012−049192号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、SLC6A6(solute carrier family 6(neurotransmitter transpoter,taurine),member 6)と呼ばれる分子またはその細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物に関する。この抗体は、特に大腸がん細胞に特異的に結合する。また、本発明はSLC6A6の発現を抑制するshRNA又はsiRNAを含むベクターを用いる。このshRNA又はsiRNAは大腸がん細胞の増殖、転移を特異的に抑制する。従って、本発明の医薬組成物はがん、特に大腸癌の治療に有用である。
本発明のモノクローナル抗体を取得するには、免疫原として、本来の立体構造を有する状態にある、ヒトSLC6A6の全長タンパク質(配列番号1(塩基配列)、配列番号2(アミノ酸配列))、あるいは細胞外領域であるアミノ酸残基143〜216(配列番号3(塩基配列)、配列番号4(アミノ酸配列))を含む部分タンパク質(以下、総称してタンパク質と表現する場合がある)を用いる。生きた細胞を認識するため、膜タンパク質本来の立体構造を認識できる抗体を取得する。
本発明の医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体(以下「本発明のモノクローナル抗体」ともいう)は、ネイティブなSLC6A6を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有する立体構造の状態にあることをいう。
また、本発明のモノクローナル抗体は、SLC6A6の細胞外領域を認識することができる。特に、細胞外領域として、SLC6A6のアミノ酸残基143〜216の領域(配列番号4)を認識することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号4に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがSLC6A6の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号4に示すアミノ酸配列の1個もしくは数個(例えば2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2、3、4または5個)のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号4に示すアミノ酸配列に70%以上、好ましくは80%以上、90%以上、95%以上、あるいは98%以上の相同性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
SLC6A6の細胞外領域は、タウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測される。変異型ポリペプチドがSLC6A6の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをactivation method(J.Membr.Biol,76,1−15,1983)で解析することにより確認することができると考えられる。
あるいは、本発明のモノクローナル抗体はSLC6A6に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明のモノクローナル抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちSLC6A6の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
変異型ポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合は、ELISA、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
また、SLC6A6の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがSLC6A6の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ELISA、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、FACSなどで比較することにより確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、SLC6A6に対し、従来の抗体よりも高い親和性を有している。
従来の抗体は、細胞外領域を認識しないために、生きた細胞に結合できず治療薬として用いることが出来ない点に問題があった。これに対し、本発明のモノクローナル抗体は、従来の抗体と異なり細胞外領域を認識するとともに、従来の抗体よりも高い親和性を有するため、がん細胞表面に存在するSLC6A6と高い親和性で結合し、生体内でSCL6A6の機能を直接的に抑制するほか、ADCC(Antibody−Dependent Cellular Cytotoxicity)活性によりがん細胞を死滅に導くことが可能になる。
本発明のモノクローナル抗体は、slc6a6のmRNAバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のSLC6A6だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、SLC6A6を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。
本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、あるいはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、例えば、H鎖、L鎖、Fv、Fab、Fab´、F(ab´)2、scFv、sdFv、sc(Fv)2、(scFv)2、DiAbody、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、標識抗体などが挙げられる。いずれも、SLC6A6の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株(ハイブリドーマ)は、「Mouse−Mouse hybridoma 4B9b」(以下「4B9b」という)及び「mouse−mouse hybridoma 5H12d」(以下「5H12d」という)と称し、どちらも、株式会社バイオマトリックス研究所(〒270−0101 千葉県流山市東深井105番地)が、2010年7月21日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1中央第6)に寄託した。その受託番号は、「4B9b」については「FERM BP−11413」であり、5H12dについては「FERM BP−11414」である。さらに細胞株として、「3A3」、「19B10」、「23G12」、「7C11」、「12E8」、「6G3」、「18A10」、「22A4」、「23H6」。「26F3」、「2F2」、「7H8」、及び「19C2j」を取得した。「3A3」、「19B10」、「23G12」、「7C11」、「12E8」はサブクラスIgGであり、残りの抗体はIgMであった。本発明は、当該ハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
これらの特徴を有する本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、WO/2010/098471に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得られるものである。当業者において一般的に実施されている製法では作製が困難である。それは、
(1)抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、
(2)細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない、
などの理由による。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明者らが抗体の製法(特に免疫方法)に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
本発明のモノクローナル抗体は、以下の特徴を有する。
本発明の抗体は、SLC6A6が本来有する立体構造をもとに作製された故に、ネイティブなSLC6A6を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体(HPA015028)と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のSLC6A6と十分に結合することができる。また、SLC6A6の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体(sc−166640)に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができ、治療薬として利用することが可能である。
加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体はがんの治療に利用することにより、がんによる死亡率を減少させることが出来る。
また、本発明は、受託番号がFERM BP−11413又はFERM BP−11414であるハイブリドーマにより産生される、SLC6A6に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のSLC6A6に対するモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ(SLC6A6のアミノ酸配列のうち、第145番目から第213番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。)を指す。
SLC6A6に対する抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であってもよい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、SLC6A6タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのH鎖定常部をヒトIgGのH鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにSLC6A6タンパク質をWO/2010/098471に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
本発明のがん治療剤には、SLC6A6抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される抗がん剤や担体を適宜結合させることができる。
本発明においては、SLC6A6の発現を抑制することで、がん細胞の増殖や転移を抑えることによって、がんの進行や転移を抑制することが出来る。つまり、RNA干渉(RNA interference(RNAi))と呼ばれる方法によりSLC6A6の発現を抑制する物質を提供することが出来る。これらはsiRNA(small interfering RNA)やshRNA(short hairpin RNA)またはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分とし、既存のドラッグデリバリーシステムを用いてがんの治療薬(がんの進展または転移の抑制剤)として利用できる。
RNAiによりSLC6A6の発現を抑制することができる物質の具体例としては、siRNA、shRNA、又はこれらを発現できる発現ベクターなどが挙げられる。これらが細胞に導入されると、RNAi現象が生じ、相同な配列を有するRNAが分解される。このようなRNAi現象は、線虫,昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物(哺乳動物を含む)において見られる現象である。
本発明においてはsiRNAと呼ばれる、約20塩基(例えば、約21〜23塩基)またはそれ未満の長さの二本鎖RNAを用いることができる。このようなsiRNAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのsiRNAの標的となる遺伝子(本発明においては、SLC6A6遺伝子の発現を抑制することができる。
本発明において用いられるsiRNAは、RNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「siRNA」とは、short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたもの、あるいは生物体内で合成されたものか、もしくは約40塩基以上の二本鎖RNAが体内で分解されてできた10塩基対以上の短鎖二本鎖RNAを言い、通常、5’−リン酸、3’−OHの構造を有しており、3’末端は約2塩基突出している。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、RISC(RNA−induced−silencing−complex)が形成される。この複合体は、siRNAと同じ配列を有するmRNAを認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部でmRNAを切断する。siRNAの配列と、標的として切断するmRNAの配列とは100%一致することが好ましい。しかし、siRNAの中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、RNAiによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも100%一致していなくてもよい。
siRNAの塩基配列と、発現を抑制すべきSLC6A6遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、SLC6A6遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、siRNAが効果的にmRNAに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、SLC6A6遺伝子の翻訳開始領域から20塩基離れていることが好ましく、より好ましくはSLC6A6遺伝子の翻訳開始領域から70塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、SLC6A6遺伝子の3’末端付近の配列でもよい。さらに、mRNAとして転写される場合、SLC6A6遺伝子のタンパク質をコードする領域の終止コドンより下流のmRNA領域(3’−UTR)に配列を作製しても良い。
本発明ではsiRNAを、RNAiを引き起こす因子として用いることができ、siRNAを生成するような因子(例えば、約40塩基以上のdsRNA)をそのような因子として用いることができる。例えば、SLC6A6遺伝子の核酸配列(配列番号1又は3)の一部に対して少なくとも約70%、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは100%の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むRNAまたはその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも約15ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約19ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約21ヌクレオチド長である。
本発明の別の態様によれば、RNAiによりSLC6A6の発現を抑制することができる因子として、3’末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るshRNA(short hairpinRNA)を使用することができる。shRNAとは、一本鎖RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約20塩基対以上の分子のことを言う。そのようなshRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基(代表的には例えば、21塩基、22塩基、23塩基)の長さに分解され、siRNAと同様にRNAiを引き起こすことができる。上記の通りshRNAは、siRNAと同様にRNAiを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
shRNAは、好ましくは3’突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約10ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約20ヌクレオチド以上である。ここで、3’突出末端は、好ましくはDNAであり、より好ましくは少なくとも2ヌクレオチド以上のDNAであり、さらに好ましくは2〜4ヌクレオチドのDNAである。
本発明で用いるRNAiによりSLC6A6の発現を抑制することができる物質(即ち、上記したようなsiRNA又はshRNAなど)は、人工的に化学合成してもよく、センス鎖およびアンチセンス鎖のDNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造のDNAをT7 RNAポリメラーゼによってインビトロでRNAを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、T7RNAポリメラーゼおよびT7プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンスおよびセンスのRNAを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、RNAiが引き起こされ、SLC6A6の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬(例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど)を用いてそのようなRNAを細胞内に導入することができる。
さらに本発明においては、RNAiによりSLC6A6の発現を抑制することができる物質(好ましくは、siRNA又はshRNA)をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。
本発明のがん治療剤は、がんの治療のために広く使用することができるが、好ましくは発がん及びがんの浸潤・転移を抑制するための薬剤として使用することができる。
本発明のがん治療剤の投与対象のがんの種類は特に限定されず、SLC6A6を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん(肝臓がん)、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、子宮がんである。
本発明のがん治療剤の投与方法は、非経口投与(例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)、患部への直接投与などが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分(本発明のモノクローナル抗体、又はRNAiによりSLC6A6の発現を抑制することができる物質)の配合割合を考慮した上で、投与対象(患者)の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
非経口剤の投与量(1日あたり)は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分(抗体の場合)は、適用対象(患者)の体重1kgあたり1mg〜15mg/日であることが好ましく、より好ましくは2−12mg/日である。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。本発明のがん治療剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および/または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
siRNA、shRNAを投与する場合は、その有効量は、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、siRNA又はshRNAは、非経口投与(例えば静注)の場合約0.1〜1.5mg/kgである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、新たながん細胞特異的な膜タンパク質を同定し、診断や治療目的の抗体を作製する目的で、新たな膜タンパク質マーカーの同定を行った。5種類の大腸がん培養細胞株(HT29、HCT116、DLD1、LOVO、SW480)で共通して発現し、2種類の正常細胞(大腸内視鏡検査を受けた健常者2名由来の正常大腸剥離細胞)では発現していない遺伝子をDNAマイクロアレイによって同定した。
180個得られた候補遺伝子の中から、定量性PCR法により5症例のがん患部と健常部とで、2倍以上の差のみられる遺伝子25個を絞り込んだ。さらにその遺伝子群の中から、in situ hybridization法により、がん部特異的に転写がみられる遺伝子を複数同定した。その中で、東京大学システム生物医学ラボラトリーのデータベース(http://www.lsbm.org/)上で公開されている39種類の正常組織すべてで発現が見られない遺伝子を調べたところ、solute carrier family 6 (neurotransmitter transpoter,taurine,SLC6A6)遺伝子を同定した。
SLC6A6遺伝子のがん部、健常部での発現を確認するために、mRNA(NM_003043)の5461−5878(418 bp)に位置する配列に対してプローブを作製し、in situ hybridyzation法により組織を分析した。
大腸がん組織パラフィン切片(Genostaff Co.Ltd.)をキシレン処理後、エタノール、PBSの順で水和を行い、パラホルムアルデヒドで15分間固定した。7μg/ml Protreinase K (Roche)で30分間処理し、4%パラホルムアルデヒド溶液で再固定した。0.25%無水酢酸0.1M Tris−HCl pH8.0で10分間アセチル化し、エタノールで脱水した。300ng/mlプローブ(Genostqaff Co.Ltd.)を含むhybridization反応液(Genostqaff Co.Ltd.)に60℃で16時間反応させた後、5×洗浄液(Genostqaff Co.Ltd.)で60℃20分間、50%ホルムアミド・2×洗浄液で60℃20分間洗浄し、RNaseAで37℃30分間処理した。
2×洗浄液、TBSTで洗浄した後、0.5%ブロッキング反応液(Roche)、20%熱処理羊血清(Sigma)と順次反応させた。AP標識抗DIG抗体(Roche)と2時間の反応を行い、PBSで洗浄後にNBT/BCIP液(Roche)中で発色させた。ケルネヒトロート液(Mutoh)で対比染色後、脱水処理し、マリノール(Mutoh)で封入した後に顕微鏡で観察を行った。図1に結果を示した。図1に示されるように、大腸がんのがん部は、健常部と比べ特異的に染色された。
(1)細胞
MCF7−14は、受託番号:FERM BP−10944を継代したものを用いた。Caco−2、COLO201、DLD−1、HCT15、HCT116、HT−29、LOVO、SW480、SW620、WiDr、293Tは、国立がん研究センター東病院より入手した。Cos7細胞は東京理科大より入手した。
MCF7−14、SW620、DLD−1、Colo201を、10%(v/v)の血清(Hyclone社製)を含むRPMI1640培地(Sigma社)で、WiDrはE−MEM培地(Sigma社)、HCT116はMcCoy’s5A培地(Sigma社)、HT−29、LoVo、SW480、293T及び残りの細胞はDMEM培地(Sigma社)で、それぞれ80%コンフルエントを越えないよう37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。
(2)SLC6A6遺伝子のクローニング
MCF7−14を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のprimerを用いてPCR反応を行なった。
プライマー配列
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および60℃、1分間のアニーリング/エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。 得られた増幅断片は、Primer上に配置した制限酵素(BamHI及びXbaI)を用いて、pEF6ベクター(Invitrogen社)へ組み込んだ。増幅断片をDNAシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれ、C末端にc−myc tag配列が付加されていることを確認した。
(3)SLC6A6過剰発現株の作製
上記(2)で作製したプラスミドを、FUGENE6(ロシュ社製)を用いてMCF7−14細胞へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。
ブラストサイジンS塩酸塩が10μg/mLとなるよう添加した実施例2(1)記載の培地で細胞を培養し、3〜5日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からSLC6A6を過剰発現している細胞を選び出すため、培養したMCF7−14及び遺伝子導入した細胞それぞれを80%コンフルエントとなるよう96ウエルプレートに植え、37℃、5%CO2下で16時間培養した。
培養上清を除去後、10%(v/v)中性緩衝ホルマリン溶液(WAKO社製)を100μL添加し、10分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、PBS(−)で3回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
抗c−myc抗体(santa cruz社、クローン9E10)をTBS−T(25mM Tris、150mM NaCl、0.05%(v/v) Tween20、pH 7.4)で1μg/mLに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで5千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を1ウエルあたり100μL添加し、室温で30分反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
最終濃度0.5mg/mLとなるようオルソフェニレンジアミン(Sigma社製)を50mMの炭酸−クエン酸バッファー(pH 5.0)に希釈し、この溶液の1万分の1量の35%(w/w)過酸化水素水(WAKO社製)を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに100μL入れ、室温で10分間反応させた。25μLの3N硫酸(WAKO社製)を添加することで反応を停止させた。492nmの吸収をプレートリーダー(SpectraMaxPure384、モレキュラーデバイス社製)で測定して、シグナルを観察し、MCF7−14よりもシグナルの高い株を3種類選択した。
(4)Western blot
上記(3)で得られた3種類の細胞を10cmシャーレに90%コンフルエントになるまで培養し、PBS(−)(0.01M sodium−phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)で2回洗浄した。細胞に2×RIPA Buffer (0.1M Tris、0.3M EDTA、1%(v/v)Triton X−100、2%(w/v)Sodium Deoxycholate、0.2%(w/v) sodium dodecyl sulfate)を200μL添加し1分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機(Branson社)で30秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Bradford法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、SDS−PAGEに供した。泳動後、トランスブロットSDセル(バイオラッド社)を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いPVDFメンブレン(PIERCE社)にタンパク質を転写した。TBS−Tに5%(w/v)となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で30分間ブロッキングを行い、TBS−Tで2回洗浄を行った。c−myc抗体をTBS−Tで1μg/mLに希釈し、メンブレンと1時間、室温で反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで1万倍に希釈した。メンブレンと室温で30分反応させた後、TBS−Tで3回洗浄した。メンブレンをImmobilon(Millipore社)に浸したのち、ラップしてLAS−3000(富士フィルム社)でシグナルを検出した。
図2に結果を示した。SLC6A6遺伝子を導入した細胞の中で最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。
(5)細胞の移植
10cmシャーレに90%コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン(GIBCO社)を用いて回収し、PBS(−)(0.01M sodium−phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)で2回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が8.6×107細胞/mLとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル(Becton Dickinson社製)に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
生理食塩水に3.5%(w/v)となるよう抱水クロラール(Sigma社製)を溶解して、3.5%抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。6〜8週齢のヌードマウス(BALB/cALcl−nu/nu系統(日本クレア社製))の腹腔内に3.5%抱水クロラール生理食塩水溶液を0.2mL投与して麻酔した。マウスの第4乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を1乳腺あたり1×106個、24Gの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。1匹のマウスに対して、2箇所の移植となるように、胴体左右両方の第4乳腺にそれぞれ移植を行った。
(6)スクリーニング用SLC6A6部分タンパク質の発現と精製
実施例2(3)に記載のpEF6ベクターに導入したSLC6A6全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基143〜216の領域(配列番号4)をコードするDNA(配列番号3)をpET32ベクターにサブクローニングした。以下のprimerを用いてPCRを行なった。
プライマー配列
PCR反応は、94℃、2分間のプレインキュベーションを行なった後、98℃、10秒間のデナチュレーション、58℃、30秒間のアニーリング、および68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、Primer上に配置した制限酵素(EcoRI及びBamHI)を用いて、pET32ベクター(Novagen社)へ組み込んだ。
増幅断片の塩基配列をDNAシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、C末端にHis tag配列が付加されていることを確認した。このベクターでBL21(DE3)(Invitrogen社)を形質転換し、1%(w/v)のグルコースを含むLB培地(1%(w/v) トリプトン(Sigma社)、0.5%(w/v)Yeast extract(Sigma社)、0.5%(w/v) NaCl(Sigma社))で培養した。培地の濁度が600nmの波長で0.6となった後、1mM IPTG(WAKO社)を加え、16時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、SLC6A6細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約10mgのサンプルをBuffer A(1M塩酸グアニジン(Sigma社)、10mM DTT(Sigma社)、10mM EDTA(Sigma社))に溶解し、37℃で1時間反応させた。1LのBuffer B(50mM Tris、150mM NaCl、5%グリセロール、0.4mM 酸化型グルタチオン(Sigma社)、pH8.5)に緩やかに加え、4℃で18時間撹拌した。溶解したサンプルをNi sepharoseカラム(GE社)に供し、Buffer C(50mMリン酸カリウム緩衝液、150mM NaCl、200mM Imidazole、pH8.0)で溶出した。Imidazoleを含まないBuffer Cに透析して、精製したSLC6A6の細胞外領域部分タンパク質を得た。
(7)抗血清の解析
上記(6)で得た組換えタンパク質を10μg/mlを100μLずつ、MaxiSorp 96 wellプレート(ヌンク社)に入れ、室温で1時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをTBS−T(TBS−T(25mM Tris、150mM NaCl、0.05%(v/v) Tween20、pH 7.4)で洗浄した後、5%となるようTBS−Tで希釈したスキムミルク(GIBCO社)を入れ、30分室温でブロッキングを行った。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をTBS−Tで1/2000倍に希釈し、ELISAプレートへ1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで5千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を1ウエルあたり100μL添加し、室温で30分反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。 最終濃度0.5mg/mLとなるようオルソフェニレンジアミン(Sigma社製)を50mMの炭酸−クエン酸バッファー(pH5.0)に希釈し、この溶液の1万分の1量の35%(w/w)過酸化水素水(WAKO社製)を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに100μL入れ、室温で10分間反応させた。25μLの3N硫酸(WAKO社製)を添加することで反応を停止させた。492nmの吸収をプレートリーダー(SpectraMaxPure384、モレキュラーデバイス社製)で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。
(8)細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63−Ag8(ATCC受託番号 CRL−1580)と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞と0.25×108個の骨髄腫株とを混合し、EP Buffer(0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう懸濁し、電気融合装置LF201(ネッパジーン社製)で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をHAT培地(Invitrogen社製)に懸濁し、各ウエル100μLとなるよう30枚の96ウエルプレートに散布した。途中、HAT培地を200μL添加し、11〜16日間培養後に顕微鏡下で観察すると、1ウエルあたり5〜12個のコロニーが形成された。
(9)モノクローナル抗体の取得
移植7ヶ月後に脾臓細胞を取り出し、上記(8)に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。SLC6A6を認識する抗体を選択するために、上記(3)及び(7)記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識を用いた。
図3は、得られたクローンを上記(7)と同様の方法で解析した結果である。「3A3」、「19B10」、「23G12」、「7C11」、「12E8」、「6G3」、「18A10」、「22A4」、「23H6」、「26F3」、「2F2」、「7H8」、及び「19C2j」はクローン番号を示す。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
(10)組織染色
4B9b抗体および5H12d抗体を用いて免疫染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織(Biochain)をキシレンで脱パラフィン処理、エタノールで親水化した。0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、加圧水蒸気下(120度)で10分間処理し、抗原賦活化を行った。3%(w/v)BSAを含むPBSで処理した後、4B9b抗体および5H12d抗体それぞれと4℃、16時間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識抗マウス2次抗体(DAKO社)で室温1時間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、DAB試薬(DAKO社)で5分間発色させた。蒸留水で水洗後、Hematoxylin(WAKO)を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
図4に、大腸癌患者の癌部及び正常部に対して免疫染色を行った結果を示した。がん部が特異的に染色されていることが示された。
(11)正常組織の組織染色
4B9b及び5H12dを用いて、ヒト正常組織の免疫染色を行った(図5)。方法は(10)に記載されている方法と同様である。
図5において、パネルA〜Hは、それぞれA:大腸、B:胃、C:回腸、D:肝臓、E:膵臓、F:心筋、G:肺、H:胎盤を示している。抗体がIgMであるため多少のバックグラウンドは観察されているが、細胞膜が染色されるのは大腸癌のみであった。
(12)リアルタイム定量的RT−PCR
培養した細胞からtotal RNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて抽出した。cDNAはtotal RNAから1st strand cDNA Synthesis Kitを用いて合成した(Roche社)。LightCycler(Roche)を用いたSLC6A6 cDNAのReal−time quantitative PCRは、LightCyclerキャピラリー中のLightCyclere DNA Master SYBRGreen I (FastStart TaqDNA polymerase、deoxynucleotide triphosphate buffer、SYBR Green I)、3.0mM MgCl2、及び0.5μMの各プライマー配列を含有する反応液(20μl)で行った。使用したprimerはSLC6A6 TagManプローブHs00161778(アプライドバイオシステム社)を用いた。
鋳型cDNAの段階的希釈によりPCR産物を直線領域で最適化した。定量的PCRの分析はLightCyclerソフトウェア3.3版を用いて行った。結果を図6に示す。
(13)FACS解析
10種類の大腸癌細胞をそれぞれ90%コンフルエントとなるよう培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、1.5mLチューブに回収した。4B9b、5H12d抗体をそれぞれ最終濃度1μg/mLとなるよう添加し、60分間反応させた。PBS+2%FBSで2回洗浄後、AlexaFluor488標識されたGoat−Anti−mouse IgG(Invitrogen社)をPBS+2%FBSで1/1000希釈して添加し、30分間反応させた。PBS+2%PBSで2回洗浄後、Guava Flow Cytometry (Millipore社)で解析を行った。結果を図7に示す。
図7より、全ての大腸癌細胞に対し本発明の抗体が反応することが明らかになった。
4B9b抗体を発現するハイブリドーマ細胞からtotal RNAをRNeasy Mini Kitを用いて抽出し、1st strand cDNA Synthesis Kitを用いてcDNAを合成した。PCR用の酵素としてはKODPlus(TOYOBO社)を用い、特に記載がない限りメーカー推奨のプロトコールで実験を行った。抗体のH鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号9と配列番号10のPrimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、30℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
抗体のL鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号11と配列番号12のPrimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、30℃、15秒間のアニーリング、68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
精製したPCR増幅断片を10mM dNTP Mix(インビトロジェン社)及び2×GoTaq Maxter Mix(Promega社)と混合し、70℃、15分間反応後、4℃、2分間氷冷することで、3’末端へdAを付加した。その後、pGEM−T−Easy Vector System(Promega社)を用い、いわゆるTAクローニング法によりH鎖断片及びL鎖断片をクローニングした。
(i)H鎖の構築
続いて、シグナル配列を付加するため、ヒト−マウスキメラIgG1抗体を発現するCHO細胞(国立がん研究センターがん治療対策部門より入手)から上記と同様の方法でtotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、配列番号13と配列番号14のPrimerでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、15秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行って断片を得た。
並行してマウスIgG1を発現するハイブリドーマ細胞(すでに作製済みの抗マウスアルブミンモノクローナル抗体C、クローンALB1)から同様にtotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、配列番号15と配列番号16のPrimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、15秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
[0072]
上記のように調製した抗体H鎖のシグナル配列、可変部、定常部を、PCR反応により連結した。シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号13と配列番号16を用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、30秒間のアニーリング、68℃、1分間のエロンゲーションのサイクルを32サイクル)を行い、連結された断片を得た。
これらを、上記TAクローニングと同じ方法でpGEM−T−Easy Vectorへクローニングした後、シグナル配列の5’側及び定常部の3’側にある制限酵素(NotI)を利用して、pcDNA3.1−myc/HisA(インビトロジェン社)へクローニングした。
(ii)L鎖の構築
L鎖についてもH鎖と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
シグナル配列を付加するために、配列番号17と配列番号18のprimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のプレインキュベーション、94℃、15秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、及び68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
定常部のクローニングには、配列番号19と配列番号20のprimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のプレインキュベーション、94℃、15秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、及び68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
H鎖と同様に、シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号17と配列番号20のprimerを用いてPCR反応により連結した。これらの断片をprimer上に設計した制限酵素(KpnIとEcoRI)を用いてpEF6ベクター(Invitrogen社)へクローニングした。マウスIgG1化したSLC6A6抗体のH鎖のDNA配列は配列番号21、アミノ酸配列は配列番号22で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号23、アミノ酸配列は配列番号24で示される。
(2)マウスIgG化抗体の発現と精製
10cm dish 4枚に90%コンフルエントとなるようCos7細胞を培養し、(1)で作製したH鎖及びL鎖発現用ベクターをCos7細胞へFugene6(Roche社)を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。24時間後に10cm dish 20枚に継代し、10μg/mLのブラストサイジン(Invitrogen社)と800μg/mLのG418(ナカライ社)とを添加した培地で6日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。遺伝子導入したCos7の培養上清200mLに対し、1mLのProteinGカラム(GEヘルスケア社)を用いた。PBSで平衡化したProteinGカラムに対し、培養液を1〜3ml/minの流速で通過させた後、6mLの洗浄バッファー(25mM Tris−HCl(pH7.4)、140mM NaCl、10mM KCl)で洗浄した。次に1mLの溶出バッファー(0.1M Glycine (pH2.5))で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris−HCl(pH7.4)を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra30(Millipore社)を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。
(3)ELISAによる活性測定
実施例2.(7)と同様の方法で活性測定を行った。この際、抗体濃度を0〜40μg/mLとした。活性測定の結果を図8に示した。マウスIgG化した抗体でも活性のあることが確認された。
(4)免疫組織染色
実施例2.(11)に記載の方法で面積組織染色を行った。3症例の大腸がん患者の組織サンプルについて、それぞれ正常部(normal mucosa)、がん部(Cancer)、がん浸潤部(invasion front)を染色した2つの症例(A及びB)結果を図9に示した。正常部から腫瘍先端部に行くにしたがって、明確に染色されることが示されている。つまり、本発明のSLC6A6抗体は、大腸癌に結合する、特に大腸癌が広がっている浸潤部分に強く結合する、ということが示された。これは、治療用抗体を開発する上で、癌が広がりつつある部分に結合し、がんを抑制できるという点として非常に優れていることを示している。また、抗体だけではなく、ターゲットであるSLC6A6も大腸癌治療のターゲットとして優れていると考えている。
実施例3.(1)に示される方法と同様の方法で、シグナル配列、可変部、及び定常部をそれぞれクローニングした後、連結することで発現ベクターを作製した。ヒトIgG1定常部及びシグナル配列のクローニングには、ヒト―マウスキメラIgG1抗体を発現するCHO細胞(国立がん研究センターがん治療対策部門より入手)から増幅を行った。
(i)H鎖の構築
H鎖可変部のクローニングには配列番号25と配列番号26のprimerを、定常部では配列番号27と配列番号28のprimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のプレインキュベーション、94℃、15秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、及び68℃、1分間のエロンゲーションのサイクルを32サイクル)により断片を得た。
H鎖シグナル配列は、配列番号29と配列番号30のprimerを用いてPCR反応(94℃、2分間のプレインキュベーション、94℃、15秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、及び68℃、20秒間のエロンゲーションのサイクルを32サイクル)により断片を得た。
マウス抗体の場合と同様に、シグナル配列、可変部、定常部を配列番号25と配列番号30のprimerを用いてPCR反応により連結し、これらの断片をprimer上に設計した制限酵素(NotI)を用いてpcDNA3.1−myc/HisAベクターへクローニングした。
(ii)L鎖の構築
L鎖についてもマウスIgG1のL鎖構築と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
可変部のクローニングには、配列番号31と配列番号32のprimerを、定常部のクローニングには配列番号33と配列番号34を、シグナル配列部分は配列番号35と配列番号36を用いてPCR反応(94℃、2分間のプレインキュベーション、94℃、15秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、及び68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
L鎖についてもシグナル配列、可変部、定常部を列番号31と配列番号36のprimerを用いてPCR反応により連結した後、定常部と配列番号36と配列番号37のprimerを用いてPCR反応により連結した。これらの断片をprimer上に設計した制限酵素(KpnIとEcoRI)を用いてpEF6ベクター(Invitrogen社)へクローニングした。マウスIgG1化したSLC6A6抗体のH鎖は配列番号37:塩基配列、配列番号38:アミノ酸配列、L鎖は配列番号39:塩基配列、配列番号40:アミノ酸配列である。
(2)ELISAによる活性測定
実施例4で作製したプラスミドを実施例3.(2)及び(3)に記載の方法で細胞への遺伝子導入、及び精製を行うことで調製したヒトIgG化抗体の活性測定を行った。この際、抗体濃度を0〜40μg/mLとした。活性測定の結果を図10に示した。ヒトIgG化した抗体でも活性のあることが確認された。
実験結果を図11に示した。取得されたサブクラスIgG抗体の中で少なくとも3種類のクローン(19B10、7C11、12E8)は、SLC6A6を過剰発現させた細胞と反応することが示された。
ヒトInterleukin−2で処理したヒト末梢血単核球を作用細胞として、下記の標的細胞を作用細胞:標的細胞=25:1、12.5:1、6.25:1、3.13:1の比率で混合し、0.1μg/mLのヒト化抗SLC6A6抗体を添加し、4時間培養した(37℃、5%CO2)。抗体及び作用細胞を添加し、CytoTox96(Promega社)により、ADCCを測定した。細胞の死滅に伴って培養液中に遊離したLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)がテトラゾリウムをホルマザンへ変化させることを利用しており、吸光度500nmの変化で検出することが出来る。
ヒト大腸癌細胞Caco2株
ヒト大腸癌細胞HCT15株
ヒト大腸癌細胞DLD−1株
ヒト大腸癌細胞HCT116株
ヒト大腸癌細胞LoVo株
ヒト大腸癌細胞SW480株
ヒト大腸癌細胞SW620株
ヒト大腸癌細胞WiDr株
HCT15細胞(ヒト大腸癌由来SLC6A6陽性細胞)に、25μg/mLのSLC6A6抗体又はキメラ化SLC6A6抗体のいずれかを添加した。これにフルオレセイン標識ヒト補体C1qを10μg/mL添加。標識C1qによる蛍光染色性をフローサイトメトリーにより測定した。次に、HCT15細胞又はHT−29(SLC6A6陽性細胞)、及びCOLO201細胞(SLC6A6弱陽性細胞)に、2.2μg/mLの抗SLC6A6抗体を添加した。これにヒト補体を添加し培養した。細胞外に放出されたLDH量をCytoTox96を用いて測定し、補体による細胞溶解率を算出した。
ヒト大腸癌細胞HCT15(SLC6A6高レベル発現株)及びCOLO201(SLC6A6低レベル発現株)を、抗SLC6A6抗体150μg/mLの存在、非存在下で1日あるいは5日間培養(37℃、5%CO2)した後、細胞のSLC6A6数を求めた。細胞あたりのSLC6A6数は、AlexaFluor488でラベルした、SLC6A6に対するモノクローナル抗体4B9bを用い、AlexaFluor488のモル吸光係数を用いて細胞あたりのSLC6A6数を算出した。
実施例2(3)に記載のpEF6ベクターに導入したSLC6A6の下流にIRES及びGFP遺伝子を導入した。IRES−GFP断片は、pMXs−IGベクター(東京大学 北村俊雄氏より購入)から制限酵素(XhoIとSalI)を用いてIRES−GFP部分を切り出し、Klenow Flagment(タカラバイオ社)を用いて末端を平滑化した。また、実施例2.(2)で作製したpEF6−SLC6A6ベクターのSLC6A6下流部分を制限酵素(PmeI)で処理し、同様にKlenow Fragmentを用いて平滑化した。IRES−GFP断片を平滑化したpEF6−SLC6A6ベクターでクローニングし、pEF6−SLC6A6−IRES−GFPベクターを構築した。このPlasmidをマウス乳癌細胞4T1へFugene6を用い導入した。導入方法は、実施例2.(3)と同様の方法で行った。GFPの蛍光を示す細胞を複数クローニングし、形態を観察した所、遺伝子導入を行っていない細胞に比べ細胞が浮遊しやすい形態を示した(図12)。
(2)表現型の解析
SLC6A6過剰発現株させた細胞を培養し、実施例2.(4)に示される方法でWestern blot解析を行った。この際、Eカドヘリン抗体、Nカドヘリン抗体、Vimentin抗体(BD社)はそれぞれ1μg/mLで用いた。実験結果を図13に示す。上皮間葉移行(EMT、Epithelial−Mesenchymal Transition)で見られる表現型の変化が観察された。つまり、SLC6A6はタウリンを輸送するだけでなく、過剰発現により癌細胞をよりがん幹細胞に近づける機能を果たしている可能性が示唆された。
結果を図14に示した。SLC6A6を発現する細胞の増殖が添加した抗体によって妨げられている結果を得た。
(2)ヌードマウス可移植性ヒト大腸癌細胞HCT15に対する効果
SLC6A6抗体単剤
ヒト大腸癌HCT15(SLC6A6高レベル発現株)細胞をヌードマウス(1群5〜10、雌)の背部皮下に移植し、腫瘍体積が200〜300mm3に達した時点より投与を開始した。SLC6A6抗体(0.1〜30mg/kg/day)は、1日1回、週2回、4〜5週間腹腔内投与した。対照群はヒトIgG1を同様のスケジュールで腹腔内投与した。
(3)SLC6A6抗体+タキソール
ヒト大腸癌HCT15(SLC6A6高レベル発現株)細胞をヌードマウス(1群7〜13匹)の背部皮下に移植し、腫瘍体積が200〜300mm3に達した時点より投与し、腫瘍体積を測定することにより抗腫瘍効果を検討した。
ヒト大腸癌HCT15(SLC6A6高レベル発現株)細胞を用い、SLC6A6抗体の存在下、細胞を3日間培養(37℃、5%CO2)した。
実施例10.(1)で作製したpEF6−IRES−GFPをCOLO201、SW6
20、HT−29、LoVo細胞へ導入し、10μg/mLのブラストサイジンで薬剤選択を行い、安定発現株を得た。
RNAiによりSLC6A6の発現を抑制できるような配列を設計した。配列を設計するソフトウエアsiDirectversion 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)を用いた。安定的に発現が抑制される細胞を取得するために、4種類の配列を設計し、shRNAの構築を行った。合成オリゴDNA2本を相補的な配列が含まれるよう設計し、アニーニングさせて(94℃、10分間のデナチュレーション後、12時間かけて温度を室温まで下げる)Plasmidベクターへ挿入する断片を作製した。そして、pCAGベクター(東京理科大学村上研究室より入手)へprimer上に設計した制限酵素(EcoRIとBamHI)を用いてクローニングした。
作製した4種類のshRNA配列としては、配列番号41、44、47、50で示される。それぞれの配列を作製するために用いたprimer配列は、配列番号41に示す配列の作製には配列番号42と43に示すプライマーを、配列番号44に示す配列の作製には配列番号45と46に示すプライマーを、配列番号47に示す配列の作製には配列番号48と49に示すプライマーを、配列番号50に示す配列の作製には配列番号51と52に示すプライマーを用いた。
Forward primer:
Reverse primer:
Forward primer:
Reverse primer:
Forward primer:
Reverse primer:
Forward primer:
Reverse primer:
(2)大腸癌細胞でのSLC6A6発現抑制
大腸癌細胞HCT15及びHT−29に、実施例10.(1)で構築したベクターを実施例2.(3)と同様の方法で導入を行った。遺伝子導入試薬はLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)10μg/mLのブラストサイジンを含む培地で薬剤選択し、細胞株を得た。SLC6A6の発現が抑制されていることを実施例2.(4)と同様の方法でWestern blotで解析した。
(3)抗体による移動能抑制試験(メンブレン移動試験)
実施例9.で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、コントロールカルチャーインサート(BD社)のトランスウエル(フィルター上部:上室)に1×105個となるよう入れ、さらにSLC6A6抗体あるいはマウスIgG1抗体を50μg/ウエルとなるよう添加し、37℃で3日間培養した。トランスウエルのメンブレン(pore sizeは8μm)を移動した細胞(フィルター下部:下室)を0.1%クリスタルバイオレット溶液で染色し、MilliQを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。
実施例11.で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、マトリゲルインベージョンチャンバー(BD社)のトランスウエル(フィルター上部:上室)に1×105個となるよう入れ、さらにSLC6A6抗体あるいはマウスIgG1抗体を50μg/ウエルとなるよう添加し、37℃で3日間培養した。トランスウエルのメンブレン(pore sizeは8μm)を移動した細胞(フィルター下部:下室)を0.1%クリスタルバイオレット溶液で染色し、MilliQを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。
実施例11.で作製した細胞をプラスチックプレートで培養し、その培養面をスクラッチした。SLC6A6抗体を添加及び非添加した培地で12時間培養を行い、スクラッチ部分の面積変化の割合を測定することで、それぞれの細胞の運動能を測定した。
実施例11.で作製した細胞をCytoSelecto Cell Transformation Assay Kit(CELL BIOLABS社)を用いて解析した。ソフトアガー中に1×102個/wellとなるよう細胞を入れ、2週間培養した後に形成されたコロニーを測定した。
受託番号:FERM BP−11413
原寄託日:2010年7月21日
国際寄託当局:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6
(2)微生物の表示:「mouse−mouse hybridoma 5H12d」
受託番号:FERM BP−11414
原寄託日:2010年7月21日
国際寄託当局:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6
[配列表]
Claims (8)
- ネイティブなSLC6A6を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はRNA干渉によりSLC6A6の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。
- SLC6A6の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
- 細胞外領域のポリペプチドが、以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも1つに示されるものである請求項2に記載の医薬組成物。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列に70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド - 受託番号がFERM BP−11413又はFERM BP−11414であるハイブリドーマにより産生される、SLC6A6に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
- 請求項4に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、SLC6A6に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
- モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- モノクローナル抗体が融合されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 大腸癌を治療するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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